Name: Analiza integralności bezkomórkowego DNA w próbkach moczu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj metodę analizy integralności bezkomórkowego DNA w moczu do wczesnego wykrywania raka pęcherza moczowego i gruczołu krokowego. Technika ta jest nieinwazyjna i łatwa do wykonania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Gráinne Tierney i Silvii Bellissimo za pomoc redakcyjną.

Protokół jest zgodny z wytycznymi Komitetu Etyki Badań Naukowych na Ludziach IRST.
UWAGA: W tym protokole wyizolowaliśmy DNA z próbek moczu, aby przeprowadzić analizę integralności DNA UCF. Do skonstruowania wzorców wykorzystano linie komórkowe Lncap i MRC. Przeprowadzono takie techniki, jak ekstrakcja DNA, kwantyfikacja DNA (spektrofotometr i PCR w czasie rzeczywistym dla genu kontrolnego, STOX1) oraz PCR w czasie rzeczywistym dla określonych onkogenów (ryc. 1).
1. Zbieranie i przetwarzanie moczu
<ol>
	<li>Uzyskaj czystą próbkę moczu pierwszego ranka w czystym, suchym, plastikowym kubku. Zebrać co najmniej 50 ml próbki moczu.</li>
	<li>Utrzymać mocz w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 3 godziny i przesłać go do laboratorium w tej samej temperaturze.</li>
	<li>Wymieszać każdą próbkę, odwracając ją dwukrotnie natychmiast po przybyciu do laboratorium i przenieść do dwóch probówek polipropylenowych o pojemności 50 ml ze stożkowym dnem.</li>
	<li>Odwirować probówki o masie 850 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C lub w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść 10 ml górnej części supernatantu moczu do dwóch probówek o pojemności 5 ml, pozostawiając co najmniej 2 ml supernatantu nad osadem komórkowym. 
	UWAGA: Przeniesienie górnej części supernatantu zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia komórkami lub resztkami komórkowymi. Nie ma wyraźnego rozgraniczenia między górną a dolną częścią.</li>
	<li>Wyrzucić osad i natychmiast zamrozić supernatant w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
2. Izolacja DNA z supernatantu moczu i linii komórkowych
UWAGA: Wyizoluj DNA z linii komórkowej (np. Lncap dla raka prostaty lub MRC dla raka pęcherza moczowego) za pomocą zestawu komercyjnego i postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Izolację DNA z supernatantu moczu należy przeprowadzić przy użyciu protokołu handlowego, zmodyfikowanego w następujący sposób:
<ol>
	<li>Rozmrozić jedną porcję supernatantu moczu w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować i wymieszać próbkę moczu i przenieść 1 ml supernatantu moczu do przezroczystej probówki o pojemności 5 ml. Zamrozić resztki moczu w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Dodać 100 μl proteinazy k bezpośrednio do próbki.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu AL do próbki i dobrze wymieszać przez pipetowanie.</li>
	<li>Zamknąć probówki i inkubować próbki w temperaturze 56 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Podczas inkubacji należy przygotować jedną kolumnę na każdą próbkę i przygotować płuczące AW1 i AW2 zgodnie z instrukcjami producenta (dodać wskazaną ilość 100% etanolu).</li>
	<li>Doprowadź próbki z powrotem do temperatury pokojowej i dodaj 1 ml absolutnego alkoholu etylowego. Całkowicie wymieszać przez pipetowanie.</li>
	<li>Dodać 650 μl mieszaniny otrzymanej w kroku 2.7 do kolumny i odwirować ją przy 6 000 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Wyrzucić probówkę zawierającą przepływowy i umieścić kolumnę na nowej, czystej probówce zbiorczej. Powtarzać kroki 2.8 i 2.9 aż do całkowitego zużycia mieszaniny próbki (5 razy).</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu AW1 bez zwilżania krawędzi kolumny. Odwirować przy 6 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Wyrzuć probówkę zawierającą przepływ i zastąp ją nową, czystą probówką zbiorczą.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu AW2 bez zwilżania krawędzi kolumny. Odwirować z pełną prędkością (20 000 x g) przez 3 minuty.</li>
