Name: Uprawa Caenorhabditis elegans w trzech wymiarach w laboratorium (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Naucz się uprawiać Caenorhabditis elegans w systemie 3D, który lepiej symuluje naturalne warunki niż standardowe metody 2D. Ta technika pozwala badać rozwój, fizjologię i zachowanie nicieni w środowisku zbliżonym do naturalnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez New Investigator Grant [2014R1A1A1005553] z National Research Foundation of Korea (NRF) dla J.I.L; oraz Yonsei University Future Leader Challenge Grant [2015-22-0133] dla J.I.L.

1. Przygotowanie rozwiązań dla NGT-3D i NGB-3D
<ol>
	<li>Przygotować następujące sterylne roztwory: 1 l 0,1454 M roztworu NaCl, 1 l 1 M CaCl2, 1 l 1 M MgSO4, bulion lizogeniczny (LB), 1 l 1 M buforu KPO4 (108,3 g KH2PO4 i 35,6 g K2HPO4 i napełnić H2O do 1 L). Produkcję NGM przy użyciu tych rozwiązań można znaleźć w poprzednim protokole10.</li>
	<li>Roztwory autoklawu w temperaturze 121 °C, 15 min.</li>
	<li>Przygotować 50 ml sterylnego roztworu cholesterolu o stężeniu 5 mg/ml. W stożkowej tubie o pojemności 50 ml wymieszaj 0,25 g cholesterolu i 50 ml 99,99% etanolu i dobrze wymieszaj. Nie sterylizować w autoklawie. Wysterylizuj roztwór cholesterolu za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml z filtrem strzykawkowym 0,45 μm. Spowoduje to również usunięcie nierozpuszczonego cholesterolu.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Przygotować 10 ml 150 mM wywaru 2'-deoksy-5-fluorourydyny (FUdR). W stożkowej probówce o pojemności 15 ml wymieszać 0,3693 g FUdR i 10 ml wody destylowanej. Wstrząsnąć.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kultury bakterii dla NGT-3D i NGB-3D
<ol>
	<li>Zaszczepić 10 ml bulionu LB bakteriami. Standardową bakterią używaną do żerowania C. elegans jest szczep E. coli OP50.</li>
	<li>Wyhodować inokulację bakteryjną w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przez noc.</li>
	<li>W celu przygotowania do seryjnego rozcieńczania, podwielokrotność roztworu NaCl rozlać na sterylne stożkowe probówki o pojemności 15 ml. Na przykład podwielokrotność 9 ml do łącznie 7 probówek, aby uzyskać 10-7 rozcieńczenie szczepu OP50 E. coli.</li>
	<li>Używając sterylnej pipety o pojemności 1 000 μl, odpipetować 1 ml kultury bakteryjnej lub rozcieńczonej kultury bakteryjnej do sterylnej nowej probówki z 9 ml roztworu NaCl i dobrze wymieszać 10 ml mieszaniny. Powtarzaj tę czynność, aż do osiągnięcia pożądanego rozcieńczenia bakteryjnego. 
	UWAGA: Pożądane rozcieńczenie bakterii zależy od rodzaju i stanu bakterii, a także dokładnych warunków eksperymentalnych. Na przykład rozcieńczenie 10-6 - 10-8 szczepu OP50 E. coli wystarczyło do wytworzenia od 1 do 200 kolonii bakteryjnych na 6,5 ml probówki NGT-3D. Robaki niezawodnie rozwijały się i rozmnażały normalnie, gdy liczba kolonii przekraczała 60, co następowało przy rozcieńczeniu 10-6 - 10-7. W przypadku NGB-3D należy użyć rozcieńczenia 10-8.</li>
</ol>
3. Wytwarzanie NGT-3D i NGB-3D (200 ml)
<ol>
	<li>Po przygotowaniu kultury bakteryjnej wymieszać 0,6 g NaCl, 1 g granulowanego agaru i 0,5 g peptonu w kolbie o pojemności 500 ml. Włożyć mieszadło magnetyczne do kolby.</li>
	<li>Dodać 195 ml wody destylowanej i przykryć wylot kolby folią aluminiową.</li>
	<li>Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 15 min.</li>
	<li>Umieścić gorącą autoklalawowaną kolbę na płytce mieszającej i mieszać z umiarkowaną prędkością przez co najmniej 2 godziny. Schłodzić kolbę do temperatury 40 °C. Należy upewnić się, że kolba jest wystarczająco ochłodzona, ponieważ kontynuowanie pracy w wysokich temperaturach może prowadzić do zmętnienia gotowego agaru. Jednak niższe temperatury mogą spowodować przedwczesne stwardnienie agaru.
	<ol>
		<li>(Opcjonalnie) Aby przyspieszyć proces chłodzenia, umieścić kolbę w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C na 15 minut przed umieszczeniem na płytce mieszającej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy temperatura podłoża agarowego osiągnie 40 °C, dodać 200 μl 1 M CaCl2, 200 μl 5 mg/ml roztworu cholesterolu, 200 μl 1 MMgSO4 i 5 ml 1 M buforu KPO4, gdy roztwór kontynuuje mieszanie do końcowych stężeń 1 mM CaCl2, 5 μg/ml cholesterolu, 1 mMMgSO4, 1 mM KPO4.
	<ol>
