Szybka, skalowalna metoda izolacji, badania funkcjonalnego i analizy macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z komórek
January 4th, 2017
Macierz zewnątrzkomórkowa odgrywa główną rolę w definiowaniu mikrośrodowiska komórek oraz w modulowaniu ich zachowania i fenotypu. Opisujemy szybką metodę izolacji macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z komórki, którą można dostosować do różnych skal do badań mikroskopowych, biochemicznych, proteomicznych lub funkcjonalnych.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie macierzy zewnątrzkomórkowej z hodowanych komórek do szerokiej gamy dalszych eksperymentów, aby pomóc zrozumieć funkcje i właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej w prawidłowych tkankach i procesach chorobowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak organizacja, skład molekularny, interakcje białkowe lub właściwości funkcjonalne macierzy zewnątrzkomórkowej. Również macierz zewnątrzkomórkowa może być przygotowana z dowolnego przylegającego typu komórek.
Główną zaletą tej techniki jest to, że można je przeprowadzać w różnych skalach, aby skutecznie usuwać komórki i zachować białka macierzy zewnątrzkomórkowej. Procedurę zademonstrują Silvia Rosini, doktorantka w moim laboratorium, oraz Andrew Hellewell, badacz z tytułem doktora. Na początek umieść komórki na szkiełkach nakrywkowych w celu obrazowania żywych komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej lub ECM.
W przypadku badań mikroskopii fluorescencyjnej należy zastosować stały ECM. Lub do przygotowania ECM pochodzącego z komórek do badań funkcjonalnych na małą skalę. Inkubować komórki w odpowiedniej temperaturze i wilgotności przez odpowiedni czas, aby komórki mogły zdeponować ECM.
Zazwyczaj dłużej niż 16 godzin. W okapie kuchennym przygotować 20 milimolowy wodorotlenek amonu w odpowiednim naczyniu, używając wody dejonizowanej, aby rozcieńczyć roztwór podstawowy od 1 do 14. Wyjmij komórki z inkubatora i delikatnie usuń pożywkę hodowlaną.
Następnie dodaj PBS bez wapnia i magnezu, delikatnie dolewając do ścianki naczynia. Rozbujaj naczynie dwa razy i odlej płyn. Następnie powtórz pranie jeszcze dwa razy.
W okapie wyciągowym wyjmij ostatnie płukanie PBS, dodaj 1,5 mililitra wodorotlenku amonu na 60-milimetrowe naczynie i inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Delikatnie mieszaj naczynia co minutę, aby zapewnić lizę wszystkich komórek. Następnie dodaj dużą ilość wody dejonizowanej do każdego naczynia i rozbujaj talerz.
Następnie odlej materiał rozpuszczony w wodorotlenku amonu, który składa się z wodorotlenku amonu, lizowanych komórek i wody dejonizowanej. Umyj nierozpuszczalną warstwę ECM w dużej ilości wody dejonizowanej jeszcze cztery razy, aby zapewnić całkowite usunięcie całego materiału rozpuszczonego w wodorotlenku amonu. Istotne jest, aby komórki zostały całkowicie usunięte za pomocą obfitych płukań w wodzie dejonizowanej.
Jeśli te kroki nie zostaną wykonane odpowiednio, materiał komórkowy może pozostać na szalce i zanieczyścić dalszą analizę. W celu zbadania ECM metodą immunofluorescencji usuń pozostałą wodę dejonizowaną, utrwal ECM, dodając 2% paraformaldehydu, w skrócie PFA, i inkubuj szalki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Użyj PBS do dwukrotnego przemycia każdej próbki i wyrzuć roztwór do pojemnika na odpady płynne przed przeprowadzeniem mikroskopii fluorescencyjnej zgodnie z protokołem tekstowym.
W okapie z przepływem laminarnym przygotuj sterylne roztwory PBS bez wapnia i magnezu, 20-milimolowego wodorotlenku amonu i wody dejonizowanej, przepuszczając każdy roztwór przez sterylny filtr 0,2 mikrometra do odpowiedniego sterylnego pojemnika. Zachowując sterylną technikę, użyj sterylnego PBS, aby delikatnie umyć komórki producenta matrycy na szkiełkach nakrywkowych trzy razy. Po usunięciu końcowego płukania PBS dodaj 1,5 mililitra sterylnego wodorotlenku amonu do 60-milimetrowej naczynia i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut z przerywanym kołysaniem.
Dodać duże ilości sterylnej wody dejonizowanej do naczynia z kołysaniem, odlać lizat komórkowy do odpowiedniego pojemnika na odpady. Powtórz to pranie jeszcze cztery razy, aby zapewnić całkowite usunięcie rozpuszczonego materiału. Po trypsynizacji i granulowaniu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, ponownie zawieś komórki testowe w świeżej sterylnej pożywce i użyj hemocytometru do policzenia komórek.