	<li>Wyrzuć probówkę zawierającą przepływ i zastąp ją nową, czystą probówką zbiorczą.</li>
	<li>Powtórz krok 2.12, aby usunąć resztki buforu myjącego.</li>
	<li>Umieść kolumnę w czystej probówce o pojemności 1.5 ml. Dodać 50 μl buforu elucyjnego AE i odczekać 7 minut, aby upewnić się, że bufor zwilży kolumnę.</li>
	<li>Odwirować go przy 8 000 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Odpipetować eluent z kroku 2.15 do minikolumny i odwirować go z maksymalną prędkością przez 1 minutę, aby zapewnić maksymalne odzyskanie DNA.</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja i rozcieńczanie DNA
<ol>
	<li>Za pomocą spektrofotometru przeprowadzić kwantyfikację DNA zarówno z linii komórkowej, jak i próbek supernatantu moczu. Użyj 2 μl próbki na spektrometrze laboratoryjnym, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbki DNA UCF do uzyskania stężenia 1 ng/μl i przechowywać DNA w temperaturze -20 °C do czasu analizy integralności DNA. 
	UWAGA: Jeśli ilość DNA nie jest wystarczająca do przeprowadzenia PCR w czasie rzeczywistym (co najmniej 100 ng), wykonaj nowy proces izolacji DNA.</li>
	<li>Rozcieńczyć DNA z próbek linii komórkowych, aby uzyskać sześć wzorców o różnych stężeniach: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 i 2 ng/μl, każdy o objętości 100 μl (st1, st2, st3, st4, st5 i st6). Wzorce DNA linii komórkowej należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy integralności DNA.</li>
</ol>
4. Test integralności DNA — PCR
<ol>
	<li>Rozmrozić startery (stężenie zależy od rodzaju testu), zielony supermix, wzorce DNA linii komórkowej i próbki rozcieńczone DNA UCF na lodzie.</li>
	<li>Przygotować probówki paskowe w płytce dla 72-dołkowej tarczy wirnika. Podwielokrotność 10 μl w dwóch egzemplarzach dla każdej próbki wzorcowej i rozcieńczonej oraz 10 μl wody wolnej od RNaz dla kontroli ujemnej.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę 1 μl każdego startera (stężenia podano w tabeli 1), 12,5 μl zielonego supermiksu i 6,5 μl wody wolnej od RNaz dla każdej próbki. Przygotowując mieszaninę, należy użyć następującej liczby próbek: 6 wzorców dla 2 kontrprób, liczba próbek dla 2 powtórzeń, kontrola ujemna dla 2 kontrprób i 2 dodatkowe próbki.</li>
	<li>Podatkować 15 μl mieszanki do każdego dołka. Nie pipetować ani nie obracać probówek.</li>
	<li>Rozpocznij protokół od warunków PCR wskazanych w tabeli 1. 
	UWAGA: W przypadku wartości DNA UCF 29 próbek DNA przetworzono dla każdego eksperymentu w czasie rzeczywistym przy użyciu 72-dołkowej tarczy wirnika: 29 x 2 próbki + 6 x 2 wzorce + kontrola ujemna x 2 = 72 (wartość UCF DNA). 
	UWAGA: Protokół analizy integralności DNA UCF można również wykonać przy użyciu innego przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym (w przypadku korzystania z innego urządzenia może być konieczne dodanie barwnika ROX).</li>
</ol>
5. Test integralności DNA — analiza i interpretacja danych
UWAGA: Wartość DNA UCF dla każdej próbki została uzyskana przez oprogramowanie systemu wykrywania w czasie rzeczywistym przy użyciu standardowej konstrukcji krzywej dla każdej indywidualnej oceny genu PCR i przy użyciu standardowej interpolacji krzywej, jak opisano wcześniej7-9 (Rysunek 2).
<ol>
	<li>Ocenić kontrpróby; próbki z różnicą ≥1 Ct muszą zostać odrzucone i ponownie ocenione w drugim doświadczeniu.</li>
	<li>Obliczyć medianę Ct dla każdej próbki i rozważyć próbki o wartości Ct ≤ 36.</li>
	<li>Oceń specyficzność produktów PCR za pomocą analizy topnienia.</li>
	<li>Ocenić stężenie każdego amplikonu przez interpolację z krzywą wzorcową; uzyskać wartość stężenia (ng/μl) dla każdego amplikonu.</li>
</ol>

