Elektroforeza kapilarna Separacja izoform przeciwciał monoklonalnych za pomocą neutralnej kapilary

Obecnie technika elektroforezy komórek kapilarnych stanowi jeden z najbardziej rozczynnych i czułych stanów do analizy biomolekuł, takich jak przeciwciała jednookrężnicowe. Jednak pomyślne wdrożenie tej techniki zależy od wiedzy i umiejętności analityka na krytycznych etapach przygotowywania próbki i systemu. Ten samouczek ma na celu przeprowadzenie udanej analizy, naprawdę szczegółowe wyjaśnienie przygotowania roztworu i próbek, przygotowanie systemu elektroforezy kapilarnej, konfigurację metody przyrządów oraz podejmowanie decyzji i przetwarzanie danych.

Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten może być wykorzystywany do rozwoju i doskonalenia umiejętności personelu zaangażowanego w przygotowanie laboratoriów chemii analitycznej. Zważyć ilość HPMC, aby uzyskać końcowe stężenie 0,05 procent w 100 mililecierach. Ponieważ HPMC jest podstawowym elastycznym polimerem, w pierwszym kroku wlej bounder do szklanej zlewki i powoli dodawaj 80 mililitrów wody, aby zdesegregować proszek.

Następnie spłucz tackę zwilżającą wodą, aby usunąć ślady proszku. Dodaj pozostałych regentów jak zwykle i wymieszaj roztwór. Dostosuj wartość pH do 4,8 za pomocą 50 procent kwasu kwasowego.

I pozwól, aby roztwór ustabilizował się przez pięć minut. Następnie w razie potrzeby dostosuj PH. Dodaj wodę, aby uzupełnić końcową objętość 100 mililitrów.

Przefiltruj przygotowany roztwór BG przez membranę neutrofilową i wlej do szklanej butelki. Na koniec odpowiednio oznacz szklaną butelkę i przechowuj w lodówce. Aby przygotować próbkę, w pierwszym kroku dodaj 162 mikrolitry śladowego roztworu buforowego do 1,5 mililitrowej probówki.

Następnie dodać 18 mikrolitrów wcześniej przygotowanej próbki map w stężeniu 10 miligramów na mililitr. W trzecim kroku dodaj 20 mikrolitrów wcześniej przygotowanego jednoprocentowego roztworu histaminy, aby uzyskać końcową objętość próbki 200 mikrolitrów. W następnym kroku przygotuj próbkę przez pięć sekund.

I wirować przez pięć sekund. Zassać całkowitą objętość próbki. I dozować w górę do mikrofiolki, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków.

Na koniec należy zakryć fiolkę i przechowywać w lodówce. Wyłącz przyrząd CE, naciskając wyłącznik zasilania. I otwórz drzwi wejściowe.

Umieść nowe ruchome wycieranie pod blokiem interfejsu. Przepłucz elektrody przez blok interfejsu wodą za pomocą butelki do mycia. Pozwól, aby woda kapała przez otwory i dokładnie wysusz blok interfejsu.

Ostrożnie usuń nadmiar wody z elektrod za pomocą chusteczki. Uważaj, aby nie znaleźć się w elektrodach podczas tej procedury. Wyjmij chusteczkę z systemu przytrzymywania próbki.

Oczyść powierzchnię tacek na próbki nową, zwilżoną wodą, nieruchomą chusteczką. I powierzchnia tac buforowych. Przesuń tacki buforowe do góry, podnieś system przytrzymywania próbki i wyczyść ich powierzchnię za pomocą chusteczki.

Przesuń tace buforowe z powrotem na miejsce. Następnie dokładnie wyczyść blok interfejsu. Wyczyść listwa zaciskową i obudowę lampy UV.

Na koniec wypróbuj system przed użyciem. Opłucz dźwignie otwierania wodą za pomocą butelki do mycia. Dokładnie oczyść ich powierzchnię nową, nieruchomą chusteczką, aby usunąć kurz i nagromadzone sole.

Na koniec wypróbuj je przed instalacją. Wyczyść dwa końce światłowodowego za pomocą zwilżonej wodą ściereczki z mikrofibry i potwierdź lampkę między końcami. Usuń nową neutralną kapilę z opakowania.

Zabierz teraz jeden koniec rurki ochronnej kapilary na stół roboczy. Rozwiń i wyprostuj plastikową rurkę, a następnie ostrożnie wyciągnij kapilatę z rurki. Przyklej kartkę papieru do stołu warsztatowego z następującymi znakami pomiaru.

Dopasuj okienko kapilarne do znaczników pomiaru od punktu zerowego do centymetrów w następujący sposób: Następnie przymocuj końce kapilary do stołu warsztatowego za pomocą taśmy. Zaznacz końce kapilary dwa milimetry poza znacznikami pomiaru. Odetnij nasadkę ochronną na końcu kapilary najbardziej oddalonym od okna.

I zanurz koniec kapilary w fiolce CE wypełnionej wodą, aby uniknąć trwałego uszkodzenia wewnętrznej powłoki kapilary. Wyjąć kapilarę z fiolki i ostrożnie włożyć ten koniec do strony wylotowej wkładu. Gdy kapilara pojawi się po drugiej stronie, pociągnij to, co jest konieczne, aż okienko kapilarne zostanie wyśrodkowane do okienka wkładu w następujący sposób.

Następnie obróć wkład i włóż zatyczkę przysłony do okienka wkładu, naciskając, aby zatrzasnąć się na swoim miejscu. Uważaj, aby nie złamać okienka kapilarnego podczas tej procedury. Upewnij się, że światło przechodzi przez okno, gdy jest wystawione na działanie szerokiego źródła światła.

