Name: Elektroforeza kapilarna Separacja izoform przeciwciał monoklonalnych za pomocą neutralnej kapilary (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Poznaj szczegółowy protokół elektroforezy kapilarnej do analizy przeciwciał monoklonalnych. Naucz się przygotowywać roztwory HPMC, konfigurować system CE i przetwarzać dane w celu niezawodnej oceny jakości białek terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Wileyowi za udzielone pozwolenie na wykorzystanie koncepcji z poniższej publikacji w tym samouczku. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analiza rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych za pomocą elektroforezy w strefie kapilarnej. Elektroforezy. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Prace te były wspierane przez CONACyT z Meksyku, grant 230551.

1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu BGE.
	<ol>
		<li>Przygotować 100 ml roztworu zawierającego 0,05% (m/v) hydroksypropylometylocelulozy (HPMC), 200 mM kwasu ε-amino n-kapronowego (EACA) oraz 30 mM octanu litu. 
		UWAGA: Ponieważ HPMC jest polimerem wiskoelastycznym, należy wsypać proszek do zlewki szklanej, dodać 80 mL wody, a na końcu włożyć mieszadło magnetyczne. Pozostałe odczynniki dodawać w sposób rutynowy. Podczas pracy z octanem litu należy nosić okulary ochronne, ponieważ może on powodować podrażnienie oczu.</li>
		<li>Dostosować pH do wartości 4,8 ± 0,1 za pomocą 50% (v/v) kwasu octowego. Odczekać 5 min aż roztwór się ustabilizuje i w razie potrzeby ponownie skorygować pH.</li>
		<li>Dopełnić wodą do końcowej objętości 100 ml w kolbie miarowej.</li>
		<li>Przefiltrować przez membranę hydrofilową o rozmiarze porów 0,2 µm.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze 2-8 °C do 7 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie standardu wewnętrznego.
	<ol>
		<li>Przygotować 1 mL roztworu zawierającego 1% (m/v) histaminy.</li>
		<li>Przefiltrować przez membranę hydrofilową o rozmiarze porów 0,2 µm.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze 2-8 °C do 1 dnia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Przygotować 180 µl próbki mAb rozcieńczonej buforem Tris (50 mM tris(hydroksymetylo)aminometan, pH 8.0) do stężenia końcowego 1 mg/ml.</li>
	<li>Dodać 20 µl 1% (m/v) histaminy.</li>
	<li>Wymieszać i wirować przy 1,000 x g przez 5 sec.</li>
	<li>Umieścić mikrokapsułkę wewnątrz fiolki uniwersalnej.</li>
	<li>Przenieść próbkę do mikrokapsułki i zakręcić fiolkę uniwersalną. Przenieść próbkę kierując strumień do góry, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 2-8 °C do 1 dnia.</li>
	<li>Umieścić fiolkę uniwersalną (z mikrokapsułką zawierającą roztwór próbki) w tacy wlotowej na próbki.</li>
</ol>
3. Przygotowanie układu CE.
<ol>
	<li>Czyszczenie systemu CE. 
	UWAGA: Procedurę tę należy przeprowadzać co najmniej raz w tygodniu, aby uniknąć upływu prądu elektrycznego wynikającego z gromadzenia się kurzu i zanieczyszczeń. Jednak w zależności od zastosowania (np. stosowania BGE o zwiększonej lepkości lub wysokim stężeniu soli, próbek o zwiększonej lepkości) elektrody i dźwignie otwierające mogą wymagać częstszego czyszczenia w celu zapobiegania zanieczyszczeniom krzyżowym i przeniesieniu próbek.
	<ol>
		<li>Wyłącz przełącznik zasilania instrumentu CE i otwórz przednie drzwiczki.</li>
		<li>Oczyść powierzchnię osłony próbek, systemu utrzymującego próbki (tace na próbki i bufor), osłonę kartridża, listwę zaciskową, blok interfejsu oraz elektrody za pomocą wilgotnej wodą chusteczki włókninowej. Powtórz procedurę, używając chusteczki zwilżonej etanolem, a następnie osusz przed użyciem.</li>
		<li>Dokładnie wypłucz dźwignie otwierające wodą. Oczyść ich powierzchnię chusteczką włókninową. Powtórz procedurę, używając chusteczki zwilżonej etanolem, a następnie osusz przed montażem.</li>
		<li>Ostrożnie oczyść oba końce kabla światłowodowego za pomocą wilgotnej wodą ściereczki z mikrofibry. Powtórz procedurę, używając ściereczki zwilżonej etanolem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż kartridża.
	<ol>
		<li>Wyjmij nową kapilarę neutralną (średnica wewnętrzna 50 µm) z opakowania.</li>
