Elektroforeza kapilarna Separacja izoform przeciwciał monoklonalnych za pomocą neutralnej kapilary

Obecnie technika kapilarnej elektroforezy komórkowej stanowi jedno z najbardziej rozdzielczych i czułych narzędzi do analizy biomolekuł, takich jak przeciwciała monoklonalne. Jednak skuteczna implementacja tej techniki zależy od wiedzy i umiejętności analityka na krytycznych etapach przygotowania próbek i systemu. Niniejszy samouczek ma na celu przedstawienie sposobu przeprowadzenia udanej analizy, w tym szczegółowe wyjaśnienie przygotowania roztworów i próbek, przygotowanie systemu elektroforezy kapilarnej, konfigurację metody w urządzeniu oraz interpretację i przetwarzanie danych.

Ogólnie rzecz biorąc, niniejszy protokół może być wykorzystany do rozwoju i doskonalenia umiejętności personelu zaangażowanego w przygotowanie laboratoriów chemii analitycznej. Odważ odpowiednią ilość HPMC, aby uzyskać stężenie końcowe 0,05% w 100 ml. Ponieważ HPMC jest podstawowym polimerem elastycznym, w pierwszym kroku wsyp proszek do zlewki szklanej i powoli dodaj 80 ml wody, aby rozproszyć proszek.

Następnie opłucz tackę zwilżającą wodą, aby usunąć pozostałości proszku. Dodaj pozostałe odczynniki w zwykły sposób i wymieszaj roztwór. Dostosuj wartość pH do 4.8 za pomocą 50% kwasu octowego.

Następnie pozostawić roztwór do ustabilizowania na pięć minut. Po tym czasie skorygować pH w razie potrzeby. Dopełnić objętość wodą do końcowej wartości 100 mililitrów.

Przefiltruj przygotowany roztwór BG przez membranę neutrofilną i przelej do szklanej butelki. Na koniec odpowiednio opisz butelkę i przechowuj w warunkach chłodniczych. Aby przygotować próbkę, w pierwszym kroku dodaj 162 µL roztworu buforu śladowego do probówki o pojemności 1,5 mL.

Następnie dodaj 18 µL wcześniej przygotowanej próbki MAP o stężeniu 10 mg/ml. W trzecim kroku dodaj 20 µL wcześniej przygotowanego 1% roztworu histaminy, aby uzyskać końcową objętość próbki wynoszącą 200 µL. W kolejnym kroku przygotuj próbkę przez pięć sekund.

Następnie wiruj przez pięć sekund. Odessij całkowitą objętość próbki i przelej ją do mikroprobówki, kierując końcówkę do góry, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.

Na koniec zakręć fiolkę i przechowuj ją w lodówce. Wyłącz urządzenie CE, naciskając przełącznik zasilania. Następnie otwórz przednie drzwiczki.

Umieść nową chłonną ściereczkę pod blokiem interfejsu. Przepłucz elektrody przez blok interfejsu wodą, używając butelki z myjką. Pozostaw wodę do odcieknięcia przez otwory i dokładnie osusz blok interfejsu.

Ostrożnie usuń nadmiar wody z elektrod za pomocą chusteczki. Uważaj, aby podczas tej procedury nie dotknąć elektrod. Usuń chusteczkę z systemu mocowania próbek.

Przetrzyj powierzchnię tac z próbkami nową, zwilżoną wodą ściereczką niepozostawiającą włókien. Przetrzyj również powierzchnię tac z buforem. Przesuń tace z buforem do góry, podnieś system utrzymujący próbki i oczyść ich powierzchnię za pomocą ściereczki.

Przesuń tace z buforem z powrotem na miejsce. Następnie dokładnie wyczyść blok interfejsu. Wyczyść pręt zaciskowy oraz obudowę lampy UV.

