Name: Syngeniczny mysi model przerzutowego raka nerkowokomórkowego do ilościowej i podłużnej oceny terapii przedklinicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Poznaj metodę wszczepiania komórek Renca do nerki myszy w celu badania wzrostu guza i przerzutów do płuc. Model ten umożliwia ilościową ocenę skuteczności terapii przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty z National Cancer Institute (R15CA173657 dla A.W. i R01CA109446 dla T.S.G.), Simmons Cancer Institute (dla A.W.) oraz University of Minnestoa Climb 4 Kidney Cancer Foundation (dla T.S.G.). Dziękujemy dr Kristin Anderson za pomoc w immunofluorescencji.

Poniższy protokół opisuje eksperymentalną procedurę indukowania i monitorowania wzrostu eksperymentalnych ortotopowych guzów nerki i wszelkich potencjalnych spontanicznych przerzutów. Wszystkie poniższe procedury są wykonywane zgodnie z polityką instytucjonalną i zatwierdzonymi procedurami dotyczącymi humanitarnego wykorzystywania zwierząt doświadczalnych.
1. Utrzymanie linii komórkowych
<ol>
	<li>Utrzymuj mysią linię komórkową gruczolakoraka nerki, Renca, w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 1% penicyliną-streptomycyną i 1 mM aminokwasów endogennych, L-glutaminy i pirogronianu sodu (określanych jako pełne RPMI). Hodowla komórek w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	UWAGA: Podobnie jak w przypadku każdej ustalonej linii komórkowej, zaleca się stosowanie komórek Renca o niskiej liczbie pasażowania do transfekcji i późniejszej implantacji, aby zminimalizować wszelkie zmiany fenotypowe lub genetyczne, które mogą wystąpić po długotrwałej hodowli.
	<ol>
		<li>Użyj systemu transpozonów, aby zmodyfikować komórki Renca tak, aby stabilnie wyrażały białko zielonej fluorescencji (GFP) i lucyferazy świetlika.
		<ol>
			<li>Używając odczynnika transfekcji na bazie kationowych liposomów, współtransfekuj komórki Renca z wektorem ekspresji transpozazy (pPGK-SB11) i wektorem transpozonowym kodującym ekspresję lucyferazy świetlika, a także genem fuzyjnym kodującym GFP i gen oporności na zeocynę, oba pod kontrolą transkrypcyjną dwukierunkowego promotora (pKT2 / LuBiG)19.</li>
			<li>Dwa dni później połóż transfekowane komórki w granicznym rozcieńczeniu i pozwól komórkom rozszerzyć się w pełnym RPMI uzupełnionym zeocyną (300 μg/ml). Potwierdzić ekspresję GFP w każdym klonie za pomocą cytometrii przepływowej. Ogniwa te są oznaczone jako Renca-GL. 
			UWAGA: Klonowanie z ograniczeniem rozcieńczenia pozwoli na uzyskanie wybranych komórek z pojedynczej komórki.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wszczepić komórki Renca donerkowo, należy przygotować komórki Renca do zawiesiny jednokomórkowej o stężeniu 2 x 106 komórek/ml w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS).
	<ol>
		<li>Usunąć przylegające komórki Renca z kolby do hodowli tkankowej, używając 0,25% trypsyny w HBSS. Po ~ 5 minutach dodaj cały RPMI do kolby, aby zneutralizować trypsynę i przenieś komórki do probówki wirówkowej w celu przemycia. Odwirować komórki przy względnej sile odśrodkowej g 300 (rcf x g) przez 5 minut w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w HBSS. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj objętość za pomocą HBSS, aby uzyskać 2 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Pobrać komórki do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 18, aby zapobiec naprężeniom ścinającym na komórkach. Zastąp igłę o rozmiarze 18 igłą o rozmiarze 28 przed wstrzyknięciem komórek nowotworowych. Wstrzyknięcie 0,1 ml dostarcza 2 x 105 komórek do nerki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie obszaru operacyjnego
<ol>
	<li>Przygotuj sterylne pole operacyjne w komorze bezpieczeństwa biologicznego, umieszczając sterylną serwetę chirurgiczną na poduszce grzewczej. Zbierz wszystkie zapasy, w tym kleszcze, skalpel, nożyczki, krople do oczu, 5% środek antyseptyczny powidonowo-jodowy i sterylną gazę. Autoklaw wszystkie instrumenty przed użyciem.</li>
	<li>Wykonaj operację przy użyciu techniki aseptycznej końcówki. Ponownie sterylizuj narzędzia między zwierzętami za pomocą sterylizatora koralików. Nosić sterylne rękawiczki, fartuch laboratoryjny i maskę na twarz.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy ketaminą/ksylazyną (odpowiednio 87,5 mg/kg i 12,5 mg/kg, i.p.) zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Określ głębokość znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palca u nogi.</li>
	<li>Gdy zwierzę zostanie uznane za niereagujące, należy przygotować miejsce wstrzyknięcia (np. lewy bok) u myszy Balb/c, wyrywając (palcami) lub goląc (za pomocą maszynki do strzyżenia) sierść.</li>
	<li>Przenieś myszy z obszaru przygotowania do operacji (np. klatki mieszkaniowej) do obszaru operacyjnego i nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Obficie przetrzyj przygotowane miejsce nacięcia 5% środkiem antyseptycznym powidonowo-jodowym.</li>
	<li>Wstrzyknąć chlorowodorek bupiwakainy (0,1 ml roztworu o stężeniu 2,5 mg/ml s.c.) w miejsce, w którym zostanie wykonane nacięcie, jako przedoperacyjne działanie przeciwbólowe.</li>
