Wykorzystanie konstruktu TMEM184A znakowanego GFP w celu potwierdzenia tożsamości receptora heparyny

Ogólnym celem użycia konstruktu znakowanego GFP jest potwierdzenie tożsamości wcześniej nieznanego białka przy użyciu GFP jako uchwytu. Metoda ta może pomóc w funkcjonalnej identyfikacji genów sierocych, gdy określona aktywność enzymatyczna nie jest dostępna do potwierdzenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że znacznik GPF pozwala na użycie tego samego konstruktu do kilku rodzajów eksperymentów.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć problemy, ponieważ transfekcja nie zawsze prowadzi do ekspresji silnego konstruktu, a komórki nie zawsze się ożywiają. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, kiedy zaczęliśmy dostrzegać trudności w identyfikacji białka przy użyciu samych przeciwciał wytworzonych przeciwko niemu. Rozpocznij od ponownego zawieszenia interesujących komórek w jednym mililitrze buforowanego przez HEPES buforowanego solą fizjologiczną bufora elektroporacyjnego i natychmiast umieść ogniwa na lodzie.

Dodaj do komórek wystarczającą objętość osocza znakowanego TMEM184A GFP, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 mikrogramów na mililitr DNA, a następnie przenieś około 0,4 mililitra komórek do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji. Elektroporuj ogniwa. Następnie obejrzyj transfekowane komórki na szalkach do hodowli tkankowych i umieść je w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 do 72 godzin.

Etap transfekcji jest najbardziej krytycznym etapem procedury, ponieważ większość pozostałych prac eksperymentalnych nie może być skutecznie wykonana, jeśli komórki nie są zdolne do życia i nie wyrażają znaczących poziomów konstruktu znakowanego GFP. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie czasowym dodać 100 mikrogramów na mililitr heparyny rodaminy do pożywki do hodowli komórek wykazujących ekspresję plazmidu GFP i inkubować komórki, chronione przed światłem, aż do osiągnięcia pożądanego poziomu barwienia, obserwowanego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Następnie przepłucz komórki PBS i przez kilka sekund delikatnie wstrząsaj, chroniąc przed światłem, a następnie utrwalaj 4% paraformaldehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem.

Aby ocenić kolokalizację heparyny rodaminy znakowanej GFP, należy użyć mikroskopu konfokalnego z odpowiednim GFP i wzbudzeniem rodaminy oraz zmniejszonymi laserami, aby zobrazować co najmniej 50 komórek z każdego oddzielnego eksperymentu znakowania. Zbadaj obrazy w odpowiednim programie do analizy obrazu, aby określić względne znajdowanie i wychwyt rodaminy w każdej komórce, używając narzędzia odręcznego do zakreślania komórek w każdym obrazie fluorescencyjnym. Użyj narzędzia miary, aby określić intensywność w każdym zakreślonym obszarze, a następnie wyeksportuj dane dotyczące intensywności fluorescencji do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć obszar pomnożony przez intensywność, odejmując tło dla tej samej ilości obszaru dla każdej komórki.

Fluorescencja na komórkę może być następnie uśredniona dla wszystkich komórek, aby uzyskać statystycznie istotne dane. Aby ułatwić transfer energii rezonansu fluorescencyjnego z TMEM184A GFP do heparyny rodaminy, najpierw zamontuj GFP TMEM184A transfekuj komórki znakowane heparyną rodaminy na szklanych szkiełkach mikroskopowych. Wzbudzić komórki na 405 nanometrach w celu zobrazowania emisji rodaminy, a następnie wzbudzić 488 nanometrów, aby zobrazować emisję GFP.

Następnie wzbudz komórki w odległości 561 nanometrów, aby uzyskać drugie obrazowanie emisji rodaminy. W celu obrazowania żywych komórek wychwytu heparyny rodaminy, należy zasiać 100-mililitrową kulturę konfluentnych komórek transfekowanych TMEM184A GFP do 635-milimetrowych naczyń do obrazowania żywych komórek, aby uzyskać komórki w pobliżu zbiegu. Po 48 godzinach zastąp supernatant pożywką hodowlaną bez czerwieni fenolowej i przenieś miskę z komórkami do mikroskopu konfokalnego ze stopniem ogrzewania ustawionym na 37 stopni Celsjusza.

Skoncentruj mikroskop i dodaj 100 mikrogramów na mililitr heparyny rodaminy do komórek, delikatnie mieszając. Następnie natychmiast rozpocznij nagrywanie obrazów na żywo. Jeśli w polu widzenia nie występuje wychwyt heparyny, należy lekko przesunąć szalkę, aby zidentyfikować komórki z co najmniej jednym zielonym pęcherzykiem zawierającym etykietę rodaminy.