<ol><li>Francis, G., Stein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Cell-Free+Tumour+DNA+in+the+Management+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Mol.Sci%22%5BJournal%5D)">Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer.</a> Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).</li>
<li>Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Nucleic+Acids+in+Urine%3A+Sources%2C+Structure%2C+Diagnostic+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential.</a> Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).</li>
<li>Szarvas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+analysis+of+tumor+and+urinary+DNA+to+detect+bladder+cancer%3A+urine+supernatant+versus+urine+sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.Rep%22%5BJournal%5D)">Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment.</a> Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).</li>
<li>Togneri, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+complexity+of+urothelial+bladder+cancer+revealed+in+urinary+cfDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Hum.Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA.</a> Eur.J.Hum.Genet. , (2016).</li>
<li>Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+DNA+Integrity%2C+Applications+for+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Clin.Chem%22%5BJournal%5D)">Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research.</a> Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).</li>
<li>Hao, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+DNA+in+serum+as+a+biomarker+for+diagnosis+and+prognostic+prediction+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer.</a> Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+Cell-Free+DNA+Integrity+Analysis+for+Early+Detection+of+Prostate+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.Markers%22%5BJournal%5D)">Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients.</a> Dis.Markers. 2015, 574120(2015).</li>
<li>Casadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+cell-free+DNA+integrity+as+a+marker+for+early+prostate+cancer+diagnosis%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.Res.Int%22%5BJournal%5D)">Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study.</a> Biomed.Res.Int. 2013, 270457(2013).</li>
<li>Casadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+cell-free+DNA+integrity+as+a+marker+for+early+bladder+cancer+diagnosis%3A+preliminary+data%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.Oncol%22%5BJournal%5D)">Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data.</a> Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li>
<li>Ishkanian, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+array+CGH+identifies+novel+regions+of+genomic+alteration+in+intermediate-risk+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer.</a> Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).</li>
<li>Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Her-2%2Fneu+oncogene+amplification+in+clinically+localised+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Patho%22%5BJournal%5D)">Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer.</a> J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).</li>
<li>Nord, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+amplifications+are+associated+with+high+grade+and+recurrences+in+stage+Ta+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma.</a> Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).</li>
<li>Tabach, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+the+20q+chromosomal+arm+occurs+early+in+tumorigenic+transformation+and+may+initiate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer.</a> PLoS One. 6 (1), e14632(2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Analiza integralności DNA UCF jest nową, nieinwazyjną metodą oceny integralności DNA w moczu. Niedawno zaproponowano go do wczesnej diagnostyki raka pęcherza moczowego9 i raka prostaty7,8. Omówiono tutaj szereg zalet i wad testu integralności DNA UCF, wraz z perspektywami na przyszłość.
Główną zaletą tego podejścia jest to, że oferuje niedrogą, nieinwazyjną metodę i prosty protokół badania moczu jako potencjalnego źródła biomarkerów, wymagający jedynie podstawowej wiedzy ...

