Name: Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj metodę kriosekcji sąsiadujących obszarów mięśnia szkieletowego myszy do analizy ekspresji genów i badań histologicznych. Technika umożliwia korelację danych molekularnych z obrazem histologicznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre i Junna Luan zapewnili pomoc techniczną. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez Narodowy Instytut Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer AR065077. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponosi autor i niekoniecznie reprezentuje ona oficjalne poglądy National Institutes of Health.

<ol><li>Foltz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+skeletal+muscle+regeneration+plus+mild+alterations+in+mature+fiber+type+specification+in+Fktn-Deficient+Dystroglycanopathy+Muscular+Dystrophy+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice.</a> PLoS One. 11 (1), 0147049(2016).</li>
<li>Bartoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+monitoring+of+therapeutic+gene+transfer+in+animal+models+of+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies.</a> Gene Ther. 13, 20-28 (2006).</li>
<li>Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+RNA+preparation+options+for+archived+myocardial+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Lung+Circ%22%5BJournal%5D)">Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies.</a> Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).</li>
<li>Beedle, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+fukutin+deletion+impairs+dystroglycan+processing+and+recapitulates+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy.</a> J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).</li>
<li>Foltz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-week+rapamycin+treatment+improves+muscular+dystrophy+in+a+fukutin-deficient+mouse+model+of+dystroglycanopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy.</a> Skeletal Muscle. 6, 20(2016).</li>
<li>AVMA Guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). Available from: 
 <a target="_blank" href="www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx">www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx</a> 1-102 (2013).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).</li>
<li>Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+commercial+RNA+extraction+kits+for+preparation+of+DNA-free+total+RNA+from+Salmonella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells.</a> BMC Res. Notes. 3, 211(2010).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J. Vis. Exp. (45), e2565(2010).</li>
<li>Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+Myf5+to+support+myogenic+differentiation+without+myogenin%2C+MyoD%2C+and+MRF4%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4.</a> Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).</li>
<li>Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+transgenic+skeletal+muscles+with+altered+timing+of+expression+of+the+basic+helix-loop-helix+muscle+regulatory+factor+MRF4%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4.</a> Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).</li>
<li>Chomczynski, P., Mackey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+chloroform+by+bromo-chloropropane+in+the+single-step+method+of+RNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation.</a> Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).</li>
<li>Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+RNA+from+tough+tissues+with+high+proteoglycan+content+by+cryosection%2C+second+phase+separation+and+high+salt+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation.</a> J. Biol. Methods. 2 (2), 20(2015).</li>
<li>Guo, D., Catchpoole, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+RNA+following+cryosections+of+archived+frozen+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue.</a> BioTechniques. 34, 48-50 (2003).</li>
<li>Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flexible+mouse-on-mouse+immunohistochemical+staining+technique+adaptable+to+biotin-free+reagents%2C+immunofluorescence%2C+and+multiple+antibody+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining.</a> J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).</li>
<li>Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+gene+analysis+of+130+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy+with+a+special+reference+to+muscle+mRNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Dev%22%5BJournal%5D)">Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis.</a> Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).</li>
<li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).</li>
<li>Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection technology.</a> Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).</li>
</ol>

Autorka oświadcza, że nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.

Aby osiągnąć najlepsze wyniki tą metodą, podczas kriokonserwacji tkanek należy ograniczać żywicę do dolnej jednej trzeciej lub połowy mięśnia, ponieważ nadmiar żywicy spowolni zbieranie połączonych kriosekcji i może zwiększyć zanieczyszczenie żywicą zatapiającą się w izolacji RNA. Ważna jest również szczególna uwaga podczas homogenizacji igieł, aby zmaksymalizować wydajność i zminimalizować prawdopodobieństwo zatkania igły. Protokół może być modyfikowany za pomocą strzykawki Luer-Lok w celu ochrony przed utratą próbki, j...