		<li>Przyklej jeden koniec rurki ochronnej kapilary taśmą do blatu roboczego. Rozwiń, wyprostuj i wyciągnij kapilarę z rurki.</li>
		<li>Przyklej kawałek taśmy lub papieru do blatu roboczego i nanieś następujące znaczniki pomiarowe: długość do detektora (30 cm), okno kapilary (0.2 cm) i długość do końca wylotowego (10 cm) (tzn. całkowita długość 40.2 cm, długość efektywna 30.0 cm).</li>
		<li>Wyrównaj okno kapilary z oznaczeniem pomiarowym 0.2 cm na papierze referencyjnym. Przymocuj kapilarę taśmą i zaznacz końce kapilary 2 mm poza znacznikami pomiarowymi.</li>
		<li>Odetnij nasadkę ochronną na końcu wlotowym kapilary (koniec najdalej oddalony od okna) jednym prostym ruchem, używając płaskiej krawędzi kamienia do przecinania.
		<ol>
			<li>Zanurz koniec kapilary w zamkniętej fiolce uniwersalnej wypełnionej wodą, aby uniknąć trwałego uszkodzenia wewnętrznej powłoki kapilary. Powtarzaj tę procedurę za każdym razem, gdy koniec kapilary jest wystawiony na działanie otoczenia przez więcej niż 1 min.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wsuń koniec wlotowy kapilary w stronę wylotową kartridża.</li>
		<li>Przesuwaj kapilarę przez kartridż w przód i w tył w razie potrzeby, aż okno kapilary zostanie wycentrowane względem okna kartridża.</li>
		<li>Włóż zatyczkę apertury (100 µm x 200 µm) do okna kartridża. 
		UWAGA: Potwierdź, że białe światło przechodzi przez okno po wystawieniu na białe źródło światła. Jeśli światło przechodzące ma brązowy odcień, dokonaj niezbędnych korekt.</li>
		<li>Wsuń kapilarę do wstępnie uformowanej rurki chłodzącej, tak aby całkowita długość kapilary wynosiła 40.2 cm (z wstępnie zamontowaną nakrętką rurki, tulejką i o-ringiem na obu końcach w tej kolejności).</li>
		<li>Przesuwaj kapilarę przez rurkę chłodzącą w razie potrzeby, aż kapilara pojawi się po drugiej stronie rurki.</li>
		<li>Wsuń koniec rurki chłodzącej w stronę wylotową kartridża i dokręć nakrętkę rurki.</li>
		<li>Wsuń koniec wlotowy kapilary w stronę wlotową kartridża.</li>
		<li>Przesuwaj kapilarę przez kartridż w przód i w tył w razie potrzeby, aż kapilara pojawi się po stronie wlotowej kartridża.</li>
		<li>Wsuń koniec rurki chłodzącej w stronę wlotową kartridża i dokręć nakrętkę rurki.</li>
		<li>Odetnij nasadkę ochronną na końcu wylotowym kapilary (koniec najbliższy okna) jednym prostym ruchem, używając płaskiej krawędzi kamienia do przecinania.</li>
		<li>Nałóż klipsy mocujące uszczelkę na końce kapilary i dociśnij, aż wskoczą na miejsce. Dokonaj wizualnej inspekcji końców kapilary. Jeśli nie są równe, powtórz procedurę.</li>
		<li>Umieść szablon długości kapilary na krawędzi blatu roboczego.</li>
		<li>Przyłóż kartridż spodem do szablonu długości kapilary i wyrównaj końce kapilary z liniami referencyjnymi na szablonie. Jeśli znaczniki pomiarowe kapilary (patrz 3.2.4) nie pokrywają się z liniami referencyjnymi, dokonaj niezbędnych korekt.</li>
		<li>Przytrzymaj kapilarę przy szablonie długości kapilary i odetnij oba końce kapilary, używając płaskiej krawędzi kamienia do przecinania 2 mm poniżej linii referencyjnych na szablonie.</li>
		<li>Obejrzyj końce kapilary pod lupą. Jeśli końce kapilary nie są gładkie, wypoleruj je miękką stroną kamienia do przecinania.</li>
		<li>Włóż o-ring apertury do otworu zatyczki apertury za pomocą narzędzia do wkładania o-ringów.</li>
		<li>Umieść zamknięte fiolki uniwersalne wypełnione wodą w obudowie kartridża i natychmiast włóż kartridż do obudowy z końcami kapilary zanurzonymi w fiolkach. Do przechowywania krótkoterminowego i długoterminowego zachować w temperaturze 2-8 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie tac z buforem.
	<ol>
		<li>Napełnij i umieść zamknięte fiolki uniwersalne w tacach wlotowych i wylotowych buforu (Rycina 1). Powtórz rozmieszczenie fiolek w ścieżkach 2, 3, 4 i 5 zgodnie z liczbą próbek do analizy, przeznaczając jedną ścieżkę na każde sześć wtrysków próbek. 