Następnie umieścić odpowiednią liczbę komórek testowych i pożywki hodowlanej na sterylnym izolowanym ECM na szkiełkach nakrywkowych i inkubować przez dwie do trzech godzin lub przez wymagany czas. Aby zbadać organizację cytoszkieletu aktynowego, utrwal komórki testowe w 2% PFA i wybarwić je FITC-falloidyną, aby uwidocznić F-aktynę, i DAPI, aby uwidocznić jądra. Po wyhodowaniu dużej liczby komórek, a następnie usunięciu komórek i umyciu ECM, jak pokazano wcześniej w filmie, przechyl każdą płytkę pod kątem, aby spuścić pozostałą wodę na dno naczynia i użyj pipety P200, aby ostrożnie usunąć pozostałą wodę, aż płytka całkowicie wyschnie.
W tym samym czasie podgrzewać bufor próbki SDS-PAGE zawierający 100 milimolowy DDT do 95 stopni Celsjusza przez dwie minuty i dodawać 200 mikrolitrów do każdej 100-milimetrowej płytki, która ma być zbadana za pomocą immunoblot. Użyj skrobaka do komórek, aby zebrać próbkę po jednej stronie naczynia i użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby przenieść ją do probówki. Aby przeanalizować ECM za pomocą spektrometrii mas, należy przygotować bardziej skoncentrowaną próbkę, pobierając bufor próbki SDS-PAGE z naczynia, podgrzewając go ponownie do 95 stopni Celsjusza i używając tej samej podwielokrotności na dwóch do trzech dodatkowych płytkach.
Przenieś resztkowy ekstrakt bufora próbki SDS-PAGE z końcówki skrobaka do komórek do probówki, aby zminimalizować straty materiału ECM. W celu efektywnej ekstrakcji izolowanego ECM do buforu próbki SDS-PAGE konieczne jest, aby bufor próbki był podgrzany do 95 stopni, zawierał środek redukujący i aby płytka była dokładnie zeskrobywana. Pokazano tutaj komórki COS-7 wyhodowane na szklanych szkiełkach nakrywkowych.
Leczenie wodorotlenkiem amonu skutecznie usunęło komórki, jak ustalono na podstawie utraty jąder komórkowych i cytoszkieletu aktynowego. Na tym rysunku komórki COS-7 transfekowano trombospondyną ze znacznikiem RFP. A ECM został uwidoczniony przed i po leczeniu wodorotlenkiem amonu.
Zakłada się, że punkty fluorescencyjne zidentyfikowane na obu obrazach są powiązane z ECM. W tym eksperymencie ludzkie fibroblasty skóry usunięto wodorotlenkiem amonu, a ECM zbadano przeciwciałem anty-kolagenowym 1, które wykazało charakterystyczny wzór barwienia kości strzałkowej i siatki. Jak pokazano tutaj, barwienie fibronektyną przeprowadzono na ECM z komórek chrzęstniakomięsaka szczura wyekstrahowanych wodorotlenkiem amonu.
W tym przykładzie testowe komórki COS-7 były siane przez dwie godziny na sterylnym ECM wytwarzanym przez komórki RCS i analizowane pod kątem organizacji F-aktyny przez barwienie FITC-falloidyną. W porównaniu do komórek COS-7 wytwarzających własne ECM. W tym eksperymencie ECM wyizolowano z komórek chrzęstniakomięsaka szczura, a białka pochodzące z ECM oddzielono następnie za pomocą SDS-PAGE.
Cztery główne pasma zostały wyizolowane i przeanalizowane za pomocą spektrometrii mas. Zidentyfikowano fibronektynę, trombospondynę-1 i piątą oraz matrilinę-1. Na koniec endogenny ECM ludzkich fibroblastów skóry analizowano za pomocą immunoblottingu.
Wykryto fibronektynę i trombospondynę-1, podczas gdy białka wewnątrzkomórkowe alfa-tubulina i beta-aktyna były nieobecne. Po opanowaniu, usunięcie komórek wodorotlenkiem amonu i ekstrakcja ECM za pomocą gorącego buforu próbki SDS-PAGE z trzech 100-milimetrowych szalek może być wykonana w ciągu jednej godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby za każdym razem przygotować świeże roztwory robocze wodorotlenku amonu w celu usunięcia komórek.
