Analiza integralności bezkomórkowego DNA w próbkach moczu
5 stycznia 2017
Zaproponowano metodę analizy integralności DNA w bezkomórkowej frakcji supernatantu próbek moczu. Metoda ta nadaje się do wczesnego wykrywania nowotworów urologicznych i okazała się skuteczna we wczesnej diagnostyce raka pęcherza moczowego.
Ogólnym celem tej metody jest ocena integralności DNA wolnego od komórek moczu w określonych sekwencjach onkogenów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nowotworów urologicznych, takie jak wczesna nieinwazyjna diagnoza raka pęcherza moczowego i prostaty. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa do wykonania i analizy.
Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę nowotworów urologicznych, ponieważ zwykle uwalniają one komórki i wolne kwasy nukleinowe w moczu. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w próbki moczu, może być również stosowana do innych systemów, takich jak surowica lub osocze. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, miałyby trudności, ponieważ stężenie DNA wolnego od komórek moczu jest często niskie.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy znaleźć prostą metodę nieinwazyjnego wczesnego wykrywania raka pęcherza moczowego. Aby rozpocząć procedurę, należy pobrać 50-mililitrową czystą próbkę moczu z pierwszego ranka, która była przechowywana w temperaturze czterech stopni Celsjusza nie dłużej niż trzy godziny. Odwróć próbkę dwukrotnie, a następnie podziel próbkę na dwie stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 mililitrów.
Odwirować próbkę w temperaturze 850 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie na każdą probówkę przenieś 10 mililitrów górnej części supernatantu do dwóch pięciomililitrowych probówek, pozostawiając co najmniej dwa mililitry supernatantu nad osadem. Wyrzuć granulki i przechowuj supernatant w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
W razie potrzeby powtórz ten proces, aby pobrać dodatkowe próbki moczu. Aby rozpocząć oczyszczanie DNA, dla każdej próbki należy rozmrozić porcję supernatantu moczu. Odwirować rozmrożoną próbkę i dwukrotnie odwrócić probówkę.
Umieść jeden mililitr próbki w pięciomililitrowej probówce, a pozostałą część przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przygotuj zestaw do oczyszczania DNA odpowiedni do próbek moczu zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać 100 mikrolitrów proteinazy K i jeden mililitr buforu do lizy do próbki i dobrze wymieszać pipetą.
Inkubować próbkę w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 15 minut. Podczas inkubacji przygotować płuczące w kolumnie wirowej. Po inkubacji pozostawić próbkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie dodać jeden mililitr absolutnego alkoholu etylowego i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
Przenieść 650 mikrolitrów próbki do kolumny. Wirować w temperaturze 6000 razy G przez jedną minutę. Wymień probówkę zbiorczą i powtarzaj ten proces, aż cała próbka zostanie załadowana do kolumny.
Następnie dodać 500 mikrolitrów pierwszego buforu do przemywania i odwirować kolumnę przy 6000 razy G przez jedną minutę. Wymień probówkę zbiorczą, dodaj 500 mikrolitrów drugiego buforu do przemywania i odwiruj kolumnę z maksymalną prędkością przez trzy minuty. Umieść kolumnę w czystej probówce zbiorczej i wiruj z maksymalną prędkością przez kolejne trzy minuty, aby usunąć resztki buforu do płukania.
Przenieś kolumnę do czystej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Załadować 50 mikrolitrów buforu elucyjnego do kolumny i pozostawić bufor do wchłonięcia się w kolumnę przez siedem minut. Następnie odwirować kolumnę pod ciśnieniem 6000 razy G przez jedną minutę.
Odpipetować eluat z powrotem do kolumny i odwirować kolumnę z maksymalną prędkością przez jedną minutę, aby uzyskać DNA wolne od komórek moczu. Aby rozpocząć przygotowywanie wzorców, należy najpierw wyizolować DNA z odpowiedniej linii komórkowej za pomocą zestawu do oczyszczania. Określ ilościowo DNA z każdej oczyszczonej próbki moczu w linii komórkowej za pomocą spektrofotometru zgodnie z instrukcjami producenta zestawu.
Rozcieńczyć DNA UCF do jednego nanograma na mikrolitr i przechowywać rozcieńczone próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do testu integralności. Rozcieńczyć DNA linii komórkowej, aby utworzyć sześć 100 mikrolitrowych wzorców o różnych stężeniach. Przechowuj wzorce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.
Aby rozpocząć test integralności DNA, rozmrozić próbki DNA UCF, wzorce, odpowiednie startery PCR i zielony supermix na lodzie. Następnie ustaw 72-dołkową płytę tarczy wirnika z rurkami paskowymi. Umieść dwie podwielokrotności wzorca o objętości 10 mikrolitrów, a następnie każdą próbkę w studzienkach.
