Name: Rozwarstwienie pęcherza słuchowego u myszy po urodzeniu: izolacja kości ucha środkowego i analiza histologiczna (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Naucz się izolacji pęcherza słuchowego i kosteczek ucha u myszy po urodzeniu. Ta metoda umożliwia analizę histologiczną i badanie biologii rany oraz endochondralnej ossyfikacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Masakiemu Yodze i Elise Lamar za krytyczne przeczytanie manuskryptu, Kazumasie Takenouchi za pomoc w histologii, Mari Fujiwarze za pomoc w mikroskopii i Makoto Morikawie za pomoc w fotografowaniu kosteczek słuchowych ludzi i myszy.

Wszystkie procedury na zwierzętach wykonywane w tym badaniu są zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Keio (IACUC - numer zatwierdzenia: 09221) i są zgodne z Wytycznymi Instytucjonalnymi dotyczącymi Eksperymentów na Zwierzętach na Uniwersytecie Keio dotyczącymi wykorzystania zwierząt w badaniach. Próbki ludzkie zostały wyizolowane ze zwłok przekazanych Wydziałowi Anatomii Szkoły Medycznej Uniwersytetu Keio i zostały wykorzystane zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
1. Izolacja pęcherza słuchowego i kapsułki
<ol>
	<li>Myszy należy poddać eutanazji w słoiku zawierającym platformę nad ręcznikami papierowymi nasączonymi izofluranem lub sewofluranem, aż do ustania wentylacji oddechowej na dłużej niż minutę, a następnie wykonać zwichnięcie szyjki macicy. Uważaj, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu myszy z nasączonymi ręcznikami papierowymi.</li>
	<li>Wykonaj małe poprzeczne nacięcie po grzbietowej stronie szyi i rozciągnij skórę w kierunku głowy i ogona, używając obu rąk, aby odsłonić leżącą pod spodem tkankę mięśniową szyi.</li>
	<li>Odetnij głowę myszom w okolicy szyjki macicy za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych o długości 14 cm.</li>
	<li>Złuszcz skórę całkowicie w kierunku nosa. Odetnij całą skórę razem z pyskiem i siekaczami.</li>
	<li>Włóż nożyczki do ust i odetnij mięśnie żwaczy po obu stronach.</li>
	<li>Ostrożnie otwórz szczękę i usuń razem język i dolną szczękę.</li>
	<li>Za pomocą ostrych nożyczek podziel czaszkę i podstawę czaszki na dwie połowy wzdłuż płaszczyzny strzałkowej (ryc. 1A, B).</li>
	<li>Za pomocą kleszczy usuń półkule mózgowe i móżdżkowe oraz pień mózgu. Bulla słuchowa i torebka znajdują się po stronie móżdżku i pnia mózgu. Należy zauważyć, że pęcherz słuchowy jest bardziej boczny w stosunku do torebki słuchowej (ryc. 1C, D).</li>
	<li>Wyciąć pęcherz i torebkę z otaczającą ją kością czaszki (ryc. 1E).</li>
	<li>Przenieść próbkę do naczynia zawierającego sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) o pH 7,4 w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pod lornetkowym mikroskopem preparacyjnym użyj kleszczy, aby rozsunąć otaczające kości i nożyczek, aby przeciąć poluzowaną granicę wokół pęcherza i torebki (ryc. 1F). Usunięte otaczające kości to kości podstawno-potyliczne (granica brzuszna), zewnątrzpotyliczna (granica brzuszno-tylna), nadopotylicza (granica tylna), międzyciemieniowa, ciemieniowa (granica grzbietowa), łuskowa (granica grzbietowo-przednia), alisphenoidalna (granica przednia) i podstawno-brzuszna (granica przednio-brzuszna). Należy zauważyć, że wyrostek rylcowy (Sp), który podtrzymuje otwór bębenkowy trąbki Eustachiusza 41, różni się od wyrostka rylcowatego kości skroniowej.</li>
</ol>
2. Izolacja kosteczek słuchowych: młoteczka, kowadełka i strzemiączka 
<ol>
	<li>młoteczek
	<ol>
		<li>Używając zarówno małych nożyczek, jak i kleszczy, usuń część zewnętrznego przewodu słuchowego boczną w stosunku do bruzdy bębenkowej, tak aby błona bębenkowa była widoczna (ryc. 2A, B).</li>
		<li>Usuń część błony bębenkowej i kości bębenkowej w pobliżu wyrostka krzyżówkowego (apofiza oczokątna, patrz Dyskusja), zarówno na ścianie brzusznej (kropkowanej), jak i tylnej (#) (ryc. 2C). Młoteczek i mięsień napinacza błony bębenkowej powinny być teraz odsłonięte (ryc. 2D, E).</li>
		<li>Podnieś młoteczek (ryc. 2F) i przetnij mięsień napinacza błony bębenkowej ściętą krawędzią igły 27 G (ryc. 2G). Należy zauważyć, że manubrium kostki mocno przylega do błony bębenkowej, jak to ma miejsce u innych ssaków.</li>
		<li>Ostrożnie odłącz błonę bębenkową od manubrium, które jest delikatne. Usuń kość bębenkową, aby odsłonić trzy kosteczki słuchowe.</li>
		<li>Zwichnąć młoteczek z kowadełka w stawie kosteczek słuchowych (ryc. 2H).</li>
		<li>Odizoluj młoteczek, pękając przedni wyrostek w goniale.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kowadełko i strzemiączko
	<ol>
		<li>Wyizoluj kowadełko, odcinając więzadło tylne kowadełka na krótkim podkuciu (ryc. 3A).</li>
		<li>Odizoluj strzemiączko, odcinając tętnicę strzemiączkową w pobliżu strzemiączka za pomocą skośnej krawędzi igły 27 G (ryc. 3B, C). W razie potrzeby przeciąć igłą ścięgno mięśnia strzemiączkowego w wyrostku mięśniowym strzemiączka.</li>
		<li>Włóż igłę do szycia (lub szpilkę do znakowania) w otwór zasłonowy strzemiączka i podnieś strzemiączka. Po zdjęciu strzemiączka owalny otwór okienny powinien być wyraźnie widoczny (ryc. 3D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Osadzanie pęcherza słuchowego i kapsuły
<ol>
	<li>Preparat do zatapiania w blokach parafinowych
	<ol>
		<li>Odizolować pęcherz i kapsułkę zgodnie z opisem w punkcie 1.</li>
		<li>Odciąć przedni koniec pęcherza (wyrostek rylcowaty) nożyczkami, zanurzyć bulla i kapsułkę w 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBS w temperaturze 4 °C i pozwolić utrwalaczowi wejść do pęcherza. Jeśli powietrze zostanie uwięzione w pęcherzu, usuń je za pomocą igły i strzykawki. Pozostawić bulla i kapsułkę w utrwalaczu w temperaturze 4 °C O/N na rotatorze probówkowym. 
		Uwaga: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.</li>
		<li>Umyj raz za pomocą PBS.</li>
		<li>Odwapnić pęcherz i kapsułkę przez tydzień w temperaturze 4 °C w 10% dwuwodnej soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA-2Na), 100 mM zasady Tris, pH 7,0, w probówce o pojemności 2 ml. Zmieniaj bufor co drugi dzień.</li>
		<li>Umyj raz za pomocą PBS. Próbki można przechowywać w 70% etanolu w wodzie o temperaturze 4 °C. Opcjonalnie przenieść do 70% etanolu za pomocą serii alkoholi o gradowanej zawartości alkoholu (30%, 50%, 70% w wodzie).</li>
		<li>Na procesorze tkanek odwodnić próbki w stopniowanej serii roztworów etanolu (70%, 2 x 95%, 3 x 100%, każda 1 godzina), oczyścić w ksylenie (4 razy, każda 1 godzina w temperaturze 40 °C) i naciekać próbki stopionym woskiem parafinowym42. Opcjonalnie zastąp ksylen dostępnym w handlu roztworem do oczyszczania tkanek (np. Histo-Clear).</li>
