Name: Wykorzystanie konstruktu TMEM184A znakowanego GFP w celu potwierdzenia tożsamości receptora heparyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Poznaj metodę znakowania GFP receptora TMEM184A w celu potwierdzenia jego roli jako receptora heparyny w komórkach naczyniowych. Technika ta umożliwia identyfikację białek i badanie ich funkcji w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium Lowe-Krentz są wspierane przez granty badawcze HL54269 z National Institutes of Health dla LLK.

<ol><li>Pugh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+Protein+184A+Is+a+Receptor+Required+for+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Responses+to+Heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin.</a> J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).</li>
<li>Daher, W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27063980">Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P.</a> Mol Biochem Parasitol. , (2016).</li>
<li>Vit, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+membrane+proteins+based+on+analysis+of+trypsin-protected+transmembrane+segments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments.</a> J Proteomics. , (2016).</li>
<li>Attwood, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+based+identification+and+comprehensive+classification+of+four-transmembrane+helix+containing+proteins+%284TMs%29+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome.</a> BMC genomics. 17, 268(2016).</li>
<li>Zou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Identification+of+Jatropha+curcas+Aquaporin+Genes+and+the+Comparative+Analysis+Provides+Insights+into+the+Gene+Family+Expansion+and+Evolution+in+Hevea+brasiliensis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis.</a> Front Plant Sci. 7, 395(2016).</li>
<li>Gilotti, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+responses+in+vascular+smooth+muscle+cells+involve+cGMP-dependent+protein+kinase+%28PKG%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG).</a> J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).</li>
<li>Farwell, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+Decreases+in+Tumor+Necrosis+Factor+alpha+%28TNFalpha%29-induced+Endothelial+Stress+Responses+Require+Transmembrane+Protein+184A+and+Induction+of+Dual+Specificity+Phosphatase+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1.</a> J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).</li>
<li>Xu, D., Esko, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demystifying+heparan+sulfate-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Demystifying heparan sulfate-protein interactions.</a> Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).</li>
<li>Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin%2FHeparan+sulfate+proteoglycans+glycomic+interactome+in+angiogenesis%3A+biological+implications+and+therapeutical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use.</a> Molecules. 20, 6342-6388 (2015).</li>
<li>Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+realignment+and+cofilin+regulation+are+essential+for+barrier+integrity+during+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress.</a> J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).</li>
<li>Patton, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+heparin-binding+protein+using+monoclonal+antibodies+that+block+heparin+binding+to+porcine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells.</a> The Biochemical journal. 311, Pt 2 461-469 (1995).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Skalamera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+genome+scale+lentiviral+vector+library+for+EF1alpha+promoter-driven+expression+of+human+ORFs+and+identification+of+human+genes+affecting+viral+titer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer.</a> PloS one. 7, 51733(2012).</li>
<li>Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turn-on+switch+in+parathyroid+hormone+receptor+by+a+two-step+parathyroid+hormone+binding+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).</li>
<li>Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+with+the+EGFP-mCherry+fluorescent+protein+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair.</a> Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+the+ATP-sensitive+potassium+channel+complex+examined+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer.</a> J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).</li>
<li>Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+a+Potent+Free+Fatty+Acid+Receptor+1+%28FFA1%29+Fluorescent+Tracer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer.</a> J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).</li>
<li>Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+rendered+susceptible+to+proteolysis%3A+positions+for+protease-sensitive+insertions%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions.</a> Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawione tutaj protokoły zostały zaprojektowane w celu dostarczenia dowodów potwierdzających identyfikację TMEM184A jako receptora heparyny w komórkach naczyniowych1. Techniki knockdown są rutynowo stosowane jako jeden z mechanizmów potwierdzających identyfikację nowych białek. Jednak pewna utrata funkcji po knockdown zazwyczaj nie jest wystarczającym dowodem na to, że białko kandydujące jest rzeczywiście właściwym receptorem (lub innym funkcjonalnym białkiem). Ważne jest również, aby mieć do...