		<li>(Opcjonalnie) W przypadku testu żywotności NGT-3D dodać 80 μl 150 mM FUdR do końcowego stężenia 120 μM12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 6 ml 10 ml rozcieńczonej kultury bakteryjnej z kroku 2.4 bezpośrednio do kolby.
	<ol>
		<li>(Opcjonalnie) W przypadku NGT-3D usuń 6 ml podłoża agarowego przed krokiem 3.6 i utrzymuj je w cieple oddzielnie. Podłoże to zostanie użyte do wykonania wolnej od bakterii warstwy wierzchniej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stosując sterylne procedury, dozuj pożywkę do sterylnej komory hodowlanej. Upewnij się, że pokrywa komory szczelnie się zamyka.
	<ol>
		<li>(Opcjonalnie) Aby zapobiec tworzeniu się kolonii bakteryjnych na górnej powierzchni agaru, należy ułożyć warstwę wolnego od bakterii podłoża agarowego z kroku 3.6.1 na górze, zanim podłoże z kroku 3.7 całkowicie stwardnieje. Spowoduje to utworzenie strefy wolnej od bakterii w górnej części NGT-3D.</li>
		<li>W przypadku NGT-3D wlej 6,5 ml pożywki do przezroczystych plastikowych probówek o pojemności 8 ml, aby utworzyć warstwę agaru bakteryjnego, i ostrożnie dozuj 200 μl pożywki wolnej od bakterii na częściowo utwardzoną pożywkę 3D, aby utworzyć cienką warstwę wolną od bakterii na wierzchu.</li>
		<li>W przypadku NGB-3D wlej 65 ml pożywki do przezroczystej plastikowej butelki do hodowli komórkowych o średnicy 25 cm2. Ilość ta powinna wypełnić korpus butelki z kulturą komórkową o średnicy 25 cm2. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostaw komory pionowo w temperaturze pokojowej na jeden tydzień, aby kolonie bakteryjne mogły urosnąć do znacznych rozmiarów o średnicy co najmniej 1 mm.
	<ol>
		<li>(Opcjonalnie) W przypadku testu żywotności w NGT-3D przykryj komory folią aluminiową, aby zapobiec degradacji światła FUdR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zmierz przydatność populacji robaków na NGT-3D (test względnej wielkości lęgu)
<ol>
	<li>Wybierz ślimak etapowy L4 za pomocą platynowego drucianego kilofa i przenieś na wolną od bakterii płytkę NGM. Pozwól robakowi swobodnie poruszać się przez kilka minut, aby usunąć bakterie przyczepione do jego ciała.</li>
	<li>Powtórz krok 4.1 i upewnij się, że robak jest wolny od bakterii. Generalnie wystarczą dwa powtórzenia 4,1.</li>
	<li>Ostrożnie umieść czystego robaka na powierzchni nośnika 3D za pomocą platynowego drucianego szpikulca. Robak powinien w końcu dostać się do agaru do matrycy agarowej 3D.</li>
	<li>Zamknij luźno pokrywę, pozwalając trochę powietrza dostać się do probówki, ale zapobiegając wysuszeniu podłoża agarowego.</li>
	<li>Inkubować przez 96 godzin w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Po 4 dniach szczelnie zamknij pokrywki i umieść komorę hodowlaną NGT-3D w łaźni wodnej o temperaturze 88 °C, aby stopić agar. Ciepło zabija robaki, ale ich ciała pozostają nienaruszone. 
	UWAGA: Używając probówek o pojemności 8 ml do NGT-3D, zwykle wystarcza 20 - 30 minut inkubacji.</li>
	<li>Za pomocą szklanej pipety przenieś stopioną pożywkę na plastikową szalkę Petriego o średnicy 9 cm. Nie zaleca się używania plastikowych pipet, ponieważ robaki często mogą się do nich przyklejać.</li>
	<li>Używając transmisyjnego mikroskopu stereoskopowego, policz liczbę robaków w stadium L3, L4 i dorosłym. Nie licz robaków w stadium L2 i młodszych, ponieważ pokolenia F1 i F2 mogą być tutaj mylone. W związku z tym test ten jest testem względnej wielkości lęgu, a nie testem całkowitej wielkości lęgu.</li>
</ol>
5. Obraz i zapis zachowania robaka na NGB-3D
<ol>
	<li>Wybierz robaka etapowego L4 za pomocą platynowego drucianego wykałacza i usuń wszelkie bakterie przyklejone do powierzchni, przenosząc go na wolną od bakterii płytkę NGM i pozwalając mu swobodnie poruszać się przez kilka minut.</li>
	<li>Powtórz krok 5.1, aby upewnić się, że robak jest wolny od bakterii.</li>
	<li>Ostrożnie umieść czystego robaka na środku powierzchni agaru NGB-3D w pobliżu szyjki butelki za pomocą platynowego drucianego szpikulca. Robak powinien w końcu dostać się do agaru do matrycy agarowej 3D.</li>
	<li>Zamknij luźno pokrywę, pozwalając trochę powietrza dostać się do probówki, jednocześnie zapobiegając wysuszeniu podłoża agarowego.</li>
	<li>Zobrazuj lub nagraj robaka pod transmisyjnym stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym. Dostosuj ostrość, gdy robak porusza się po matrycy 3D.</li>
</ol>