Przygotuj dwie studzienki z 10 mikrolitrami wody wolnej od RNaz jako kontrole negatywne. Dla każdej napełnionej studzienki przygotuj mieszankę jednego mikrolitra każdego podkładu, 12,5 mikrolitra zielonego supermiksu i 6,5 mikrolitra wody wolnej od RNaz. Przenieś 15 mikrolitrów mieszanki do każdej napełnionej studzienki, a następnie przenieś studzienki do 72-dołkowej tarczy wirnika.
Wykonaj PCR za pomocą przyrządu działającego w czasie rzeczywistym zgodnie ze specyfikacją producenta. Korzystając z oprogramowania przyrządu, sprawdź, czy w przypadku jakichkolwiek powtórzeń różnica wartości progowych cykliczności wynosi jeden lub więcej. Próbki należy odrzucić z analizy i ocenić średni próg cykliczny dla pozostałych próbek.
Przeprowadzić analizę topnienia na każdej próbce o medianie wartości progowej cyklu wynoszącej 36 lub mniej, aby ocenić swoistość produktu PCR. Następnie użyj krzywej standardowej, aby określić stężenie w nanogramach na mikrolitr dla każdego zastosowania. Wyizolowano DNA wolne od komórek moczu, a integralność DNA oceniono w czterech regionach, które wykazują zwiększoną liczbę kopii DNA w guzach litych.
Oceniono również sekwencję kontrolną w celu sprawdzenia, czy ilość DNA w każdej próbce jest wystarczająca do przeprowadzenia testu integralności. Dla każdego genu obliczono całkowite stężenie wolnego DNA oraz współczynniki zmienności. Metoda ta wykazuje 73%czułość i 84%swoistość w wykrywaniu raka pęcherza moczowego, ale tylko 58%czułość i 44%swoistość w przypadku raka prostaty.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego dnia roboczego, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak cyfrowy PCR lub sekwencjonowanie nowej generacji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak induktor liczby kopii interesujących genów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak w bardzo prosty sposób wyizolować wolne DNA z komórek i jak badać integralność określonych regionów zainteresowania za pomocą metod PCR w czasie rzeczywistym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę analizy integralności DNA w frakcji nadsączu bezkomórkowego próbek moczu, mającą na celu wczesne wykrywanie nowotworów urologicznych. Wykazano jej skuteczność w nieinwazyjnym diagnozowaniu raka pęcherza moczowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia urologiczna
- Nieinwazyjne techniki diagnostyczne
- Analiza wolnokrążącego DNA
Wstęp
- Nowotwory urologiczne często uwalniają wolne kwasy nukleinowe do moczu.
- Wczesna diagnostyka jest kluczowa dla skutecznego leczenia.
- Obecne metody mogą być inwazyjne lub mniej dokładne.
- Analiza wolnego DNA może dostarczyć cennych informacji.
Cel badania
- Ocena integralności wolnego od komórek DNA w moczu.
- Ułatwienie wczesnej diagnostyki raka pęcherza moczowego oraz raka prostaty.
- Opracowanie metody łatwej w wykonaniu i analizie.
Zastosowane metody
- Analiza integralności wolnego DNA w próbkach moczu.
- Ocena sekwencji specyficznych onkogenów.
- Zastosowanie metody do innych płynów biologicznych, takich jak surowica.
- Uwzględnienie problemów związanych z niskim stężeniem w próbkach moczu.
Główne wyniki
- Metoda ta jest skuteczna w wczesnym wykrywaniu raka pęcherza moczowego.
- Wykazuje ona potencjał w diagnostyce innych nowotworów urologicznych.
- Łatwość zastosowania sprawia, że jest ona dostępna dla badaczy.
- Zdobyte informacje mogą usprawnić zrozumienie biologii nowotworów.
Wnioski
- Metoda ta oferuje obiecujące podejście do nieinwazyjnej diagnostyki nowotworów.
- Można ją dostosować do różnych rodzajów próbek biologicznych.
