Mapowanie miejsca wiązania aptameru na ATP za pomocą termoforezy w mikroskali
7 stycznia 2017
Termoforeza w mikroskali (MST) to czuła technologia do charakteryzowania interakcji aptamer-cel. Niniejszy manuskrypt opisuje protokół MST do charakteryzowania oddziaływań aptamer-małe cząsteczki.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest scharakteryzowanie oddziaływań małych cząsteczek aptamerów DNA, w tym mapowanie miejsc wiązania, przy użyciu termoforezy w mikroskali. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące podstawowych parametrów wiązania oddziaływań molekularnych. Główną zaletą tej technologii jest to, że jest ona niezależna od wielkości partnera interakcji, co pozwala na uzyskanie danych kontroli jakości trudnych interakcji między aptamerami a małymi cząsteczkami.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w interakcje małych cząsteczek aptamerów, można ją również zastosować do innych interakcji molekularnych, takich jak interakcje lek-cel lub antygen/przeciwciało. Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować 100-mikromolowy roztwór podstawowy aptameru DH25.42 znakowanego DNA Cy5 w wodzie destylowanej. Następnie rozcieńczyć roztwór podstawowy aptameru do 200 nanomoli z buforem wiążącym.
Inkubować roztwór roboczy aptameru przez dwie minuty w temperaturze 90 stopni Celsjusza. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej na lodzie. Następnie oznaczyć i ustawić probówki do mikrowirówek o niskim poziomie wiązania o pojemności 200 mikrolitrów w celu 16-etapowego seryjnego rozcieńczania liganda, który ma być testowany.
Odpipetować 20 mikrolitrów 10-milimolowego roztworu podstawowego liganda i buforu wiążącego do probówki 1. Odpipetować 10 mikrolitrów buforu wiążącego do probówek od 2 do 16. Następnie przenieś 10 mikrolitrów wywaru ligandowego z probówki 1 do probówki 2 i dobrze wymieszaj pipetą.
Przenieś 10 mikrolitrów rozcieńczonej mieszaniny do probówki 3 i dobrze wymieszaj. Kontynuować seryjne rozcieńczanie w ten sposób, korygując w razie potrzeby efekty rozcieńczania buforu, a po zakończeniu wyrzucić nadmiar 10 mikrolitrów z probówki 16. Dodać 10 mikrolitrów roztworu roboczego aptameru do każdego rozcieńczenia i dobrze wymieszać pipetą.
Inkubować próbki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie wciągnij każdą mieszaninę do czystej, standardowej kapilary, upewniając się, że dotykasz kapilary tylko na końcach. Umieść kapilary w uchwycie tacki w malejącej kolejności stężenia.
Uruchom urządzenie MST i otwórz oprogramowanie sterujące instrumentem. Włącz ręczną kontrolę temperatury i ustaw temperaturę przyrządu na 25 stopni Celsjusza. Gdy przyrząd osiągnie odpowiednią temperaturę, włóż tackę kapilarną.
Ustaw kanał LED na czerwony dla aptamera z oznaczeniem Cy5. Ustaw moc diody LED, aby uzyskać sygnał fluorescencji 500 jednostek. Następnie wykonaj skanowanie kapilarne, aby uzyskać pozycje naczyń włosowatych i sprawdzić jakość próbki.
Jeśli powstałe piki mają kształt litery U lub są spłaszczone, przygotuj nowe próbki w zakodowanych kapilarach, aby zminimalizować efekt przywierania. W oprogramowaniu przyrządu MST wypełnij stężenie liganda i typ rozcieńczenia dla pierwszej kapilary. Kliknij i przeciągnij, aby wypełnić stężenia i rozcieńczenia dla pozostałych naczyń włosowatych.
Wprowadź stężenie aptameru do końcowej mieszanki. Upewnij się, że metoda eksperymentu jest ustawiona na wykrywanie fluorescencji przez pięć sekund, rejestruj MST przez 30 sekund, a następnie rejestruj fluorescencję przez pięć sekund po wyłączeniu lasera. Ustaw moc lasera na 20%Ustaw ścieżkę do pliku i zapisz plik eksperymentu.
Następnie rozpocznij pomiar MST. Uzyskaj w ten sposób co najmniej trzy pomiary. Aby rozpocząć analizę danych, otwórz oprogramowanie do analizy MST i załaduj plik eksperymentu.
Wybierz MST jako typ analizy. Oprogramowanie analityczne pozwala na porównywanie powtórzeń technicznych, w których wszystkie pomiary dotyczyły tego samego zestawu naczyń włosowatych. Do analizy można również dodać powtórzenia biologiczne z innego zestawu naczyń włosowatych.
