Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych
12 grudnia 2016
Kolejne kriosekcje są zbierane, aby umożliwić zastosowania histologiczne i wzbogacenie RNA do pomiarów ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Wysokiej jakości RNA uzyskuje się z 20 - 30 mg zbiorczych kriosekcji, a pomiary są bezpośrednio porównywane między aplikacjami.
Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie analizy parametrów histologicznych i molekularnych z sąsiednich odcinków pojedynczej tkanki. Dzięki tej metodzie możemy pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii i chorób mięśni szkieletowych. Na przykład, jakie są efekty regeneracyjne po urazie mięśni i jakie są skutki dostarczania genów wirusa przez wstrzyknięcie domięśniowe?
Zaletą tej metody jest to, że dane histologiczne i molekularne mogą być bezpośrednio skorelowane z pojedynczej tkanki. Pozwala to na skuteczniejszą analizę danych i lepsze wykorzystanie tkanek eksperymentalnych. Pięć minut przed zakończeniem sekcji schłodzić kąpiel kriokonserwacyjną.
Gdy próbki tkanek są gotowe do zatopienia, najpierw nałóż żywicę osadzającą na dolną jedną trzecią do połowy tkanki, gdzie mięsień styka się z korkiem. Należy to zrobić starannie, aby zmniejszyć interferencję żywicy z dalszymi etapami. Następnie natychmiast wrzuć korek do kąpieli 2-metylobutanowej schłodzonej do minus 140 stopni Celsjusza.
Zawiera do ośmiu preparatów tkankowych w każdej partii. W kąpieli mieszaj chusteczki przez 30 sekund, zeskrobując dno zlewki, aby zapobiec zamarzaniu korków tkanek w roztworze. Po 30 sekundach za pomocą metalowego narzędzia wyciągnij korek na bibułę z 2-metylobutanu.
Następnie szybko usuń podtrzymujący szkiełko nakrywkowe. Wklep nadmiar 2-metylobutanu z powrotem do kąpieli, a następnie wrzuć korek tkankowy do zewnętrznej kąpieli azotowej. Po przeniesieniu wszystkich tkanek do ciekłego azotu przenieś je do pojemnika i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Po przygotowaniu kriostatu i zamontowaniu próbki tkanki, użyj zgrubnych i precyzyjnych elementów sterujących, aby przesunąć próbkę do ostrza, tak aby dotykała ostrza. W tym momencie zresetuj sumę grubości przekroju do zera. Następnie ustaw kriostat na funkcję trymowania z grubością przekroju 30 mikronów.
I wytnij i wyrzuć skrawki do żądanej głębokości tkanki. Aby skutecznie zebrać kriosekcje do ekstrakcji RNA, najpierw otwórz probówkę zbiorczą i umieść ją w pobliżu nośnika ostrza. Tam użyj wstępnie schłodzonej, czystej szczotki, aby podnieść każdą sekcję i przenieść ją do tuby.
Połączone 30-mikronowe przednie odcinki kości piszczelowej myszy pobrane z głębokości tkanki od 400 do 4 000 mikronów zwykle dają od 25 do 50 miligramów mięśni. Jeśli zatopiona żywica otacza kriosekcję, zablokuj hamulec ręczny i użyj żyletki, aby zgolić małe kawałki żywicy, aż wokół górnej części mięśnia pozostanie tylko cienka warstwa. Zawsze tnij żywicę ostrzem odchylonym od mięśnia.
Cienka warstwa żywicy zatapiającej nie wpływa znacząco na ekstrakcję RNA. Jeśli obecna jest grubsza żywica do zatapiania, użyj szczotek, aby oderwać ją od mięśnia przed przeniesieniem kriosekcji do probówki zbiorczej. Podczas procesu cięcia, gdy pożądane są skrawki histologiczne, należy zresetować grubość plastra do siedmiu mikronów za pomocą kontrolek kriostatu.
Następnie wytnij i odrzuć od czterech do siedmiu odcinków, aby uzyskać spójną, równą powierzchnię tkanki i zanotuj tę głębokość tkanki. Teraz wytnij dobry odcinek i zorientuj go na powierzchni nośnika ostrza. Używając szkiełka mikroskopowego o temperaturze pokojowej, podnieś sekcję i przywróć szkiełko do temperatury pokojowej.
Zbierz wszystkie żądane sekcje, a następnie zanotuj ostateczną głębokość tkanki. Po zakończeniu sekcji szybko zapisz masę połączonych kriosekcji do izolacji RNA. Natychmiast włóż probówkę z powrotem do komory kriostatu, aby utrzymać temperaturę sekcji w pobliżu minus 20 stopni Celsjusza.
Zacznij od szybkiego przeniesienia zebranych kriosekcji do lodu i dodania około jednego mililetera odczynnika do ekstrakcji organicznego RNA na 50 miligramów kriosekcji. Im szybciej odczynnik zostanie zastosowany, tym mniej RNA ulega degradacji. Następnie za pomocą jednomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 18 homogenizuj kriosekcje bez tworzenia zbyt wielu pęcherzyków, wielokrotnie pobierając roztwór i wyrzucając go na ścianki probówki.