Celem tej techniki jest umożliwienie wielu analiz eksperymentalnych za pomocą różnych modalności, takich jak histologia i ekspresja genów, z pojedynczej małej tkanki źródłowej mięśni szkieletowych. Zastosowania mikroskopowe są najbardziej wrażliwe na metody konserwacji próbek, które muszą być dokładnie kontrolowane, aby ograniczyć tworzenie się artefaktów kryształów lodu podczas krioprezerwacji. W związku z tym opracowanie metody opiera się na zamrożonym mięśniu piszczelowym przednim (TA) częściowo pokrytym żywicą zatopioną w kąpieli 2-metylobutanowej chłodzonej ciekłym azotem o temperaturze -140 °C jako materiale źródłowym zarówno do mikroskopii immunofluorescencyjnej, jak i analiz ekspresji genów.
Potrzeba użycia tego samego materiału źródłowego do różnych podejść technicznych jest szczególnie ważna w eksperymentach opartych na iniekcjach domięśniowych, gdzie lewy i prawy mięsień reprezentują różne warunki, jeden eksperymentalny i jeden kontrolny. Na przykład w badaniach nad regeneracją mięśni jednemu mięśniowi wstrzykuje się toksynę, aby spowodować rozległe uszkodzenie tkanki, podczas gdy mięsień przeciwległy służy jako kontrola, której wstrzykuje się nośnik1. Podobnie, badania nad terapią genową w zaburzeniach mięśni zwykle rozpoczynają się od walidacji wektora terapii genowej przez wstrzyknięcie domięśniowe w celu porównania z pustym wektorem, niepowiązanym wektorem lub kontrolą nośnika po stronie przeciwnej2. W związku z tym nie jest możliwe pozyskanie każdego mięśnia TA do innego zastosowania.
Typowe strategie radzenia sobie z tym problemem to: i) użycie innej grupy mięśni do każdej aplikacji, ii) użycie dodatkowych myszy, lub iii) odcięcie kawałka mięśnia dla każdej aplikacji. Jednak znaczne różnice między grupami mięśniowymi utrudniają porównywanie danych z oddzielnych zastosowań, a dodatkowe zwierzęta zwiększają koszty i są słabo uzasadnione, jeśli istnieją inne alternatywy. Podział mięśnia po rozbiorze w celu uzyskania różnych zastosowań jest w wielu przypadkach najlepszą opcją. Jednak kawałki mięśni są często zbyt małe, aby można było użyć sproszkowania w ciekłym azocie lub technik mielenia mechanicznego do homogenizacji2-5. Ponieważ mięśnie są wysoce strukturalną tkanką wypełnioną macierzą zewnątrzkomórkową i białkami kurczliwymi, nieodpowiednia homogenizacja mechaniczna prowadzi do niskiej wydajności późniejszego DNA, RNA lub białka. Opisana tutaj metoda pozwala na wykorzystanie niewielkich ilości tkanki z jednego mięśnia źródłowego w wielu zastosowaniach, a włączenie kriosekcji i trituracji igłowej poprawia homogenizację mechaniczną w celu uzyskania lepszej wydajności RNA.