Kliknij przycisk informacyjny pod pierwszym pomiarem. Sprawdź ślady MST pod kątem wybrzuszeń lub skoków wskazujących na agregację lub efekty opadów. Następnie sprawdź skan kapilarny i nakładkę w kształcie kapilary pod kątem spłaszczonych lub w kształcie litery U pików wskazujących na efekty przywierania lub absorpcji.
Ponieważ agregaty i efekty absorpcyjne są szybko wykrywalne w MST, metoda ta pozwala na szybką i szybką optymalizację konfiguracji technicznej w celu zapewnienia optymalnej jakości danych. Sprawdź, czy w skanowaniu kapilarnym i wstępnej fluorescencji nie ma zależnych od ligandów efektów wygaszania lub wzmacniania fluorescencji. Sprawdź zmianę fluorescencji w czasie pod kątem oznak wybielania lub poprawiania zdjęć.
Po zweryfikowaniu jakości danych należy przejść do trybu reakcji na dawkę. Wybierz ustawienie analizy eksperckiej w strategii oceny T Jump MST. Następnie wybierz model nachylenia do dopasowania krzywej, aby automatycznie obliczyć parametry wiązania.
Z menu porównania wyników wybierz typ normalizacji. Wyeksportuj znormalizowane dane jako arkusz kalkulacyjny lub plik PDF. W tej procedurze MST wykorzystano do zbadania oddziaływań wiążących aptamera pojedynczej nici DNA z wybranymi ligandami drobnocząsteczkowymi.
Krzywe MST dopasowano do równania wzgórza i wyznaczono połowę maksymalnych wartości stężenia efektywnego. W pięciu niezależnych pomiarach powtórzeń biologicznych aptameru z ATP, oddziaływanie aptameru ATP wykazało ujemną amplitudę wiązania od 6 do 13 jednostek i średnią wartość EC50 wynoszącą około 52,3 mikromola. Dane dla każdego liganda znormalizowano do frakcji związanych cząsteczek, a następnie porównano.
Wartości EC50 dla ADP, AMP i SAM w porównaniu z ATP sugerują, że liczba grup fosforanowych ma co najwyżej niewielki wpływ na zachowanie wiązania aptamerów. Usunięcie grupy hydroksalowej robo C2 również wykazało tylko niewielki wpływ na powinowactwo wiązania aptamerów. Aptamer nie wiązał się w przypadku braku grupy parującej lub jeśli grupa parująca została zmieniona na guaninę.
Aptamer wiązał się z samą adeniną, co dodatkowo wskazuje, że grupa adeninowa jest głównym miejscem wiązania aptameru. Po opanowaniu technika ta może dostarczyć niezbędnych informacji na temat podstawowych parametrów wiązania w ciągu kilku minut do godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono szczegółowy protokół charakteryzacji oddziaływań między aptamerami DNA a małymi cząsteczkami z wykorzystaniem miksokalowej termeforezy (MST). MST umożliwia ilościowe określenie parametrów wiązania, takich jak powinowactwo, stechiometria i termodynamika w roztworze, niezależnie od wielkości oddziałujących partnerów. Badanie demonstruje zastosowanie MST do mapowania miejsca wiązania aptameru DNA z ATP oraz cząsteczkami pokrewnymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Chemia biofizyczna
- Biologia molekularna
- Biochemia analityczna
Wprowadzenie
- Zrozumienie oddziaływań molekularnych jest kluczowe zarówno dla badań podstawowych, jak i stosowanych.
- MST to czuła technika, która mierzy ruch cząsteczek w gradientach temperatury w celu oceny zdarzeń wiązania.
- Tradycyjne metody mogą być ograniczone przez rozmiar lub naturę partnerów wiązania; MST pozwala pokonać te ograniczenia.
- Aptamery DNA to krótkie, jednoniciowe oligonukleotydy, które mogą wiązać małe cząsteczki z wysoką specyficznością.
Cel badania
- Aby przedstawić protokół charakterystyki oddziaływań aptamer-mała cząsteczka z wykorzystaniem MST.
- Aby zademonstrować czułość i wszechstronność MST w badaniu trudnych oddziaływań molekularnych.
- Aby zmapować miejsce wiązania aptameru DNA DH25.42 z ATP i związkami pokrewnymi.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworów ligandów oraz aptameru DNA znakowanego Cy5.
- Rozcieńczanie seryjne ligandów i mieszanie ich z roztworem roboczym aptameru.
- Inkubacja i wprowadzanie próbek do kapilar do analizy MST.