		<li>Rozładuj próbki z procesora i wyjmij je z kaset.</li>
		<li>Na konsoli do zatapiania tkanek umieść próbki w foremkach wypełnionych stopionym woskiem parafinowym. Przejdź do osadzania (sekcja 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat do zatapiania w zamrożonych blokach (metoda foliowa Kawamoto)43
	<ol>
		<li>Odizolować pęcherz i kapsułkę zgodnie z opisem w punkcie 1.</li>
		<li>Odciąć przedni koniec pęcherza (wyrostek rylcowy) nożyczkami, zanurzyć pęcherz i kapsułkę w utrwalaczu (2% lub 1% PFA zamiast 4% w PBS w celu zachowania antygenowości) w temperaturze 4 °C. Jeśli powietrze jest uwięzione w bulli, usuń je za pomocą igły i strzykawki. Pozostawić bulla i kapsułkę w utrwalaczu w temperaturze 4 °C O/N na rotatorze probówki.</li>
		<li>Szybko umyć bulla i kapsułkę w PBS i natychmiast zanurzyć w płynnym związku do zatapiania w krioterapii w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ważne: Usuń pęcherzyki powietrza, jeśli występują, w uchu środkowym i zewnętrznym poprzez aspirację igłą i dodanie masy osadzającej za pomocą kleszczy. Przejdź do osadzania (sekcja 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Orientacja próbki i osadzanie
UWAGA: Cała bulla i kapsuła muszą być ułożone w określonej orientacji podczas osadzania, aby wyciąć pożądane sekcje. Procedury opisane poniżej służą do cięcia młoteczka w różnych orientacjach.
<ol>
	<li>Przekrój podłużny (przystrzałkowy) młoteczka
	<ol>
		<li>Połóż boczną stronę pęcherza lub zewnętrznego przewodu słuchowego w ciepłej parafinie (lub związku kriogenicznym). Dostosuj orientację tak, aby szyjka i blaszka poprzeczna młoteczka były równoległe do poziomego dna naczynia do zatapiania (Rysunek 4A - C). Należy zauważyć, że błona bębenkowa jest nachylona pod kątem około 30° do pionu w głowie myszy (ryc. 4A; Rysunek 59 w Kampen44).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poziome przecięcie młoteczka
	<ol>
		<li>Umieść grzebień grzbietowy poziomo w ciepłej parafinie (lub związku do zatapiania w krio). Dostosuj orientację pęcherza i kapsułki tak, aby szyjka i blaszka poprzeczna młoteczka były prostopadłe do dna naczynia do osadzania (Rysunek 4D - F).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekrój czołowy (przekroje poprzeczne) błony bębenkowej i bębenkowej 5
	<ol>
		<li>Umieść manubrium z kostki w ciepłej parafinie (lub związku do zatapiania w krio) tak, aby było prostopadłe do dna naczynia do zatapiania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Schłodzić blok do temperatury odpowiedniej do utwardzenia wosku parafinowego na konsoli do zatapiania tkanek (alternatywnie należy użyć środka do zatapiania w suchym lodzie / kąpieli heksanowej).</li>
	<li>Przetwarzaj tkanki, blokuj i wycinaj skrawki za pomocą rutynowych procedur. Na przykład skrawki parafiny barwić hematoksyliną i eozyną (H&E), safraniną O (dla chrząstki) lub dla aktywności fosfatazy kwasowej odpornej na winian (TRAP) (dla osteoklastów) 3 lub za pomocą immunohistochemii. Nieodwapnione kriosekcje nadają się do znakowania kości przy użyciu fluorochromów 14, barwienia czerwienią alizarynową wapnia i immunofluorescencji 42.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy metodę przydatną do izolacji pęcherza słuchowego i torebki u myszy po urodzeniu. Przed P12 tkanki są delikatne i mogą ulec uszkodzeniu podczas izolacji. Po P12 pęcherz słuchowy i torebkę można łatwo odizolować od otaczających tkanek. Wypreparowanie pęcherza z głowy przed cięciem ma kilka zalet. Po pierwsze, kawitacja poporodowa i wzrost pęcherza słuchowego zachodzą najaktywniej od P6 i kończą się do P14 50. Tkanka mezenchymalna między błoną bębenkową a ścianą ślimaka jest zastępowana powietrzem w procesie kawitacji. Powstające powietrze w jamie ucha środkowego może utrudniać kontakt tkanek z płynami podczas utrwalania, odwapniania i osadzania. Łatwiej jest usunąć powietrze z izolowanego pęcherza słuchowego, odcinając przedni koniec (wyrostek rylcowy), niż próbując to zrobić w nieizolowanym pęcherzu. Po drugie, orientacja młoteczka (i błony bębenkowej) nie jest pionowa w głowie. Dlatego łatwiej jest podzielić młoteczek na pożądane płaszczyzny, osadzając izolowaną pęcherz słuchowy i torebkę w danej orientacji.
Po wyizolowaniu pęcherze słuchowe i kapsułki są przydatne do wielu analiz. Na przykład mikrotomografia rentgenowska o wysokiej rozdzielczości może ujawnić morfologię mikrostruktury kości, taką jak naczynia włosowate osteogenne w młoteczku 14. Mikroskop stereofluorescencyjny jest potężnym narzędziem do wizualizacji struktur w ocenie myszy reporterowych wyrażających białka fluorescencyjne w uchu środkowym lub wewnętrznym 33. Ponadto można podjąć różne metody znakowania fluorescencji in vivo lub ex vivo i wykrywania immunofluorescencji całej góry. Mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego jest również przydatna do analizy trójwymiarowej 51. Chociaż nie zostało to tutaj opisane, za pomocą tego protokołu można również ocenić różne struktury anatomiczne związane z pęcherzem słuchowym i torebką, takie jak nerwy obwodowe, naczynia krwionośne i błona bębenkowa w uchu środkowym.
Należy pamiętać, że cięcie parafinowe wymaga odwapnienia tkanek kostnych przed osadzeniem i dlatego nie pozwala na analizę mineralizacji. Natomiast metoda filmu Kawamoto 43 stosowana do przygotowania zamrożonych skrawków może być wykonywana bez odwapniania i nadaje się do badań mineralizacji przy użyciu technik znakowania kości in vivo lub specjalnego barwienia, takiego jak barwienie alizaryną. Warunki kriosekcji powinny być zoptymalizowane w zależności od wieku myszy. Na przykład w przypadku starszych próbek myszy zaleca się mniej niską temperaturę wewnątrz komory kriostatu, aby zminimalizować uszkodzenia sekcji.
U myszy prawidłowym terminem dla wydatnego półkulistego występu młoteczka jest "apofiza orbicular apophysis". Niemniej jednak termin "processus brevis" jest szeroko stosowany do określenia apofizy orbikularnej od ponad dwóch dekad, szczególnie wśród biologów zajmujących się rozwojem myszy 16,20,22-25. "Processus brevis" pierwotnie odnosił się do wyrostka bocznego (processus lateralis), który różni się od apofizy oczolnej. U ludzi wyrostek boczny przypominający lekką stożkową projekcję tworzy ogólną linię przyczepu do błony bębenkowej, rozciągającą się od manubrium (niewidoczna na rycinie 6B, widok przyśrodkowy). U myszy wyrostek boczny jest również projekcją manubrium na przeciwległym końcu do baldachimu 48. Pars flaccida błony bębenkowej znajduje się powyżej bocznego wyrostka młoteczka. Apofiza oczodołu nie jest widoczna w ludzkim młoteczku.

