Mapowanie miejsca wiązania aptameru na ATP za pomocą termoforezy w mikroskali
January 7th, 2017
Termoforeza w mikroskali (MST) to czuła technologia do charakteryzowania interakcji aptamer-cel. Niniejszy manuskrypt opisuje protokół MST do charakteryzowania oddziaływań aptamer-małe cząsteczki.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest scharakteryzowanie oddziaływań małych cząsteczek aptamerów DNA, w tym mapowanie miejsc wiązania, przy użyciu termoforezy w mikroskali. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące podstawowych parametrów wiązania oddziaływań molekularnych. Główną zaletą tej technologii jest to, że jest ona niezależna od wielkości partnera interakcji, co pozwala na uzyskanie danych kontroli jakości trudnych interakcji między aptamerami a małymi cząsteczkami.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w interakcje małych cząsteczek aptamerów, można ją również zastosować do innych interakcji molekularnych, takich jak interakcje lek-cel lub antygen/przeciwciało. Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować 100-mikromolowy roztwór podstawowy aptameru DH25.42 znakowanego DNA Cy5 w wodzie destylowanej. Następnie rozcieńczyć roztwór podstawowy aptameru do 200 nanomoli z buforem wiążącym.
Inkubować roztwór roboczy aptameru przez dwie minuty w temperaturze 90 stopni Celsjusza. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej na lodzie. Następnie oznaczyć i ustawić probówki do mikrowirówek o niskim poziomie wiązania o pojemności 200 mikrolitrów w celu 16-etapowego seryjnego rozcieńczania liganda, który ma być testowany.
Odpipetować 20 mikrolitrów 10-milimolowego roztworu podstawowego liganda i buforu wiążącego do probówki 1. Odpipetować 10 mikrolitrów buforu wiążącego do probówek od 2 do 16. Następnie przenieś 10 mikrolitrów wywaru ligandowego z probówki 1 do probówki 2 i dobrze wymieszaj pipetą.
Przenieś 10 mikrolitrów rozcieńczonej mieszaniny do probówki 3 i dobrze wymieszaj. Kontynuować seryjne rozcieńczanie w ten sposób, korygując w razie potrzeby efekty rozcieńczania buforu, a po zakończeniu wyrzucić nadmiar 10 mikrolitrów z probówki 16. Dodać 10 mikrolitrów roztworu roboczego aptameru do każdego rozcieńczenia i dobrze wymieszać pipetą.
Inkubować próbki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie wciągnij każdą mieszaninę do czystej, standardowej kapilary, upewniając się, że dotykasz kapilary tylko na końcach. Umieść kapilary w uchwycie tacki w malejącej kolejności stężenia.
Uruchom urządzenie MST i otwórz oprogramowanie sterujące instrumentem. Włącz ręczną kontrolę temperatury i ustaw temperaturę przyrządu na 25 stopni Celsjusza. Gdy przyrząd osiągnie odpowiednią temperaturę, włóż tackę kapilarną.
Ustaw kanał LED na czerwony dla aptamera z oznaczeniem Cy5. Ustaw moc diody LED, aby uzyskać sygnał fluorescencji 500 jednostek. Następnie wykonaj skanowanie kapilarne, aby uzyskać pozycje naczyń włosowatych i sprawdzić jakość próbki.
Jeśli powstałe piki mają kształt litery U lub są spłaszczone, przygotuj nowe próbki w zakodowanych kapilarach, aby zminimalizować efekt przywierania. W oprogramowaniu przyrządu MST wypełnij stężenie liganda i typ rozcieńczenia dla pierwszej kapilary. Kliknij i przeciągnij, aby wypełnić stężenia i rozcieńczenia dla pozostałych naczyń włosowatych.
Wprowadź stężenie aptameru do końcowej mieszanki. Upewnij się, że metoda eksperymentu jest ustawiona na wykrywanie fluorescencji przez pięć sekund, rejestruj MST przez 30 sekund, a następnie rejestruj fluorescencję przez pięć sekund po wyłączeniu lasera. Ustaw moc lasera na 20%Ustaw ścieżkę do pliku i zapisz plik eksperymentu.
Następnie rozpocznij pomiar MST. Uzyskaj w ten sposób co najmniej trzy pomiary. Aby rozpocząć analizę danych, otwórz oprogramowanie do analizy MST i załaduj plik eksperymentu.
Wybierz MST jako typ analizy. Oprogramowanie analityczne pozwala na porównywanie powtórzeń technicznych, w których wszystkie pomiary dotyczyły tego samego zestawu naczyń włosowatych. Do analizy można również dodać powtórzenia biologiczne z innego zestawu naczyń włosowatych.
Kliknij przycisk informacyjny pod pierwszym pomiarem. Sprawdź ślady MST pod kątem wybrzuszeń lub skoków wskazujących na agregację lub efekty opadów. Następnie sprawdź skan kapilarny i nakładkę w kształcie kapilary pod kątem spłaszczonych lub w kształcie litery U pików wskazujących na efekty przywierania lub absorpcji.
Ponieważ agregaty i efekty absorpcyjne są szybko wykrywalne w MST, metoda ta pozwala na szybką i szybką optymalizację konfiguracji technicznej w celu zapewnienia optymalnej jakości danych. Sprawdź, czy w skanowaniu kapilarnym i wstępnej fluorescencji nie ma zależnych od ligandów efektów wygaszania lub wzmacniania fluorescencji. Sprawdź zmianę fluorescencji w czasie pod kątem oznak wybielania lub poprawiania zdjęć.