Identyfikacja białek kandydujących do nowych funkcji często zależy od protokołów izolacji opartych na powinowactwie, po których następuje częściowe określenie sekwencji. Ostatnie przykłady nowo zidentyfikowanych białek obejmują białko transbłonowe 184A (TMEM184A), receptor heparyny zidentyfikowany po interakcjach powinowactwa heparyny1, oraz TgPH1, białko domeny homologii pleckstriny, które wiąże fosfoinozytyd PI(3,5)P22. Inna nowatorska identyfikacja białek obejmuje bezpośrednią analizę sekwencji peptydów, taką jak ta przeprowadzona przez Vit i wsp., którzy wykorzystali peptydy transbłonowe do identyfikacji produktów białkowych z wcześniej niescharakteryzowanych genów3. Podobnie, identyfikacja nowych sekwencji białek może być dokonana za pomocą bioinformatycznego przeszukiwania wcześniej scharakteryzowanych rodzin białek, takich jak identyfikacja nowych białek 4TM 4. Badanie sekwencji genów rodziny akwaporyn przyniosło również identyfikację nowych członków o nowych funkcjach5. Po zidentyfikowaniu, analiza funkcji białka jest zazwyczaj kolejnym krokiem, który czasami można zbadać przy użyciu specyficznego testu funkcji białka, takiego jak w przypadku akwaporyny.
Jeśli to możliwe, funkcja nowo zidentyfikowanego białka może być badana za pomocą specyficznych enzymatycznych lub podobnych testów funkcji in vitro. Ponieważ wiele funkcji nowych białek zależy od złożonych interakcji, które zachodzą tylko w nienaruszonych komórkach lub organizmach, testy in vitro nie zawsze są skuteczne. Testy in vivo muszą być jednak zaprojektowane w taki sposób, aby zależały od sekwencji genu. W hodowlach komórkowych i/lub prostych organizmach modelowych, knockdown może dostarczyć dowodów potwierdzających identyfikację białka/funkcji6. W przypadku nowych białek zidentyfikowanych zgodnie z powyższym, często nie wystarczy po prostu strącić białko w celu potwierdzenia funkcji, a projektowanie testów funkcjonalnych in vivo, które zależą od sekwencji genów, staje się ważne dla charakterystyki nowych białek.
Niedawna identyfikacja TMEM184A jako receptora heparyny (modulującego proliferację w mięśniach gładkich naczyń krwionośnych i reakcje zapalne w komórkach śródbłonka) przy użyciu chromatografii powinowactwa i MALDI MS1,7 dała możliwość opracowania zbioru testów po tym, jak knockdown dał wyniki zgodne z identyfikacją. Niedawny przegląd potwierdził, że heparyna oddziałuje specyficznie z wieloma czynnikami wzrostu, ich receptorami, składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej, receptorami adhezji komórek i innymi białkami8. W układzie naczyniowym heparyna i proteoglikany siarczanu heparanu (zawierające łańcuchy siarczanu heparanu o budowie zbliżonej do heparyny) oddziałują z kilkuset białkami9. Aby funkcjonalnie potwierdzić, że TMEM184A jest zaangażowana w wychwyt i wiązanie heparyny, opracowano techniki wykorzystujące konstrukt genu dla TMEM184A. Niniejszy raport zawiera zbiór testów opartych na konstrukcie GFP-TMEM184A do wykorzystania w celu potwierdzenia tożsamości TMEM184A jako receptora heparyny.

