Syngeniczny mysi model przerzutowego raka nerkowokomórkowego do ilościowej i podłużnej oceny terapii przedklinicznych

Implementacja ortotopowego modelu raka nerkowokomórkowego u myszy immunokompetentnych daje badaczowi klinicznie istotny system zdefiniowany przez obecność pierwotnego guza nerki i przerzutów do płuc u tego samego zwierzęcia. System ten może być stosowany do przedklinicznego testowania różnych metod leczenia in vivo.

Ogólnym celem tej procedury jest ustalenie ortotopowych guzów nerki myszy poprzez wewnątrznerkową implantację komórki nowotworowej w celu zbadania wzrostu guza i przerzutów oraz skuteczności terapii przeciwnowotworowych. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie onkologii urologicznej, takie jak skuteczność nowej terapii w przedklinicznym modelu raka nerki. Główną zaletą tej techniki jest to, że implantacja guza śródnerkowego tworzy pierwotny guz nerki z przerzutami do płuc, naśladując kliniczną patogenezę raka nerkowokomórkowego.

Aby przygotować komórki nowotworowe Renca, najpierw odłącz hodowlę komórkową za pomocą 0,25% trypsyny i HBSS po spłukaniu PBS. Zneutralizuj reakcję po pięciu minutach za pomocą Complete RPMI Medium. Przenieś komórki do stożkowej probówki w celu odwirowania i ponownie zawiesić osad w świeżym HBSS.

Po zliczeniu dostosuj objętość do stężenia dwa razy dziesięć do sześciu komórek na mililitr w HBSS i wciągnij komórki do jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 18. Następnie umieść sterylną serwetę chirurgiczną na poduszce grzewczej i potwierdź odpowiedni poziom sedacji poprzez uszczypnięcie palca u nogi. Usuń włosy z lewego boku myszy i nałóż maść weterynaryjną na oczy.

Następnie przetrzyj miejsce implantacji środkiem antyseptycznym z 5% jodowidonem i za pomocą sterylnego skalpela wykonaj pojedyncze nacięcie na jeden do półtora centymetra na lewym boku, uważając, aby nie przeniknąć do otrzewnej. Za pomocą nożyczek oddziel skórę właściwą od otrzewnej, przecierając miejsce nacięcia sterylną bawełnianą gazą, aby usunąć krew. Następnie chwyć głowę lewą ręką i podeprzyj bok prawą ręką, aby zlokalizować śledzionę przez otrzewną.

Używając jednego palca prawej ręki, obmacuj mysz od spodu. Nerka powinna stać się widoczna. Trzymając zwierzę mocno, aby zapewnić napięcie w poprzek otrzewnej i nerki, poproś asystenta, aby powoli dostarczył 0,1 mililitra komórek Renca przez nienaruszoną otrzewną do środka nerki.

Przytrzymaj igłę na miejscu przez pięć do 10 sekund, aby zmniejszyć przepływ wsteczny komórek. Następnie zamknij nacięcie cienką warstwą kleju tkankowego z cyjanoakrylanu. W eksperymentalnym punkcie końcowym użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej, zaczynając od połowy brzucha przez klatkę piersiową, szyję i gruczoły ślinowe.

Za pomocą nożyczek i kleszczy ostrożnie usuń żebra, nie naruszając tkanki płucnej, i usuń tkankę łączną, aby odsłonić tchawicę. Napełnij trzymililitrową strzykawkę wyposażoną w igłę o rozmiarze 18 z 10% India Ink i PBS. Następnie za pomocą kleszczy ostrożnie nawlecz jedwabny szew pod tchawicę, a następnie zawiąż luźny węzeł.

Następnie ostrożnie włóż igłę do tchawicy i powoli napompuj płuca jednym do półtora mililitra roztworu India Ink. Pociągnij mocno węzeł wokół tchawicy, aby zahamować cofanie się atramentu, a następnie wyjmij igłę i ostrożnie odetnij tkankę łączną, aby usunąć napompowane płuca. Umieść płuca w 15-mililitrowej stożkowej rurce zawierającej pięć mililitrów roztworu Fekete w chemicznym dygestorium o temperaturze pokojowej.

Po 24 do 48 godzinach usuń nienaruszone, odbarwione płuca i ostrożnie rozsuń płaty na szalce Petriego o wymiarach 35 na 10 milimetrów. Następnie policz liczbę białych guzków guza pod mikroskopem preparacyjnym. Udana implantacja komórek Renca u myszy do nerek powoduje rozwój guza w nerce i przerzuty do płuc, przy czym zwierzęta z nowotworem wykazują duże obciążenie guzem, mierzone zwiększoną masą nerek z implantem nowotworowym.

Jak zaobserwowano, guzy Renca można zidentyfikować za pomocą barwienia immunohistochemicznego cytokeratyny ósmej i 18. Implantacja linii komórkowej Renca z ekspresją lucyferazy umożliwia śledzenie obciążenia guzem w nerce i przerzutów do płuc za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego, co dodatkowo potwierdza inflacja płuc India Link. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w mniej niż pięć minut na mysz, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wyraźnej identyfikacji nerki przez otrzewną, aby zapewnić dokładną implantację guza wewnątrznerkowego. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak przedkliniczne testy leków, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jakim stopniu nowy lek wpływa na wzrost lub przerzuty guzów wewnątrznerkowych? Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać wewnątrznerkową implantację komórek nowotworowych w celu ustalenia ortotopowych guzów nerki u myszy.

Nie zapominaj, że praca z żywymi zwierzętami i narzędziami chirurgicznymi może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak przestrzeganie wytycznych dotyczących obchodzenia się ze zwierzętami oraz utrzymywanie sterylnego obszaru chirurgicznego i narzędzi.