Trzy kosteczki słuchowe ucha środkowego, a mianowicie młoteczek, kowadełko i strzemiączko, tworzą specyficzny dla ssaków łańcuch słuchowy, który przekazuje dźwięk z błony bębenkowej do ucha wewnętrznego, czyli ślimaka 1,2. Funkcję słuchu można ocenić u myszy, mierząc progi słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR) 3-6, a wibracje młoteczka za błoną bębenkową można monitorować za pomocą laserowej wibrometrii dopplerowskiej (LDV) 7. Łącząc pomiary ABR, LDV i otoemisji akustycznej produktu zniekształceń (DPOAE), przewodzeniowy ubytek słuchu można odróżnić od upośledzenia czuciowo-nerwowego 8.
Zwierzęce modele chorób uszu są potrzebne, biorąc pod uwagę znaczenie słuchu i zdrowia uszu dla dobrego samopoczucia pacjentów w każdym wieku. Na przykład zapalenie ucha środkowego jest niezwykle powszechną infekcją ucha obserwowaną u niemowląt i dzieci, a ciężkie, ostre zapalenie ucha środkowego i jego powikłania mogą wystąpić, jeśli stan ten nie jest leczony odpowiednimi środkami przeciwdrobnoustrojowymi 9. Mysie modele zapalenia ucha środkowego mogą okazać się przydatne w zrozumieniu patogenezy i opracowaniu metod leczenia 10,11.
Mysie kosteczki słuchowe, które (z wyjątkiem goniale części młoteczka) powstają w wyniku kostnienia śródchrzęstnego 12,13, są bardzo istotne dla badania metabolizmu i morfogenezy kości. Po pierwsze, ich niewielkie rozmiary pozwalają na analizę kości z nienaruszoną okostną w wysokiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopii rentgenowskiej lub fluorescencyjnej 14. Po drugie, nieprawidłowy metabolizm kości, taki jak nadmierna lub niedostateczna resorpcja kości lub upośledzone interakcje między komórkami kostnymi 15, może być analizowany jako potencjalny czynnik przyczyniający się do utraty słuchu 3,4,7. Po trzecie, nieprawidłowa morfogeneza kosteczek słuchowych jest zgłaszana u kilku myszy z niedoborem genu, takich jak zwierzęta pozbawione Hoxa2 16-19, Msx1 20-22, Prrx1 23, Goosecoid (Gsc) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, Fgfr1 29, receptory hormonów tarczycy (Thra, Thrb) 5, Bcl2 30 i inne 1,31, lub u myszy z nadekspresją Hoxa2 32. Wreszcie, pomimo niewielkich rozmiarów, dostępne są struktury związane z kosteczkami słuchowymi, takie jak mięśnie 33 i stawy 34,35.
Kosteczki mysie są mniejsze niż kosteczki ludzkie, ale warto zauważyć, że środkowe ucho myszy nie jest miniaturową wersją swojego ludzkiego odpowiednika. Na przykład u myszy tętnica strzemiączkowa, która przechodzi przez pierścień strzemiączka, utrzymuje się przez całe życie 36, podczas gdy u ludzi zarodkowa tętnica strzemiączkowa zanika podczas ciąży. Ponadto morfologia młoteczka myszy różni się od morfologii kości ludzkiej (patrz ryc. 6). U myszy pęcherz słuchowy (bębenkowy) otacza wypełnioną powietrzem jamę ucha środkowego, podczas gdy u ludzi komórki powietrzne wyrostka sutkowatego złożone z kości beleczkowej w kości skroniowej mieszczą kosteczki słuchowe, a nie pęcherz 37. U obu gatunków torebka słuchowa (torebka uszna, błędnik kostny) otacza ślimak i kanały półkoliste ucha wewnętrznego. Biologia porównawcza i ewolucyjna ucha środkowego została poddana obszernemu przeglądowi 38-40.
Poniższy protokół najpierw opisuje, jak rozdzielić pęcherz słuchowy i torebkę, które składają się głównie z ucha środkowego i ucha wewnętrznego. Protokół ten pokazuje również, jak odizolować młoteczek, kowadełko i strzemiączko od pęcherza słuchowego. Na koniec pokazano, jak zorientować pęcherz słuchowy i torebkę do osadzenia w ramach przygotowań do wycięcia tkanek kosteczek słuchowych.