<table><tbody><tr><td>Korek</td><td>VWR Scientific</td><td>23420-708</td><td>Pokrój na małe kwadraty ostrym ostrzem.</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe z tworzywa sztucznego</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td>Służy do orientacji mięśni podczas zamrażania.</td></tr><tr><td>Termometr niskotemperaturowy</td><td>VWR Scientific</td><td>89370-158</td><td></td></tr><tr><td>2-metylobutan</td><td>Sigma</td><td>M32631-4L</td><td>Uwaga: niebezpieczna substancja chemiczna. Przechowywać w łatwopalnej szafce.</td></tr><tr><td>Żywica do zatapiania: "cryomatrix"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6769006</td><td>Cryomatrix można zastąpić innymi żywicami do zatapiania.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>microm HM550 z jednorazowym nośnikiem ostrzy</td><td>Każdy działający kriostat powinien być wystarczający do przestrzegania protokołu.</td></tr><tr><td>Jednorazowe ostrze do kriostatu</td><td>Thermo Fisher Scientific 3052835</td><td></td><td>Użyj odpowiedniego ostrza lub noża do kriostatu, który ma być używany.</td></tr><tr><td>Roztwór do odkażania RNAza: "RNase Zap"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel</td><td>malarski Daler Rowney</td><td>214900920</td><td>Służy do obsługi kriosekcji. Można go znaleźć w sklepach z prostymi artykułami plastycznymi.</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>VWR Scientific</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td></td><td>Odczynnik do</td> ekstrakcji organicznej RNA 48311600 <td></td>VWR</tr>: <tr><td>TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Uwaga: TRIzol jest niebezpieczną substancją chemiczną. Uwaga: Do ekstrakcji RNA z mięśni szkieletowych zalecane są wyłącznie odczynniki do ekstrakcji organicznej.</td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze 18 VWR</td><td>Scientific</td><td>BD305185</td><td></td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze 22 Igła</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305155</td><td></td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze 26</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305115</td><td>Opcjonalnie. Może być stosowany do trzeciej rundy trituracji próbki w protokole ekstrakcji RNA.</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>VWR Scientific BD309659</td><td></td><td>W przypadku próbek o bardzo wysokiej wartości zalecana jest strzykawka Luer-Lok (np. , VWR BD309628).</td></tr><tr><td>1-bromo-3-chloropentan (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>Do 70% etanolu w wodzie DEPC: 200-procentowy alkohol</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>+M18027161M</td><td>Wymieszaj 35 ml 200 proof alkoholu + 15 ml wody DEPC.&nbsp;</td></tr><tr><td>Dla 70% etanolu w wodzie DEPC: woda uzdatniona DEPC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9922</td><td>Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania RNA: Minizestaw PureLink RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>Końcowe etapy przygotowania RNA.</td></tr><tr><td>Woda wolna od DNaz/Rnaz&nbsp;</td><td>Można również użyć wody uzdatnionej przez</td> <td>Gibco</td><td>10977</td> DEPC.</tr><tr><td>Spektrofotometr: Nanodrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2222</td><td>Poddaj oczyszczone RNA działaniu w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń DNA przed ich zastosowaniem.</td></tr><tr><td>Długopis hydrofobowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>PBS do protokołu immunofluorescencji.</td></tr><tr><td>Surowica osła</td><td>Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc</td><td>017-000-121</td><td>Uwodnić normalną surowicę osła zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie rozcieńczyć podwielokrotność do 5% w celu uzyskania immunofluorescencji. Można również użyć normalnej koziej surowicy.</td></tr><tr><td>Przeciwciało eMHC</td><td>University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>F1.652</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Collagen VI</td><td>Fitzgerald Industries</td><td>#70R-CR009x</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-królik AlexaFluor488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-mysia IgG1 AlexaFluor546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21123</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6- diamidino-2-fenyloindol)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Wodne media montażowe: Permafluor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td>Używaj wyłącznie mediów montażowych przeznaczonych do zastosowań fluorescencyjnych o właściwościach zapobiegających blaknięciu.</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>szklane VWR Scientific</td><td>16004-314</td><td>Służy do montażu szkiełek na końcu protokołu immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu: ImageProExpress</td><td>Media Cybernetics, Inc.</td><td>Image-Pro Express lub bardziej zaawansowane produkty</td><td>Freeware ImageJ powinny również działać do ręcznego liczenia. Bardziej zaawansowane oprogramowanie z możliwością segmentacji może pozwolić na częściową automatyzację procesu; np. , ImageProPremier.</td></tr><tr><td>Scalanie i mapowanie obrazów sekcji: Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop</td><td></td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Sigma</td><td>C9659</td><td>Sigma C9659 został wycofany. Inne opcje dla kardiotoksyny to EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; lub Ge Script # RP17303; Nie zostały one jednak potwierdzone.</td></tr><tr><td>zestaw do odwrotnej transkrypcji: System syntezy pierwszej nici w indeksie górnym III</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080051</td><td>Można stosować dowolne zwalidowane, wysokiej jakości odczynniki do odwrotnej transkrypcji.</td></tr><tr><td>Standardowy PCR: System polimerazy GoTaq Flexi</td><td>Promega</td><td>M8298</td><td>Można zastosować dowolny zwalidowany, wysokiej jakości system polimerazy Taq. Jeśli sekwencjonowanie DNA ma być stosowane do jakiegokolwiek zastosowania po PCR, należy zamiast tego użyć systemu PCR o wysokiej wierności.</td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7585</td><td>Do stosowania w qPCR, gdy nie używa się dedykowanej mieszanki qPCR master. Stosować z SuperROX (do instrumentów Applied Biosystems) oraz polimerazą i GoTaq Flexi.</td></tr><tr><td>ROX: SuperROX, 15 mM</td><td>BioResearch Technologies, Inc. Novato CA</td><td>SR-1000-10</td><td>SuperROX jest bardziej stabilny w reakcji PCR, dlatego jest preferowany do stosowania jako pasywny barwnik referencyjny qPCR zamiast ROX (karboksy-X-rodamina). Do qPCR z instrumentami Applied Biosystems</td></tr><tr><td>PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Applied Biosystems</td><td>7900HT</td><td></td></tr></tbody></table>

kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

Dzięki tej metodzie, kolejne kriosekcje są pobierane, aby umożliwić zarówno zastosowania mikroskopowe do histologii tkanek, jak i wzbogacanie RNA do ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Zazwyczaj trudno jest osiągnąć odpowiednią homogenizację małych próbek mięśni szkieletowych, ponieważ objętości mogą być zbyt małe dla wydajnych zastosowań mielenia, ale bez wystarczającego zakłócenia mechanicznego gęsta architektura tkankowa mięśni ogranicza przenikanie odczynników buforowych, ostatecznie powodując niską wydajność RNA. Postępując zgodnie z opisanym tutaj protokołem, skrawki 30 μm są zbierane i łączone, co pozwala na kriosekcję, a następnie homogenizację igłową w celu mechanicznego przerwania mięśnia, zwiększając powierzchnię narażoną na penetrację bufora. Podstawowym ograniczeniem tej techniki jest to, że wymaga ona kriostatu i ma stosunkowo niską przepustowość. Jednak wysokiej jakości RNA można uzyskać z małych próbek połączonych kriosekcji mięśni, dzięki czemu metoda ta jest dostępna dla wielu różnych mięśni szkieletowych i innych tkanek. Co więcej, technika ta umożliwia dopasowane analizy (np. histopatologia tkanek i ekspresja genów) z sąsiednich regionów pojedynczego mięśnia szkieletowego, dzięki czemu pomiary mogą być bezpośrednio porównywane między zastosowaniami w celu zmniejszenia niepewności doświadczalnej i zmniejszenia liczby replikacyjnych eksperymentów na zwierzętach niezbędnych do pozyskania małej tkanki do wielu zastosowań.

RNA z krioprzekrojów mięśni charakteryzuje się wysoką jakością i zapewnia wydajność wystarczającą dla większości zastosowań
Analizy szesnastu preparatów RNA z mięśni szkieletowych przedstawiono w Tabeli 1, wykorzystując od 19,4 do 41 mg połączonego mięśnia piszczelowego przedniego (TA) od 8 myszy kontrolnych. Zarówno lewy (L), jak i prawy (R) mięsień TA zostały przygotowane w eksperymentach nad regeneracją, w który...

Kolejne kriosekcje są zbierane, aby umożliwić zastosowania histologiczne i wzbogacenie RNA do pomiarów ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Wysokiej jakości RNA uzyskuje się z 20 - 30 mg zbiorczych kriosekcji, a pomiary są bezpośrednio porównywane między aplikacjami.

Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie analizy parametrów histologicznych i molekularnych z sąsiednich odcinków pojedynczej tkanki. Dzięki tej metodzie możemy pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii i chorób mięśni szkieletowych. Na przykład, jakie są efekty regeneracyjne po urazie mięśni i jakie są skutki dostarczania genów wirusa przez wstrzyknięcie domięśniowe?Zaletą tej metody jest to, że dane histologiczne i molekularne mogą być bezpośrednio skorelowane z pojedynczej tkanki. Pozwala to na skuteczniejszą analizę danych i lepsze wykorzystanie tkanek eksperymentalnych. Pięć minut przed zakończeniem sekcji schłodzić kąpiel kriokonserwacyjną.Gdy próbki tkanek są gotowe do zatopienia, najpierw nałóż żywicę osadzającą na dolną jedną trzecią do połowy tkanki, gdzie mięsień styka się z korkiem. Należy to zrobić starannie, aby zmniejszyć interferencję żywicy z dalszymi etapami. Następnie natychmiast wrzuć korek do kąpieli 2-metylobutanowej schłodzonej do minus 140 stopni Celsjusza.Zawiera do ośmiu preparatów tkankowych w każdej partii. W kąpieli mieszaj chusteczki przez 30 sekund, zeskrobując dno zlewki, aby zapobiec zamarzaniu korków tkanek w roztworze. Po 30 s

cryosectioning-contiguous-regions-single-mouse-skeletal-muscle-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Profilowanie ekspresji RNA w oddzielnych regionach mózgu myszy wymaga precyzyjnej i powtarzalnej strategii pobierania tkanek. W niniejszym opracowaniu opisano protokół wykorzystujący zarówno sekcjonowanie mózgu w płaszczyźnie czołowej, jak i mikrodysekcję wspomaganą wycinakiem do tkanek. Wydajność i jakość całkowitego RNA uzyskanego z otrzymanych próbek potwierdzają użyteczność przedstawionej metody.

Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Ten film opisuje procedurę szybkiego zamrażania tkanki mięśniowej i uzyskiwania jej cienkich odcinków. Technika ta może pomóc w badaniu kacheksji związanej z rakiem w mysich modelach raka jelita grubego.

Błyskawiczne zamrażanie tkanki mięśniowej do cięcia: protokół uzyskiwania ultracienkich skrawków szybko zamrożonej mysiej tkanki mięśniowej

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest zmienione w różnych stanach, które czasami mogą prowadzić do niewydolności synaptycznej. W niniejszym raporcie opisano metody oparte na mikroskopie fluorescencyjnym do ilościowego określania takich zmian strukturalnych.

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj demonstrujemy najbardziej efektywne metody zamrażania, osadzania, kriosekcji i barwienia biopsji mięśni, aby uniknąć artefaktów zamrażania.

Co robić, a czego nie robić w przygotowaniu kriosekcji mięśni do analizy histologicznej

Tutaj opisujemy prostą metodę izolacji przestrzennie odrębnych komórek powierzchni nabłonka mysiego okrężnicy od leżących poniżej komórek o kryptobazie.

Metoda kriosekcji do mikrodysekcji mysiej błony śluzowej okrężnicy

Tutaj prezentujemy protokół zamrażania i cięcia tkanki mózgowej od wielu zwierząt jako oszczędzającą czas alternatywę dla przetwarzania pojedynczych mózgów. Zmniejsza to zmienność barwienia podczas immunohistochemii i skraca czas kriosekcji i obrazowania.

Jednoczesna kriosekcja wielu mózgów gryzoni

Protokół mikrodysekcji laserowej (LCM) został opracowany w celu uzyskania wystarczającej ilości wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów w komórkach kostnych. Obecne badanie koncentruje się na mysich odcinkach kości udowej. Jednak opisany tutaj protokół LCM może być wykorzystany do badania ekspresji genów w komórkach dowolnej tkanki twardej.

Protokół mikrodysekcji z wychwytem laserowym, który zapewnia wysokiej jakości RNA ze świeżo zamrożonych kości myszy

Ten protokół opisuje mikrodysekcję laserową do izolacji chrząstki i kości ze świeżo zamrożonych fragmentów zarodka myszy. Chrząstka i kość mogą być szybko uwidocznione przez barwienie fioletem krezylo i precyzyjnie zebrane w celu uzyskania wysokiej jakości RNA do analizy transkryptomicznej.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki embrionalnej i kości myszy w celu analizy ekspresji genów

Przedstawiamy praktyczny, krok po kroku, szybki protokół usuwania mózgu myszy i preparowania dyskretnych obszarów z świeżej tkanki mózgowej. Pozyskiwanie regionów mózgu do analizy molekularnej stało się rutyną w wielu laboratoriach neurobiologicznych. Te obszary mózgu są natychmiast zamrażane w celu uzyskania wysokiej jakości danych transkryptomicznych do analizy na poziomie systemu.

Mikrodysekcja mózgu myszy na funkcjonalnie i anatomicznie różne regiony

Coraz więcej dowodów wskazuje, że nadmierna infiltracja lipidów wewnątrz mięśni szkieletowych prowadzi do lipotoksyczności i cukrzycy. Tutaj przedstawiamy kompletny protokół, w tym przetwarzanie tkanek, barwienie za pomocą Bodipy, akwizycję obrazu i analizę, w celu ilościowego określenia wielkości, gęstości i subkomórkowego rozkładu kropelek lipidów w sposób specyficzny dla rodzaju włókna.

Analiza zawartości kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych pod kątem rodzaju włókien i subkomórek

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Poznaj metodę kriosekcji sąsiadujących obszarów mięśnia szkieletowego myszy do analizy ekspresji genów i badań histologicznych. Technika umożliwia korelację danych molekularnych z obrazem histologicznym.

Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych (Wideo) | JoVE Journal

Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych

Przeglądaj więcej filmów