Rozwarstwienie pęcherza słuchowego u myszy po urodzeniu: izolacja kości ucha środkowego i analiza histologiczna

Ogólnym celem procedury preparacji jest wyizolowanie pęcherza słuchowego i torebki, a następnie poszczególnych kosteczek słuchowych od myszy po urodzeniu w celu przeprowadzenia różnych analiz całościowych i histologicznych. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii ran, takie jak mechanizmy słabej morfogenezy, kostnienie śródchrzęstne czy słaby metabolizm minerałów. Metoda ta opiera się na dogłębnej znajomości szczegółów anatomicznych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają przygodę z myszą jako systemem biologicznym, mogą mieć problemy, ponieważ ich wiedza na temat ludzkiego ucha środkowego może nie mieć zastosowania do mysiego odpowiednika. Procedurę zademonstruje Ayako Sakamoto, technik w moim laboratorium. Rozpocznij od umieszczenia pęcherza słuchowego i kapsułki z otaczającą kością czaszki w naczyniu na próbkę zawierającą buforowaną fosforanami sól fizjologiczną o pH 7,4 w temperaturze pokojowej.

Pod lornetkowym mikroskopem preparacyjnym zidentyfikuj kości czaszki otaczające torebkę słuchową, jak pokazano tutaj. Użyj jednego zestawu kleszczy, aby chwycić otaczającą czaszkę, a drugiego zestawu, aby odciągnąć kość podstawno-fenoidalną i potyliczną. Następnie za pomocą kleszczy delikatnie odciągnij kości międzyciemieniowe i ciemieniowe od kapsułki i wyjmij je po całkowitym poluzowaniu.

Następnie odciągnij łuskę od pęcherza i torebki i delikatnie oderwij kość i tkanki miękkie. Następnie chwyć ucho zewnętrzne i odwróć próbkę, aby odsłonić przyśrodkową stronę. Następnie obróć próbkę o 180 stopni, chwyć kapsułkę i odciągnij pozostałe tkanki miękkie.

Grzebień grzbietowy jest teraz widoczny. Pod tym kątem wyraźnie widoczne są nerwy twarzowe i przedsionkowo-ślimakowe w przewodzie słuchowym wewnętrznym, dole podłukowatym i przednim kanale półkolistym. Gdy grzebień grzbietowy jest pochylony w kierunku dna naczynia rozwarstwiającego, pęcherz słuchowy jest wyraźnie widoczny.

Jeśli preparat jest lekko pochylony, młoteczek jest widoczny w pęcherzu. Zacznij od użycia kleszczy do złamania zewnętrznego kanału słuchowego powyżej młoteczka i bocznego do bruzdy bębenkowej. Utwórz drugą fakturę przed pierwszą.

Następnie usuń fragment zewnętrznego przewodu słuchowego tak, aby błona bębenkowa była widoczna. Następnie usuń część błony bębenkowej i kość bębenkową w pobliżu wyrostka krzyżkowego zarówno na ścianie brzusznej, jak i tylnej. Młoteczek, kowadełko, strzemiączko i mięsień napinacza błony bębenkowej powinny być teraz odsłonięte.

Podnieś młoteczek i przetnij mięsień napinacza błony bębenkowej za pomocą ściętej krawędzi igły o rozmiarze 27. Należy zauważyć, że manubrium kostki mocno przylega do błony bębenkowej, jak to ma miejsce u innych ssaków. Zwichnąć młoteczek od kowadełka w stawie koszystek słuchowych poprzez złamanie przedniego wyrostka młoteczka w goniale.

Odizoluj młoteczek od pęcherza słuchowego za pomocą kleszczy. Usuń większą część pęcherza słuchowego, aby odsłonić kowadełko i strzemiączko. Następnie użyj ściętej krawędzi igły o rozmiarze 27, aby odciąć tylne więzadło kowadełka na krótkim grzebieniu.

Odizoluj kowadełko za pomocą kleszczy. Odetnij tętnicę strzemiączkową w pobliżu strzemiączka ściętą krawędzią igły o rozmiarze 27. Obrócić próbkę tak, aby okrągłe okienko znajdowało się na dole.

Następnie włóż igłę do szycia w otwór zasłonowy strzemiączka i podnieś strzemiączko. Po zdjęciu strzemiączka owalny otwór okienny powinien być wyraźnie widoczny. Użyj igły o rozmiarze 27, aby odepchnąć strzemiączko od igły do szycia.

Aby rozpocząć osadzanie tkanki, najpierw użyj nożyczek, aby odciąć wyrostek rylcowy na przednim końcu pęcherza. Młoteczek i grzebień grzbietowy są widoczne przez wyciętą część. Zanurz bulla i kapsułkę w 1-2% paraformaldehydzie w PBS.

Jeśli powietrze jest uwięzione w pęcherzu, usuń je za pomocą igły i strzykawki. Pozostaw bullę i kapsułkę w utrwalaczu w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc na rotatorze rurowym. Następnego dnia szybko umyj bullę i kapsułkę w PBS.

Następnie natychmiast zanurz w płynnym związku do zatapiania w krioterapii w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Często zdarza się, że pęcherzyki powietrza tworzą się w związku kriozatapiającym na poziomie ucha środkowego i zewnętrznego. Usunąć pęcherzyk powietrza z ucha środkowego poprzez aspirację za pomocą igły.

Tę samą technikę należy zastosować do pęcherzyków powietrza w uchu zewnętrznym. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza należy ustawić tkankę zgodnie z rodzajem skrawków, które mają zostać uzyskane. Tkanka może być następnie osadzona w zamrożonych blokach przed cięciem.

Ten obraz pokazuje barwienie H i E podłużnego odcinka parafinowego odwapnionego młoteczka, oznaczonego literą M, oraz pęcherza słuchowego i torebki myszy P14. Błona bębenkowa jest oznaczona literą TM. Ten obraz przedstawia wapniowe oznakowanie kości podłużnego odcinka zamrożonego, nieodwapnionego młoteczka, oznaczonego literą M, oraz pęcherza słuchowego myszy P21. Zielone sygnały wapniowe ujawniają nowe tworzenie się kości w młoteczku, pęcherzu i torebce.

Po opanowaniu techniki, pęcherz słuchowy i torebka mogą zostać odizolowane w ciągu dziesięciu minut, jeśli procedura zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć anatomiczne orientacje kosteczek słuchowych i pęcherza u myszy, które zostały opisane w tekście głównym.