Na koniec należy upewnić się, że system został przetestowany przed użyciem. Przepłucz dźwignie otwierające wodą za pomocą butelki zmywaka. Dokładnie oczyść ich powierzchnię nową, niepozostawiającą włókien ściereczką, aby usunąć kurz i nagromadzone sole.

Na koniec należy upewnić się, że działają one przed instalacją. Przetrzyj oba końce światłowodu ściereczką z mikrofibry zwilżoną wodą i potwierdź obecność wiązki światła między końcami. Wyjmij nową kapilarę neutralną z opakowania.

Przenieś teraz jeden koniec rurki ochronnej kapilary na stół roboczy. Rozwiń i wyprostuj plastikową rurkę, a następnie ostrożnie wyciągnij z niej kapilarę. Przymocuj do stołu roboczego kartkę papieru z następującymi oznaczeniami pomiarowymi.

Dostosuj okno kapilary do punktu zero znaczników pomiarowych w centymetrach w następujący sposób: Następnie przymocuj końce kapilary do blatu warsztatowego za pomocą taśmy. Zaznacz końce kapilary dwa milimetry poza znacznikami pomiarowymi. Odetnij ochronną nasadkę na końcu kapilary znajdującym się najdalej od okna.

Zanurz koniec kapilary w fiolce do CE wypełnionej wodą, aby zapobiec trwałemu uszkodzeniu wewnętrznej powłoki kapilary. Wyjmij kapilarę z fiolki i ostrożnie włóż ten koniec do strony wylotowej wkładu. Gdy kapilara pojawi się po drugiej stronie, wyciągnij ją w takim stopniu, aby okienko kapilary znalazło się w centrum okienka wkładu, jak pokazano poniżej.

Następnie obróć kasetę i włóż korek otworu do okna kasety, dociskając go aż do zaskoczenia w pozycji. Należy uważać, aby nie uszkodzić okna kapilary podczas tej procedury. Potwierdź, że światło przechodzi przez okno po wystawieniu go na szerokie źródło światła.

Wprowadź kapilarę do wcześniej przygotowanej rurki chłodziwa z fabrycznie zainstalowaną rurką, nakrętką i o-ringiem. Przesuwaj kapilarę przez rurkę, aż pojawi się ona po drugiej stronie. Następnie włóż koniec rurki do strony wylotowej wkładu i dokręć nakrętki rurki.

Wprowadź koniec wlotowy kapilary do strony wlotowej kartridża. Gdy kapilara pojawi się po drugiej stronie, pociągnij ją w razie potrzeby. Następnie wprowadź koniec rurki do strony wlotowej kartridża i dokręć nakrętki rurki.

Odetnij nakładkę ochronną na końcu kapilary znajdującym się najbliżej okna. Następnie zamontuj klipsy mocujące ogniwo na końcach kapilar, dociskając je, aż wskoczą na miejsce w następujący sposób. Otnij końce kapilar poniżej linii referencyjnych na płytkach wydłużających kapilary.

Należy dokładnie obejrzeć końce kapilar za pomocą lupy. Jeśli końce kapilar nie są gładkie, należy je wypolerować za pomocą kamienia Cleven. Umieść o-ring otworu w niebieskim otworze apertury.

Następnie należy go ostrożnie włożyć za pomocą narzędzia do montażu pierścienia O-ring. Na koniec należy umieścić w obudowie kartridża fiolki CE wypełnione wodą, a następnie niezwłocznie włożyć kartridż do obudowy, wprowadzając końce kapilar do fiolek, i przechowywać w warunkach chłodniczych. Należy ustawić objętość pipety.

Wlej odpowiednią objętość wody do wlotu buforu w koordynatach tacy A1, B1 oraz F6. Następnie wlej wodę do wylotu buforu w koordynatach tacy A1, B1, C1, E6 oraz F6. Dodaj HCl 0,1 normalny do wlotu buforu w koordynatach tacy C1 i E6. Następnie dodaj BGE do wlotu buforu w koordynatach tacy D1 i E6 oraz do wylotu buforu w koordynacie tacy D1. Na koniec zakręć wszystkie fiolki CE w tacach wlotowych i wylotowych buforu. Podczas procedury należy unikać zamoczenia zakrętki fiolki, aby zapobiec wyciekowi węgla. Otwórz przednie drzwi urządzenia CE.