Po zweryfikowaniu jakości danych należy przejść do trybu reakcji na dawkę. Wybierz ustawienie analizy eksperckiej w strategii oceny T Jump MST. Następnie wybierz model nachylenia do dopasowania krzywej, aby automatycznie obliczyć parametry wiązania.
Z menu porównania wyników wybierz typ normalizacji. Wyeksportuj znormalizowane dane jako arkusz kalkulacyjny lub plik PDF. W tej procedurze MST wykorzystano do zbadania oddziaływań wiążących aptamera pojedynczej nici DNA z wybranymi ligandami drobnocząsteczkowymi.
Krzywe MST dopasowano do równania wzgórza i wyznaczono połowę maksymalnych wartości stężenia efektywnego. W pięciu niezależnych pomiarach powtórzeń biologicznych aptameru z ATP, oddziaływanie aptameru ATP wykazało ujemną amplitudę wiązania od 6 do 13 jednostek i średnią wartość EC50 wynoszącą około 52,3 mikromola. Dane dla każdego liganda znormalizowano do frakcji związanych cząsteczek, a następnie porównano.
Wartości EC50 dla ADP, AMP i SAM w porównaniu z ATP sugerują, że liczba grup fosforanowych ma co najwyżej niewielki wpływ na zachowanie wiązania aptamerów. Usunięcie grupy hydroksalowej robo C2 również wykazało tylko niewielki wpływ na powinowactwo wiązania aptamerów. Aptamer nie wiązał się w przypadku braku grupy parującej lub jeśli grupa parująca została zmieniona na guaninę.
Aptamer wiązał się z samą adeniną, co dodatkowo wskazuje, że grupa adeninowa jest głównym miejscem wiązania aptameru. Po opanowaniu technika ta może dostarczyć niezbędnych informacji na temat podstawowych parametrów wiązania w ciągu kilku minut do godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia protokół charakteryzacji interakcji między DNA aptamerami a małymi cząsteczkami za pomocą mikroskalowej termoforezy (MST). MST jest wrażliwą techniką, która umożliwia analizę parametrów wiązania w interakcjach molekularnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia molekularna
- Chemia analityczna
Tło
- Mikroskalowa termoforesis (MST) jest używana do badania interakcji molekularnych.
- Metoda jest niezależna od wielkości partnerów interakcji.
- MST może dostarczać danych do kontroli jakości dla wymagających interakcji aptamer-mała cząsteczka.
- Może być również zastosowana do innych interakcji, takich jak interakcje leku z celem lub antygen/przeciwciało.
Cel badania
- Charakteryzowanie interakcji między DNA aptamerami a małymi cząsteczkami.
- Mapowanie miejsc wiązania aptameru.
- Wyznaczanie kluczowych parametrów wiązania w interakcjach molekularnych.
Stosowane metody
- Przygotowanie 100 mikromolarnego roztworu początkowego Cy5 oznaczonego DNA DH25.42 aptameru.
- Rozcieńczenie roztworu początkowego aptameru do 200 nanomolar z buforem wiązania.
- Zastosowanie mikroskalowej termoforezy do analizy interakcji.
- Zbieranie i analiza danych w celu oceny parametrów wiązania.
Główne wyniki
- Udane scharakteryzowanie interakcji między aptamerami a małymi cząsteczkami.
- Identyfikacja miejsc wiązania i parametrów.
- Demonstracja zastosowania MST do różnych interakcji molekularnych.
- Dostarczenie danych do kontroli jakości dla wymagających interakcji.
Wnioski
- MST jest cennym narzędziem do badania interakcji między aptamerami a małymi cząsteczkami.
- Metoda poprawia zrozumienie dynamiki wiązania.
- Może być rozszerzona na inne typy interakcji molekularnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative mapping of aptamer-small molecule binding sites using MicroScale Thermophoresis (MST) addresses a critical need for precise target validation and mechanistic de-risking in early discovery. MST's sensitivity and independence from molecular size enable robust characterization of challenging interactions, supporting predictive confidence at key portfolio inflection points. This capability enhances the reliability of molecular interaction data for downstream screening and lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of binding affinity and specificity for aptamer-target interactions.
- Supports mechanistic de-risking by mapping precise binding sites, clarifying molecular recognition.
- Facilitates functional target validation for novel or challenging molecular entities.
- Provides rapid feedback on binding parameters to inform portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Delivers validated quantitative outputs for assay standardization and reproducibility.
- Prepares robust biological systems for reliable compound screening workflows.
- Enables scalability and platform reuse by supporting diverse buffer and sample conditions.
- Ensures high-quality data for compound evaluation through rapid detection of aggregation or absorption artifacts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular interaction data with disease-relevant systems when aptamers are used as translational tools.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by providing consistent binding metrics.
- Supports risk-adjusted advancement decisions with quantitative, reproducible interaction data.
Pipeline & Workflow Integration
MST-based binding site mapping integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, enabling seamless data flow and decision-making.
- Discovery Biology: Provides hypothesis testing and pathway clarification by quantifying aptamer-ligand interactions.
- Screening: Offers reproducible, quantitative assay outputs for downstream screening readiness.
- Analytics: Generates EC50 and binding amplitude measurements to compare molecular conditions and optimize protocols.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity when aptamers are leveraged in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes MST as a reusable platform for diverse molecular interaction studies beyond a single project.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for molecular interaction analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-quality binding data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on robust interaction metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biophysical assay setup and data interpretation.
- Needs access to MST instrumentation and compatible analytical software.
- Demands rigorous cross-team standardization for sample preparation and data quality control.
- May require adaptation of protocols for different aptamer or ligand systems.
- Sample aggregation or absorption artifacts must be rapidly identified and mitigated for optimal results.