Wprowadzić kapilarę do wstępnie uformowanej rurki chłodziwa z fabrycznie zainstalowanymi rurkami, nie dzikimi i o-ringiem. Przepchnij kapilarę przez rurkę, aż kapilara pojawi się po drugiej stronie. Następnie włóż koniec rurki po stronie wylotowej wkładu i dokręć nakrętki przewodów.

Włóż końcówkę wlotu kapilary do strony wlotowej wkładu. Gdy kapilara pojawi się po drugiej stronie, pociągnij w razie potrzeby. Następnie włóż koniec rurki po stronie wlotowej wkładu i dokręć nakrętki przewodu.

Odetnij nasadkę ochronną na końcu kapilary znajdującym się najbliżej okna. I zainstaluj zaciski ustalające ogniwa na końcach kapilary, dociskając, aby zatrzasnąć się na miejscu w następujący sposób. Wytnij końce kapilar poniżej linii odniesienia na wydłużonych kapilarnie płytkach.

Pamiętaj, aby sprawdzić końce kapilar za pomocą szkła powiększającego. Jeśli końce kapilarne nie są gładkie, wypoleruj je za pomocą kamienia cleven. Umieść o-ring przysłony w niebieskim otworze przysłony.

I włóż go ostrożnie za pomocą narzędzia do wkładania o-ringów. Na koniec zainstaluj fiolki CE wypełnione wodą w obudowie wkładu i natychmiast umieść wkład w opakowaniu z końcami kapilar włożonymi do fiolek i przechowuj w lodówce. Dostosuj objętość pipety.

Dodaj odpowiednią ilość wody do wlotu bufora o współrzędnych tacy A1, B1 i F6. A do tacy wylotowej bufora współrzędne A1, B1, C1, E6 i F6. Dodaj HCl 0,1 normalną do tacy wlotowej bufora o współrzędnych C1 i E6. I dodaj BGE do koryta wlotowego bufora o współrzędnych D1 i E6. I do tacy wylotowej bufora współrzędna D1. Na koniec zakryj wszystkie fiolki CE w tacach wlotowych i wylotowych buforu. Podczas zabiegu należy unikać zwilżania nasadek fiolek, aby zapobiec wyciekowi węgla. Otwórz przednie drzwiczki instrumentu CE.

Najpierw zainstaluj detektor UV i zabezpiecz go, obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Podnieś drzwi wewnętrzne i zainstaluj dźwignie otwierające, wciskając je do bloku interfejsu. Włóż światłowodowy do zacisku i obróć zgodnie z ruchem wskazówek zegara.

I podłącz drugi koniec do czujnika. Z światłowodowym należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ zginanie może spowodować jego pęknięcie. Umieścić tackę na próbkę w systemie do przechowywania próbki i zatrzasnąć ją na swoim miejscu.

Postępując zgodnie z tą samą procedurą, umieścić tacki buforowe w układzie do przechowywania próbki. Podnieś listwę zaciskową i umieść wkład kapilarny w bloku interfejsu. Naciśnij clamp listwa zaciskowa na obu końcach i dokręć pokrętła, obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara.

Zamknij drzwi wewnętrzne i zamknij drzwi przednie. Na koniec włącz instrument CE, naciskając wyłącznik zasilania. Utwórz metodę instrumentu kondycjonującego.

Skonfiguruj parametry personelu stanu początkowego, w tym napięcie, kartridż i temperaturę przechowywania próbki oraz ustawienia wyzwalania. Wybierz dwa tysiące czternaście jako długość fali akwizycji. Zadeklaruj czynności, które mają być wykonane przez urządzenie, konfigurując parametry w zaprogramowanych w czasie komórkach.

W tym szczegółowe ustawienia dla każdego etapu płukania, wtryskiwania i separacji. Przeprowadź tę procedurę, aby utworzyć metody kondycjonowania i wyłączania przyrządu. Następnym krokiem jest utworzenie nowej sekwencji.

Zaprogramować kapilarnę do kondycjonowania za pomocą metody kondycjonowania. Jeśli kapilar jest używany po raz pierwszy, zaprogramuj cztery powtórzenia. W przeciwnym razie zaprogramuj dwa powtórzenia.

Następnie zaprogramuj próbki do analizy przy użyciu uruchomionej metody. Na koniec zaprogramuj kapilarę do przechowywania metodą wyłączania. Analiza elektroforezy komórek kapilarnych jest zakończona w ciągu 30 minut.

Pierwszy wynik odpowiadał standardowi internalistycznemu histaminy jako miary wydajności systemu adeque. Po tym następują charakterystyczne podstawowe, główne i kwaśne formy lodu monoklonalnego anthiberi ebaluacytu. Cała separacja przebiega pod stałym prądem o natężeniu około 30 mikroamperów.

Po przeprowadzeniu eksperymentu wyeksportuj surowe dane z oprogramowania do pobierania i zaimportuj je za pomocą oprogramowania do przetwarzania. Procentową zawartość każdej formy lodu uzyskuje się po pionowym zintegrowaniu profilu elektrofarogramu z linią kropli. Tutaj przedstawiliśmy szczegółowy przewodnik krok po kroku, aby przeprowadzić analizę aktywności monoklonalnej, która została wygenerowana przez elektroforezę komórek kapilarnych.

Wraz z kilkoma zaleceniami mającymi na celu złagodzenie potencjalnych problemów, obecny protokół ma tę zaletę, że można go łatwo dostosować do analizy innych białek, biorąc pod uwagę krótkie modyfikacje parametrów przewodności i pH.