Bezkomórkowe DNA można wykryć we krwi i moczu z powodu śmierci komórki w wyniku mechanizmów apoptotycznych lub nekrotycznych. Bezkomórkowe DNA we krwi jest szeroko badane w celach diagnostycznych i prognostycznych, w różnych chorobach, zwłaszcza w raku1. Jednak mniej wiadomo na temat roli DNA wolnego od komórek moczowych (UCF). DNA UCF może pochodzić z krwi przechodzącej przez system filtracji kłębuszkowej lub z komórek, które mają bezpośredni kontakt z tym płynem ustrojowym 2 (np. komórki urotelialne lub komórki gruczołu krokowego). Wykorzystanie DNA UCF jako źródła biomarkerów było badane głównie pod kątem wczesnej diagnozy raka nerki, pęcherza moczowego i prostaty ze względu na wysoki odsetek DNA UCF pochodzącego bezpośrednio z komórek dróg moczowych3,4.
Niewiele wiadomo o DNA UCF i najlepszych metodach jego izolowania i charakteryzowania. Biorąc pod uwagę hipotezę, że komórki nowotworowe uwalniają dłuższe fragmenty DNA niż normalne komórki, zbadano ocenę integralności DNA bez komórek w celu wyjaśnienia pochodzenia DNA w krążeniu krwi5. Niektóre badania wykazały, że bezkomórkowa integralność DNA we krwi stanowi dobry test diagnostyczny dla wielu rodzajów raka6 i ta sama hipoteza została zaproponowana w odniesieniu do moczu7-9.
Ten artykuł opisuje nową metodę analizy integralności DNA UCF z potencjalnym zastosowaniem do wykrywania raka pęcherza moczowego i prostaty. W szczególności integralność fragmentów DNA UCF dłuższych niż 250 pz badano w 4 regionach, o których wiadomo, że mają zwiększoną liczbę kopii DNA w guzach litych, w tym raku prostaty i pęcherza moczowego: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1), BCAS1 (20q13.2) i AR (Xq12)10-14. Wybrano konkretne onkogeny, a nie losowe sekwencje, aby zwiększyć prawdopodobieństwo ich znalezienia we frakcji bezkomórkowej pacjentów z rakiem. Jedną z głównych zalet tej metody jest to, że jest elastyczna i że inne regiony można również wybrać na podstawie rodzaju i cech guza.

<table><tbody><tr><td>Mini zestaw QIAamp DNA &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&nbsp; Zielony Supermix, 100 x 50 &mikro; L rxns, 2,5 ml (2 x 1,25 mL)</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>IDT niestandardowe oligonukleotydy DNA&nbsp;</td><td>IDT&nbsp;</td><td></td><td>Oczyszczanie HPLC, spektrofotometr 100nMole DNA oligo</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Inne metody spektrofotometryczne mogą być również wykorzystane do ilościowego oznaczania DNA</td></tr><tr><td>Rotor-Gene 6000</td><td>Corbett</td><td></td><td>Można również użyć innego instrumentu do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr>, jednej <tr><td>wirówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>do probówek</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>o pojemności 50 ml<td>inkubator-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C zamrażarka-20</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C zamrażarka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &#956; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &#956; Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>200 &#956; Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>1,000 &#956; Końcówki do pipet</td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>(10; 20; 200; 1,000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml Probówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Rotor-Disc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>72 Rotor</td><td></td><td>Corbett 9018899</td><td></td></tr><tr><td>Probówki paskowe i nakrętki, 0,1 ml (250)</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td></td></tr><tr><td>Probówki zbiorcze (2 ml)</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td></td></tr><tr><td>Bufor AL (264 ml)</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K (10 ml)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza integralności bezkomórkowego dna w próbkach moczu

