Szybka, skalowalna metoda izolacji, badania funkcjonalnego i analizy macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z komórek
4 stycznia 2017
Macierz zewnątrzkomórkowa odgrywa główną rolę w definiowaniu mikrośrodowiska komórek oraz w modulowaniu ich zachowania i fenotypu. Opisujemy szybką metodę izolacji macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z komórki, którą można dostosować do różnych skal do badań mikroskopowych, biochemicznych, proteomicznych lub funkcjonalnych.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie macierzy zewnątrzkomórkowej z hodowanych komórek do szerokiej gamy dalszych eksperymentów, aby pomóc zrozumieć funkcje i właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej w prawidłowych tkankach i procesach chorobowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak organizacja, skład molekularny, interakcje białkowe lub właściwości funkcjonalne macierzy zewnątrzkomórkowej. Również macierz zewnątrzkomórkowa może być przygotowana z dowolnego przylegającego typu komórek.
Główną zaletą tej techniki jest to, że można je przeprowadzać w różnych skalach, aby skutecznie usuwać komórki i zachować białka macierzy zewnątrzkomórkowej. Procedurę zademonstrują Silvia Rosini, doktorantka w moim laboratorium, oraz Andrew Hellewell, badacz z tytułem doktora. Na początek umieść komórki na szkiełkach nakrywkowych w celu obrazowania żywych komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej lub ECM.
W przypadku badań mikroskopii fluorescencyjnej należy zastosować stały ECM. Lub do przygotowania ECM pochodzącego z komórek do badań funkcjonalnych na małą skalę. Inkubować komórki w odpowiedniej temperaturze i wilgotności przez odpowiedni czas, aby komórki mogły zdeponować ECM.
Zazwyczaj dłużej niż 16 godzin. W okapie kuchennym przygotować 20 milimolowy wodorotlenek amonu w odpowiednim naczyniu, używając wody dejonizowanej, aby rozcieńczyć roztwór podstawowy od 1 do 14. Wyjmij komórki z inkubatora i delikatnie usuń pożywkę hodowlaną.
Następnie dodaj PBS bez wapnia i magnezu, delikatnie dolewając do ścianki naczynia. Rozbujaj naczynie dwa razy i odlej płyn. Następnie powtórz pranie jeszcze dwa razy.
W okapie wyciągowym wyjmij ostatnie płukanie PBS, dodaj 1,5 mililitra wodorotlenku amonu na 60-milimetrowe naczynie i inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Delikatnie mieszaj naczynia co minutę, aby zapewnić lizę wszystkich komórek. Następnie dodaj dużą ilość wody dejonizowanej do każdego naczynia i rozbujaj talerz.
Następnie odlej materiał rozpuszczony w wodorotlenku amonu, który składa się z wodorotlenku amonu, lizowanych komórek i wody dejonizowanej. Umyj nierozpuszczalną warstwę ECM w dużej ilości wody dejonizowanej jeszcze cztery razy, aby zapewnić całkowite usunięcie całego materiału rozpuszczonego w wodorotlenku amonu. Istotne jest, aby komórki zostały całkowicie usunięte za pomocą obfitych płukań w wodzie dejonizowanej.
Jeśli te kroki nie zostaną wykonane odpowiednio, materiał komórkowy może pozostać na szalce i zanieczyścić dalszą analizę. W celu zbadania ECM metodą immunofluorescencji usuń pozostałą wodę dejonizowaną, utrwal ECM, dodając 2% paraformaldehydu, w skrócie PFA, i inkubuj szalki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Użyj PBS do dwukrotnego przemycia każdej próbki i wyrzuć roztwór do pojemnika na odpady płynne przed przeprowadzeniem mikroskopii fluorescencyjnej zgodnie z protokołem tekstowym.