<table><tbody><tr><td>GFP-TMEM184A konstrukt</td><td>OriGene</td><td>RG213192</td><td></td></tr><tr><td>Rodamin-Heparyna</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-204</td><td>Światłoczuły</td></tr><tr><td>Fluoresceina-Heparyna</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-201</td><td>Światłoczuły</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>EMD Millipore</td><td>475904-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA, bez metanolu)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, dostępne za pośrednictwem Fisher Scientific</td><td>PI28908 w Fisher</td><td>Use in Dygestoria</td></tr><tr><td>Płytki neutrawidyczne Reacti-bind (czarne 96-dołkowe naczynia pokryte Avidinem)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, za pośrednictwem Fisher Scientific</td><td>PI15510 w Fisher</td><td>Zwróć uwagę na okres trwałości</td></tr><tr><td>Czarne 96-dołkowe płytki</td><td>Corning Life Sciences Plastic, zakupione za pośrednictwem Fisher Scientific</td><td>064432 w Fisher</td><td></td></tr><tr><td>Komórka mięśni gładkich naczyń krwionośnych A7r5 linia</td><td>ATCC</td><td>CRL 1444</td><td>Może być wymieniona na MEM medium1</td></tr><tr><td>BAOEC bydlęce komórki śródbłonka aorty</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>B304-05</td><td>Hodowla zgodnie z zaleceniami początkowymi, może być wymieniona na pożywkę MEM w celu kontynuacji hodowli1,7</td></tr><tr><td>BAOSMC komórki mięśni gładkich aorty bydlęcej</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>B354-05</td><td>Hodowla zgodnie z zaleceniami początkowymi, może być wymieniona na pożywkę MEM w celu kontynuacji hodowli1</td></tr><tr><td>RAOEC szczurze komórki śródbłonka aorty</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>R304-05a Kultura</td><td>zgodnie z zaleceniami początkowymi, może być wymieniona na pożywkę MEM w celu kontynuacji hodowli7</td></tr><tr><td>Biotynylowany anty-GFP</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, za pośrednictwem Fisher Scientific</td><td>MA5-15256-BTIN</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki pokryte streptawidyną</td><td>Sigma</td><td>S1638</td><td></td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Dostępne w Bio-Rad</td><td></td><td>Można przygotować w laboratorium. pH wynosi 6,8</td></tr><tr><td>TMEM184A przeciwciała przeciwko N-końcach</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc292006</td><td>Znane tylko TMEM184A przeciwciała przeciwko regionowi N-końcowemu.</td></tr><tr><td>TMEM184A przeciwciało przeciwko C-końcowi</td><td>Uzyskane od ProSci Inc, Poway, CA&nbsp;</td><td>Pro Sci 5681</td><td>ProSci stosowany w <silnych>Ryc. 1< / silnych></td></tr> <tr><td>przeciwciałach GFP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc9996</td><td>Stosowanych w <silnych> Ryc. 5< / silnych></td></tr> <tr><td>przeciwciałach drugorzędowych, znakowanych TRITC lub Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA</td><td>711 025 152 (osły anty-królik, TRITC) 715 165 150 (osły anty-myszy, Cy3)</td> <td>Minimalna reaktywność krzyżowa w celu zminimalizowania niespecyficznych zabarwień.</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Zakupiony od Sigma</td><td>C5849</td><td>Należy pamiętać, że ten konkretny numer katalogowy został wycofany.&nbsp; Dostawca udzieli informacji na temat wymiany.</td></tr><tr><td>Obrazowanie na żywo Czasze 35 mm</td><td>MatTek (Ashland MA)</td><td>P35G-1.0 &ndash; 20 mm - C</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta z 63-krotną soczewką olejową</td><td>Używany do obrazów i obrazowania na żywo w <silny>Rysunki 1, 2 i 3</silny></td></tr><tr><td>mikroskop konfokalny</td><td>Nikon</td><td>C2+ konfokalny z 60-krotnym obiektywem olejowym</td><td>Używany do obrazów w <silny>Rysunek 5</silny></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 880 z 63-krotną soczewką olejową</td><td>Używany do obrazów w <silny>Rysunek 2C</td></tr><tr><td>Sprzęt do elektroporacji</td><td>Bio-Rad</td><td>Gene Pulser X-Cell System</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety do elektroporacji</td><td>Dostępne w MidSci</td><td>EC2L</td><td>Można również uzyskać od dostawcy sprzętu</td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td></td><td>TECAN TECAN Infinite&reg; m200 Pro czytnik płyt</td><td>Odczyty w środku studni, a nie na powierzchni.</td></tr><tr><td>Program komputerowy do pomiaru intensywności barwienia</td><td>Obraz J</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/ Program i informacje dostępne on-line</td><td>Można użyć dowolnego odpowiedniego programu. Zobacz https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html, aby uzyskać dodatkowe informacje&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny do hodowli komórkowych</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td>zakupiony jako 10x roztwór</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie konstruktu tmem184a znakowanego gfp w celu potwierdzenia tożsamości receptora heparyny