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Chociaż obecność krążącego bezkomórkowego DNA w osoczu lub surowicy została powszechnie uznana za odpowiednie źródło biomarkerów dla wielu typów raka, niewiele badań skupiało się na potencjalnym wykorzystaniu DNA bezkomórkowego w moczu (UCF). Wychodząc od hipotezy, że normalne komórki apoptotyczne wytwarzają wysoce rozdrobnione DNA i że komórki nowotworowe uwalniają dłuższe DNA, oceniono potencjalną rolę integralności DNA UCF jako wczesnego markera diagnostycznego zdolnego do rozróżnienia pacjentów z rakiem prostaty lub pęcherza moczowego od osób zdrowych.
Analiza integralności DNA UCF jest proponowana na podstawie czterech ilościowych PCR w czasie rzeczywistym czterech sekwencji dłuższych niż 250 pz: c-MYC, BCAS1, HER2 i AR. Do analizy wybrano sekwencje, które często mają zwiększoną liczbę kopii DNA w raku pęcherza moczowego i prostaty, ale metoda jest elastyczna i geny te można zastąpić innymi genami będącymi przedmiotem zainteresowania. Potencjalna użyteczność UCF DNA jako źródła biomarkerów została już wykazana w przypadku nowotworów urologicznych, torując w ten sposób drogę do dalszych badań nad charakterystyką DNA UCF. Test integralności DNA UCF ma tę zaletę, że jest nieinwazyjny, szybki i łatwy do wykonania, a do przeprowadzenia analizy potrzeba tylko kilku mililitrów moczu.

Całkowite stężenie wolnego DNA było mierzalne spektrofotometrycznie dla wszystkich analizowanych próbek i mieściło się w zakresie od 1,51 do 138 ng/µL. W celu zapewnienia powtarzalności danych wykorzystano pięć próbek kontrolnych: przeprowadzono dwa niezależne eksperymenty w czasie rzeczywistym dla c-MYC, HER2, BCAS1, AR oraz STOX1. Następnie obliczono współczynniki zmienności (CV) dla każdego genu (Tabela 2), stwierdzając dobr...

Zaproponowano metodę analizy integralności DNA w bezkomórkowej frakcji supernatantu próbek moczu. Metoda ta nadaje się do wczesnego wykrywania nowotworów urologicznych i okazała się skuteczna we wczesnej diagnostyce raka pęcherza moczowego.