		UWAGA: Unikaj zamoczenia nakrętek fiolek, aby zapobiec upływowi prądu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Ustawienie tacy z buforami do elektroforezy; tace wlotowe i wylotowe, oznakowane rzędy i kolumny, rozkład chemikaliów." src="/files/ftp_upload/55082/55082fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Położenie i poziom napełnienia uniwersalnych fiolek w tacach wlotowych i wylotowych buforu.Poziomy napełnienia: 1/1 = 1400 µL, 3/4 = 1300 µL oraz 1/2 = 1000 µL. Skróty: W = woda, HCl = 0.1 M kwas solny. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="4">
	<li>Montaż komponentów systemu CE.
	<ol>
		<li>Zainstaluj detektor UV.</li>
		<li>Zainstaluj dźwignie otwierające, dociskając je do góry w bloku interfejsu.</li>
		<li>Zainstaluj kabel światłowodowy. Wsuń odpowiedni koniec do listwy zaciskowej i, trzymając oba końce, obróć go zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Podłącz drugi koniec do detektora UV. 
		UWAGA: Podczas tej procedury należy obchodzić się z kablem światłowodowym z ostrożnością, ponieważ jego zgięcie może spowodować pęknięcie.</li>
		<li>Umieść tacki na próbki i bufory w systemie utrzymującym próbki i zatrzaśnij je w odpowiedniej pozycji.</li>
		<li>Umieść wkład kapilarny w bloku interfejsu i, dociskając listwę zaciskową z obu końców, dokręć pokrętła.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Konfiguracja metod aparatury
<ol>
	<li>Utwórz metody kondycjonowania, pomiarowe i wyłączania instrumentu zgodnie z poniższymi parametrami oraz Tabelą 1: Napięcie, max: 30.0 kV; Prąd, max: 300.0 µA; Temperatura kolumny: 20.0 °C; Temperatura przechowywania próbek: 10.0 °C; Warunki początkowe detektora UV: Długość fali: 214 nm; Częstotliwość próbkowania: 4 Hz; Filtr: Normal; Szerokość piku (punkty): 16-25; Sygnał absorbancji: Direct. 
	UWAGA: Częstotliwość próbkowania danych może zostać zwiększona do 25 Hz w celu poprawy pokrycia wąskich stref separacji.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="8">Program czasowy metody kondycjonowania</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas (min)</td >
			<td >Zdarzenie</td >
			<td >Wartość</td >
			<td >Czas trwania</td >
			<td >Fiolka wlotowa</td >
			<td >Fiolka wylotowa</td >
			<td >Podsumowanie</td >
			<td >Uwagi</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >-</td >
			<td >Płukanie - ciśnienie</td >
			<td >2068 mbar</td >
			<td >1.0 min</td >
			<td >BI:C1</td >
			<td >BO:C1</td >
			<td >W przód</td >
			<td >HCl 0.1 M</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >-</td >
			<td >Płukanie - ciśnienie</td >
			<td >2068 mbar</td >
			<td >2.0 min</td >
			<td >BI:B1</td >
			<td >BO:C1</td >
			<td >W przód</td >
			<td >Woda</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >-</td >
			<td >Płukanie - ciśnienie</td >
			<td >2068 mbar</td >
			<td >10.0 min</td >
			<td >BI:E1</td >
			<td >BO:C1</td >
			<td >W przód</td >
			<td >BGE</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >0.00</td >
			<td >Rozdział - napięcie</td >
			<td >15.0 KV</td >
			<td >10.0 min</td >
			<td >BI:D1</td >
			<td >BO:D1</td >
			<td >Rampa 0.17 min, polaryzacja normalna</td >
			<td >Rozdział</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >10.00</td >
			<td >Płukanie - ciśnienie</td >
			<td >2758 mbar</td >
			<td >10.0 min</td >
			<td >BI:E1</td >
			<td >BO:C1</td >
			<td >W przód</td >
			<td >BGE</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >20.01</td >
			<td >Oczekiwanie</td >
			<td >-</td >
			<td >0.0 min</td >
			<td >BI:A1</td >
			<td >BO:A1</td >
			<td >-</td >
			<td >Płukanie końcówek</td >
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="8">Program czasowy metody pomiarowej</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas (min)</td >
			<td >Zdarzenie</td >
			<td >Wartość</td >
			<td >Czas trwania</td >
			<td >Fiolka wlotowa</td >
			<td >Fiolka wylotowa</td >
			<td >Podsumowanie</td >
			<td >Uwagi</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >-</td >
			<td >Płukanie - ciśnienie</td >
			<td >2068 mbar</td >
			<td >1.0 min</td >
			<td >BI:C1</td >
			<td >BO:C1</td >
			<td >W przód, zwiększ fiolkę wejście/wyjście o 6</td >
			<td >HCl 0.1 M</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >-</td >