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Consortium, C. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li>
<li>Choi, J. I., Yoon, K. H., Kalichamy, S. S., Yoon, S. S., Lee, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+natural+odor+attraction+between+lactic+acid+bacteria+and+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">A natural odor attraction between lactic acid bacteria and the nematode Caenorhabditis elegans.</a> ISME J. 10 (3), 558-567 (2016).</li>
<li>Gaertner, B. E., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+molecular+quantitative+genetics+and+the+systems+biology+of+natural+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Res+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation.</a> Genet Res (Camb). 92 (5-6), 331-348 (2010).</li>
<li>Cutter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+evolution+in+the+wild%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis evolution in the wild.</a> Bioessays. 37 (9), 983-995 (2015).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Felix, M. A., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The natural history of Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 20 (58), R965-R969 (2010).</li>
<li>Barriere, A., Felix, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+local+genetic+diversity+and+low+outcrossing+rate+in+Caenorhabditis+elegans+natural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations.</a> Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).</li>
<li>Lee, T. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGT-3D%3A+a+simple+nematode+cultivation+system+to+study+Caenorhabditis+elegans+biology+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">NGT-3D: a simple nematode cultivation system to study Caenorhabditis elegans biology in 3D.</a> Biol Open. 5 (4), 529-534 (2016).</li>
<li>Lewis, J. A., Flemming, J. T. Basic Culture Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLewis%2C+JA+%22Caenorhabditis+elegans.%3A+Modern+Biological+Analysis+of+an+Organism%22">Caenorhabditis elegans.: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. Epstein, H. F., Shakes, D. C. 48, 4-27 (1995).</li>
<li>Choi, S. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Violacein%3A+Properties+and+Production+of+a+Versatile+Bacterial+Pigment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Violacein: Properties and Production of a Versatile Bacterial Pigment.</a> Biomed Res Int. , 465056(2015).</li>
<li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Kwon, N., Pyo, J., Lee, S. J., Je, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+worm+tracker+for+freely+moving+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">3-D worm tracker for freely moving C. elegans.</a> PLoS One. 8 (2), e57484(2013).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).</li>
<li>Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+C.+elegans+behavioral+genetics+in+3-D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments.</a> Sci Rep. 5, 9564(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Laboratoryjna hodowla C. elegans przy użyciu klasycznych pożywek dla nicieni miała kluczowe znaczenie dla setek ważnych odkryć, które dostarczyły badania nad C. elegans . W tym miejscu przedstawiamy nowe metody hodowli C. elegans w środowisku, które dokładniej odzwierciedla ich naturalne trójwymiarowe siedliska. Chociaż do obserwacji C. elegans w 3D13 zastosowano inne metody, jest to pierwszy protokół, który pozwala na hodowlę robaków w stałej matrycy 3D. Dwie pokazane tutaj...