Analiza integralności bezkomórkowego DNA w próbkach moczu

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Ogólnym celem tej metody jest ocena integralności DNA wolnego od komórek moczu w określonych sekwencjach onkogenów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nowotworów urologicznych, takie jak wczesna nieinwazyjna diagnoza raka pęcherza moczowego i prostaty. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa do wykonania i analizy.Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę nowotworów urologicznych, ponieważ zwykle uwalniają one komórki i wolne kwasy nukleinowe w moczu. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w próbki moczu, może być również stosowana do innych systemów, takich jak surowica lub osocze. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, miałyby trudności, ponieważ stężenie DNA wolnego od komórek moczu jest często niskie.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy znaleźć prostą metodę nieinwazyjnego wczesnego wykrywania raka pęcherza moczowego. Aby rozpocząć procedurę, należy pobrać 50-mililitrową czystą próbkę moczu z pierwszego ranka, która była przechowywana w temperaturze czterech stopni Celsjusza nie dłużej niż trzy godziny. Odwróć próbkę dwukrotnie, a następnie podziel próbkę na dwie stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 mililitrów.Odwirować próbkę w temperaturze 850 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie na każdą probówkę przenieś 10 mililitrów górnej części supernatantu do dwóch pięciomililitrowych probówek, pozostawiając co najmniej dwa mililitry supernatantu nad osadem. Wyrzuć granulki i przechowuj supernatant w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.W razie potrzeby powtórz ten proces, aby pobrać dodatkowe próbki moczu. Aby rozpocząć oczyszczanie DNA, dla każdej próbki należy rozmrozić porcję supernatantu moczu. Odwirować rozmrożoną próbkę i dwukrotnie odwrócić probówkę.Umieść jeden mililitr próbki w pięciomililitrowej probówce, a pozostałą część przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przygotuj zestaw do oczyszczania DNA odpowiedni do próbek moczu zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać 100 mikrolitrów proteinazy K i jeden mililitr buforu do lizy do próbki i dobrze wymieszać pipetą.Inkubować próbkę w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 15 minut. Podczas inkubacji przygotować płuczące w kolumnie wirowej. Po inkubacji pozostawić próbkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie dodać jeden mililitr absolutnego alkoholu etylowego i dobrze wymieszać przez pipetowanie.Przenieść 650 mikrolitrów próbki do kolumny. Wirować w temperaturze 6000 razy G przez jedną minutę. Wymień probówkę zbiorczą i powtarzaj ten proces, aż cała próbka zostanie załadowana do kolumny.Następnie dodać 500 mikrolitrów pierwszego buforu do przemywania i odwirować kolumnę przy 6000 razy G przez jedną minutę. Wymień probówkę zbiorczą, dodaj 500 mikrolitrów drugiego buforu do przemywania i odwiruj kolumnę z maksymalną prędkością przez trzy minuty. Umieść kolumnę w czystej probówce zbiorczej i wiruj z maksymalną prędkością przez kolejne trzy minuty, aby usunąć resztki buforu do płukania.Przenieś kolumnę do czystej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Załadować 50 mikrolitrów buforu elucyjnego do kolumny i pozostawić bufor do wchłonięcia się w kolumnę przez siedem minut. Następnie odwirować kolumnę pod ciśnieniem 6000 razy G przez jedną minutę.Odpipetować eluat z powrotem do kolumny i odwirować kolumnę z maksymalną prędkością przez jedną minutę, aby uzyskać DNA wolne od komórek moczu. Aby rozpocząć przygotowywanie wzorców, należy najpierw wyizolować DNA z odpowiedniej linii komórkowej za pomocą zestawu do oczyszczania. Określ ilościowo DNA z każdej oczyszczonej próbki moczu w linii komórkowej za pomocą spektrofotometru zgodnie z instrukcjami producenta zestawu.Rozcieńczyć DNA UCF do jednego nanograma na mikrolitr i przechowywać rozcieńczone próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do testu integralności. Rozcieńczyć DNA linii komórkowej, aby utworzyć sześć 100 mikrolitrowych wzorców o różnych stężeniach. Przechowuj wzorce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Aby rozpocząć test integralności DNA, rozmrozić próbki DNA UCF, wzorce, odpowiednie startery PCR i zielony supermix na lodzie. Następnie ustaw 72-dołkową płytę tarczy wirnika z rurkami paskowymi. Umieść dwie podwielokrotności wzorca o objętości 10 mikrolitrów, a następnie każdą próbkę w studzienkach.Przygotuj dwie studzienki z 10 mikrolitrami wody wolnej od RNaz jako kontrole negatywne. Dla każdej napełnionej studzienki przygotuj mieszankę jednego mikrolitra każdego podkładu, 12,5 mikrolitra zielonego supermiksu i 6,5 mikrolitra wody wolnej od RNaz. Przenieś 15 mikrolitrów mieszanki do każdej napełnionej studzienki, a następnie przenieś studzienki do 72-dołkowej tarczy wirnika.Wykonaj PCR za pomocą przyrządu działającego w czasie rzeczywistym zgodnie ze specyfikacją producenta. Korzystając z oprogramowania przyrządu, sprawdź, czy w przypadku jakichkolwiek powtórzeń różnica wartości progowych cykliczności wynosi jeden lub więcej. Próbki należy odrzucić z analizy i ocenić średni próg cykliczny dla pozostałych próbek.Przeprowadzić analizę topnienia na każdej próbce o medianie wartości progowej cyklu wynoszącej 36 lub mniej, aby ocenić swoistość produktu PCR. Następnie użyj krzywej standardowej, aby określić stężenie w nanogramach na mikrolitr dla każdego zastosowania. Wyizolowano DNA wolne od komórek moczu, a integralność DNA oceniono w czterech regionach, które wykazują zwiększoną liczbę kopii DNA w guzach litych.Oceniono również sekwencję kontrolną w celu sprawdzenia, czy ilość DNA w każdej próbce jest wystarczająca do przeprowadzenia testu integralności. Dla każdego genu obliczono całkowite stężenie wolnego DNA oraz współczynniki zmienności. Metoda ta wykazuje 73%czułość i 84%swoistość w wykrywaniu raka pęcherza moczowego, ale tylko 58%czułość i 44%swoistość w przypadku raka prostaty.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego dnia roboczego, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak cyfrowy PCR lub sekwencjonowanie nowej generacji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak induktor liczby kopii interesujących genów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak w bardzo prosty sposób wyizolować wolne DNA z komórek i jak badać integralność określonych regionów zainteresowania za pomocą metod PCR w czasie rzeczywistym.

cell-free-dna-integrity-analysis-in-urine-samples

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Prezentowany zestaw diagnostyczny FL-DNA to oszczędzająca czas i przyjazna dla użytkownika metoda określania wiarygodnego prawdopodobieństwa wystąpienia zmian rakowych jelita grubego.