- Pomiar ruchu termoforetycznego przy użyciu aparatury i oprogramowania MST.
- Analiza danych, obejmująca dopasowanie krzywej za pomocą równania Hilla oraz normalizację danych wiązania.
Główne wyniki
- Za pomocą MST pomyślnie określono powinowactwo wiązania między aptamerem DNA a ATP, uzyskując średnią wartość EC50 wynoszącą około 52,3 μM.
- Amplituda wiązania w powtórzeniach biologicznych mieściła się w zakresie od 6 do 13 jednostek.
- Analiza porównawcza z ADP, AMP i SAM wykazała, że liczba grup fosforanowych ma minimalny wpływ na wiązanie.
- Aptamer wiąże się specyficznie z adeniną, co potwierdza, że adenina jest głównym miejscem wiązania.
Wnioski
- MST jest niezawodną i czułą metodą charakteryzowania oddziaływań między aptamerami a małymi cząsteczkami.
- Technika ta umożliwia szybką optymalizację i kontrolę jakości warunków eksperymentalnych.
- MST może być szeroko stosowana do badania różnorodnych oddziaływań molekularnych wykraczających poza aptamery.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe mapowanie miejsc wiązania aptamerów z małymi cząsteczkami za pomocą mikrotermophorezy (MST) odpowiada na kluczową potrzebę precyzyjnej walidacji celu i ograniczania ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Czułość MST oraz niezależność od wielkości cząsteczek umożliwiają solidną charakterystykę trudnych oddziaływań, co zwiększa pewność predykcyjną w kluczowych punktach decyzyjnych portfela projektów. Możliwość ta podnosi wiarygodność danych o oddziaływaniach molekularnych dla późniejszych etapów przesiewania i identyfikacji wiodących cząsteczek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią kwantyfikację powinowactwa i specyficzności wiązania w interakcjach aptamer-cel.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez mapowanie precyzyjnych miejsc wiązania, co pozwala wyjaśnić rozpoznawanie molekularne.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla nowych lub trudnych obiektów molekularnych.
- Zapewnia szybką informację zwrotną na temat parametrów wiązania w celu wsparcia decyzji dotyczących selekcji projektów w portfolio.
Przesiew i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane wyniki ilościowe w celu standaryzacji i powtarzalności testów.
- Przygotowuje stabilne układy biologiczne dla niezawodnych przepływów pracy w badaniach przesiewowych związków.
- Umożliwia skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy dzięki wsparciu dla różnorodnych warunków buforowych i próbek.
- Gwarantuje wysoką jakość danych do oceny związków poprzez szybkie wykrywanie artefaktów agregacji lub absorpcji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje dane o oddziaływaniach molekularnych z systemami istotnymi dla danej choroby, gdy aptamery są wykorzystywane jako narzędzia translacyjne.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez dostarczanie spójnych parametrów wiązania.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, dostarczając ilościowe i powtarzalne dane o oddziaływaniach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Mapowanie miejsc wiązania oparte na MST integruje się z procesem odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu, przez opracowywanie testów, aż po badania przedkliniczne, umożliwiając płynny przepływ danych i podejmowanie decyzji.
- Biologia odkryć: Umożliwia weryfikację hipotez i wyjaśnienie szlaków sygnałowych poprzez kwantyfikację oddziaływań aptamer-ligand.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki analiz niezbędne do przeprowadzenia dalszego screeningu.
- Analityka: Pozwala na wyznaczenie wartości EC50 oraz amplitudy wiązania w celu porównania warunków molekularnych i optymalizacji protokołów.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów i zachowanie ciągłości przedklinicznej przy wykorzystaniu aptamerów w modelach chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia MST jako uniwersalną platformę do różnorodnych badań oddziaływań molekularnych wykraczających poza zakres pojedynczego projektu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy w analizie oddziaływań molekularnych.
- Wartość strategiczna: usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową dzięki dostarczaniu wysokiej jakości danych o wiązaniu na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: umożliwia priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój kandydatów w oparciu o solidne wskaźniki oddziaływań.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie konfiguracji testów biofizycznych oraz interpretacji danych.
- Wymagany jest dostęp do aparatury MST oraz kompatybilnego oprogramowania analitycznego.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w zakresie przygotowania próbek i kontroli jakości danych.
- Może być wymagana adaptacja protokołów dla różnych systemów aptamerów lub ligandów.
- W celu uzyskania optymalnych wyników należy szybko identyfikować i niwelować artefakty wynikające z agregacji próbek lub absorpcji.