W celu oceny wiązania heparyny in vitro należy przepłukać jedną czarną 96-dołkową płytkę pokrytą ativanem i jedną czarną niepowlekaną 96-dołkową płytkę 200 mikrolitrami 0,2% CHAPS PBS pro-well przez trzy pięciominutowe płukanie z potrząsaniem. Po ostatnim przemyciu dodać 100 mikrolitrów po 60 pikomoli na studzienkę biotynylowanego anty-GFP w trzech egzemplarzach do płytki pokrytej ativanem dla każdej grupy wykrywającej GFP. Następnie dodać bufor tylko do studzienek kontrolnych i uszczelnić wszystkie studzienki pokrywą płytki na dwugodzinną inkubację w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem.

Pod koniec inkubacji umyć wszystkie studzienki trzykrotnie w CHAPS PBS, jak właśnie pokazano, i dodać 100 mikrolitrów po pięć nanomoli na studzienkę TMEM184A GFP lub samego GFP do odpowiednich dołków na płytce pokrytej ativanem. Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem, umyć wszystkie studzienki świeżym CHAPS PBS i dodać 100 mikrolitrów każdego eksperymentalnego stężenia heparyny fluoresceinowej do odpowiednich studzienek testowych w trzech egzemplarzach, na płytkę pokrytą ativanem. Dodać wzorce stężenia zarówno do płytek pokrytych ativanem, jak i niepowlekanych, i inkubować obie płytki przez 10 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając, chroniąc przed światłem.

Teraz użyj czytnika płytek, aby zarejestrować początkową emisję fluorescencji heparyny w studzienkach kontrolnych obu płytek oraz początkową całkowitą emisję fluorescencji z dołków z unieruchomionym TMEM184A GFP lub GFP na płytce pokrytej ativanem. Następnie przenieść niezwiązaną heparynę fluorescencyjną z dołków z unieruchomionym TMEM184A GFP lub GFP do odpowiednich studzienek w niepowlekanej czarnej płytce. Po natychmiastowym odczycie emisji fluorescencji na niepowlekanej czarnej płytce, dodać 100 mikrolitrów świeżego PBS CHAPS z powrotem do studzienek, z których usunięto heparynę fluoresceinową, i odczytać emisje fluorescencji dla tych studzienek, aby uzyskać emisję fluorescencji z usuniętych, niezwiązanych próbek na niepowlekanej płytce.

Po uzyskaniu wszystkich odczytów bez ograniczeń, należy użyć całkowitych wartości emisji heparyny, aby potwierdzić, że do każdego dołka dodano prawidłowe poziomy heparyny, odejmując średnie odczyty tła od wartości. Następnie utwórz wykres emisji w stosunku do całkowitej dodanej heparyny fluoresceinowej, aby określić skalę emisji w stosunku do ilości heparyny i wykreślić skorygowaną związaną heparynę w funkcji dodanej heparyny dla trzech razy z obu dołków GFP i GFP TMEM184A. Czas po transfekcji wpływa na rozkład TMEM184A GFP, który wydaje się kumulować przez co najmniej 72 godziny, przy czym z czasem w regionie parajądrowym pojawia się więcej GFP.

Wzór barwienia GFP w tej reprezentatywnej hodowli komórek naczyniowych wydaje się być najbardziej podobny do przeciwciała podniesionego przeciwko peptydowi C-końcowemu, co jest logicznym wynikiem, biorąc pod uwagę, że GFP znajduje się na C-końcu białka. Zastosowanie liganda fluoresceina-rodamina-heparyna może być również wykorzystane do oceny kolokalizacji receptora liganda w czasie rzeczywistym. Wychwyt heparyny jest zwiększony w GFP TMEM184A konstruowania transfekowanych stabilnych komórek knockdown, w wyniku czego komórki mogą odzyskać zdolność do internalizacji heparyny rodaminy na poziomie lub powyżej komórek typu dzikiego.

Wykorzystując zademonstrowany system taktu GFP kodowany plazmidem, wyizolowany TMEM184A konstrukt GFP z przeciwciałem anty-GFP wykazuje specyficzne wiązanie heparyny satriple, podczas gdy kontrolny GFP nie wiąże żadnej heparyny. Proste barwienie immunofluorescencyjne przeciwciałami ponownie GFP może również dostarczyć informacji o lokalizacji GFP, w oparciu o dostęp przeciwciał w komórkach nieprzepuszczalnych, dostarczając wstępnych dowodów na to, że GFP wyrażany na błonie plazmatycznej jest pozakomórkowy. Po opanowaniu, technika ta może zaowocować doskonałą ekspresją konstruktu GFP, po 24 do 48 godzinach hodowli.

Podczas próby protokołu obrazowania na żywo należy pamiętać, że niektóre komórki mogą nie wykazywać kolokalizowanego wychwytu, dlatego często konieczne jest zbadanie innych komórek. Testy wiązania z ligandami GFP mogą być skomplikowane ze względu na dimery lub agregaty wyższego rzędu białka GFP, szczególnie jeśli znajdują się one w micelach detergentowych. Ogólnie rzecz biorąc, ekspresja białek znakowanych GFP może ułatwić przeprowadzenie wielu różnych eksperymentów w celu potwierdzenia tożsamości nieznanego wcześniej białka.