Ocena ryzyka i rozpowszechnienia raka jelita grubego za pomocą wykrywania integralności DNA kału

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Opisujemy tutaj metody czułego i dokładnego oznaczania zmian 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxodGuo), 1,N 6-etheno-2'-deoksyadenozyny (1,N 6-dAdo) i 1,N 2-etheno-2'-deoksyguanozyny (1,N 2-dGuo) w DNA. Metody te zastosowano do oceny wpływu drobnego pyłu zawieszonego (PM2,5) w tkankach (płuca, wątroba i nerki) narażonych myszy A/J.

Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół techniki nieinwazyjnej płynnej biopsji, w tym pobieranie krwi, separację osocza i kożucha, ekstrakcję cfDNA i DNA linii zarodkowej, kwantyfikację cfDNA lub DNA linii zarodkowej oraz analizę wzbogacania fragmentów cfDNA.

Wykrywanie bezkomórkowego DNA w próbkach osocza krwi pacjentów z rakiem

Nieoznakowana, nieradio-izotopowa metoda oznaczania aktywności glikozylazy uracylo-DNA została opracowana przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF do bezpośredniej analizy produktu zawierającego miejsce apurinowe/apirymidynowe. Test okazał się dość prosty, specyficzny, szybki i łatwy w użyciu do pomiaru glikozylazy DNA.

Test glikozylazy uracylo-DNA za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Test kometarny jest popularnym sposobem wykrywania uszkodzeń DNA. W tym badaniu opisano podejście do przeprowadzania slajdów w reprezentatywnych wariantach testu komety. Takie podejście znacznie zwiększyło liczbę próbek przy jednoczesnym skróceniu czasu trwania testu, liczby manipulacji szkiełkami i ryzyka uszkodzenia żeli.

Wysokoprzepustowy test kometowy do oceny uszkodzeń DNA komórkowego

Płynna biopsja zrewolucjonizowała nasze podejście do badań translacyjnych w onkologii, a pobieranie, jakość i przechowywanie próbek są kluczowymi krokami dla jej udanego zastosowania klinicznego. W tym miejscu opisujemy ustandaryzowany i zwalidowany protokół dla dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia, który może być stosowany w większości laboratoriów badań translacyjnych.

Standaryzowany protokół przedanalityczny do biopsji płynnej do dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia

Ten protokół opisuje wieloanalitowy test syntetycznego biomarkera moczu za pośrednictwem CRISPR-Cas, który umożliwia diagnostykę raka w miejscu opieki nad pacjentem poprzez analizę ex vivo aktywności proteazy związanej z nowotworem.

Multianalitowy test syntetycznego biomarkera moczu za pośrednictwem CRISPR-Cas do przenośnej diagnostyki

Protokół ten opisuje zautomatyzowany, akredytowany przez ISO15189 proces sekwencjonowania nowej generacji do wykrywania celowanych zmian genomowych w tkankach formalinowych osadzonych w parafinie tkankach raka płuc niedrobnokomórkowych (NSCLC).

Wykrywanie celowalnych zmian w niedrobnokomórkowym raku płuc za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Poznaj metodę analizy integralności bezkomórkowego DNA w moczu do wczesnego wykrywania raka pęcherza moczowego i gruczołu krokowego. Technika ta jest nieinwazyjna i łatwa do wykonania.

Analiza integralności bezkomórkowego DNA w próbkach moczu

Przeglądaj więcej filmów