Badania nad nicieniem Caenorhabditis elegans w laboratorium doprowadziły do przełomowych odkryć w dziedzinie biologii w ciągu ostatnich pięciu dekad1. C. elegans był pierwszym organizmem wielokomórkowym, którego genom został zsekwencjonowany w 1998 roku2 i był nieoceniony w zrozumieniu wkładu poszczególnych genów w rozwój, fizjologię i zachowanie całego organizmu. Naukowcy starają się teraz lepiej zrozumieć, w jaki sposób geny te mogą przyczyniać się do przetrwania i sprawności reprodukcyjnej organizmów w ich naturalnym środowisku, zadając pytania dotyczące ekologii i ewolucji na poziomie genetycznym3-5. 
C. elegans po raz kolejny może dostarczyć doskonałego systemu do odpowiedzi na te pytania. Jednak niewiele wiadomo na temat biologii C. elegans w naturalnych siedliskach nicieni i nie ma obecnie metod symulacji kontrolowanych warunków naturalnych C. elegans w laboratorium. W laboratorium C. elegans jest hodowany na powierzchni płytek agarowych wysianych bakteriami E. coli 6. Jednak w naturze C. elegans i pokrewne nicienie można znaleźć rzadko zasiedlające gleby na całym świecie, ale szczególnie dobrze rozwijają się w gnijących owocach i materii wegetatywnej7,8. Te trójwymiarowe (3D) złożone środowiska znacznie różnią się od prostych środowisk 2D, na które narażone są robaki w laboratorium. 
Aby zacząć odpowiadać na pytania dotyczące biologii nicieni w bardziej naturalnym otoczeniu 3D, zaprojektowaliśmy trójwymiarowe siedlisko do laboratoryjnej hodowli nicieni, które nazwaliśmy Nematode Growth Tube 3D lub NGT-3D w skrócie9. Celem było zaprojektowanie systemu wzrostu 3D, który pozwala na porównywalny wzrost, rozwój i płodność ze standardowymi płytkami 2D z pożywką do wzrostu nicieni (NGM)10. System ten wspomaga rozwój bakterii i nicieni przez cały ich cykl życia w 3D, pozwala robakom swobodnie poruszać się i zachowywać w trzech wymiarach, a także jest łatwy i niedrogi w produkcji i użytkowaniu. 
W obecnym badaniu przedstawiamy krok po kroku metodę produkcji NGT-3D oraz oceny rozwoju i płodności robaków. Oprócz oceny sprawności robaków w 3D, staraliśmy się obrazować, nagrywać i oceniać zachowanie i fizjologię robaków w uprawie 3D. Tak więc, oprócz NGT-3D, przedstawiamy tutaj alternatywną metodę o nazwie Nematode Growth Bottle 3D lub NGB-3D, do obrazowania mikroskopowego C. elegans podczas hodowli 3D. Będzie to szczególnie ważne dla badania znanych zachowań zidentyfikowanych w 2D oraz identyfikacji nowych zachowań unikalnych dla uprawy 3D.