<table><tbody><tr><td>Narzędzia/Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ręcznik papierowy</td><td>Daio Paper Corporation</td><td>703347</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>Szklany słoik</td><td>Różne</td><td></td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne 14 cm</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>91400-14</td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Bardzo drobne nożyczki proste</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14084-08</td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Kleszcze drobne kątowe 45&deg; </td><td>Narzędzia Nauki Precyzyjnej (F.S.T.)</td><td>11063-07</td><td>można kupić u innych dostawców Mikroskop</td></tr><tr><td>preparacyjny</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>do rutynowej sekcji</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>do filmów&nbsp;</td></tr><tr><td>Igła iniekcyjna 27 G</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td> Strzykawka <td></td></tr><tr><td>(1 mL)</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Znacznik</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotator rurowy RT-50</td><td>TAITEC</td><td>0000165-000</td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/</td></tr> <tr><td>TC-65 Ostrze wolframowe</td><td>Leica</td><td>14021626379</td><td>do twardej metody Kawamoto</td></tr><tr><td>Pojemniki ze stali nierdzewnej</td><td>Leica</td><td></td><td>do twardej metody Kawamoto</td></tr><tr><td>Kriofilm typu IIC</td><td>Leica</td><td></td><td>do twardej metody Kawamoto</td></tr><tr><td>Szkiełko pokryte silanem (New Silane II)</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>511617</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe</td><td>Matsunami</td><td></td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>Procesor tkanek</td><td>Sakura Finetek</td><td>VIP-5</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>System konsoli do osadzania tkanek</td><td>Sakura Finetek</td><td>Tissue-Tek TEC 5&nbsp;</td><td>można kupić od innych sprzedawców</td></tr><tr><td>Mikrotom przesuwny do parafiny</td><td>Yamato Kohki Industrial</td><td>REM-710</td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Path Blade+pro do tkanek twardych</td><td>Matsunami</td><td>PB3503C</td><td>do sekcji parafinowej</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>RIGAKU</td><td>R_mCT2</td><td>http://www.rigaku.com/en</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa </td><td>Company<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Maruishi pharmaceutical Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>wako</td><td>191-01665</td><td>dla PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>wako</td><td>285-14</td><td>dla PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4 12H2O</td><td>wako</td><td>196-02835</td><td>dla PBS</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>wako</td><td>287-21</td><td>dla PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA, klasa EM)</td><td>TAAB</td><td>P001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>wako</td><td>15111-45</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Super Cryoembedding Medium</td><td>Leica</td><td></td><td>do twardej metody Kawamoto</td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td>Różne</td><td></td><td>do twardej metody Kawamoto</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>wako</td><td>080-03423</td><td>do twardej metody Kawamoto</td></tr><tr><td>Super Cryomouting Medium typ R2</td><td>Leica</td><td></td><td>do twardej metody Kawamoto</td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Sakura Finetek</td><td>781001A0107</td><td></td></tr><tr><td>Histo-Clear</td><td>NDS</td><td>HS-200</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>DOJINDO</td><td>340-00433</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina&nbsp;</td><td>wako</td><td>131-09665</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>wako</td><td>051-06515</td><td></td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie pęcherza słuchowego u myszy po urodzeniu: izolacja kości ucha środkowego i analiza histologiczna

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

U większości ssaków, kosteczki słuchowe w uchu środkowym, w tym młoteczek, kowadełko i strzemiączko, są najmniejszymi kośćmi. U myszy struktura kostna zwana pęcherzem słuchowym mieści kosteczki słuchowe, podczas gdy torebka słuchowa otacza ucho wewnętrzne, a mianowicie ślimak i kanały półkoliste. Mysie kosteczki słuchowe są niezbędne do słyszenia i dlatego cieszą się dużym zainteresowaniem badaczy w dziedzinie otolaryngologii, ale ich metabolizm, rozwój i ewolucja są bardzo istotne dla innych dziedzin. Zmieniony metabolizm kości może wpływać na funkcje słuchu u dorosłych myszy, a różne myszy z niedoborem genów wykazują zmiany w morfogenezie kosteczek słuchowych w macicy. Chociaż mysie kosteczki słuchowe są małe, ich manipulacja jest możliwa, jeśli zrozumie się ich anatomiczną orientację i strukturę 3D. Tutaj opisujemy, jak rozciąć pęcherz słuchowy i torebkę myszy po urodzeniu, a następnie wyizolować poszczególne kosteczki słuchowe poprzez usunięcie części pęcherza. Omawiamy również, jak osadzić bullę i kapsułkę w różnych orientacjach, aby wytworzyć parafinę lub zamrożone sekcje odpowiednie do przygotowania podłużnych, poziomych lub czołowych odcinków młoteczka. Na koniec wyliczamy różnice anatomiczne między kosteczkami słuchowymi myszy i człowieka. Metody te byłyby przydatne w analizie patologicznych, rozwojowych i ewolucyjnych aspektów kosteczek słuchowych i ucha środkowego u myszy.