	<li>Wykonaj pojedyncze nacięcie (~ 1,0 - 1,5 cm) na lewym boku zwierzęcia za pomocą sterylnego skalpela lub nożyczek, ostrożnie, aby nie przebić otrzewnej. Oddziel skórę właściwą od otrzewnej sterylnymi nożyczkami. Przetrzyj miejsce nacięcia sterylną gazą bawełnianą, aby usunąć krew.</li>
	<li>Trzymaj mysz obiema rękami, lewą ręką trzymaj głowę, a prawą ręką podpieraj bok.</li>
	<li>Zidentyfikuj śledzionę przez otrzewną i jednym palcem prawej ręki obmacuj mysz od spodu; nerka powinna być teraz widoczna przez otrzewną. Trzymaj zwierzę mocno, aby zapewnić napięcie w poprzek otrzewnej i nerek.</li>
	<li>Poproś drugą osobę o wstrzyknięcie komórek nowotworowych (przygotowanych w punkcie 1.2.) przez nienaruszoną otrzewną do środka nerki za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 28. Powoli dostarczaj 0,1 ml (2 x 105) komórek. Po wstrzyknięciu komórek należy przytrzymać igłę na miejscu przez 5 - 10 sekund, aby zmniejszyć cofanie się komórek. Ważne jest, aby pamiętać o konieczności zachowania szczególnej ostrożności podczas tego etapu, ponieważ osoba wstrzykująca komórki zbliży igłę do palców osoby trzymającej mysz.</li>
	<li>Wyjąć igłę i zamknąć nacięcie cienką warstwą kleju tkankowego z cyjanoakrylanu.</li>
	<li>Umieść zwierzę z powrotem w czystej klatce ze sterylnym ręcznikiem papierowym. Pozwól zwierzętom dojść do siebie na poduszce grzewczej. Nie pozostawiaj zwierząt bez opieki w okresie rekonwalescencji. Nie należy przywracać zwierząt do standardowych warunków w pomieszczeniach, dopóki nie osiągną pozycji pionowej i mostkowej. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi we wszystkich procedurach z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych.</li>
</ol>
4. Obrazowanie bioluminescencyjne
<ol>
	<li>Monitoruj wzrost guza za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. 
	UWAGA: Szczegóły proceduralne dotyczące wykonywania obrazowania bioluminescencyjnego można uzyskać od Lim et al.20 Sygnał lucyferazy można wykryć już po 24 godzinach od implantacji komórek nowotworowych. Ponieważ w tym modelu nie ma widocznego na zewnątrz guza, konieczne jest okresowe monitorowanie wzrostu guza. W zależności od zaprojektowanego eksperymentu, ortotopowy wzrost guza może postępować przez różny czas. Jedną z korzyści płynących ze stosowania komórek Renca wykazujących ekspresję lucyferazy jest to, że wzrost guza może być wielokrotnie monitorowany u tego samego zwierzęcia w regularnych odstępach czasu przez cały czas trwania eksperymentu, a w określonym punkcie końcowym można przeprowadzić specyficzne badanie narządów zawierających guz i wolnych od guza.
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć lucyferynę (0,1 ml roztworu 15 mg/ml w sterylnym PBS) i.p. i pozostawić ją do krążenia przez 10 minut przed umieszczeniem myszy w systemie obrazowania bioluminescencyjnego. Ułóż mysz grzbietem do góry, lekko przewróconą na bok, tak aby wstrzyknięta nerka była skierowana do góry.</li>
		<li>Zmierz obciążenie guza w fotonach światła emitowanego na sekundę (strumień fotonów) w zdefiniowanym obszarze zainteresowania (r.o.i.) za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja obciążenia guzem w poszczególnych narządach. 
	UWAGA: Oznaczanie ilościowe można przeprowadzić w określonych punktach czasowych w poszczególnych narządach po ich usunięciu od myszy poddanych eutanazji.
	<ol>
		<li>Wstrzyknij myszom lucyferynę, jak w kroku 4.1.</li>
		<li>Po 10 minutach poddać myszy eutanazji zgodnie z zatwierdzoną procedurą.</li>
		<li>Przeprowadź sekcję narządów będących przedmiotem zainteresowania (np. nerek i płuc; patrz sekcja 5 poniżej). Przenieś tkankę na szalki Petriego o wymiarach 35 x 10 mm i umieść je w systemie obrazowania bioluminescencyjnego.</li>
		<li>Zmierz obciążenie guza w fotonach światła emitowanego na sekundę (strumień fotonów) w określonym r.o.i. za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Grabież organów
<ol>
	<li>W określonym punkcie końcowym dla indywidualnego eksperymentu należy poddać eutanazji myszy z guzem zgodnie z preferowanymi wytycznymi instytucjonalnymi (np. CO2, zwichnięcie szyjki macicy, przedawkowanie znieczulenia). Należy jednak unikać zwichnięcia szyjki macicy, jeśli płuca mają być pobrane po napompowaniu atramentu indyjskiego.</li>
	<li>Przeprowadzić ogólną ocenę wzrostu pierwotnego guza nerki w nerce, do której wstrzyknięto szczepionkę, mierząc masę mokrego narządu.
	<ol>
		<li>Aby określić masę guza (w g), wyizoluj 21 i zważ nerkę zawierającą guz i nerkę przeciwległą od tej samej myszy, gdzie różnica w masie nerki określa masę guza. Ostrożnie wypreparuj wszelkie obce tkanki łączne z wyciętych nerek przed pomiarem ich wagi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń stopień przerzutów guza do płuc, napompowując płuca tuszem indyjskim przed wycięciem i natychmiast utrwalając płuca w roztworze Fekete'a22. Następnie można przeprowadzić ręczne obliczenia zmian przerzutowych na powierzchni płuc.
	<ol>
		<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej za pomocą nożyczek, zaczynając od połowy brzucha, przez klatkę piersiową i w górę przez szyję/gruczoły ślinowe. Ostrożnie zdejmij klatkę piersiową za pomocą nożyczek i kleszczy, nie naruszając tkanki płucnej.</li>