<table><tbody><tr><td>Rosół LB, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Difco</td><td>224620</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>DAEJUNG</td><td>7548-4400</td><td>58,44 MW</td></tr><tr><td>Agar, granulowany</td><td>Difco</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia, dwuwodny</td><td>Bio Basic</td><td>CD0050</td><td>2*H2O; 147,02 MW</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Bio Basic</td><td>CD0122</td><td>386,67 MW</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>B& J</td><td>RP090-1</td><td>99,99%; 46,07 MW</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu, bezwodny</td><td>Bio Basic</td><td>MN1988</td><td>120,37 MW</td></tr><tr><td>Fosforan potasu, jednozasadowy, bezwodny</td><td>Bio Basic</td><td>PB0445</td><td>136,09 MW</td></tr><tr><td>2'-deoksy-5-fluorourydyna</td><td>Tokio Przemysł chemiczny</td><td>D2235</td><td>246,19 MW</td></tr><tr><td>Fosforan potasu, dwuzasadowy, bezwodny</td><td>Bio Basic</td><td>PB0447</td><td>174,18 MW</td></tr><tr><td>Wielofunkcyjne probówki</td><td>Stockwell Scientific</td><td>ST.8570</td> 8 <td>ml</td></tr><tr><td>Zamknięcia probówek</td><td>Stockwell Scientific</td><td>ST.8575</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych</td><td>SPL Lifescience</td><td>70125</td><td>25 cm2</td></tr><tr><td>Research Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>Głowica kolorowego aparatu o wysokiej rozdzielczości</td><td>Nikon</td><td>DS-Fi2</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka sterująca oparta na komputerze</td><td>Nikon</td><td>DS-U3</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Badania podstawowe, oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego</td><td>Nikon</td><td>MQS32000</td><td></td></tr></tbody></table>

uprawa caenorhabditis elegans w trzech wymiarach w laboratorium

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Użycie modeli genetycznych, takich jak Caenorhabditis elegans, doprowadziło do przełomowych odkryć w biologii w ciągu ostatnich pięciu dekad. Większość tego, co wiemy o C. elegans, ogranicza się do laboratoryjnej hodowli nicieni, które niekoniecznie muszą odzwierciedlać środowisko, w którym normalnie żyją w naturze. Uprawa C. elegans w środowisku 3D, które jest bardziej podobne do matrycy 3D, którą robaki napotykają w zgniłych owocach i kompoście wegetatywnym w naturze, może ujawnić nowe fenotypy i zachowania, których nie zaobserwowano w 2D. Ponadto eksperymenty w 3D mogą sprawdzić, w jaki sposób fenotypy, które obserwujemy w 2D, są istotne dla robaka w naturze. W tym miejscu przedstawiono nową metodę, w której C. elegans rośnie i rozmnaża się normalnie w trzech wymiarach. Hodowla C. elegans w Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) może pozwolić nam zmierzyć sprawność reprodukcyjną szczepów C. elegans lub różne warunki w środowisku 3D. elegans. Przedstawiamy również nowatorską metodę, nazwaną Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), do hodowli C. elegans w 3D do analizy mikroskopowej. Metody te pozwalają naukowcom badać biologię C. elegans w warunkach, które bardziej odzwierciedlają środowiska, z którymi spotykają się w naturze. Mogą nam one pomóc w zrozumieniu nadrzędnego ewolucyjnego znaczenia fizjologii i zachowania C. elegans, które obserwujemy w laboratorium.

Konstrukcja NGT-3D jest prostym i bezpośrednim protokołem, w wyniku którego powstaje wypełniona agarem probówka z małymi koloniami bakterii rozmieszczonymi w całej masie agaru (Rycina 1A). Nicienie mogą swobodnie poruszać się w matrycy agarowej, odnajdując i konsumując kolonie bakteryjne. Aby potwierdzić, czy C. elegans może normalnie rozmnażać się i rosnąć w NGT-3D, porównano płodność i rozwój larwalny w systemie 3D ze standardowymi płytkami NGM 2D. W teście wzg...