Niniejszy protokół przedstawia metodę izolacji kostek słuchowych z pęcherzyka słuchowego myszy. Najpierw pęcherzyk oraz kapsuła są wypreparowywane z czaszki jako pojedynczy fragment (Rycina 1). Następnie wypreparowany pęcherzyk jest wykorzystywany do przygotowania młoteczka (Rycina 2) oraz kowadełka i strzemiączka (Rycina 3). Punktami orientacyjnymi pęcherzyka słuchowego i kapsuły są wyrostek stylopodowy na przednim końcu pęcherzyka, grzebień grzbietowy, przedni półokrągły kanał oraz dołek podłukowy (Rycina 1F). Obrazowanie mikrotomografią komputerową (CT) pozwala uwidocznić kostki słuchowe w pęcherzyku słuchowym, a także wyznaczyć optymalne orientacje dla przekrojów podłużnych i poprzecznych tych kostek (Rycina 4).
W celu wykonania podłużnych przekrojów parafiny młoteczka, bąbel oraz torebka zostali zdekalcyfikowane w EDTA w temperaturze 4 °C przez tydzień, zatopione w bloku parafiny w orientacji pokazanej na Rysunku 4 A - C, pocięte na plastry o grubości 4 µm, a następnie barwione H&amp;E. Młoteczek przytwierdzony do błony bębenkowej w bąblu słuchowym wykazywał trwającą kostnienie endochondralne w dniu P14 (Rysunek 5A). Aby zwizualizować tworzenie nowej kości, myszy w dniu P20 wstrzyknięto do otrzewnej kalceinę (30 µg/g masy ciała), a bąbel i torebkę wyizolowano 24 h później, w dniu P21. Próbkę bez dekalkyfikacji zamrożono i wykonano krioprzekroje o grubości 6 µm przy użyciu folii adhezyjnej zgodnie z metodą Kawamoto 43. Po barwieniu jąder komórkowych DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), przekrój oglądano pod mikroskopem fluorescencyjnym. Sygnały kalceiny (zielone) ujawniły tworzenie nowej kości w młoteczku (m), bąblu i torebce (Rysunek 5B). W celu wykonania przekrojów poziomych młoteczka, bąbel słuchowy wyizolowany z 5-tygodniowej myszy zamrożono bez dekalkyfikacji (orientację przedstawiono na Rysunku 4D - F), wykonano krioprzekroje o grubości 6 µm metodą Kawamoto i zbarwiono H&amp;E. Poziome przekroje wyrostka krótkiego młoteczka (mPB) ukazują również ślimaka (Rysunek 5C).
Widok od strony przyśrodkowej prawych kosteczek słuchowych wyizolowanych z myszy P31 pokazuje typowe cechy młoteczka mysiego, mianowicie trzonek przypominający „ślizgające się skrzydło mewy” (lub perski miecz 45), wystający wyrostek krótki (apofiza okrągła, patrz Dyskusja) oraz blaszkę poprzeczną (Rysunek 6). Należy zauważyć, że wyrostek przedni (processus anterior) uległ złamaniu podczas procedury sekcji w okolicy goniale i został oddzielony od pierścienia błonnego (ectotympanic). Ta reprezentatywna próbka wykazuje nienaruszone stawu młoteczkowo-kowadłowego pomiędzy młoteczkiem a kowadłem, podczas gdy staw kowadłowo-strzemiączkowy jest zwichnięty. Wykrywalne są przyczepy ścięgniste do wyrostków mięśniowych młoteczka i strzemiączka (Rysunek 6A, gwiazdkami).
Rysunek 6B porównuje kosteczki słuchowe myszy i człowieka przy tym samym powiększeniu. Różnice międzygatunkowe, poza rozmiarem, obejmują następujące cechy. Trzonek młoteczka u myszy ma kształt skrzydła, natomiast u ludzi przypomina maczugę. Kąt między osią anatomiczną (lub osią obrotu, czyli linią przechodzącą przez wyrostek przedni młoteczka i wyrostek krótki kowadełka) a trzonkiem jest znacznie mniejszy u myszy i oba elementy są prawie równoległe, w przeciwieństwie do niemal prostopadłego ustawienia u ludzi 6,46-48. W przypadku kosteczek człowieka badania wibrometryjne wykazują, że staw kowadełkowo-młoteczkowy jest ruchomy, a nie funkcjonalnie nieruchomy 49. Młoteczek myszy wykazuje szeroką, cienką i płaską blaszkę poprzeczną, która nie występuje u ludzi 47. U myszy processus anterior zrasta się z kośćmi błoniastymi, mianowicie z goniale i pierścieniem błonnym, podczas gdy u ludzi processus anterior jest zredukowany do niewielkiej kostnej skierości 41. Strzemię myszy i człowieka również się różni: u myszy ramionko przednie jest zakrzywione, a ramionko tylne bardziej proste, podczas gdy u ludzi ramionko przednie jest prostsze niż tylne. Warto zauważyć, że głowa młoteczka w stosunku do wielkości ciała jest masywnie powiększona u gatunków takich jak kret złoty, co wykazuje znaczną zmienność w relacjach allometrycznych „najmniejszych” kości 48.
<img alt="Schemat sekwencji sekcji anatomicznej obrazujący różne obszary mózgu i nerwy czaszkowe." src="/files/ftp_upload/55054/55054fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Disekcja bąbla słuchowego i torebki. (A) Czaszka myszy w 31. dniu po urodzeniu (P31) jest podzielona na prawą i lewą połowę. A – przednia; P – tylna; L – lewa; R – prawa. (B) Powierzchnia przyśrodkowa prawej połowy przeciętej i obdartej ze skóry głowy. Cx, kora mózgowa; Cb, móżdżek; Bs, pień mózgu. D, grzbietowa; V, brzuszna. (C) Usuwanie mózgu za pomocą pęsety. (D) Widok przyśrodkowy torebki słuchowej w czaszce prawej. Grzebień grzbietowy (groty strzałek) znajduje się pomiędzy jamą czaszki środkową (mcf) a jamą czaszki tylną (pcf) i oddziela powierzchnię grzbietowo-przednią od powierzchni brzuszno-tylnej torebki słuchowej. Pasek skali, 2 mm. (E) Powiększenie bąbelka słuchowego i torebki (widok przyśrodkowy). Co, ślimak; VII, nerw twarzowy; VIII, nerw przedsionkowo-ślimakowy; AC, przedni (górny) kanał półkolisty; Sf, dołek podłukowaty, w którym znajduje się paraflokulus móżdżku. Pasek skali, 1 mm. (F) Mikrograf wyizolowanej bąbelka słuchowej i torebki (widok przyśrodkowy). Sp, wyrostek styloidalny. Pasek skali, 1 mm.A - E), mysz P31. (F), mysz P3. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Anatomia mięczaków: opisane obrazy z sekcji przedstawiające struktury wewnętrzne; schemat badawczy do celów edukacyjnych." src="/files/ftp_upload/55054/55054fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Disekcja młoteczka. (A) Widok brzuszno-boczny prawej byczeli słuchowej i torebki. Bruzda bębenkowa (ST, przerywana strzałka) jest miejscem przyczepu błony bębenkowej. Kość położona bocznie od ST stanowi część ucha zewnętrznego, a kość położona przyśmianowo od ST tworzy dno jamy ucha środkowego. A, przedni; P, tylny; D, grzbietowy; V, brzuszny. (B) Widok po usunięciu przewodu słuchowego zewnętrznego, odsłaniający błonę bębenkową (TM), w tym część wiotką (Pf) oraz część napiętą (Pt). (C) Usunięcie fragmentów kości bębenkowej (linie przerywane i #) w pobliżu krótkiego wyrostka młoteczka (mPB). m, młoteczek; mM, trzonek młoteczka. Strzałka: pęcherzyk powietrza w jamie ucha środkowego widoczny przez błonę bębenkową. (D) Odsłonięty młoteczek. Wskazano główkę młoteczka. Linia przerywana wskazuje powierzchnię stawową obrządka. (E) Ścięgno mięśnia napinacza błony bębenkowej (TT) przyczepione do młoteczka. (F) Mięsień napinaczy błony bębenkowej jest naciągany podczas uniesienia młoteczka. *, wyrostek mięśniowy. (G) Mięsień naprężacz błony bębenkowej zostaje przecięty za pomocą igły. (H) Trzy kosteczki słuchowe po usunięciu błony bębenkowej. Staw między młoteczkem a kowadełkiem jest zwichnięty. m, młoteczek; i, kowadełko; s, strzemiączko; Go, goniale (zrośnięte z młteczkiem i pierścieniem bębenkowym, TR). Wszystkie paski skali, 0,5 mm.A, H), mysz P3. (B - G), mysz P31. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy z opisanymi strukturami ślimaka, schemat części ucha wewnętrznego, nauka o słuchu." src="/files/ftp_upload/55054/55054fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Disekcja kowadełka i strzemiączka. (A) Kowadełko i stemiączko po usunięciu młoteczka. Tętnica stemiączkowa (SA) przebiega przez stemiączko (s). Linia przerywana oznacza powierzchnię stawową kowadełka. Należy zwrócić uwagę, że krótka odnoga (iCB, crus breve) kowadełka (i) jest utrwalona przez więzadło tylne (niewidoczne). Gwiazdka: wyrostek mięśniowy stemiączka. (B) Stapes po usunięciu kowadełka. Końcówka igły służy do przecięcia tętnicy strzemiennej (SA). Strzałka wskazuje kierunek przepływu krwi. Linia przerywana oznacza powierzchnię stawową strzemiączka. (C) Tętnica strzemiączkowa zostaje usunięta ze strzemiączka. X oznacza przecięty koniec tętnicy strzemiączkowej (SA). (D) okno owalne (Ow, okienko owalne lub okno owalne) jest widoczne po usunięciu strzemienia. Rw, okno owalne (okno owalne lub okno owalne). Paski skali, 0,5 mm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopowe obrazowanie fluorescencyjne; schematy przekrojów podłużnych i poprzecznych; analiza strukturalna." src="/files/ftp_upload/55054/55054fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4. Ustawienie bąbelka słuchowego i torebki podczas zatapiania do przekrojów podłużnych (parasagitalnych, A – C) i poziomych (D – E) Krojenie na skrawki młoteczka. (A - C) Szyjka i blaszka poprzeczna młoteczka są ustawione równolegle do dna naczynia do zatapiania. (A) Widok z boku: obraz mikro-CT przedstawiający zatopienie prawego młoteczka w bąbelku (pseudokolor niebieski). Młoteczek i kowadełko są zaznaczone pseudokolorem zielonym. Linia przerywana – pożądana płaszczyzna cięcia. Linia ciągła – dno naczynia do zatapiania. m, młoteczek; groty strzałek, grzebień grzbietowy. M, przyśrodkowo; L, bocznie; D, grzbietowo; V, brzusznie. (B) Widok z góry: obraz mikro-CT. Należy zauważyć, że przedni koniec bąbla (wyrostek stylopodny) został usunięty. i, kowadełko. (C) Widok z góry: mikrografia (wykonana z użyciem filtra kolorowego). AC, przedni (górny) kanał półkolisty; Sf, dołek podłukowy; Sp, wyrostek styloidalny. A, przedni; P, tylny; D, grzbietowy; V, brzuszny. (D – F) Wyrostek krótki młoteczka należy umieścić prostopadle do dna naczynia do zatapiania. (D) Widok z boku: Obraz mikro-CT pokazujący zatopienie prawego młoteczka. Linia przerywana – pożądana płaszczyzna cięcia. Linia ciągła – dno naczynia do zatapiania. (E) Widok z góry: obraz mikrotomografii komputerowej (micro-CT). mM, trzon kostki. (F) Widok z góry: mikrografia (wykonana z użyciem filtra kolorystycznego). Paski skali: 1 mm. Obrazy mikro-CT uzyskano przy rozdzielczości woksela wynoszącej 5 μmzgodnie z wcześniejszym opisem 7. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy histologiczne: parafina H&amp;E, krio-kalceina, rozwój kości, analiza przekrojów, badanie naukowe." src="/files/ftp_upload/55054/55054fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rycina 5. Histologia. (A) H&amp;Barwienie E. Przekrój podłużny (parasagitalny) zatopionego w parafinie prawego młoteczka (m) w pęcherzyku słuchowym (linia przerywana) w 14. dniu po urodzeniu (P14). TM, błona bębenkowa. (B) Markowanie kości kalceiną. Przekrój podłużny zamrożonego, nieodwapionego lewego młoteczka (m) w sromniku u myszy w 21. dniu po urodzeniu (P21). Przeciwbarwienie: DAPI. (C) H&amp;Barwienie E. Przekrój poziomy zamrożonego, nieodwapionego lewego wyrostka krótkiego kostki Malleus (mPB) w obrębie bąbla i torebki słuchowej (mysz w wieku 5 tygodni). Co, ślimak. Paski skali, 1 mm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat anatomiczny przedstawiający opisane sekcje kości; struktura głowy i szyi; sekcja eksperymentalna." src="/files/ftp_upload/55054/55054fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rycina 6. Widok przyśrodkowy kosteczek słuchowych. (A) Prawe kosteczki słuchowe myszy P31. A, przedni; P, tylny; D, grzbietowy; V, brzuszny. Pasek skali, 1 mm. główka młoteczka (Caput mallei, Capitulum mallei); szyjka (Collum mallei); blaszka (lamina poprzeczna); mM (Manubrium mallei); czarna gwiazdka (wyrostek mięśniowy młoteczka); mPA (Processus anterior, Processus gracilis); mPB (processus brevis); trzon kowadełka (Corpus incudis); iCB (Crus breve, krótka noga, krótki wyrostek); iCL (Crus longum, długa noga, długi wyrostek); iPL (Processus lenticularis, wyrostek soczewkowaty, wyrostek Sylwiusza); główka strzemiączka (Caput stapedis); biała gwiazdka (wyrostek mięśniowy strzemiączka); sCA (Crus anterius, noga przednia); sCP (Crus posterius, noga tylna); stopa (Basis stapedis, stopa strzemiączka); sOF (otwór obturatora, otwór między predictability nogami). (B) Prawe kosteczki słuchowe 76-letniej kobiety (uprzejmie udostępnione przez Department of Anatomy, Keio University School of Medicine). Kosteczki myszy P31 (prawy dolny róg) obrazowano przy tym samym powiększeniu, co w przypadku kosteczek ludzkich. Zakrzywione strzałki wskazują kąt między osią anatomiczną a uchwytem młoteczka (linie przerywane). Pasek skali: 2 mm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Przedstawiamy protokół izolowania pęcherza słuchowego, torebki i kosteczek słuchowych od myszy po urodzeniu w celu przeprowadzenia całego wierzchowca i analizy histologicznej.