W okapie z przepływem laminarnym przygotuj sterylne roztwory PBS bez wapnia i magnezu, 20-milimolowego wodorotlenku amonu i wody dejonizowanej, przepuszczając każdy roztwór przez sterylny filtr 0,2 mikrometra do odpowiedniego sterylnego pojemnika. Zachowując sterylną technikę, użyj sterylnego PBS, aby delikatnie umyć komórki producenta matrycy na szkiełkach nakrywkowych trzy razy. Po usunięciu końcowego płukania PBS dodaj 1,5 mililitra sterylnego wodorotlenku amonu do 60-milimetrowej naczynia i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut z przerywanym kołysaniem.
Dodać duże ilości sterylnej wody dejonizowanej do naczynia z kołysaniem, odlać lizat komórkowy do odpowiedniego pojemnika na odpady. Powtórz to pranie jeszcze cztery razy, aby zapewnić całkowite usunięcie rozpuszczonego materiału. Po trypsynizacji i granulowaniu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, ponownie zawieś komórki testowe w świeżej sterylnej pożywce i użyj hemocytometru do policzenia komórek.
Następnie umieścić odpowiednią liczbę komórek testowych i pożywki hodowlanej na sterylnym izolowanym ECM na szkiełkach nakrywkowych i inkubować przez dwie do trzech godzin lub przez wymagany czas. Aby zbadać organizację cytoszkieletu aktynowego, utrwal komórki testowe w 2% PFA i wybarwić je FITC-falloidyną, aby uwidocznić F-aktynę, i DAPI, aby uwidocznić jądra. Po wyhodowaniu dużej liczby komórek, a następnie usunięciu komórek i umyciu ECM, jak pokazano wcześniej w filmie, przechyl każdą płytkę pod kątem, aby spuścić pozostałą wodę na dno naczynia i użyj pipety P200, aby ostrożnie usunąć pozostałą wodę, aż płytka całkowicie wyschnie.
W tym samym czasie podgrzewać bufor próbki SDS-PAGE zawierający 100 milimolowy DDT do 95 stopni Celsjusza przez dwie minuty i dodawać 200 mikrolitrów do każdej 100-milimetrowej płytki, która ma być zbadana za pomocą immunoblot. Użyj skrobaka do komórek, aby zebrać próbkę po jednej stronie naczynia i użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby przenieść ją do probówki. Aby przeanalizować ECM za pomocą spektrometrii mas, należy przygotować bardziej skoncentrowaną próbkę, pobierając bufor próbki SDS-PAGE z naczynia, podgrzewając go ponownie do 95 stopni Celsjusza i używając tej samej podwielokrotności na dwóch do trzech dodatkowych płytkach.
Przenieś resztkowy ekstrakt bufora próbki SDS-PAGE z końcówki skrobaka do komórek do probówki, aby zminimalizować straty materiału ECM. W celu efektywnej ekstrakcji izolowanego ECM do buforu próbki SDS-PAGE konieczne jest, aby bufor próbki był podgrzany do 95 stopni, zawierał środek redukujący i aby płytka była dokładnie zeskrobywana. Pokazano tutaj komórki COS-7 wyhodowane na szklanych szkiełkach nakrywkowych.
Leczenie wodorotlenkiem amonu skutecznie usunęło komórki, jak ustalono na podstawie utraty jąder komórkowych i cytoszkieletu aktynowego. Na tym rysunku komórki COS-7 transfekowano trombospondyną ze znacznikiem RFP. A ECM został uwidoczniony przed i po leczeniu wodorotlenkiem amonu.
Zakłada się, że punkty fluorescencyjne zidentyfikowane na obu obrazach są powiązane z ECM. W tym eksperymencie ludzkie fibroblasty skóry usunięto wodorotlenkiem amonu, a ECM zbadano przeciwciałem anty-kolagenowym 1, które wykazało charakterystyczny wzór barwienia kości strzałkowej i siatki. Jak pokazano tutaj, barwienie fibronektyną przeprowadzono na ECM z komórek chrzęstniakomięsaka szczura wyekstrahowanych wodorotlenkiem amonu.