Bardzo ważne jest również, aby używać obfitych myć wodą dejonizowaną, aby upewnić się, że usunąłeś wszystkie komórki. Po tej procedurze można przeprowadzić takie metody, jak analiza proteomiczna wyekstrahowanego ECM, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak względna obfitość białek ECM wytwarzanych przez różne typy komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie usuwać komórki z naczyń do hodowli komórkowych i jak ekstrahować ECM.
Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak praca w okapie kuchennym i noszenie środków ochrony osobistej.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia szybki sposób izolacji pozakomórkowej matrycy (ECM) pochodzącej z komórek z kultur, który można dostosować do różnych skal eksperymentów. Technika ta jest kluczowa dla badań nad rolą ECM w zachowaniu komórek i jej wpływem na stany normalne i chorobowe.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- Badania nad pozakomórkową matrycą
- Analiza biochemiczna
Tło
- Pozakomórkowa matryca jest niezbędna dla mikrośrodowiska i zachowania komórek.
- Zrozumienie właściwości ECM może dać wgląd w funkcjonowanie tkanek i patologię.
- Ta metoda pozwala na badanie ECM z każdego typu komórki adhezywnej.
- Efektywne usuwanie komórek przy zachowaniu białek ECM jest kluczową zaletą.
Cel badania
- Izolowanie ECM dla różnych eksperymentów pobocznych.
- Badanie organizacji i składu molekularnego ECM.
- Zbadanie interakcji białkowych i właściwości funkcjonalnych ECM.
Stosowane metody
- Komórki są hodowanie na pokrywkach szkła do depozycji ECM.
- Wodorotlenek amonu jest używany do lizy komórek i izolacji ECM.
- Etapy mycia zapewniają całkowite usunięcie materiału komórkowego.
- Imunofluorescencja i SDS-PAGE są wykorzystywane do analizy ECM.
Główne wyniki
- Sukces izolacji ECM wykazany za pomocą mikroskopii.
- Fluorescencyjne barwienie ujawnia organizację i skład ECM.
- Metoda pozwala na analizę właściwości ECM w różnych typach komórek.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia roli ECM w zdrowiu i chorobie.
Wnioski
- Opisana metoda jest skuteczna w izolowaniu ECM z hodowanych komórek.
- Przedstawia podstawę dla dalszych badań nad funkcjami ECM.
- Technika ta może poprawić badania w biologii komórki i inżynierii tkankowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid, scalable isolation of cell-derived extracellular matrix (ECM) enables high-confidence functional studies and biochemical analyses critical for early discovery and target validation. This method addresses a key bottleneck in ECM research by providing reproducible, contamination-minimized ECM preparations suitable for diverse downstream workflows. Its adaptability across adherent cell types supports portfolio-wide translational research and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of ECM composition and organization for pathway clarification.
- Supports functional target validation by isolating ECM free from cellular contaminants.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct analysis of ECM-protein interactions.
- Provides a platform for comparative studies across cell types and disease models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated ECM substrates for standardized phenotypic and functional assays.
- Ensures reproducibility and quantitative output in immunofluorescence and biochemical assays.
- Supports scalable workflows from small-scale functional studies to large-scale proteomics.
- Enables reliable evaluation of compound effects on ECM dynamics and composition.
Translational & Preclinical Research
- Aligns ECM analysis with disease-relevant systems for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from in vitro ECM studies to preclinical model validation.
- Reduces biological ambiguity in ECM-driven disease mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement of ECM-targeted therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This ECM isolation method integrates seamlessly from early discovery through lead identification and preclinical research, enabling robust hypothesis testing and downstream analytics.
- Discovery Biology: Provides high-purity ECM for hypothesis-driven studies of protein composition and organization.
- Screening: Delivers standardized ECM substrates for reproducible assay development and compound screening.
- Analytics: Supports quantitative immunofluorescence, SDS-PAGE, immunoblotting, and mass spectrometry outputs.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro ECM findings with disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, scalable protocol for diverse cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in ECM-related studies.
- Operational Value: Standardizes ECM preparation, ensuring reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling robust, contamination-minimized ECM analyses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of ECM-targeted programs and translational initiatives.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique and cell culture handling.
- Needs access to fluorescence microscopy, SDS-PAGE, and mass spectrometry infrastructure.
- Demands rigorous washing and extraction steps to prevent cellular contamination.
- Adaptable to any adherent cell type, supporting cross-model standardization.
- Careful handling of hazardous reagents (e.g., paraformaldehyde) is essential for safety.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Removal of Cells with Ammonium Hydroxide Solution
3:21
Sterile Preparation of Cell-derived Extracellular Matrix for Cell Functional Assays
5:01
Isolation of Extracellular Matrix for SDS-PAGE, Immunoblot Analysis, or Proteomics
6:30
Results: Isolation and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix
8:26
Conclusion