Rozwarstwienie pęcherza słuchowego u myszy po urodzeniu: izolacja kości ucha środkowego i analiza histologiczna

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Ogólnym celem procedury preparacji jest wyizolowanie pęcherza słuchowego i torebki, a następnie poszczególnych kosteczek słuchowych od myszy po urodzeniu w celu przeprowadzenia różnych analiz całościowych i histologicznych. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii ran, takie jak mechanizmy słabej morfogenezy, kostnienie śródchrzęstne czy słaby metabolizm minerałów. Metoda ta opiera się na dogłębnej znajomości szczegółów anatomicznych.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają przygodę z myszą jako systemem biologicznym, mogą mieć problemy, ponieważ ich wiedza na temat ludzkiego ucha środkowego może nie mieć zastosowania do mysiego odpowiednika. Procedurę zademonstruje Ayako Sakamoto, technik w moim laboratorium. Rozpocznij od umieszczenia pęcherza słuchowego i kapsułki z otaczającą kością czaszki w naczyniu na próbkę zawierającą buforowaną fosforanami sól fizjologiczną o pH 7,4 w temperaturze pokojowej.Pod lornetkowym mikroskopem preparacyjnym zidentyfikuj kości czaszki otaczające torebkę słuchową, jak pokazano tutaj. Użyj jednego zestawu kleszczy, aby chwycić otaczającą czaszkę, a drugiego zestawu, aby odciągnąć kość podstawno-fenoidalną i potyliczną. Następnie za pomocą kleszczy delikatnie odciągnij kości międzyciemieniowe i ciemieniowe od kapsułki i wyjmij je po całkowitym poluzowaniu.Następnie odciągnij łuskę od pęcherza i torebki i delikatnie oderwij kość i tkanki miękkie. Następnie chwyć ucho zewnętrzne i odwróć próbkę, aby odsłonić przyśrodkową stronę. Następnie obróć próbkę o 180 stopni, chwyć kapsułkę i odciągnij pozostałe tkanki miękkie.Grzebień grzbietowy jest teraz widoczny. Pod tym kątem wyraźnie widoczne są nerwy twarzowe i przedsionkowo-ślimakowe w przewodzie słuchowym wewnętrznym, dole podłukowatym i przednim kanale półkolistym. Gdy grzebień grzbietowy jest pochylony w kierunku dna naczynia rozwarstwiającego, pęcherz słuchowy jest wyraźnie widoczny.Jeśli preparat jest lekko pochylony, młoteczek jest widoczny w pęcherzu. Zacznij od użycia kleszczy do złamania zewnętrznego kanału słuchowego powyżej młoteczka i bocznego do bruzdy bębenkowej. Utwórz drugą fakturę przed pierwszą.Następnie usuń fragment zewnętrznego przewodu słuchowego tak, aby błona bębenkowa była widoczna. Następnie usuń część błony bębenkowej i kość bębenkową w pobliżu wyrostka krzyżkowego zarówno na ścianie brzusznej, jak i tylnej. Młoteczek, kowadełko, strzemiączko i mięsień napinacza błony bębenkowej powinny być teraz odsłonięte.Podnieś młoteczek i przetnij mięsień napinacza błony bębenkowej za pomocą ściętej krawędzi igły o rozmiarze 27. Należy zauważyć, że manubrium kostki mocno przylega do błony bębenkowej, jak to ma miejsce u innych ssaków. Zwichnąć młoteczek od kowadełka w stawie koszystek słuchowych poprzez złamanie przedniego wyrostka młoteczka w goniale.Odizoluj młoteczek od pęcherza słuchowego za pomocą kleszczy. Usuń większą część pęcherza słuchowego, aby odsłonić kowadełko i strzemiączko. Następnie użyj ściętej krawędzi igły o rozmiarze 27, aby odciąć tylne więzadło kowadełka na krótkim grzebieniu.Odizoluj kowadełko za pomocą kleszczy. Odetnij tętnicę strzemiączkową w pobliżu strzemiączka ściętą krawędzią igły o rozmiarze 27. Obrócić próbkę tak, aby okrągłe okienko znajdowało się na dole.Następnie włóż igłę do szycia w otwór zasłonowy strzemiączka i podnieś strzemiączko. Po zdjęciu strzemiączka owalny otwór okienny powinien być wyraźnie widoczny. Użyj igły o rozmiarze 27, aby odepchnąć strzemiączko od igły do szycia.Aby rozpocząć osadzanie tkanki, najpierw użyj nożyczek, aby odciąć wyrostek rylcowy na przednim końcu pęcherza. Młoteczek i grzebień grzbietowy są widoczne przez wyciętą część. Zanurz bulla i kapsułkę w 1-2% paraformaldehydzie w PBS.Jeśli powietrze jest uwięzione w pęcherzu, usuń je za pomocą igły i strzykawki. Pozostaw bullę i kapsułkę w utrwalaczu w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc na rotatorze rurowym. Następnego dnia szybko umyj bullę i kapsułkę w PBS.Następnie natychmiast zanurz w płynnym związku do zatapiania w krioterapii w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Często zdarza się, że pęcherzyki powietrza tworzą się w związku kriozatapiającym na poziomie ucha środkowego i zewnętrznego. Usunąć pęcherzyk powietrza z ucha środkowego poprzez aspirację za pomocą igły.Tę samą technikę należy zastosować do pęcherzyków powietrza w uchu zewnętrznym. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza należy ustawić tkankę zgodnie z rodzajem skrawków, które mają zostać uzyskane. Tkanka może być następnie osadzona w zamrożonych blokach przed cięciem.Ten obraz pokazuje barwienie H i E podłużnego odcinka parafinowego odwapnionego młoteczka, oznaczonego literą M, oraz pęcherza słuchowego i torebki myszy P14. Błona bębenkowa jest oznaczona literą TM. Ten obraz przedstawia wapniowe oznakowanie kości podłużnego odcinka zamrożonego, nieodwapnionego młoteczka, oznaczonego literą M, oraz pęcherza słuchowego myszy P21. Zielone sygnały wapniowe ujawniają nowe tworzenie się kości w młoteczku, pęcherzu i torebce.Po opanowaniu techniki, pęcherz słuchowy i torebka mogą zostać odizolowane w ciągu dziesięciu minut, jeśli procedura zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć anatomiczne orientacje kosteczek słuchowych i pęcherza u myszy, które zostały opisane w tekście głównym.