		<li>Odsłoń tchawicę, usuwając tkankę łączną.</li>
		<li>Przygotuj strzykawkę o pojemności 3 ml z igłą o rozmiarze 18 wypełnioną 10% roztworem atramentu indyjskiego w HBSS.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie nawlecz jedwabny szew pod tchawicę. Zostanie to wykorzystane do związania tchawicy po napompowaniu.</li>
		<li>Ostrożnie włóż igłę do tchawicy i powoli wciśnij strzykawkę, aby napełnić płuca roztworem atramentu indyjskiego. Około 1 - 1,5 ml roztworu atramentu indyjskiego w pełni napompuje płuca.</li>
		<li>Ściśnij tchawicę, zawiązując kilka węzłów, ze szwem poniżej igły, aby zahamować cofanie się atramentu.</li>
		<li>Wyjmij igłę i ostrożnie odetnij tkankę łączną, aby usunąć napompowane płuca.</li>
		<li>W dygestorium chemicznym umieść płuca w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml roztworu Fekete (35 ml 95% EtOH, 15 ml dH2O, 5 ml formaldehydu i 2,5 ml lodowatego kwasu kwaśnego w szklanej butelce o pojemności 100 ml)23.</li>
		<li>Pozwól płucom utrwalić się/odbarwić przez 24 - 48 godzin w temperaturze pokojowej przed ręcznym liczeniem odbarwionych guzków nowotworowych.</li>
		<li>Po odbarwieniu usunąć nienaruszone płuca i ostrożnie wyciąć nieruchome płuca za pomocą płata na szalce Petriego o wymiarach 35 x 10 mm. Policz liczbę guzków nowotworowych (białych guzków) na każdym płacie pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.3322/caac.21387/full">Cancer statistics.</a> CA Cancer J. Clin. 66, 7-30 (2016).</li>
<li>Chow, W. H., Dong, L. M., Devesa, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+risk+factors+for+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and risk factors for kidney cancer.</a> Nat. Rev. Urol. 7, 245-257 (2010).</li>
<li>Hollingsworth, J. M., Miller, D. C., Daignault, S., Hollenbeck, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rising+incidence+of+small+renal+masses%3A+a+need+to+reassess+treatment+effect%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Rising incidence of small renal masses: a need to reassess treatment effect.</a> J. Natl. Cancer Inst. 98, 1331-1334 (2006).</li>
<li>Lee-Ying, R., Lester, R., Heng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+management+and+future+perspectives+of+metastatic+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Current management and future perspectives of metastatic renal cell carcinoma.</a> Int. J. Urol. 21, 847-855 (2014).</li>
<li>Rini, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+in+kidney+cancer%3A+therapeutic+advances+through+understanding+the+molecular+basis+of+response+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">New strategies in kidney cancer: therapeutic advances through understanding the molecular basis of response and resistance.</a> Clin. Cancer Res. 16, 1348-1354 (2010).</li>
<li>Acquavella, N., Fojo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+cell+carcinoma%3A+trying+but+failing+to+improve+the+only+curative+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Renal cell carcinoma: trying but failing to improve the only curative therapy.</a> J. Immunother. 36, 459-461 (2013).</li>
<li>Salup, R. R., Wiltrout, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvant+immunotherapy+of+established+murine+renal+cancer+by+interleukin+2-stimulated+cytotoxic+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes.</a> Cancer Res. 46, 3358-3363 (1986).</li>
<li>Ko, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+differential+suppression+of+myeloid-derived+suppressor+cell+subsets+by+sunitinib+is+compartmentally+constrained%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Direct and differential suppression of myeloid-derived suppressor cell subsets by sunitinib is compartmentally constrained.</a> Cancer Res. 70, 3526-3536 (2010).</li>
<li>Kusmartsev, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+regulates+expression+of+VEGFR1+in+myeloid+cells%3A+link+to+tumor-induced+immune+suppression+in+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress regulates expression of VEGFR1 in myeloid cells: link to tumor-induced immune suppression in renal cell carcinoma.</a> J. Immunol. 181, 346-353 (2008).</li>
<li>Rocha, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endostatin+gene+therapy+enhances+the+efficacy+of+IL-2+in+suppressing+metastatic+renal+cell+carcinoma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Endostatin gene therapy enhances the efficacy of IL-2 in suppressing metastatic renal cell carcinoma in mice.</a> Cancer Immunol. Immunother. 59, 1357-1365 (2010).</li>
<li>Shanker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+metastatic+solid+tumors+with+bortezomib+and+a+tumor+necrosis+factor-related+apoptosis-inducing+ligand+receptor+agonist+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Treating metastatic solid tumors with bortezomib and a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonist antibody.</a> J. Natl. Cancer Inst. 100, 649-662 (2008).</li>