W tym przykładzie testowe komórki COS-7 były siane przez dwie godziny na sterylnym ECM wytwarzanym przez komórki RCS i analizowane pod kątem organizacji F-aktyny przez barwienie FITC-falloidyną. W porównaniu do komórek COS-7 wytwarzających własne ECM. W tym eksperymencie ECM wyizolowano z komórek chrzęstniakomięsaka szczura, a białka pochodzące z ECM oddzielono następnie za pomocą SDS-PAGE.
Cztery główne pasma zostały wyizolowane i przeanalizowane za pomocą spektrometrii mas. Zidentyfikowano fibronektynę, trombospondynę-1 i piątą oraz matrilinę-1. Na koniec endogenny ECM ludzkich fibroblastów skóry analizowano za pomocą immunoblottingu.
Wykryto fibronektynę i trombospondynę-1, podczas gdy białka wewnątrzkomórkowe alfa-tubulina i beta-aktyna były nieobecne. Po opanowaniu, usunięcie komórek wodorotlenkiem amonu i ekstrakcja ECM za pomocą gorącego buforu próbki SDS-PAGE z trzech 100-milimetrowych szalek może być wykonana w ciągu jednej godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby za każdym razem przygotować świeże roztwory robocze wodorotlenku amonu w celu usunięcia komórek.
Bardzo ważne jest również, aby używać obfitych myć wodą dejonizowaną, aby upewnić się, że usunąłeś wszystkie komórki. Po tej procedurze można przeprowadzić takie metody, jak analiza proteomiczna wyekstrahowanego ECM, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak względna obfitość białek ECM wytwarzanych przez różne typy komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie usuwać komórki z naczyń do hodowli komórkowych i jak ekstrahować ECM.
Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak praca w okapie kuchennym i noszenie środków ochrony osobistej.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szybką metodę izolacji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) pochodzenia komórkowego z hodowli komórkowych, którą można dostosować do różnych skal eksperymentalnych. Technika ta jest kluczowa dla badania roli ECM w zachowaniu komórek oraz jej znaczenia w stanach prawidłowych i chorobowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Badania macierzy zewnątrzkomórkowej
- Analiza biochemiczna
Wprowadzenie
- Macierz pozakomórkowa ma kluczowe znaczenie dla mikrośrodowiska i zachowania komórek.
- Zrozumienie właściwości ECM może dostarczyć cennych informacji na temat funkcji i patologii tkanek.
- Ta metoda umożliwia badanie ECM z dowolnego typu komórek adherentnych.
- Kluczową zaletą jest efektywne usuwanie komórek przy jednoczesnym zachowaniu białek ECM.
Cel badania
- Izolacja ECM do różnorodnych dalszych eksperymentów.
- Badanie organizacji i składu molekularnego ECM.
- Analiza oddziaływań białkowych i właściwości funkcjonalnych ECM.
Zastosowane metody
- Komórki wysiewa się na szkiełka podstawowe w celu depozycji ECM.
- Wodorotlenek amonu jest wykorzystywany do lizy komórek i izolacji ECM.
- Etapy płukania zapewniają całkowite usunięcie materiału komórkowego.
- Do analizy ECM stosuje się immunofluorescencję oraz SDS-PAGE.
Główne wyniki
- Pomyślna izolacja ECM wykazana za pomocą mikroskopii.
- Barwienie fluorescencyjne ujawnia organizację i skład ECM.
- Metoda umożliwia analizę właściwości ECM w różnych typach komórek.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia roli ECM w zdrowiu i chorobie.
Wnioski
- Opisana metoda jest skuteczna w izolowaniu ECM z hodowli komórkowych.
- Stanowi ona podstawę do dalszych badań nad funkcjami ECM.