dissection-auditory-bulla-postnatal-mice-isolation-middle-ear-bones

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Istnieją różne metody wprowadzania czynników ototoksycznych do ślimaków modeli zwierzęcych. Przedstawiono protokół chirurgiczny dostarczania środków ototoksycznych do wnęki okrągłego okna. Procedura jest niezawodna, tworzy ukierunkowane zmiany wewnątrzślimakowe i pozwala uniknąć mechanicznych uszkodzeń mikroarchitektury. Możliwe jest badanie samonaprawy/regeneracji ślimaka.

Mysie podejście oparte na okrągłym oknie do dostarczania czynników ototoksycznych: szybka i niezawodna technika indukowania zwyrodnienia komórek ślimakowych

Pierwotne rzęski wpływają na różne szlaki sygnałowe. Ślimak ssaków jest idealny do badania sygnalizacji biegunowości komórek płaskich (PCP). Dysfunkcja rzęsek wpływa na rozrost ślimaka, wzór komórkowy i orientację komórek rzęsatych, odczyty PCP. Naszym celem jest analiza sygnalizacji PCP w ślimaku myszy za pomocą analizy fenotypowej, immunohistochemii i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii

Przedstawiamy metodę izolowania dorosłego organu Cortiego jako trzech nienaruszonych zwojów ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa). Demonstrujemy również procedurę barwienia immunologicznego za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Razem techniki te pozwalają na badanie komórek rzęsatych, komórek podporowych i innych typów komórek znajdujących się w ślimaku.

Rozwarstwienie całej góry i immunofluorescencja ślimaka dorosłej myszy

Opisano tutaj i porównano dwa podejścia mikrochirurgiczne do miejscowego dostarczania leków do ucha wewnętrznego pod względem wpływu na parametry słuchu, cytoarchitekturę ślimaka i ekspresję markerów stanu zapalnego.

Badanie porównawcze metod dostarczania leków ukierunkowanych do ucha wewnętrznego myszy: pęcherzyk a wstrzyknięcie przezbębenkowe

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie skutecznej metody decelularyzacji i odkamieniania ślimaków myszy w celu wykorzystania ich jako rusztowań do zastosowań inżynierii tkankowej.

Protokół decelularyzacji ślimaków myszy w inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego

Zwierzęce modele implantów ślimakowych mogą poszerzyć wiedzę na temat technologicznych podstaw leczenia trwałego odbiorczego ubytku słuchu za pomocą stymulacji elektrycznej. W badaniu przedstawiono protokół chirurgiczny ogłuszenia i implantacji ślimakowej zestawu elektrod u myszy, a także ocenę funkcjonalną z odpowiedzią słuchową pnia mózgu.

Operacja wszczepienia implantu ślimakowego i elektrycznie wywołane nagrania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u myszy C57BL/6

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Ten artykuł przedstawia zmodyfikowaną metodę przygotowania powierzchni ślimaka, która wymaga odwapnienia i użycia kleju komórkowego i tkankowego do przyklejenia kawałków nabłonka ślimaka do 10 mm okrągłych szkiełek nakrywkowych do immunohistochemii u dorosłych ślimaków myszy.

Przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy

Prążek naczyniowy jest niezbędny do generowania potencjału wewnątrzślimakowego. Tutaj przedstawiamy sekcję rozstępów naczyniowych dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego.

Rozwarstwienie rozstępu naczyniowego dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od myszy. Początkowo narząd Cortiego został wypreparowany z noworodków (w wieku 3-5 dni) mysich ślimaków pod mikroskopem. Następnie komórki trawiono enzymatycznie do zawiesiny jednokomórkowej i identyfikowano za pomocą immunofluorescencji po kilku dniach w hodowli.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od nowonarodzonych myszy

Przedstawiamy tutaj protokół izolacji, oczyszczania i hodowli pierwotnych komórek marginalnych z myszy stria vascularis oraz do tworzenia in vitro modeli stresu oksydacyjnego i starzenia komórkowego w celu badania zaburzeń ściany bocznej ślimaka.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek brzegowych prążkowania naczyniowego u noworodkowych myszy

Naucz się izolacji pęcherza słuchowego i kosteczek ucha u myszy po urodzeniu. Ta metoda umożliwia analizę histologiczną i badanie biologii rany oraz endochondralnej ossyfikacji.

Rozwarstwienie pęcherza słuchowego u myszy po urodzeniu: izolacja kości ucha środkowego i analiza histologiczna

Przeglądaj więcej filmów