<li>VanOosten, R. L., Griffith, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+tumor-specific+CD8%2B+T+Cells+after+intratumoral+Ad5-TRAIL%2FCpG+oligodeoxynucleotide+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of tumor-specific CD8+ T Cells after intratumoral Ad5-TRAIL/CpG oligodeoxynucleotide combination therapy.</a> Cancer Res. 67, 11980-11990 (2007).</li>
<li>Bibby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+models+of+cancer+for+preclinical+drug+evaluation%3A+advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages.</a> Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).</li>
<li>Devaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissues+in+different+anatomical+sites+can+sculpt+and+vary+the+tumor+microenvironment+to+affect+responses+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy.</a> Mol. Ther. 22, 18-27 (2014).</li>
<li>Devaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+potency+of+regulatory+T+cell-mediated+immunosuppression+in+kidney+tumors+compared+to+subcutaneous+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Differential potency of regulatory T cell-mediated immunosuppression in kidney tumors compared to subcutaneous tumors.</a> Oncoimmunology. 3, 963395(2014).</li>
<li>Devaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk+between+tumors+can+affect+responses+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Cross-talk between tumors can affect responses to therapy.</a> Oncoimmunology. 4, 975572(2015).</li>
<li>Norian, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+metastatic+renal+cell+carcinoma+after+adenovirus-encoded+TNF-related+apoptosis-inducing+ligand+%28TRAIL%29%2FCpG+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Eradication of metastatic renal cell carcinoma after adenovirus-encoded TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)/CpG immunotherapy.</a> PLoS One. 7, 31085(2012).</li>
<li>Matin, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+response+to+renal+cryoablation+in+an+in+vivo+orthotopic+renal+cell+carcinoma+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Immunological response to renal cryoablation in an in vivo orthotopic renal cell carcinoma murine model.</a> J. Urol. 183, 333-338 (2010).</li>
<li>Wilber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+as+a+source+of+transposase+for+Sleeping+Beauty-mediated+gene+insertion+and+expression+in+somatic+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA as a source of transposase for Sleeping Beauty-mediated gene insertion and expression in somatic cells and tissues.</a> Mol. Ther. 13, 625-630 (2006).</li>
<li>Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescent+imaging+of+mammary+tumors+using+IVIS+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+and+CTL+adoptive+transfer+immunotherapy+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+experimental+pulmonary+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of experimental pulmonary metastases.</a> J. Natl. Cancer Inst. 36, 641-645 (1966).</li>
<li>James, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG-mediated+modulation+of+MDSC+contributes+to+the+efficacy+of+Ad5-TRAIL+therapy+against+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">CpG-mediated modulation of MDSC contributes to the efficacy of Ad5-TRAIL therapy against renal cell carcinoma.</a> Cancer Immunol. Immunother. 63, 1213-1227 (2014).</li>
<li>James, B. R., Brincks, E. L., Kucaba, T. A., Boon, L., Griffith, T. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24711083">Effective TRAIL-based immunotherapy requires both plasmacytoid and CD8a DC.</a> Cancer Immunol. Immunother. 63, 685-697 (2014).</li>
<li>James, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+alters+dendritic+cell+function+in+the+presence+and+absence+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity alters dendritic cell function in the presence and absence of tumor growth.</a> J. Immunol. 189, 1311-1321 (2012).</li>
<li>Brincks, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triptolide+enhances+the+tumoricidal+activity+of+TRAIL+against+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Triptolide enhances the tumoricidal activity of TRAIL against renal cell carcinoma.</a> FEBS J. 282, 4747-4765 (2015).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+intravascular+staining+redefines+lung+CD8+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: intravascular staining redefines lung CD8 T cell responses.</a> J. Immunol. 189, 2702-2706 (2012).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nat. Protocols. 9, 209-222 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiamy protokół dla ortotopowego modelu myszy RCC. Implantacja komórek nowotworowych gruczolakoraka nerki myszy do nerki myszy zapewnia klinicznie istotny model mRCC. Model ten powoduje pierwotny guz w nerce i odległe przerzuty do płuc, które są cechami charakterystycznymi zaawansowanego raka nerkowego. Przedstawiony tutaj opis jest specyficzny dla linii komórkowej Renca u immunokompetentnych myszy Balb/c. Korzystając z tego modelu ortotopowego, wykazaliśmy, że guzy Renca reagują na immunoterapię, wykazując przyda...