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

Gdy nowe białka są identyfikowane poprzez izolację opartą na powinowactwie i analizę bioinformatyczną, często są one w dużej mierze niescharakteryzowane. Przeciwciała przeciwko określonym peptydom w przewidywanej sekwencji pozwalają na pewne eksperymenty lokalizacyjne. Jednak często nie można wykluczyć innych możliwych interakcji z przeciwciałami. Sytuacja ta stała się okazją do opracowania zestawu testów zależnych od sekwencji białka. W szczególności uzyskano konstrukt zawierający sekwencję genu sprzężoną z sekwencją kodującą GFP na C-końcowym końcu białka i wykorzystano go do tych celów. Eksperymenty mające na celu scharakteryzowanie lokalizacji, powinowactwa ligandów i wzmocnienia funkcji zostały pierwotnie zaprojektowane i przeprowadzone w celu potwierdzenia identyfikacji TMEM184A jako receptora heparyny1. Ponadto konstrukt ten może być wykorzystany do badań nad kwestiami topologii błony i szczegółowymi interakcjami białko-ligand. W niniejszym raporcie przedstawiono szereg protokołów eksperymentalnych opartych na konstrukcie GFP-TMEM184A ulegającym ekspresji w komórkach naczyniowych, które można łatwo zaadaptować do innych nowych białek.

Choć teoretycznie transfekcja dowolnego konstruktu DNA do komórek mogłaby zostać przeprowadzona przy użyciu lipofilnych odczynników do transfekcji, wcześniejsze doniesienia wskazują na bardziej efektywną transfekcję konstruktów GFP do komórek śródbłonka przy użyciu elektroporacji12. Przedstawiony tutaj protokół zazwyczaj pozwalał na uzyskanie ekspresji konstruktu GFP w ponad 80% użytych pierwotnych komórek śródbłonka oraz komórek mięśni gładkich. Do zaprojektowania...

Konstrukt kodujący TMEM184A ze znacznikiem GFP na końcu karboksylowym, przeznaczony do ekspresji eukariotycznej, został wykorzystany w testach mających na celu potwierdzenie identyfikacji TMEM184A jako receptora heparyny w komórkach naczyniowych.

Wykorzystanie konstruktu TMEM184A znakowanego GFP w celu potwierdzenia tożsamości receptora heparyny