Użyj końcówki igły, aby rozproszyć zbrylone kawałki. Po każdych pięciu pociągnięciach na krótko umieść próbkę z powrotem na lodzie, aby ostygła. Po homogenizacji użyj igły o rozmiarze 22, aby ostrożnie rozcierać próbkę, wykonując pięć kolejnych pociągnięć.
Następnie umieść próbkę z powrotem w lodzie. Powtórz ten proces trzy lub cztery razy, aby uzyskać bardzo drobno zdyspergowaną jednorodność tkanki. Po przygotowaniu końcowego homogenatu pozwól mu inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby rozbić kompleksy molekularne.
Następnie w dygestorium dodaj 0,1 mililitra BCP na mililitr odczynnika do izolacji RNA. Następnie energicznie potrząsaj tubką przez 15 sekund. Nie używaj wiru.
Następnie inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech minut. Po krótkiej inkubacji odwirować próbkę przez 15 minut w temperaturze 12 000 g i czterech stopniach Celsjusza. Następnie ostrożnie zbierz przezroczystą górną fazę zawierającą RNA.
Przenieś go do czystej probówki i dodaj równą objętość 70% etanolu, przygotowanego w głębokiej wodzie morskiej. Po krótkim wirowaniu probówki, pozwól jej inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej i postępuj zgodnie z protokołem tekstowym. Preparaty RNA mięśni szkieletowych wykonano z przedniej kości piszczelowej myszy.
Trzy dni wcześniej niektórym mięśniom wstrzyknięto 10 mikromolową kardiotoksynę, a innym sól fizjologiczną. Czystość i wydajność RNA z tych próbek była doskonała. Wydajność RNA była znacznie wyższa w mięśniach piszczelowych przednich po uszkodzeniu toksyną.
Integralność tkanek i produkcja RNA mogą mieć wpływ na tę obserwację. Trwałość przygotowanego RNA oceniano przy użyciu jednego mikrolitra RNA, który był przechowywany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 18 miesięcy. Wyraźne prążki rybosomalnego RNA 18S i 28S są nadal widoczne w próbkach wykazujących wysoką jakość RNA.
Siedmiomikronowe skrawki barwiono pod kątem ekspresji embrionalnego łańcucha ciężkiego miozyny, widocznego na czerwono. Aby wykryć regenerujące się włókna, barwione na kolagen sześć, widoczne na zielono, które obrysowują włókna mięśniowe i zabarwione dappy, na niebiesko, aby obserwować jądra. Kiedy wstrzyknięcie toksyny jest złe, uraz wydaje się minimalny.
Udane wstrzyknięcie toksyny powoduje, że dotknięty jest znacznie większy obszar docelowego przedziału mięśniowego. Stopień uszkodzenia może być wykorzystany jako kryterium włączenia do analizy RNA. Po opanowaniu, cięcie odcinków do ekstrakcji RNA i szkiełka histologicznego można wykonać w mniej niż pół godziny dla pojedynczej tkanki.
Po tej procedurze można śledzić inne barwniki histologiczne lub immunofluorescencyjne, aby odpowiedzieć na wiele różnych pytań. Kriosekcje zbiorcze mogą być również używane do pobierania DNA lub białka.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza procedura umożliwia analizę parametrów histologicznych i molekularnych z sąsiednich skrawków tej samej tkanki, a konkretnie mięśnia szkieletowego myszy. Ułatwia ona korelację danych histologicznych i molekularnych, co usprawnia analizę danych oraz wykorzystanie tkanek eksperymentalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biologia
- badania nad mięśniami szkieletowymi
Wprowadzenie
- Kolejne skrawki mrożone są pobierane do zastosowań histologicznych.
- Wzbogacanie RNA do pomiarów ekspresji genów jest przeprowadzane z obszarów sąsiednich.
- Wysokiej jakości RNA jest pozyskiwane z połączonych skrawków mrożonych.
- Metoda ta umożliwia bezpośrednie porównanie wyników między różnymi zastosowaniami.
Cel badania
- Analiza efektów regeneracyjnych po urazie mięśniowym.
- Badanie efektów wirusowej dostawy genów poprzez wstrzyknięcie domięśniowe.
- Korelacja danych histologicznych i molekularnych z jednej tkanki.
Zastosowane metody
- Kriokonserwacja próbek tkanek.
- Pobieranie następujących po sobie skrawków mrożonych.
- Ekstrakcja RNA z połączonych skrawków mrożonych.
- Analiza histologiczna sąsiednich skrawków tkanki.
Główne wyniki
- Wysokiej jakości RNA można uzyskać z 20 - 30 mg połączonych skrawków mrożonych.
- Dane histologiczne i molekularne można skutecznie skorelować.
- Metoda ta usprawnia analizę tkanek eksperymentalnych.
- Można dzięki niej odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii mięśni szkieletowych.