Przedstawiamy prostą metodę budowy systemów hodowli nicieni 3D o nazwach NGT-3D i NGB-3D. Można je wykorzystać do badania sprawności i zachowań nicieni w siedliskach, które są bardziej podobne do naturalnych siedlisk Caenorhabditis elegans niż standardowe płytki hodowlane C. elegans w laboratorium 2D.

Uprawa Caenorhabditis elegans w trzech wymiarach w laboratorium

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie trójwymiarowego systemu hodowli nicieni, który może lepiej symulować warunki naturalne. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu rozwoju, fizjologii i zachowania C. elegans. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy badaliśmy naturalne zachowanie nicieni w gnijących owocach, które są środowiskiem 3D.Ta technika jest korzystna w porównaniu ze standardowymi technikami uprawy dwuwymiarowej, ponieważ nicienie żyją w siedliskach 3D w naturze. Chociaż metoda ta została opracowana w hodowli C elegans, można ją również stosować do innych nicieni. Tę procedurę zademonstruje Tong Young Lee, doktorant w moim laboratorium.Aby rozpocząć tę procedurę, Otto Clave przygotowane roztwory w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie przygotuj 50 mililitrów sterylnego roztworu cholesterolu w stężeniu 5 miligramów na mililitr. W stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów dodaj 0,25 grama cholesterolu i 50 mililitrów 99,99% etanolu i dobrze wymieszaj.Następnie wysterylizuj roztwór cholesterolu za pomocą 50-mililitrowej strzykawki z wentylowanym filtrem strzykawkowym 0,45 i usuń nierozwinięty cholesterol. Następnie zaszczep 10 mililitrów bulionu lizogenicznego bakteriami. Hoduj inokulację bakteryjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem przez noc.Przygotowując się do seryjnego rozcieńczania, należy umieścić dziewięć mililitrów roztworu chlorku sodu w siedmiu sterylnych stożkowych probówkach o pojemności 15 mililitrów. Aby zrobić namiot z siódmego krotnego rozcieńczenia Opi 50 Szczep E Coli. Następnie wylej jeden mililitr kultury bakteryjnej lub rozcieńczonej kultury bakteryjnej do nowej probówki z dziewięcioma mililitrami roztworu chlorku sodu.I dobrze zmieszaj mieszaninę. Po przygotowaniu kultury bakteryjnej dodać 0,6 grama chlorku sodu, jeden gram granulowanego ślimaka i 0,5 grama peptonu do kolby o pojemności 500 mililitrów. Umieścić mieszadło magnetyczne w kolbie.Następnie dodaj 195 mililitrów wody destylowanej i przykryj kolbę folią aluminiową. Następnie Otto Clave próbkę w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie umieścić gorącą kolbę Otto Claved na płytce mieszającej, mieszać z umiarkowaną prędkością przez co najmniej dwie godziny, aż osiągnie 40 stopni Celsjusza.Alternatywnie, kolbę można schłodzić do 40 stopni Celsjusza, umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza na 15 minut przed przeniesieniem na płytkę mieszającą. Pamiętaj, aby wystarczająco ostygnąć, kontynuując od tego miejsca. Wysoka temperatura może prowadzić do zmętnienia gotowego ślimaka, ale zbyt niska temperatura może spowodować przedwczesne stwardnienie ślimaka.Gdy temperatura pożywki ślimakowej osiągnie 40 stopni Celsjusza, dodaj chlorek wapnia, roztwór cholesterolu, siarczan magnezu i bufor fosforanu potasu i kontynuuj mieszanie roztworu. W przypadku testu żywotności NGT-3D dodaj 80 mikrolitrów 150-milimetrowego FUDR do pożywki, aby uzyskać końcowe stężenie 120 mikromolów. Następnie wyjmij sześć mililitrów pożywki ślimakowej do sterylnej stożkowej rurki i trzymaj ją w cieple