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

Ogólnym celem użycia konstruktu znakowanego GFP jest potwierdzenie tożsamości wcześniej nieznanego białka przy użyciu GFP jako uchwytu. Metoda ta może pomóc w funkcjonalnej identyfikacji genów sierocych, gdy określona aktywność enzymatyczna nie jest dostępna do potwierdzenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że znacznik GPF pozwala na użycie tego samego konstruktu do kilku rodzajów eksperymentów.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć problemy, ponieważ transfekcja nie zawsze prowadzi do ekspresji silnego konstruktu, a komórki nie zawsze się ożywiają. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, kiedy zaczęliśmy dostrzegać trudności w identyfikacji białka przy użyciu samych przeciwciał wytworzonych przeciwko niemu. Rozpocznij od ponownego zawieszenia interesujących komórek w jednym mililitrze buforowanego przez HEPES buforowanego solą fizjologiczną bufora elektroporacyjnego i natychmiast umieść ogniwa na lodzie.Dodaj do komórek wystarczającą objętość osocza znakowanego TMEM184A GFP, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 mikrogramów na mililitr DNA, a następnie przenieś około 0,4 mililitra komórek do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji. Elektroporuj ogniwa. Następnie obejrzyj transfekowane komórki na szalkach do hodowli tkankowych i umieść je w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 do 72 godzin.Etap transfekcji jest najbardziej krytycznym etapem procedury, ponieważ większość pozostałych prac eksperymentalnych nie może być skutecznie wykonana, jeśli komórki nie są zdolne do życia i nie wyrażają znaczących poziomów konstruktu znakowanego GFP. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie czasowym dodać 100 mikrogramów na mililitr heparyny rodaminy do pożywki do hodowli komórek wykazujących ekspresję plazmidu GFP i inkubować komórki, chronione przed światłem, aż do osiągnięcia pożądanego poziomu barwienia, obserwowanego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Następnie przepłucz komórki PBS i przez kilka sekund delikatnie wstrząsaj, chroniąc przed światłem, a następnie utrwalaj 4% paraformaldehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem.Aby ocenić kolokalizację heparyny rodaminy znakowanej GFP, należy użyć mikroskopu konfokalnego z odpowiednim GFP i wzbudzeniem rodaminy oraz zmniejszonymi laserami, aby zobrazować co najmniej 50 komórek z każdego oddzielnego eksperymentu znakowania. Zbadaj obrazy w odpowiednim programie do analizy obrazu, aby określić względne znajdowanie i wychwyt rodaminy w każdej komórce, używając narzędzia odręcznego do zakreślania komórek w każdym obrazie fluorescencyjnym. Użyj narzędzia miary, aby określić intensywność w każdym zakreślonym obszarze, a następnie wyeksportuj dane dotyczące intensywności fluorescencji do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć obszar pomnożony przez intensywność, odejmując tło dla tej samej ilości obszaru dla każdej komórki.Fluorescencja na komórkę może być następnie uśredniona dla wszystkich komórek, aby uzyskać statystycznie istotne dane. Aby ułatwić transfer energii rezonansu fluorescencyjnego z TMEM184A GFP do heparyny rodaminy, najpierw zamontuj GFP TMEM184A transfekuj komórki znakowane heparyną rodaminy na szklanych szkiełkach mikroskopowych. Wzbudzić komórki na 405 nanometrach w celu zobrazowania emisji rodaminy, a następnie wzbudzić 488 nanometrów, aby zobrazować emisję GFP.Następnie wzbudz komórki w odległości 561 nanometrów, aby uzyskać drugie obrazowanie emisji rodaminy. W celu obrazowania żywych komórek wychwytu heparyny rodaminy, należy zasiać 100-mililitrową kulturę konfluentnych komórek transfekowanych TMEM184A GFP do 635-milimetrowych naczyń do obrazowania żywych komórek, aby uzyskać komórki w pobliżu zbiegu. Po 48 godzinach zastąp supernatant pożywką hodowlaną bez czerwieni fenolowej i przenieś miskę z komórkami do mikroskopu konfokalnego ze stopniem ogrzewania ustawionym na 37 stopni Celsjusza.Skoncentruj mikroskop i dodaj 100 mikrogramów na mililitr heparyny rodaminy do komórek, delikatnie mieszając. Następnie natychmiast rozpocznij nagrywanie obrazów na żywo. Jeśli w polu widzenia nie występuje wychwyt heparyny, należy lekko przesunąć szalkę, aby zidentyfikować komórki z co najmniej jednym zielonym pęcherzykiem zawierającym etykietę rodaminy.W celu oceny wiązania heparyny in vitro należy przepłukać jedną