Rak nerkowokomórkowy (RCC) odpowiada za większość złośliwych nowotworów nerki i około 3% wszystkich nowotworów złośliwych dorosłych na świecie1,2. Z powodu braku objawów, błędnej diagnozy i niewystarczających narzędzi do badań przesiewowych w kierunku RCC, prawie 30% pacjentów będzie miało przerzutowy RCC (mRCC) w momencie diagnozy, a dodatkowe 20-30% pacjentów będzie się rozwijać do stadium przerzutowego2. Przypadki te skutkują ~13 500 zgonami rocznie1,3. Chociaż wcześniejsze wykrywanie i leczenie pierwotnego RCC uległo poprawie, wskaźnik zgonów związanych z RCC nadal rośnie, co sugeruje, że choroba przerzutowa jest w dużej mierze odpowiedzialna za śmiertelność3. Rozwój terapii RCC poczynił postępy w ciągu ostatniej dekady wraz z odkryciem i wdrożeniem terapii celowanych i immunoterapii. Niestety, przeżycie wolne od progresji choroby i całkowite przeżycie w zaawansowanych przypadkach są nadal znacznie poniżej 2 lat dla większości pacjentów4,5,6. Statystyki te uzasadniają potrzebę dalszych badań nad identyfikacją i opracowaniem skutecznych metod leczenia RCC. Aby odpowiednio rozwinąć interwencje terapeutyczne w przypadku mRCC, najpierw potrzebne są odpowiednie dla translacji modele przedkliniczne choroby.
Opracowanie odpowiedniego i spójnego modelu do podsumowania ludzkiej kondycji zaawansowanego RCC powinno odpowiedzieć na kilka kluczowych pytań: 1) Czy model jest anatomicznie istotny; 2) Czy guz postępuje podobnie do patologii człowieka; 3) Czy przerzuty powstają z guza pierwotnego; oraz 4) Czy można monitorować progresję guza pierwotnego i przerzutowego w czasie? W zależności od rodzaju badanego leczenia, u myszy z niedoborem odporności lub niedoboru odporności można stosować mysie linie komórek nowotworowych RCC, ludzkie linie komórek nowotworowych RCC i ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów z ludzkim RCC. Gospodarz z nienaruszonym i funkcjonalnym układem odpornościowym jest wymagany do badań oceniających jakiś aspekt immunoterapii, co wymaga użycia dobrze opisanej linii komórkowej Renca pochodzącej z samoistnego gruczolakoraka nerki myszy Balb/c7. Większość badań polega na wstrzyknięciu komórek Renca podskórnie (s.c.), co tworzy łatwy do zmierzenia miejscowy guz, lub dożylnie (i.v.) myszom Balb/c w celu wytworzenia eksperymentalnych "przerzutów" do płuc 8,9,10,11,12. Wykorzystanie guza Renca z implantem s.c. do modelowania ludzkiego RCC ma szereg ograniczeń, w tym niedokładny unerwienie naczyń krwionośnych13, różnice w mikrośrodowisku14,15 oraz brak komunikacji komórkowej narządu/guza13,16. Ponadto wiele guzów s.c. (zwłaszcza Renca) nie daje przerzutów do dystalnych narządów, co hamuje badanie zdarzenia, które jest powszechną cechą kliniczną17. Aby zbadać mRCC, komórki Renca mogą być wstrzykiwane dożylnie w celu ustalenia obciążenia guza w płucach - pierwotnej lokalizacji przerzutów u pacjentów z RCC. Metoda iniekcji dożylnej polegająca na inicjowaniu guzów przerzutowych nie pozwala jednak na zbadanie, jak, kiedy i dlaczego komórki migrowały z pierwotnego narządu (tj. nerki) do odległego miejsca. Model z widoczną zarówno chorobą pierwotną, jak i przerzutową u tego samego zwierzęcia ma kluczowe znaczenie dla badania progresji i leczenia zaawansowanej choroby, zwłaszcza biorąc pod uwagę, że przerzuty są zwykle przyczyną śmiertelności u tych pacjentów.
Nasze laboratorium opracowało mysi model mRCC, który zawiera wszystkie cechy opisane powyżej. Aby ustalić pierwotne, ortotopowe guzy, komórki Renca są wszczepiane bezpośrednio do nerki zwierzęcia przez przezroczystą otrzewną. Małe nacięcie w lewym boku pozwala na uwidocznienie śledziony (jako punktu orientacyjnego) i lewej nerki. Za pomocą igły o małej średnicy komórki nowotworowe Renca są wstrzykiwane bezpośrednio do nerki przez otrzewną w celu implantacji ortotopowej. W porównaniu z innymi metodami wszczepiania komórek Renca poniżej torebki nerkowej18, ta metoda implantacji pozwala na większą przepustowość, ponieważ jest dość nieinwazyjna, nie wymaga szycia, ma niską klasę bólu i jest efektywna czasowo, gdy jest praktykowana.
Ten dobrze scharakteryzowany model skutkuje powtarzalnym obciążeniem pierwotnym nowotworem (~ 99% wskaźnika poboru) w wstrzykniętej nerce, jak również przerzutowym obciążeniem guza w płucach. Do istotnych zalet tego modelu należą: jego syngeniczny charakter, pozwalający na prowadzenie badań nad immunoterapią; jego spontaniczne przerzuty, w celu zbadania zaawansowanej choroby; oraz jego implantację ortotopową, w celu modelowania anatomicznego wpływu na postęp choroby i leczenie. Terapie ukierunkowane na raka nerkowokomórkowego odniosłyby ogromne korzyści z wykorzystania tego modelu podczas rozwoju przedklinicznego.