w inkubatorze.To podłoże zostanie użyte do warstwy wierzchniej wolnej od bakterii. Następnie dodaj sześć mililitrów rozcieńczonej kultury bakterii do kolby bezpośrednio na wysterylizowanej ławce. W przypadku NGT-3D wlej 6,5 mililitra pożywki do ośmiomililitrowych przezroczystych plastikowych probówek, aby utworzyć warstwę ślimaka bakteryjnego.I ostrożnie dozuj 200 mikrolitrów pożywki wolnej od bakterii na półtwarde podłoże 3D, aby utworzyć cienką warstwę wolną od bakterii na wierzchu. Następnie szczelnie zamknij pokrywę komory. W przypadku NGB-3D wlej 65 mililitrów pożywki do przezroczystej plastikowej butelki do hodowli komórkowych o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych.Następnie ustaw komorę pionowo w temperaturze pokojowej na tydzień, aby kolonie bakterii mogły urosnąć do znacznych rozmiarów o średnicy co najmniej jednego milimetra. W tej procedurze wybierz czterostopniowego robaka L i przenieś go na wolną od bakterii płytkę NGM. Następnie pozwól robakowi swobodnie poruszać się przez kilka minut, aby usunąć bakterie z jego ciała.I powtórz procedurę jeszcze dwa razy. Następnie ostrożnie umieść czystego robaka na powierzchni nośnika 3D. Robak powinien był wprowadzić ślimak do matrycy ślimaka 3D.Następnie luźno zamknij pokrywę, aby inkubować przez 96 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Po czterech dniach szczelnie zamknij pokrywę i umieść komorę hodowlaną NGT-3D w łaźni wodnej o temperaturze 88 stopni Celsjusza, aby stopić ślimak. Za pomocą szklanej pipety przenieś stopioną pożywkę na dziewięciocentymetrową plastikową szalkę Petriego.Następnie, za pomocą transmisyjnego mikroskopu stereoskopowego, policz liczbę robaków w stadium L3, L4 i dorosłym. Jak pokazano tutaj, konstrukcja NGT-3D to prosty i nieskomplikowany protokół, który powoduje, że probówka wypełniona ślimakiem jest wypełniona małymi koloniami bakterii rozmieszczonymi w całym ślimaku. Aby potwierdzić, czy C elegans mogą redukować się i normalnie rosnąć w NGT-3D, płodność i rozwój larw są porównywane w 3D ze standardowymi płytkami 2D NGM.W teście względnej wielkości lęgu dorosłe hermafrodyty C. elegans w NGT-3D rozmnażały się tak samo dobrze, jak hermafrodyty na standardowych płytkach MGM 2D, gdy kolonie bakteryjne są obfite z co najmniej 60 koloniami. Co więcej, rozwój larw w NGT-3D przebiega normalnie również wtedy, gdy po 96 godzinach jest dużo kolonii bakteryjnych, a większość robaków jest w stanie dorosłym. Jeśli jednak kolonie bakteryjne są rzadkie w matrycy 3D, ma to negatywny wpływ zarówno na względną wielkość czerwiu, jak i rozwój larw.Oto krzywa przeżywalności dzikich eleganów typu C na płytkach NGT-3D lub NGM. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak testy długości życia i analiza zachowania, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące starzenia się i zachowania w 3D.Po opracowaniu, technika ta może utorować drogę naukowcom w dziedzinie genetyki do zbadania pytań dotyczących ekologii i ewolucji u C. elegans. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować nicienie w środowisku laboratoryjnym 3D.

cultivation-caenorhabditis-elegans-three-dimensions

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Petersen, C. i in., Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje izolację i hodowlę gatunków bakterii związanych z Caenorhabditis elegans. Liza C. elegans oparta na koralikach, a następnie selektywna hodowla, umożliwia izolację różnorodnych szczepów mikroorganizmów do dalszej analizy.