			<td >Płukanie - ciśnienie</td >
			<td >2068 mbar</td >
			<td >2.0 min</td >
			<td >BI:B1</td >
			<td >BO:C1</td >
			<td >W przód, zwiększ fiolkę wejście/wyjście o 6</td >
			<td >Woda</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >-</td >
			<td >Płukanie - ciśnienie</td >
			<td >2068 mbar</td >
			<td >4.0 min</td >
			<td >BI:E1</td >
			<td >BO:C1</td >
			<td >W przód, zwiększ fiolkę wejście/wyjście o 6</td >
			<td >BGE</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >-</td >
			<td >Wtrysk - ciśnienie</td >
			<td >34 mbar</td >
			<td >20.0 sec</td >
			<td >SI:A1</td >
			<td >BO:B1</td >
			<td >Nadpisanie, w przód</td >
			<td >Wtrysk próbki</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >-</td >
			<td >Oczekiwanie</td >
			<td >-</td >
			<td >0.4 min</td >
			<td >BI:A1</td >
			<td >BO:A1</td >
			<td >Zwiększ fiolkę wejście/wyjście o 6</td >
			<td >Mycie końcówek</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >0</td >
			<td >Rozdział - napięcie</td >
			<td >15.0 KV</td >
			<td >30.0 min</td >
			<td >BI:D1</td >
			<td >BO:D1</td >
			<td >Rampa 0.17 min, polaryzacja normalna, zwiększ fiolkę wejście/wyjście o 6</td >
			<td >Rozdział próbki</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >0.5</td >
			<td >Autozero</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >30.01</td >
			<td >Zatrzymanie danych</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >30.02</td >
			<td >Płukanie - ciśnienie</td >
			<td >2068 mbar</td >
			<td >2.0 min</td >
			<td >BI:B1</td >
			<td >BO:C1</td >
			<td >W przód, zwiększ fiolkę wejście/wyjście o 6</td >
			<td >Woda</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >32.03</td >
			<td >Oczekiwanie</td >
			<td >-</td >
			<td >0.0 min</td >
			<td >BI:A1</td >
			<td >BO:A1</td >
			<td >Zwiększ fiolkę wejście/wyjście o 6</td >
			<td >Płukanie końcówek</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >32.04</td >
			<td >Koniec</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
			<td >Koniec</td >
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="8">Program czasowy metody wyłączania</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas (min)</td >
			<td >Zdarzenie</td >
			<td >Wartość</td >
			<td >Czas trwania</td >
			<td >Fiolka wlotowa</td >
			<td >Fiolka wylotowa</td >
			<td >Podsumowanie</td >
			<td >Uwagi</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >-</td >
			<td >Płukanie - ciśnienie</td >
			<td >2068 mbar</td >
			<td >1.0 min</td >
			<td >BI:E6</td >
			<td >BO:E6</td >
			<td >W przód</td >
			<td >HCl 0.1 M</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >-</td >
			<td >Płukanie - ciśnienie</td >
			<td >2068 mbar</td >
			<td >6.0 min</td >
			<td >BI:F6</td >
			<td >BO:F6</td >
			<td >W przód</td >
			<td >Woda</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >-</td >
			<td >Lampa - wyłącz</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >-</td >
			<td >Oczekiwanie</td >
			<td >-</td >
			<td >0.0 min</td >
			<td >BI:A1</td >
			<td >BO:A1</td >
			<td >-</td >
			<td >Płukanie końcówek</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Programy czasu kondycjonowania, pracy i wyłączania.
5. Pozyskiwanie i przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Zaprogramuj zestaw próbek.
	<ol>
		<li>Zaprogramuj kapilarę do kondycjonowania, korzystając z metody kondycjonowania instrumentu. Jeśli kapilara jest używana po raz pierwszy, zaprogramuj cztery powtórzenia; w przeciwnym razie zaprogramuj tylko dwa powtórzenia metody kondycjonowania.</li>
		<li>Zaprogramuj próbki do analizy, korzystając z metody pomiarowej instrumentu.</li>
		<li>Zaprogramuj kapilarę do przechowywania, korzystając z metody wyłączania instrumentu, i powtórz procedurę opisaną w sekcji 3.2.22.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź eksperyment.</li>
	<li>Wyeksportuj elektroferogramy.</li>
	<li>Oblicz czas migracji oraz zawartość procentową izoform zasadowych, głównych i kwasowych, stosując całkowanie profilu elektroferogramu metodą linii pionowych.</li>
</ol>