- Przyszłe badania mogą usprawnić jej zastosowanie w warunkach klinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Nieinwazyjne wykrywanie biomarkerów w nowotworach urologicznych pozostaje krytyczną, niezaspokojoną potrzebą w procesach wczesnej diagnostyki. Analiza integralności wolnokrwiejnego DNA w moczu oferuje szybką metodę z niskim zapotrzebowaniem na materiał wejściowy do badania loci onkogenów za pomocą ilościowego PCR, co wspiera walidację celów i opracowywanie testów w procesach odkrywania biomarkerów. Prostota tej metody oraz możliwość jej dostosowania do innych płynów biologicznych umożliwiają jej wielofunkcyjne wykorzystanie w translacyjnych programach badawczych nad biomarkerami.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju bi farmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia analizę specyficznych sekwencji onkogenów (c-MYC, BCAS1, HER2, AR) w celu oceny integralności DNA jako funkcjonalnego wskaźnika uwalniania kwasów nukleinowych pochodzących z guza.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje zaledwie kilka mililitrów moczu, co wymaga minimalnej objętości próbki i standardowego wyposażenia laboratoryjnego, zapewniając szeroką dostępność metody.
- Wartość prognostyczna: Dostarcza ilościowych danych o cyklu progowym (Ct), aby ocenić progi integralności DNA rozróżniające stany nowotworowe od zdrowych, co wspiera testowanie hipotez w walidacji celów terapeutycznych.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych pomiarów stężeń specyficznych dla genów za pomocą krzywych wzorcowych, co umożliwia powtarzalną ocenę integralności DNA w wielu loci onkogenów.
- Wartość operacyjna: Metoda jest kompatybilna z platformami real-time PCR i zawiera wbudowane kontrole (negatywne kontrole wodne, sprawdzanie spójności powtórzeń), aby zapewnić specyficzność testu i jakość danych.
- Skalowalność: Metodę można dostosować do innych interesujących genów lub płynów biologicznych (surowica/osocze), co pozwala na ponowne wykorzystanie platformy w różnych projektach badawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wykazano 73% czułości i 84% swoistości w wykrywaniu raka pęcherza moczowego w próbkach moczu ludzkiego, co stanowi punkt odniesienia dla przejścia z fazy przedklinicznej do klinicznej.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Ocenia integralność DNA w locus często amplifikowanych w guzach litych, łącząc fenotyp molekularny z genomicznymi zmianami związanymi z nowotworem.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o wskaźniki integralności uzyskane z próbek nieinwazyjnych, co zmniejsza zależność od inwazyjnych biopsji w fazie wczesnej walidacji.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy, od walidacji celu opartej na hipotezie po kwalifikację testu, w szczególności w programach dotyczących nowotworów urologicznych, w których poszukiwane są nieinwazyjne biomarkery.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wzorców uwalniania DNA w procesach apoptozy i nekrozy poprzez pomiar integralności długich amplikonów (>250 bp) w nadosadzie moczu.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowanych, ilościowych wyników (ng/μL na gen), które umożliwiają porównywanie zestawów próbek i warunków w celu wyłonienia trafień.
- Analityka: Generuje dane dotyczące mediany progu cyklu i stężenia, które mogą być oceniane statystycznie w celu ustalenia wartości odcięcia dla diagnostyki oraz powtarzalności.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną dzięki udowodnionej skuteczności w próbkach ludzkich, wspierając wysiłki w zakresie kwalifikacji biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Protokół jest modularny — izolacja DNA z moczu oraz testy integralności mogą być rozdzielone i zastosowane do innych typów próbek lub paneli genów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w opracowywaniu płynnej biopsji, zapewniając bezpośredni pomiar integralności długości fragmentów DNA pochodzenia nowotworowego.
- Wartość operacyjna: Ustandaryzowany przepływ pracy z określonymi etapami wirowania, oczyszczania i kontroli jakości zapewnia powtarzalność wyników między użytkownikami i ośrodkami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) we wczesnej fazie odkryć, oferując nieinwazyjny i kosztowo efektywny wskaźnik oceny obciążenia nowotworem.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów lub testów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wyniki integralności nieinwazyjnego DNA w próbkach istotnych dla danej choroby.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w obchodzeniu się z próbkami moczu, oczyszczaniu DNA oraz konfiguracji reakcji real-time PCR w celu zarządzania niską wydajnością i zapobiegania kontaminacji.
- Metoda zależy od dostępu do wirówki, termocyklera z funkcją analizy krzywej topnienia oraz narzędzi do kwantyfikacji spektrofotometrycznej.
- Konieczna jest standaryzacja czasu pobrania moczu (pierwszy poranny, <3h w 4°C) oraz procesu przetwarzania w celu zminimalizowania zmienności przedanalitycznej.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji stężenia wejściowego DNA oraz wyboru amplikonu w zależności od statusu liczby kopii genu docelowego.
- Ograniczenie praktyczne: Niskie stężenie wolnego DNA w moczu może wymagać łączenia próbek lub normalizacji ilości wejściowej w celu uzyskania spójnych wyników, zgodnie z opisem w protokole.