czarną 96-dołkową płytkę pokrytą ativanem i jedną czarną niepowlekaną 96-dołkową płytkę 200 mikrolitrami 0,2% CHAPS PBS pro-well przez trzy pięciominutowe płukanie z potrząsaniem. Po ostatnim przemyciu dodać 100 mikrolitrów po 60 pikomoli na studzienkę biotynylowanego anty-GFP w trzech egzemplarzach do płytki pokrytej ativanem dla każdej grupy wykrywającej GFP. Następnie dodać bufor tylko do studzienek kontrolnych i uszczelnić wszystkie studzienki pokrywą płytki na dwugodzinną inkubację w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem.Pod koniec inkubacji umyć wszystkie studzienki trzykrotnie w CHAPS PBS, jak właśnie pokazano, i dodać 100 mikrolitrów po pięć nanomoli na studzienkę TMEM184A GFP lub samego GFP do odpowiednich dołków na płytce pokrytej ativanem. Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem, umyć wszystkie studzienki świeżym CHAPS PBS i dodać 100 mikrolitrów każdego eksperymentalnego stężenia heparyny fluoresceinowej do odpowiednich studzienek testowych w trzech egzemplarzach, na płytkę pokrytą ativanem. Dodać wzorce stężenia zarówno do płytek pokrytych ativanem, jak i niepowlekanych, i inkubować obie płytki przez 10 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając, chroniąc przed światłem.Teraz użyj czytnika płytek, aby zarejestrować początkową emisję fluorescencji heparyny w studzienkach kontrolnych obu płytek oraz początkową całkowitą emisję fluorescencji z dołków z unieruchomionym TMEM184A GFP lub GFP na płytce pokrytej ativanem. Następnie przenieść niezwiązaną heparynę fluorescencyjną z dołków z unieruchomionym TMEM184A GFP lub GFP do odpowiednich studzienek w niepowlekanej czarnej płytce. Po natychmiastowym odczycie emisji fluorescencji na niepowlekanej czarnej płytce, dodać 100 mikrolitrów świeżego PBS CHAPS z powrotem do studzienek, z których usunięto heparynę fluoresceinową, i odczytać emisje fluorescencji dla tych studzienek, aby uzyskać emisję fluorescencji z usuniętych, niezwiązanych próbek na niepowlekanej płytce.Po uzyskaniu wszystkich odczytów bez ograniczeń, należy użyć całkowitych wartości emisji heparyny, aby potwierdzić, że do każdego dołka dodano prawidłowe poziomy heparyny, odejmując średnie odczyty tła od wartości. Następnie utwórz wykres emisji w stosunku do całkowitej dodanej heparyny fluoresceinowej, aby określić skalę emisji w stosunku do ilości heparyny i wykreślić skorygowaną związaną heparynę w funkcji dodanej heparyny dla trzech razy z obu dołków GFP i GFP TMEM184A. Czas po transfekcji wpływa na rozkład TMEM184A GFP, który wydaje się kumulować przez co najmniej 72 godziny, przy czym z czasem w regionie parajądrowym pojawia się więcej GFP.Wzór barwienia GFP w tej reprezentatywnej hodowli komórek naczyniowych wydaje się być najbardziej podobny do przeciwciała podniesionego przeciwko peptydowi C-końcowemu, co jest logicznym wynikiem, biorąc pod uwagę, że GFP znajduje się na C-końcu białka. Zastosowanie liganda fluoresceina-rodamina-heparyna może być również wykorzystane do oceny kolokalizacji receptora liganda w czasie rzeczywistym. Wychwyt heparyny jest zwiększony w GFP TMEM184A konstruowania transfekowanych stabilnych komórek knockdown, w wyniku czego komórki mogą odzyskać zdolność do internalizacji heparyny rodaminy na poziomie lub powyżej komórek typu dzikiego.Wykorzystując zademonstrowany system taktu GFP kodowany plazmidem, wyizolowany TMEM184A konstrukt GFP z przeciwciałem anty-GFP wykazuje specyficzne wiązanie heparyny satriple, podczas gdy kontrolny GFP nie wiąże żadnej heparyny. Proste barwienie immunofluorescencyjne przeciwciałami ponownie GFP może również dostarczyć informacji o lokalizacji GFP, w oparciu o dostęp przeciwciał w komórkach nieprzepuszczalnych, dostarczając wstępnych dowodów na to, że GFP wyrażany na błonie plazmatycznej jest pozakomórkowy. Po opanowaniu, technika ta może zaowocować doskonałą ekspresją konstruktu GFP, po 24 do 48 godzinach hodowli.Podczas próby protokołu obrazowania na żywo należy pamiętać, że niektóre komórki mogą nie wykazywać kolokalizowanego wychwytu, dlatego często konieczne jest zbadanie innych komórek. Testy wiązania z ligandami GFP mogą być skomplikowane ze względu na dimery lub agregaty wyższego rzędu białka GFP, szczególnie jeśli znajdują się one w micelach detergentowych. Ogólnie rzecz biorąc, ekspresja białek znakowanych GFP może ułatwić przeprowadzenie wielu różnych eksperymentów w celu potwierdzenia tożsamości nieznanego wcześniej białka.