<table><tbody><tr><td>Maść okulistyczna ze sztucznymi łzami</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Klej tkankowy Vetbond</td><td>3M</td><td>CBGBIW011019</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór betadyny (powidon-jod, 5%)</td><td>Purdue Products, L.P.</td><td>NDC 67618-155-32</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Marcaine (bupivavaine HCl do wstrzykiwań)</td><td>Hospira</td><td>0409-1587-50&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td> Strzykawki <td>Sunbeam</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Venture</td><td>908291</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>NDC 57319-609-02</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-111</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Sole zrównoważone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>IVIS</td><td>Caliper</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Lucyferin, sól potasowa</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>India Ink</td><td>Chartpak Inc</td><td>44201</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>System transpozonów Śpiąca Królewna (SB)</td><td>Neuromika</td><td></td><td></td>SBT0200</tr><tr><td>Renca</td><td>ATCC</td><td>CRL-2947</td><td></td></tr></tbody></table>

syngeniczny mysi model przerzutowego raka nerkowokomórkowego do ilościowej i podłużnej oceny terapii przedklinicznych

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Rak nerkowokomórkowy (RCC) dotyka rocznie > 60 000 osób w Stanach Zjednoczonych, a ~ 30% pacjentów z RCC ma mnogie przerzuty w momencie diagnozy. Przerzutowy rak nerkowokomórkowy (mRCC) jest nieuleczalny, a mediana czasu przeżycia wynosi zaledwie 18 miesięcy. Interwencje immunologiczne (>np. interferon (IFN) i interleukina (IL)-2) wywołują trwałe odpowiedzi u części pacjentów z mRCC, a inhibitory multikinaz (np. sunitynib lub sorafenib) lub przeciwciała monoklonalne przeciwko receptorowi VEGF (mAb) są w dużej mierze paliatywne, ponieważ całkowite remisje są rzadkie. Takie niedociągnięcia w obecnych terapiach dla pacjentów z mRCC stanowią uzasadnienie dla opracowania nowych protokołów leczenia. Kluczowym elementem w badaniach przedklinicznych nowych terapii mRCC jest odpowiedni model zwierzęcy. Korzystne cechy, które podsumowują stan człowieka, obejmują pierwotny guz nerki, przerzuty do guza nerki i nienaruszony układ odpornościowy w celu zbadania wszelkich odpowiedzi efektorowych immunologicznych opartych na terapii i tworzenia czynników immunosupresyjnych indukowanych przez nowotwór. Ten raport opisuje ortotopowy model myszy mRCC, który ma wszystkie te cechy. Opisujemy technikę implantacji wewnątrznerkowej przy użyciu linii komórkowej gruczolakoraka nerki myszy Renca, a następnie ocenę wzrostu guza w nerce (miejsce pierwotne) i płucach (miejsce przerzutowe).