Wnioski
- Ta metoda stanowi solidne podejście do badania biologii mięśni.
- Umożliwia ona efektywną analizę danych z jednego źródła tkankowego.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do pogłębienia wiedzy na temat regeneracji mięśni i dostarczania genów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia bezpośrednią korelację danych histologicznych i molekularnych z sąsiednich przekrojów mięśnia szkieletowego, co redukuje niepewność eksperymentalną oraz liczbę wykorzystywanych zwierząt w procesach badawczych. Dzięki zwiększeniu wydajności RNA z niewielkich próbek tkanek poprzez łączenie krioprzekrojów i homogenizację igłową, metoda ta wspiera walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnych modelach chorób układu mięśniowo-szkieletowego. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną poprzez powiązanie obserwacji fenotypowych ze zmianami ekspresji genów z tego samego systemu biologicznego.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez korelację histopatologicznych markerów uszkodzeń ze zmianami w ekspresji genów w tej samej tkance.
- Wartość operacyjna: Ogranicza konieczność powtarzania eksperymentów na zwierzętach dzięki uzyskaniu dopasowanych danych histologicznych i molekularnych z jednego mięśnia szkieletowego.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka związanego z doborem celu terapeutycznego poprzez spójne odczyty fenotypowe i molekularne, co zwiększa pewność w interpretacji mechanizmu choroby.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia zestandaryzowane przygotowanie tkanek do późniejszej ekstrakcji RNA, co umożliwia spójne profilowanie ekspresji genów w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przygotowanie do analizy poprzez generowanie homogenizowanych lizatów z połączonych krioskrawków, odpowiednich dla protokołów qPCR lub sekwencjonowania.
- Skalowalność: Pozwala na przetwarzanie wielu tkanek w jednej partii przy użyciu kriotomu, co wspiera zastosowania w badaniach przesiewowych o średniej przepustowości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia płynne przejście z histologii odkrywczej do walidacji molekularnej z wykorzystaniem sąsiednich obszarów tkanki, co wzmacnia korelację biomarkerów.
- Istotność modelu przedklinicznego: Wspiera ocenę odpowiedzi regeneracyjnych i efektów terapii genowej w modelach uszkodzeń poprzez dopasowaną analizę strukturalną i molekularną.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez redukcję zmienności między punktami końcowymi histologicznymi a molekularnymi uzyskanymi z tej samej próbki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, umożliwiając analizę biologii mięśni szkieletowych opartą na hipotezach, w której badanie histologiczne stanowi podstawę dla dalszych analiz molekularnych przeprowadzanych na tym samym materiale tkankowym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i walidację celów poprzez powiązanie fenotypów strukturalnych (np. włóknienia, regeneracji) z odpowiedziami transkrypcyjnymi w sąsiednich sekcjach.
- Screening: Pozwala na tworzenie zestandaryzowanych pul krioprzekrojów, które służą jako powtarzalne materiały wyjściowe do ekstrakcji RNA i późniejszych analiz analitycznych.
- Analityka: Generuje ilościowe wskaźniki wydajności i jakości RNA, które umożliwiają porównania między grupami traktowanymi a warunkami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy histopatologiczną ocenę uszkodzeń z molekularnymi sygnaturami regeneracji lub dostarczania genów, wspierając ciągłość badań przedklinicznych.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy wielokrotnego użytku platformę przygotowania tkanek, którą można zastosować w przypadku wielu mięśni szkieletowych i modeli chorób, co ogranicza redundantny rozwój protokołów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję szumu biologicznego dzięki dopasowaniu danych histologicznych i molekularnych z identycznych obszarów tkanki.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację poprzez łączenie krioprzekrojów oraz kontrolowaną homogenizację igłową, co minimalizuje zmienność techniczną.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez maksymalizację uzysku danych z jednego zwierzęcia, redukując potrzebę prowadzenia badań powtórnych w kampaniach walidacji celów terapeutycznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka dzięki spójnym dowodom fenotypowym i molekularnym, zmniejszając ryzyko niepowodzenia na późnych etapach z powodu niezgodności mechanistycznej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obsługi kriotomu oraz zatapiania tkanek, aby zapewnić odpowiednią jakość skrawków i zapobiec wpływowi żywicy na późniejszą ekstrakcję RNA.
- Metoda jest uzależniona od dostępu do kriotomu oraz infrastruktury ciekłego azotu w celu konserwacji tkanek i wykonywania skrawków w kontrolowanych temperaturach.
- Konieczna jest standaryzacja grubości skrawków (30 µm dla RNA, 7 µm dla histologii) oraz protokołów pobierania próbek przez wszystkich użytkowników w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja metody do innych typów tkanek może wymagać optymalizacji parametrów krojenia oraz technik homogenizacji w zależności od gęstości i architektury tkanki.
- Ograniczenia praktyczne obejmują stosunkowo niską przepustowość oraz konieczność zachowania szczególnej ostrożności podczas pobierania i przetwarzania skrawków, aby zapobiec degradacji RNA.