- Technika ta może usprawnić badania w dziedzinie biologii komórki i inżynierii tkankowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka i skalowalna izolacja macierzy pozakomórkowej (ECM) pochodzącej z komórek umożliwia wysoką wiarygodność badań funkcjonalnych i analiz biochemicznych, które są kluczowe dla wczesnego etapu odkrywania leków oraz walidacji celów terapeutycznych. Metoda ta eliminuje główny problem w badaniach nad ECM, zapewniając powtarzalne i zminimalizowane pod kątem zanieczyszczeń preparaty ECM, odpowiednie dla różnorodnych procesów analitycznych. Jej możliwość adaptacji do różnych typów komórek przylegających wspiera translacyjne badania w całym portfolio oraz mechanistyczne ograniczanie ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę składu i organizacji ECM w celu wyjaśnienia szlaków sygnałowych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez izolację ECM wolnej od zanieczyszczeń komórkowych.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez bezpośrednią analizę oddziaływań białkowych z ECM.
- Zapewnia platformę do badań porównawczych różnych typów komórek i modeli chorób.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane podłoża ECM do standaryzowanych analiz fenotypowych i funkcjonalnych.
- Zapewnia powtarzalność i mierzalne wyniki w analizach immunofluorescencyjnych i biochemicznych.
- Wspiera skalowalne przepływy pracy, od małoskalowych badań funkcjonalnych po wielkoskalową proteomikę.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków na dynamikę i skład ECM.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje analizę ECM z systemami istotnymi dla przebiegu choroby w celu translacyjnego odkrywania biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość przejścia od badań ECM in vitro do walidacji w modelach przedklinicznych.
- Redukuje niejednoznaczność biologiczną w mechanizmach chorób napędzanych przez ECM.
- Wspiera dostosowane do ryzyka rozwijanie hipotez terapeutycznych celowanych w ECM.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda izolacji ECM płynnie integruje się z procesem od wczesnego etapu odkryć, poprzez identyfikację wiodących cząsteczek, aż po badania przedkliniczne, umożliwiając rzetelną weryfikację hipotez i analizy końcowe.
- Biologia odkrywcza: Dostarcza wysokiej czystości ECM do badań nad składem i organizacją białek opartych na postawionych hipotezach.
- Przesiewanie: Zapewnia standaryzowane podłoża ECM do odtwarzalnego opracowywania testów i przesiewania związków.
- Analityka: Wspiera uzyskiwanie wyników w ilościowej immunofluorescencji, SDS-PAGE, immunoblotingu oraz spektrometrii mas.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie wyników badań ECM in vitro do modeli chorób i strategii biomarkerowych.
- Zastosowania instytucjonalne: Oferuje szeroko stosowalny, skalowalny protokół dla różnych typów komórek i projektów eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa wiarygodność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad ECM.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie ECM, zapewniając powtarzalność i skalowalność w różnych projektach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez umożliwienie przeprowadzania rzetelnych analiz ECM z minimalnym zanieczyszczeniem.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów ukierunkowanych na ECM oraz inicjatyw translacyjnych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie technik sterylnych oraz hodowli komórkowych.
- Wymaga dostępu do infrastruktury mikroskopii fluorescencyjnej, SDS-PAGE oraz spektrometrii mas.
- Konieczne jest rygorystyczne przestrzeganie etapów płukania i ekstrakcji w celu zapobiegania kontaminacji komórkowej.
- Metoda jest możliwa do zastosowania w każdym typie komórek adherentnych, co wspiera standaryzację między różnymi modelami.
- Ze względów bezpieczeństwa niezbędna jest ostrożna obsługa odczynników niebezpiecznych (np. paraformaldehydu).
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Removal of Cells with Ammonium Hydroxide Solution
3:21
Sterile Preparation of Cell-derived Extracellular Matrix for Cell Functional Assays
5:01
Isolation of Extracellular Matrix for SDS-PAGE, Immunoblot Analysis, or Proteomics
6:30
Results: Isolation and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix
8:26
Conclusion