Pomyślna implantacja komórek Renca doprowadzi do rozwoju guza w nerce oraz przerzutów do płuc myszy. Po wycięciu nerki z guzem oraz nerki przeciwległej zmierzono masę mokrej tkanki (g), aby wykazać obciążenie nowotworowe na podstawie zwiększonej masy (Rycina 1). Guzy Renca można zidentyfikować za pomocą immunohistochemii poprzez barwienie na cytokeratynę 8 i 18 (Rycina 2). Do badań podłużnych wykorzystano implantowaną linię komórkową Renca wykazującą eksp...

Implementacja ortotopowego modelu raka nerkowokomórkowego u myszy immunokompetentnych daje badaczowi klinicznie istotny system zdefiniowany przez obecność pierwotnego guza nerki i przerzutów do płuc u tego samego zwierzęcia. System ten może być stosowany do przedklinicznego testowania różnych metod leczenia in vivo.

Syngeniczny mysi model przerzutowego raka nerkowokomórkowego do ilościowej i podłużnej oceny terapii przedklinicznych

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie ortotopowych guzów nerkowych u myszy poprzez wewnątrznerkową implantację komórek nowotworowych w celu badania wzrostu i przerzutowania guza oraz skuteczności terapii przeciwnowotworowych. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie onkologii urologicznej, takie jak określenie skuteczności nowej terapii w przedklinicznym modelu raka nerki. Główną zaletą tej techniki jest to, że wewnątrznerkowa implantacja guza pozwala na wytworzenie pierwotnego guza nerki z przerzutami do płuc, co naśladuje patogenezę klinicznego raka jasnokomórkowego nerki.Aby przygotować komórki nowotworowe Renca, najpierw należy oddelegować kulturę komórkową za pomocą 0,25% Trypsyny i HBSS po uprzednim przemyciu PBS. Po pięciu minutach reakcję należy zneutralizować, dodając pełne medium RPMI. Komórki należy przenieść do probówki stożkowej w celu odwirowania, a następnie zawiesić osad w świeżym HBSS.Po policzeniu komórek, dostosuj ich objętość do stężenia 2×10⁶ komórek/ml w HBSS, a następnie pobierz zawiesinę do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 18 G. Następnie rozłóż jałowe pole operacyjne na podkładce

a-syngeneic-mouse-model-metastatic-renal-cell-carcinoma-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie rozwijamy ortotopowy mysi model raka nerkowokomórkowego. Model ten skutkuje powtarzalnymi guzami pierwotnymi w wstrzykniętej nerce i przerzutami w płucach, co pozwala na ocenę postępu choroby i leczenia.