W pierwszej kolejności należy zainstalować detektor UV i zabezpieczyć go, obracając śrubę zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Podnieść wewnętrzne drzwiczki i zainstalować dźwignie otwierające, wcisnąjąc je w górę do bloku interfejsu. Włożyć kabel światłowodowy do zacisku i obrócić go zgodnie z ruchem wskazówek zegara.

Drugi koniec należy podłączyć do detektora. Z kablem światłowodowym należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ jego zgięcie może spowodować pęknięcie. Włożyć tackę z próbką do systemu utrzymującego próbki i zatrzasnąć ją w odpowiedniej pozycji.

Postępując zgodnie z tą samą procedurą, umieść tacki z buforem w systemie utrzymującym próbki. Podnieś poprzeczkę zaciskową i umieść wkład kapilarny w bloku interfejsu. Naciśnij poprzeczkę zaciskową z obu stron i dokręć pokrętła, obracając je zgodnie z ruchem wskazówek zegara.

Zamknij wewnętrzne drzwiczki, a następnie zamknij przednie drzwiczki. Na koniec włącz urządzenie CE, naciskając przełącznik zasilania. Stwórz metodę kondycjonowania urządzenia.

Skonfiguruj parametry w sekcji warunków początkowych, w tym napięcie, kasetę, temperaturę przechowywania próbek oraz ustawienia wyzwalacza. Jako długość fali akwizycji wybierz dwie tysiące czternaście. Zdefiniuj czynności, które ma wykonać instrument, konfigurując parametry w komórkach programowania czasu.

W tym celu należy uwzględnić konkretne ustawienia dla każdego etapu płukania, wtrysku i rozdziału. Przeprowadź tę procedurę, aby stworzyć metody kondycjonowania, analizy oraz wyłączania instrumentu. Kolejnym krokiem jest utworzenie nowej sekwencji.

Zaprogramuj kapilarę do kondycjonowania, korzystając z metody kondycjonowania. Jeśli kapilara jest używana po raz pierwszy, zaprogramuj cztery powtórzenia. W przeciwnym razie zaprogramuj dwa powtórzenia.

Następnie zaprogramuj próbki do analizy, korzystając z metody pomiarowej. Na koniec zaprogramuj kapilarę do przechowywania, używając metody wyłączania. Analiza metodą elektroforezy kapilarnej zostaje zakończona w ciągu 30 minut.

Pierwszy wynik odpowiada wewnętrznemu standardowi histaminy jako miernikowi prawidłowego działania systemu. Następnie widoczne są charakterystyczne formy zasadowe, główne i kwasowe ocenianego przeciwciała monoklonalnego. Cały proces rozdziału przebiega przy stałym prądzie wynoszącym około 30 µA.

Po przeprowadzeniu eksperymentu wyeksportuj surowe dane z oprogramowania grab i zaimportuj je do oprogramowania empower w celu ich przetworzenia. Procentowa zawartość każdej formy izoelektrycznej jest uzyskiwana po pionowej integracji linii bazowej profilu elektroferogramu. Poniżej przedstawiono szczegółowy przewodnik krok po kroku, jak przeprowadzić analizę aktywności przeciwciał monoklonalnych wygenerowanych za pomocą kapilarnej elektroforezy komórkowej.

Oprócz kilku zaleceń mających na celu zminimalizowanie potencjalnych problemów, niniejszy protokół oferuje możliwość łatwego dostosowania do analizy innych białek poprzez wprowadzenie niewielkich modyfikacji parametrów przewodności i pH.