Izolacja i hodowla bakterii związanych z Caenorhabditis elegans

Opisujemy tutaj poprawiony protokół dla hodowli na dużą skalę embrionalnych komórek C. elegans. Embrionalne komórki C. elegans hodowane in vitro przy użyciu tej metody wydają się różnicować i rekapitulować ekspresję genów w sposób specyficzny dla komórki. Techniki, które wymagają bezpośredniego dostępu do komórek lub izolacji określonych typów komórek z innych tkanek, mogą być stosowane na komórkach hodowanych przez C. elegans.

Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

C. elegans jest zwykle uprawiany na solidnych płytkach agarowych lub w płynnych kulturach z wysiewem E. coli. Aby zapobiec zakłóceniom w badaniach toksykologicznych i żywieniowych bakteryjnych produktów ubocznych, wykorzystaliśmy płynne podłoże akseniczne, CeHR, do hodowli i synchronizacji dużej liczby robaków do szeregu dalszych zastosowań.

Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Ten protokół opisuje metodę uprawy Caenorhabditis elegans na dużą skalę na stałych podłożach. Jako alternatywa dla hodowli płynnej, protokół ten pozwala na uzyskanie parametrów o różnych skalach pod uprawą płytkową. Zwiększa to porównywalność wyników poprzez pominięcie różnic morfologicznych i metabolicznych między hodowlą pożywek płynnych i stałych.

Hodowla Caenorhabditis elegans na dużych obszarach na płytkach: przygotowanie próbki do badania zmian metabolicznych w cukrzycy

Protokół opisuje prosty mikroprzepływowy układ scalony i metodologię mikroprodukcji używaną do hodowli C. elegans w obecności ciągłego dostarczania pożywienia przez okres do 36 godzin. Urządzenie do wzrostu i obrazowania umożliwia również przerywane, długotrwałe obrazowanie procesów komórkowych i subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju przez kilka dni.

Prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych gatunków modelowych w biologii, jednak prawie wszystkie badania są prowadzone pod nieobecność naturalnie związanych z nim mikrobów. Opisane tutaj metody pomogą lepiej zrozumieć różnorodność powiązanych mikroorganizmów jako podstawę przyszłych badań funkcjonalnych nad C. elegans.

Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans

Mikrokosmosy kompostu wprowadzają do laboratorium różnorodność mikrobiologiczną występującą w naturze, aby ułatwić badania mikrobiomu u Caenorhabditis elegans. Poniżej znajdują się protokoły do przeprowadzania eksperymentów mikrokosmicznych, przy czym eksperymenty wykazują zdolność do modulowania różnorodności mikrobiologicznej środowiska w celu zbadania związków między różnorodnością mikrobiologiczną środowiska a składem mikrobiomu jelitowego robaków.

Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w mikrofabrykowanych urządzeniach wielodołkowych. Takie podejście pozwala na monitorowanie poszczególnych zwierząt przez całe życie pod kątem różnych fenotypów związanych ze starzeniem się i zdrowiem, w tym aktywności, wielkości i kształtu ciała, geometrii ruchu i przeżycia.

Długotrwała hodowla i monitorowanie izolowanych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych w urządzeniach wielodołkowych

Tutaj prezentujemy protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w celu śledzenia parametrów fizjologicznych przez całe życie i kwantyfikacji fluorescencji. Ten system hodowli obejmuje barierę kwasu palmitynowego wokół studni z pojedynczymi robakami, aby zapobiec ucieczce zwierząt, umożliwiając stosowanie interwencji awersyjnych, w tym bakterii chorobotwórczych i chemicznych czynników stresogennych.

Długotrwała hodowla poszczególnych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych do długotrwałego monitorowania fluorescencji i interwencji awersyjnych

Naucz się uprawiać Caenorhabditis elegans w systemie 3D, który lepiej symuluje naturalne warunki niż standardowe metody 2D. Ta technika pozwala badać rozwój, fizjologię i zachowanie nicieni w środowisku zbliżonym do naturalnego.

Uprawa Caenorhabditis elegans w trzech wymiarach w laboratorium

Przeglądaj więcej filmów