Generowanie modelu raka nerkowokomórkowego: protokół rozwoju ortotopowego mysiego modelu RCC poprzez donerkową implantację komórek rakowych

Ten ortotopowy model ludzkiego raka prostaty pozwala na ilościowe określenie wielkości guza, krążących komórek nowotworowych i tworzenie wyraźnych przerzutów do płuc. Ponieważ komórki muszą uciec z narządu pierwotnego, dostać się do krwiobiegu i zagnieździć się w miejscu wtórnym, model ten skutecznie podsumowuje scenariusz u ludzi.

Ortotopowy mysi model przerzutów ludzkiego raka prostaty

Modele spontanicznej progresji choroby raka nerkowokomórkowego z przerzutami (RCC) mogą być używane do oceny leczenia w klinicznie istotnych warunkach. Protokół ten demonstruje różne procedury ortotopowej implantacji komórek nowotworowych nerki, prawidłowej nefrektomii, a na koniec przedstawia przewodnik po sekcji zwłok do wizualnej i bioluminescencyjnej oceny obciążenia i lokalizacji przerzutów.

Modelowanie spontanicznego przerzutowego raka nerkowokomórkowego (mRCC) u myszy po nefrektomii

Przedkliniczny, mysi model przerzutów do wątroby wykonany techniką iniekcji hemispleen.

Przedkliniczny mysi model przerzutów do wątroby

Przerzutowe rozprzestrzenianie się raka jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem. Przedstawiamy szczegółowy opis naszej metodologii chirurgii przeżycia w celu ustanowienia "podobnego do pacjenta" ortotopowego syngenicznego modelu myszy do badania mechanizmów przerzutów w guzach narządów litych.

"Podobny do pacjenta" ortotopowy syngeniczny mysi model przerzutów raka wątrobowokomórkowego

Ten protokół opisuje powstawanie mysich ortotopowych guzów pęcherza moczowego u samic myszy C57BL/6J oraz monitorowanie wzrostu guza.

Mysi ortotopowy model guza pęcherza moczowego i system wykrywania guzów

Rak jasnokomórkowy nerki z przerzutami jest chorobą, która nie posiada kompleksowego modelu zwierzęcego do dokładnych badań przedklinicznych. Protokół ten ilustruje dwa nowatorskie modele zwierzęce choroby: ortotopowo wszczepiony model myszy i model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka, z których oba wykazują przerzuty do płuc przypominające przypadki kliniczne.

Porównanie modelu przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki ustalonej w nerce myszy i na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurczaka

Opisane podejście łączy eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych z obrazowaniem żywych zwierząt in vivo, aby umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym powstawania i wzrostu przerzutów raka piersi, a także ilościowe określenie liczby i wielkości przerzutów w płucach.

Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

To jest skuteczna metoda do wykrywania supresorów lub czynników powodujących przerzuty raka. Komórki, transdukowane biblioteką ekspresji, są wstrzykiwane do układu naczyniowego błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu utworzenia kolonii przerzutowych. Kolonie o zmniejszonej lub zwiększonej inwazyjności są wycinane, namnażane, ponownie wstrzykiwane w celu potwierdzenia ich fenotypu, a na koniec analizowane przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt

Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.

Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka

Głównym wyzwaniem przy opracowywaniu nowych terapii raka płuc jest modelowanie mikrośrodowiska guza w miarę postępu choroby regionalnej w kierunku choroby przerzutowej. Tutaj opisujemy prostą metodę ustanowienia ortotopowego modelu syngeneicznego raka płuc, który pozwala na śledzenie chorób in vivo w czasie.

Minimalnie inwazyjna metoda tworzenia syngeneicznego ortotopowego modelu myszy raka płuc

Poznaj metodę wszczepiania komórek Renca do nerki myszy w celu badania wzrostu guza i przerzutów do płuc. Model ten umożliwia ilościową ocenę skuteczności terapii przeciwnowotworowych.

Syngeniczny mysi model przerzutowego raka nerkowokomórkowego do ilościowej i podłużnej oceny terapii przedklinicznych

Przeglądaj więcej filmów