<ol><li>Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advent+of+monoclonal+antibodies+in+the+treatment+of+chronic+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases.</a> Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).</li>
<li>Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of monoclonal antibodies.</a> J. Pharm. Sci. 97 (7), 2426-2447 (2008).</li>
<li>Creamer, J. S., Oborny, N. J., Lunte, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+analysis+of+therapeutic+proteins+by+capillary+and+microchip+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Methods%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the analysis of therapeutic proteins by capillary and microchip electrophoresis.</a> Anal. Methods. 6 (15), 5427-5449 (2014).</li>
<li>Fekete, S., Guillarme, D., Sandra, P., Sandra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic%2C+Electrophoretic%2C+and+Mass+Spectrometric+Methods+for+the+Analytical+Characterization+of+Protein+Biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals.</a> Anal. Chem. 88 (1), 480-507 (2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+identity%2C+charge+variants%2C+and+disulfide+isomers+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+an+uncoated+capillary+column%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of identity, charge variants, and disulfide isomers of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in an uncoated capillary column.</a> Anal. Chem. 82 (8), 3222-3230 (2010).</li>
<li>He, Y., Isele, C., Hu, W., Ruesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+charge+variants+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+dynamically+coated+fused-silica+capillary%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary.</a> J. Sep. Sci. 34 (5), 548-555 (2011).</li>
<li>Zhao, S. S., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+capillary+electrophoresis+in+characterizing+recombinant+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics.</a> Electrophoresis. 35 (1), 96-108 (2014).</li>
<li>Štěpánová, S., Kašička, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+impurities+and+counterions+of+pharmaceuticals+by+capillary+electromigration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of impurities and counterions of pharmaceuticals by capillary electromigration methods.</a> J. Sep. Sci. 37 (15), 2039-2055 (2014).</li>
<li>Štěpánová, S., Kašička, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+applications+of+capillary+electromigration+methods+to+separation+and+analysis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Recent applications of capillary electromigration methods to separation and analysis of proteins.</a> Anal. Chim. Acta. 933, 23-42 (2016).</li>
<li>Espinosa-de la Garza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+recombinant+monoclonal+antibodies+by+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis.</a> Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).</li>
<li>Staub, A., Guillarme, D., Schappler, J., Veuthey, J. L., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+protein+analysis+in+the+biopharmaceutical+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Intact protein analysis in the biopharmaceutical field.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 55 (4), 810-822 (2011).</li>
<li>Altria, K. D. Troubleshooting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltria%2C+KD+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Vol+52.+Capillary+Electrophoresis+Guidebook%3A+Principles%2C+Operation+and+Applications%22">Methods in Molecular Biology, Vol 52. Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation and Applications</a>. Altria, K. D. , Chapter 10 (1996).</li>
<li>Ma, S., Nashabeh, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+therapeutics+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatographia%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein therapeutics by capillary electrophoresis.</a> Chromatographia. 53 (5), 75-89 (2001).</li>
<li>Jaccoulet, E., Smadja, C., Prognon, P., Taverna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+for+rapid+identification+of+monoclonal+antibodies+for+routine+application+in+hospital%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis for rapid identification of monoclonal antibodies for routine application in hospital.</a> Electrophoresis. 36 (17), 2050-2056 (2015).</li>
</ol>

