Uprawa Caenorhabditis elegans w trzech wymiarach w laboratorium

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie trójwymiarowego systemu hodowli nicieni, który może lepiej symulować warunki naturalne. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu rozwoju, fizjologii i zachowania C. elegans. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy badaliśmy naturalne zachowanie nicieni w gnijących owocach, które są środowiskiem 3D.

Ta technika jest korzystna w porównaniu ze standardowymi technikami uprawy dwuwymiarowej, ponieważ nicienie żyją w siedliskach 3D w naturze. Chociaż metoda ta została opracowana w hodowli C elegans, można ją również stosować do innych nicieni. Tę procedurę zademonstruje Tong Young Lee, doktorant w moim laboratorium.

Aby rozpocząć tę procedurę, Otto Clave przygotowane roztwory w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie przygotuj 50 mililitrów sterylnego roztworu cholesterolu w stężeniu 5 miligramów na mililitr. W stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów dodaj 0,25 grama cholesterolu i 50 mililitrów 99,99% etanolu i dobrze wymieszaj.

Następnie wysterylizuj roztwór cholesterolu za pomocą 50-mililitrowej strzykawki z wentylowanym filtrem strzykawkowym 0,45 i usuń nierozwinięty cholesterol. Następnie zaszczep 10 mililitrów bulionu lizogenicznego bakteriami. Hoduj inokulację bakteryjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem przez noc.

Przygotowując się do seryjnego rozcieńczania, należy umieścić dziewięć mililitrów roztworu chlorku sodu w siedmiu sterylnych stożkowych probówkach o pojemności 15 mililitrów. Aby zrobić namiot z siódmego krotnego rozcieńczenia Opi 50 Szczep E Coli. Następnie wylej jeden mililitr kultury bakteryjnej lub rozcieńczonej kultury bakteryjnej do nowej probówki z dziewięcioma mililitrami roztworu chlorku sodu.

I dobrze zmieszaj mieszaninę. Po przygotowaniu kultury bakteryjnej dodać 0,6 grama chlorku sodu, jeden gram granulowanego ślimaka i 0,5 grama peptonu do kolby o pojemności 500 mililitrów. Umieścić mieszadło magnetyczne w kolbie.

Następnie dodaj 195 mililitrów wody destylowanej i przykryj kolbę folią aluminiową. Następnie Otto Clave próbkę w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie umieścić gorącą kolbę Otto Claved na płytce mieszającej, mieszać z umiarkowaną prędkością przez co najmniej dwie godziny, aż osiągnie 40 stopni Celsjusza.

Alternatywnie, kolbę można schłodzić do 40 stopni Celsjusza, umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza na 15 minut przed przeniesieniem na płytkę mieszającą. Pamiętaj, aby wystarczająco ostygnąć, kontynuując od tego miejsca. Wysoka temperatura może prowadzić do zmętnienia gotowego ślimaka, ale zbyt niska temperatura może spowodować przedwczesne stwardnienie ślimaka.

Gdy temperatura pożywki ślimakowej osiągnie 40 stopni Celsjusza, dodaj chlorek wapnia, roztwór cholesterolu, siarczan magnezu i bufor fosforanu potasu i kontynuuj mieszanie roztworu. W przypadku testu żywotności NGT-3D dodaj 80 mikrolitrów 150-milimetrowego FUDR do pożywki, aby uzyskać końcowe stężenie 120 mikromolów. Następnie wyjmij sześć mililitrów pożywki ślimakowej do sterylnej stożkowej rurki i trzymaj ją w cieple w inkubatorze.

To podłoże zostanie użyte do warstwy wierzchniej wolnej od bakterii. Następnie dodaj sześć mililitrów rozcieńczonej kultury bakterii do kolby bezpośrednio na wysterylizowanej ławce. W przypadku NGT-3D wlej 6,5 mililitra pożywki do ośmiomililitrowych przezroczystych plastikowych probówek, aby utworzyć warstwę ślimaka bakteryjnego.

I ostrożnie dozuj 200 mikrolitrów pożywki wolnej od bakterii na półtwarde podłoże 3D, aby utworzyć cienką warstwę wolną od bakterii na wierzchu. Następnie szczelnie zamknij pokrywę komory. W przypadku NGB-3D wlej 65 mililitrów pożywki do przezroczystej plastikowej butelki do hodowli komórkowych o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych.

Następnie ustaw komorę pionowo w temperaturze pokojowej na tydzień, aby kolonie bakterii mogły urosnąć do znacznych rozmiarów o średnicy co najmniej jednego milimetra. W tej procedurze wybierz czterostopniowego robaka L i przenieś go na wolną od bakterii płytkę NGM. Następnie pozwól robakowi swobodnie poruszać się przez kilka minut, aby usunąć bakterie z jego ciała.

I powtórz procedurę jeszcze dwa razy. Następnie ostrożnie umieść czystego robaka na powierzchni nośnika 3D. Robak powinien był wprowadzić ślimak do matrycy ślimaka 3D.

Następnie luźno zamknij pokrywę, aby inkubować przez 96 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Po czterech dniach szczelnie zamknij pokrywę i umieść komorę hodowlaną NGT-3D w łaźni wodnej o temperaturze 88 stopni Celsjusza, aby stopić ślimak. Za pomocą szklanej pipety przenieś stopioną pożywkę na dziewięciocentymetrową plastikową szalkę Petriego.

Następnie, za pomocą transmisyjnego mikroskopu stereoskopowego, policz liczbę robaków w stadium L3, L4 i dorosłym. Jak pokazano tutaj, konstrukcja NGT-3D to prosty i nieskomplikowany protokół, który powoduje, że probówka wypełniona ślimakiem jest wypełniona małymi koloniami bakterii rozmieszczonymi w całym ślimaku. Aby potwierdzić, czy C elegans mogą redukować się i normalnie rosnąć w NGT-3D, płodność i rozwój larw są porównywane w 3D ze standardowymi płytkami 2D NGM.

W teście względnej wielkości lęgu dorosłe hermafrodyty C. elegans w NGT-3D rozmnażały się tak samo dobrze, jak hermafrodyty na standardowych płytkach MGM 2D, gdy kolonie bakteryjne są obfite z co najmniej 60 koloniami. Co więcej, rozwój larw w NGT-3D przebiega normalnie również wtedy, gdy po 96 godzinach jest dużo kolonii bakteryjnych, a większość robaków jest w stanie dorosłym. Jeśli jednak kolonie bakteryjne są rzadkie w matrycy 3D, ma to negatywny wpływ zarówno na względną wielkość czerwiu, jak i rozwój larw.

Oto krzywa przeżywalności dzikich eleganów typu C na płytkach NGT-3D lub NGM. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak testy długości życia i analiza zachowania, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące starzenia się i zachowania w 3D.

Po opracowaniu, technika ta może utorować drogę naukowcom w dziedzinie genetyki do zbadania pytań dotyczących ekologii i ewolucji u C. elegans. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować nicienie w środowisku laboratoryjnym 3D.