Zastosowanie techniki miękkiego nakładki agarowej do badań przesiewowych pod kątem związków hamujących wytwarzanych przez bakterie

Ogólnym celem tej procedury jest badanie przesiewowe w kierunku czynników wytwarzanych przez jeden szczep bakterii, które są hamujące w stosunku do drugiego szczepu bakteryjnego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania w wielu dziedzinach mikrobiologicznych, ale jest szczególnie przydatna w ekologii drobnoustrojów, w zrozumieniu antagonistycznych interakcji bakteryjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest niedroga i łatwa do wykonania i interpretacji.

Procedurę zademonstruje Aretha, studentka w laboratorium. Aby rozpocząć eksperyment, zaszczepij pojedynczą kolonię P syringae w 3 mililitrach bulionu King's Medium B lub KB. Inkubuj kulturę przez noc. Następnego ranka rozcieńczyć kulturę bulionową w ilości od 1 do 100 do 3 mililitrów świeżego bulionu KB.

Inkubuj kulturę przez trzy do czterech godzin, wstrząsając w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że kultura ma zauważalny wzrost zmętnienia, a następnie dodaj mitomycynę C. Następnie inkubuj kulturę przez noc, wstrząsając w temperaturze pokojowej. Następnego dnia zasyp od jednego do dwóch mililitrów kultur indukowanych mitomycyną C w mikrowirówce stołowej.

Usunąć i wysterylizować supernatanty hodowlane, przepuszczając supernatant przez filtr o wielkości porów 0,22 mikrometra. Dodać chlorek sodu, aby osiągnąć stężenie jednomolowe, i dodać glikol polietylenowy lub PEG 8000 do 10% stężenia końcowego do sterylnego supernatantu. Kilkakrotnie odwracać próbki, aż do całkowitego rozpuszczenia zarówno chlorku sodu, jak i PEG.

Próbki należy inkubować w łaźni lodowej przez godzinę. Następnie odwirować próbki. Po odwirowaniu zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze, wielokrotnie pipetując.

Usunąć resztki PEG przez dwie sekwencyjne ekstrakcje równą objętością chloroformu. Połącz z chloroformem z ponownie zawieszonym osadem i wiruj mieszaninę przez 15 sekund. Następnie odwirować mieszaninę w temperaturze 20 000 razy G przez pięć minut.

Przenieś górną fazę wodną do świeżej probówki do mikrofuge. Powtórz tę ekstrakcję dwa razy, aż nie będzie widoczna biała granica między fazą wodną a organiczną. Pozostawić resztki chloroformu do odparowania z wyekstrahowanych supernatantów w dygestorium.

Zaszczepić pojedynczą kolonię szczepu P syringae w trzech mililitrach KB i inkubować kulturę przez noc, wstrząsając w temperaturze pokojowej. Następnego ranka rozcieńczyć kulturę od 1 do 100 na świeży KB. Inkubuj kulturę przez trzy do czterech godzin, wstrząsając w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj wysterylizowany agar wodny poprzez autoklawowanie zawiesiny agaru w ultraczystej wodzie.

Przed użyciem utrzymuj stopiony miękki agar w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej przenieś trzy mililitry miękkiego agaru do sterylnej probówki hodowlanej. Umieść probówkę hodowlaną z powrotem w łaźni wodnej, aby utrzymać ją w stanie stopionym.

Przed wylaniem nakładki pozwól stopionemu agarowi ostygnąć, ale nie pozwól mu zastygnąć. Bardzo ważne jest, aby agar był utrzymywany w gorącym, całkowicie stopionym stanie przed inokulacją. Jeśli nie, nakładka będzie miała ziarnisty wygląd i będzie trudniejsza do zinterpretacji.

W sterylnym kapturze zaszczepij 100 mikrolitrów kultury szczepu testera do miękkiego agaru i wiruj w celu wymieszania. Obracaj kulturę ręcznie przez 10 do 15 sekund, a następnie wylej ją na dno talerza agarowego. Przechyl płytkę we wszystkich kierunkach, aby upewnić się, że miękki agar równomiernie pokrywa dolny agar.

Przykryj talerz i pozwól mu stwardnieć przez 20 do 30 minut. Uważaj, aby nie naruszyć płytki podczas krzepnięcia. Po zestaleniu się nanieść od dwóch do pięciu mikrolitrów supernatantu na nakładkę.

Pozostaw płytki do inkubacji przez noc w temperaturze pokojowej. Obserwuj i zapisuj wyniki następnego dnia rano. Stosując tę metodę, dwa szczepy P syringae są hamowane przez różne bakteriocyny.

Szczep A jest wrażliwy na bakteriocynę o dużej masie cząsteczkowej Tailocin, ale nie jest wrażliwy na alternatywną bakteriocynę o niskiej masie cząsteczkowej. I odwrotnie, szczep B jest niewrażliwy na tailocynę, ale jest wrażliwy na bakteriocynę o niskiej masie cząsteczkowej. Tailocin jest skutecznie odzyskiwany po wytrąceniu PEG, podczas gdy bakteriocyny o niższej masie cząsteczkowej nie.

Zabijanie za pośrednictwem bakteriofagów odróżnia się od innych niereplikacyjnych środków przeciwdrobnoustrojowych poprzez porównanie serii rozcieńczeń. W przypadku oczyszczania za pośrednictwem bakteriofagów, rozcieńczenie supernatantu rozpadało się na pojedyncze blaszki lub strefy oczyszczania, podczas gdy oczyszczanie za pośrednictwem bakteriocyny nie rozpadało się na takie blaszki. Procedura ta może być wykorzystana jako wstępne badanie przesiewowe do identyfikacji czynników hamujących i może być łączona z dalszymi manipulacjami genetycznymi w celu zidentyfikowania lub potwierdzenia źródła tej aktywności.