Autorzy: Carlos E. Espinosa-de la Garza, Rodolfo D. Salazar-Flores, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz i Emilio Medina-Rivero są pracownikami firmy Probiomed S.A. de C.V., która opracowuje i wprowadza do obrotu produkty biopodobne. Wszyscy autorzy są zaangażowani w rozwój produktów biopodobnych dla Probiomed.

W tym samouczku podkreślamy znaczenie właściwych praktyk podczas przeprowadzania analiz CZE mAb w celu zwiększenia prawdopodobieństwa sukcesu. Jednakże, gdy CZE jest używane rutynowo, nieuchronnie pojawiają się problemy12.
Aby uzyskać najlepsze wyniki, ważne jest, aby postępować zgodnie z uwagami, które zostały zawarte w całym protokole, ponieważ pomogą one analitykowi przezwyciężyć trudne kroki i rozwiązać ich problemy. Głównym czynnikiem branym pod uwagę w celu uzyskania optymalne...

Przeciwciała monoklonalne (mAb) są białkami bioterapeutycznymi, które cieszą się coraz większym zainteresowaniem ze względu na ich zdolność do działania przeciwko kilku chorobom przewlekłym i zwyrodnieniowym1. Podobnie jak inne biomolekuły, mAb są podatne na szereg modyfikacji fizykochemicznych na wszystkich etapach swojego cyklu życia (tj. od biosyntezy do produktu końcowego). Takie modyfikacje obejmują między innymi: deamidację, glikozylację, utlenianie, cyklizację, izomeryzację, agregację i rozszczepienie proteolityczne2. W związku z tym potrzebne są techniki analityczne zdolne do wyodrębniania wewnętrznych izoform w celu monitorowania niejednorodności i stabilności mAb w celu ustalenia specyfikacji jakościowych.
Elektroforeza kapilarna (CE) to wysokowydajna technologia separacji przeprowadzana wewnątrz wąskiej rurki z topionej krzemionki (zakres μm) wypełnionej elektrolitem tła (BGE). Po przyłożeniu pola elektrycznego (do 30 000 V) naładowane cząsteczki migrują w kierunku elektrody z przeciwnym ładunkiem (tj. separacją napędzaną elektrycznie). Zastosowanie wysokich napięć w CE pozwala na szybkie analizy i zwiększenie wydajności, które przewyższają klasyczną elektroforezę żelową. Elektroforeza w strefie kapilarnej (CZE) jest techniką opartą na CE rutynowo stosowaną w przemyśle biofarmaceutycznym do oceny jakości produktu3-9. W przeciwieństwie do innych metod CE (np. elektroforeza kapilarna w żelu, kapilarne ogniskowanie izoelektryczne) lub metod opartych na chromatografii, CZE można przeprowadzić bez użycia denaturantów lub granic faz stałych, co pozwala na analizę nieodłącznej heterogeniczności mAb zbliżonej do ich stanu macierzystego10. Separacja izoform mAb CZE zachodzi wewnątrz kapilary stopionej krzemionką pokrytej hydrofilowym polimerem (kapilara obojętna) i opiera się na ich różnej ruchliwości elektroforetycznej, która zależy od ładunku, masy, wielkości i kształtu (lub objętości hydrodynamicznej)11. Cząstki mAb są wykrywane, gdy są mobilizowane i przechodzą przez okno detekcji, które jest wykrywane przez detektor absorpcji ultrafioletu (UV) przy 214 nm4.
Pomyślne wdrożenie tej techniki analitycznej będzie zależało od odpowiedniej dbałości o szczegóły przed i w trakcie eksperymentu. Działanie w przeciwnym razie zwiększy koszty i czas przeprowadzenia analizy, co ostatecznie doprowadzi do ciągłych niepowodzeń i frustracji.
Tutaj prezentujemy przewodnik krok po kroku, jak przeprowadzić udaną analizę heterogeniczności mAb przez CZE poprzez szczegółowe wyjaśnienie przygotowania roztworów i próbek, przygotowania systemu CE, konfiguracji metod instrumentów, pozyskiwania danych i przetwarzania. Na potrzeby tego samouczka jako model białkowy stosuje się rekombinowany, w pełni ludzki czynnik martwicy nowotworów alfa (anty-TNFα); Jednak protokół ten można łatwo dostosować do analizy innych białek, biorąc pod uwagę krótkie modyfikacje. Ponadto zaproponowano kilka zaleceń mających na celu złagodzenie potencjalnych problemów. Czytelnik jest zachęcany do ścisłego przestrzegania proponowanego protokołu, ponieważ prawdopodobieństwo sukcesu wzrośnie.

<table><tbody><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Tecsiquim</td><td>AT0035-7</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny klasy ACS</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-05</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek histaminy</td><td>Fluka</td><td>53300</td><td></td></tr><tr><td>(hydroksypropylo)metyloceluloza&nbsp;</td><td>Fluka</td><td>09963</td><td></td></tr><tr><td>Octan litu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 6-aminokapronowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Tris Buffer, 50,0 mM,&nbsp; pH 8</td><td>Beckman Coulter</td><td>477427</td><td></td></tr><tr><td>PA 800 Plus System analizy farmaceutycznej</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66528</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Kapila neutralna&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>477441</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka, Micro, 200 i mikro; l</td><td>Beckman Coulter</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalne nasadki na fiolki</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62250</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki uniwersalne</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62251</td><td></td></tr><tr><td>, optyka, UV/Vis</td><td>Beckman Coulter</td><td>144093</td> Moduł detektora UV/Vis Beckman Coulter 144733 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>zestaw montażowy wkładu, pusty</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>144738</tr></tbody></table>

elektroforeza kapilarna separacja izoform przeciwciał monoklonalnych za pomocą neutralnej kapilary