using-gfp-tagged-tmem184a-construct-for-confirmation-heparin-receptor

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Tutaj demonstrujemy użycie fluorescencyjnego barwnika Alexa sprzężonego z α-bungarotoksyną do pomiaru lokalizacji powierzchni receptora GABA A i endocytozy w neuronach hipokampa. Dzięki zastosowaniu konstruktów z krótkim znacznikiem zewnątrzkomórkowym, który wiąże α-bungarotoksynę, można uzyskać analizę transportu endocytarnego białek błony komórkowej.

Używanie znacznika miejsca wiązania α-bungarotoksyny do badania lokalizacji i transportu błony receptora GABA A

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Białka otoczki jądrowej odgrywają kluczową rolę w wielu podstawowych procesach biologicznych i są związane z różnymi chorobami ludzkimi.  Protokół ten opisuje nowy model myszy oparty na Cre/Lox, który pozwala na czasoprzestrzenną kontrolę zakłóceń kompleksów LINC.

Walidacja modelu mysiego w celu rozbicia kompleksów LINC w sposób specyficzny dla komórki

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Ten artykuł przedstawia metodę badania transportu receptora glutaminianu (GluR) w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa. Wykorzystując podejście oparte na podawaniu przeciwciał do znakowania endogennych lub nadmiernie eksprymowanych receptorów w połączeniu z podejściami farmakologicznymi, metoda ta pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych regulujących ekspresję powierzchniową GluR poprzez modulację procesów internalizacji lub recyklingu.

Podejście do karmienia przeciwciałami w celu zbadania transportu receptora glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

Ten artykuł przedstawia protokół izolacji błony plazmatycznej na małą skalę w celu scharakteryzowania białka Cdr1 Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), którego nadekspresja występuje w Saccharomyces cerevisiae. Podwójny znacznik c-końcowy mGFPHis z rozszczepialnym proteazą z łącznikiem 16 reszt między Cdr1 a znacznikiem został zaprojektowany w celu ułatwienia oczyszczania i przesiewania detergentem Cdr1.

Preparat błony plazmatycznej na małą skalę do analizy Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Poznaj metodę znakowania GFP receptora TMEM184A w celu potwierdzenia jego roli jako receptora heparyny w komórkach naczyniowych. Technika ta umożliwia identyfikację białek i badanie ich funkcji w czasie rzeczywistym.

Wykorzystanie konstruktu TMEM184A znakowanego GFP w celu potwierdzenia tożsamości receptora heparyny

Przeglądaj więcej filmów