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Białka bioterapeutyczne, takie jak przeciwciała monoklonalne (mAb), są realnymi alternatywami w leczeniu chorób przewlekło-zwyrodnieniowych. Aktywność biologiczna tych białek zależy od ich właściwości fizykochemicznych. Opisano zastosowanie technik o wysokiej wydajności, takich jak chromatografia i elektroforeza kapilarna, do analizy niejednorodności fizykochemicznej mAb. Obecnie technika elektroforezy w strefie kapilarnej (CZE) stanowi jeden z najbardziej rozdzielczych i czułych testów do analizy biomolekuł. Poza tym separacja sterowana elektrycznie w CZE jest regulowana przez rozległe właściwości materii i oferuje tę zaletę, że analizuje białka w stanie zbliżonym do ich rodzimego stanu. Jednak pomyślne wdrożenie tej techniki do rutynowej analizy zależy od umiejętności analityka na krytycznych etapach przygotowywania próbki i systemu. Celem tego samouczka jest szczegółowe omówienie kroków, które należy wykonać, aby odnieść sukces w analizie CZE mAb. Ponadto protokół ten może być wykorzystywany do rozwoju i doskonalenia umiejętności personelu zaangażowanego w laboratoria chemii analitycznej białek.

Rysunek 2 przedstawia typowy profil prądu elektrycznego dla BGE składającego się z 200 mM EACA i 30 mM octanu litu o pH 4.8, z próbką mAb anty-TNFα rozcieńczoną buforem Tris (50 mM, pH 8.0). Jak widać, prąd pozostaje stabilny przez cały czas trwania analizy i może oscylować w granicach od 30 do 35 µA. Rysunek 3 przedstawia elektroferogram CZE dla próbki ślepej, w której wykryty piki odpowiada wewnętrznemu standardowi histaminy. Przewidywany czas migracji ...

Tutaj prezentujemy kompleksowy protokół elektroforezy strefy kapilarnej do oceny wewnętrznej fizykochemicznej heterogeniczności przeciwciał monoklonalnych jako atrybutu jakości.

Elektroforeza kapilarna Separacja izoform przeciwciał monoklonalnych za pomocą neutralnej kapilary

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Obecnie technika kapilarnej elektroforezy komórkowej stanowi jedno z najbardziej rozdzielczych i czułych narzędzi do analizy biomolekuł, takich jak przeciwciała monoklonalne. Jednak skuteczna implementacja tej techniki zależy od wiedzy i umiejętności analityka na krytycznych etapach przygotowania próbek i systemu. Niniejszy samouczek ma na celu przedstawienie sposobu przeprowadzenia udanej analizy, w tym szczegółowe wyjaśnienie przygotowania roztworów i próbek, przygotowanie systemu elektroforezy kapilarnej, konfigurację metody w urządzeniu oraz interpretację i przetwarzanie danych.Ogólnie rzecz biorąc, niniejszy protokół może być wykorzystany do rozwoju i doskonalenia umiejętności personelu zaangażowanego w przygotowanie laboratoriów chemii analitycznej. Odważ odpowiednią ilość HPMC, aby uzyskać stężenie końcowe 0,05% w 100 ml. Ponieważ HPMC jest podstawowym polimerem elastycznym, w pierwszym kroku wsyp proszek do zlewki szklanej i powoli dodaj 80 ml wody, aby rozproszyć proszek.Następnie opłucz tackę zwilżającą wodą, aby usunąć pozostałości proszku. Dodaj pozostałe odczynniki w zwykły sposób i wymieszaj roztwór. Dostosuj wartość pH do 4.8 za pomocą 50% kwasu octowego.Następnie po

capillary-electrophoresis-separation-monoclonal-antibody-isoforms

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje technikę chromatografii powinowactwa do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych 2F5 za pomocą ligandów DsRed-2F5-Epitope lub DFE. Oczyszczone przeciwciała monoklonalne 2F5 są niezbędnymi lekami w immunoterapii.

Chromatografia powinowactwa oparta na DFE: technika oczyszczania przeciwciał monoklonalnych 2F5 z surowej próbki przy użyciu warunków elucji opartych na wysokiej sile jonowej

Ten film demonstruje technikę oczyszczania przeciwciał monoklonalnych z supernatantu hodowli uzyskanego z hodowli komórkowej wytwarzającej przeciwciała. Proces ten polega na wykorzystaniu matrycy usieciowanych kulek agarozy ze sprzężonym białkiem A, które unieruchamia przeciwciała w supernatancie na kulkach, co pozwala na skuteczne oddzielenie od zanieczyszczeń. Poprzez zastosowanie buforu elucyjnego o niskim pH oddziaływanie białka A z przeciwciałem zostaje rozluźnione, co ułatwia zbieranie...

Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych

Ten film demonstruje protokół testu immunologicznego elektroforezy kapilarnej do wykrywania biomarkera białkowego związanego ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) z płytek krwi ludzkiej. Potwierdzenie obecności białka biomarkerowego ALS uzyskuje się poprzez rozdzielenie białek płytek krwi na podstawie wielkości, a następnie detekcję chemiluminescencyjną.

Test immunologiczny elektroforezy kapilarnej do wykrywania biomarkerów białkowych

W porównaniu z tradycyjną chromatografią powinowactwa z użyciem kolumn wypełnionych kulkami białka A, adsorbery błonowe białka A mogą znacznie przyspieszyć laboratoryjną izolację przeciwciał i innych białek wyrażających fragmenty Fc. Odpowiednie metody analizy i kwantyfikacji mogą jeszcze bardziej przyspieszyć przetwarzanie białek, pozwalając na zakończenie izolacji/charakterystyki w ciągu jednego dnia roboczego, zamiast 20+ godzin pracy.

Izolacja i charakterystyka chimerycznych ludzkich białek eksprymujących Fc przy użyciu adsorberów błonowych białka A i usprawnionego przepływu pracy

Zademonstrowano test immunologiczny oparty na naczyniach włosowatych, wykorzystujący komercyjną platformę do pomiaru docelowych białek z całkowitych preparatów białkowych. Ponadto parametry testowe czasu ekspozycji, stężenia białka i rozcieńczenia przeciwciał są zoptymalizowane pod kątem systemu modelowego hodowli komórkowych.

Procedura i kluczowe strategie optymalizacyjne dla zautomatyzowanej metody immunologicznego opartego na elektroforetycznych naczyniach włosowatych

Ogniskowanie izoelektryczne kapilarne to oparta na przeciwciałach, ultraczuła, wysokoprzepustowa technika, umożliwiająca szczegółową charakterystykę białek i ich izoform z bardzo małych próbek biologicznych. Poniżej opisano protokół wykrywania i oznaczania ilościowego określonych białek i ich izoform w sposób zautomatyzowany i zrobotyzowany.

Wysoce czułe i ilościowe wykrywanie białek i ich izoform metodą kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego

Opisano szczegółowy protokół oczyszczania i późniejszej analizy przeciwciała monoklonalnego z pobranego płynu do hodowli komórek (HCCF) zautomatyzowanych mikrobioreaktorów. Przedstawiono również wykorzystanie analiz do określenia krytycznych atrybutów jakości (CQA) i maksymalizacji ograniczonej objętości próbki w celu wyodrębnienia istotnych informacji.

Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora

Przedstawiono protokół profilowania metabolicznego próbek biologicznych za pomocą elektroforezy kapilarnej - spektrometrii mas z wykorzystaniem projektu interfejsu porowatej końcówki bez osłony.

Elektroforeza kapilarna bez osłonki – spektrometria mas do profilowania metabolicznego próbek biologicznych

Ten artykuł opisuje prosty i szybki protokół oceny oligomerycznego stanu białka GTPase MxA podobnego do dynaminy z lizatów komórek ludzkich przy użyciu kombinacji niedenaturującego PAGE z analizą western blot.

Charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego MxA przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu

Ten protokół opisuje produkcję przeciwciała terapeutycznego w systemie ekspresji ssaków. Opisane metody obejmują przygotowanie DNA wektora, stabilną transfekcję i adaptację ludzkiej linii komórkowej 293 zarodka nerki bez surowicy, stworzenie kultur na dużą skalę i oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa.

Produkcja i oczyszczanie przeciwciała terapeutycznego na skalę laboratoryjną

Poznaj szczegółowy protokół elektroforezy kapilarnej do analizy przeciwciał monoklonalnych. Naucz się przygotowywać roztwory HPMC, konfigurować system CE i przetwarzać dane w celu niezawodnej oceny jakości białek terapeutycznych.

Elektroforeza kapilarna Separacja izoform przeciwciał monoklonalnych za pomocą neutralnej kapilary

Przeglądaj więcej filmów