Analiza korzystnego wpływu suplementów diety na funkcje bariery nabłonkowej jelit podczas eksperymentalnego zapalenia jelita grubego

Ogólnym celem tego protokołu jest ocena wpływu dodatkowych składników odżywczych w mysim modelu zapalenia jelita grubego wywołanego przez siarczan dekstranu sodu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii jelitowej dotyczące rozwoju nauk klinicznych w całym kierunku eksperymentu modelowego zapalenia jelita grubego. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest tania, nie wymaga wyrafinowanego sprzętu i zapewnia przejrzystą analizę morfologii całej okrężnicy.

Metoda ta może być stosowana do oceny stresu oksydacyjnego w jelicie grubym w wyniku nadmiernej rekrutacji neutrofili. W przypadku podawania suplementu diety przez zgłębnik, najpierw ręcznie przytrzymuj mysz za kark, umieszczając ogon między trzecim palcem a podstawą kciuka. Następnie, trzymając mysz w pozycji pionowej, włóż igłębkę do lewej strony pyska zwierzęcia i ostrożnie podążaj za podniebieniem, aby zlokalizować przełyk.

Jeśli nie napotkasz oporu, przesuń igłę w kierunku żołądka. Powoli podawać całą objętość suplementu, a następnie ostrożnie wyjmować strzykawkę i mierzyć masę ciała zwierzęcia. Przypisz wynik od zera do czterech zgodnie z procentową utratą wagi, a następnie zbierz świeżą próbkę kału i użyj dostarczonych aplikatorów, aby nałożyć cienki rozmaz próbki na szkiełko z zestawu do badania krwi utajonej w kale gwajakowym.

Zamknij pokrywę z przodu zestawu i otwórz tylne okno, aby nałożyć dwie krople roztworu wywoływacza na tył przykładowej lokalizacji. Przeczytaj wyniki po 30 sekundach, przypisując wynik od zera do czterech w zależności od siły sygnału. Następnie obserwuj drugą świeżą próbkę kału, aby ocenić konsystencję kału, przypisując odpowiednio wynik od zera do czterech.

Aby określić przepuszczalność nabłonka jelitowego in vivo, umieść znieczulone zwierzę w pozycji leżącej na plecach i wykonaj nacięcie w linii środkowej, aby odsłonić jelita. Zlokalizuj jelito ślepe i wykonaj małe nacięcie w bliższym segmencie wstępnych okrężnicy. Następnie włóż igłę do karmienia o rozmiarze 22 i zabezpiecz igłę zwykłą ligaturą z nici jedwabnej.

Ostrożnie przepłucz dużą objętość PBS przez igłę, aby spłukać cały kał z okrężnicy, a następnie zainstaluj niebieski roztwór Evansa, aż barwnik dotrze do odbytu. Po 15 minutach przepłukać probówkę nadmiarem objętości PBS, aż wypłukanie okołoodbytnicze będzie czyste. Następnie wytnij okrężnicę i przepłucz tkankę większą ilością PBS, a następnie jednym mililitrem sześciomilimolowej N-acetylocysteiny, aby wyeliminować wszelkie barwniki przywierające do śluzu okrężnicy.

Teraz przeciąć okrężnicę wzdłuż i jeszcze raz przepłukać tkankę PBS i N-acetylocysteiną, a następnie zapisać wagę i długość okrężnicy i umieścić tkankę w dwóch mililitrach N, N-dimetyloformamidu w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem, aby wyekstrahować pozostały barwnik, mierząc stężenie barwnika spektrofotometrycznie na 610 nanometrach następnego ranka. Po siedmiu dniach od wystąpienia siarczanu sodu dekstranu lub zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS, należy wyciąć całą okrężnicę i zapisać jej długość. W przypadku bułek szwajcarskich otwórz okrężnicę wzdłużnie, ostrożnie usuń kał i użyj cienkiego, okrągłego, drewnianego patyczka lub kleszczy z cienką końcówką, aby zwinąć tkankę błoną śluzową skierowaną do wewnątrz.

Następnie ostrożnie umieść tkankę w kasecie do zatapiania, a następnie utrwal pięcioma mililitrami 10% formaldehydu w temperaturze pokojowej. Bardzo ważne jest, aby ciasno zwinąć okrężnicę bez fałdowania, aby uniknąć problemów podczas sekcji tkanek, które mogą skutkować klinicznym uszkodzeniem tkanki i fałszywą interpretacją jako uszkodzenia związanego z zapaleniem jelita grubego. Po 48 godzinach przemywać próbkę wodą z kranu przez 18 godzin, a następnie odwodnić serią etanolu.

Po ostatnim absolutnym zanurzeniu w etanolu potraktuj tkankę czterema jednogodzinnymi inkubacjami w ksylenie. Po ostatnim zanurzeniu ksylenu umieść próbkę w 50 mililitrach ciekłej parafiny na jedną 17-godzinną i jedną trzygodzinną inkubację. Pod koniec trzygodzinnej inkubacji zanurz próbkę w plastikowej formie o powierzchni 22 milimetrów sześciennych w ośmiu do 10 mililitrach świeżej ciekłej parafiny na 24 godziny.

Gdy parafina zastygnie, za pomocą mikrotomu uzyskaj skrawki tkanek o grubości pięciu mikronów, a następnie na krótko zanurz przekroje w jednolitrowej łaźni wodnej zawierającej 0,3% żelatyny i natychmiast umieść próbki na szkiełkach potraktowanych polilizyną w celu barwienia H&E. W celu analizy stresu oksydacyjnego najpierw stwórz barierę wokół tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka. Następnie inkubuj ośmiomikronowe przekroje kriogeniczne tkanek w pięciu mikromolowych DHE rozpuszczonych w wodzie przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności.

Po inkubacji następują trzy 15-minutowe płukanie w PBS z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej. Wysuszyć próbki na powietrzu i dodać kroplę pożywki montażowej w celu ochrony fluorescencji. Następnie obserwuj utlenioną fluorescencję etydyny na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym przy 40-krotnym powiększeniu.

Leczenie DSS prowadzi do ciągłego wzrostu wskaźnika aktywności choroby zgodnie z oczekiwaniami, osiągając maksymalny wynik w siódmym dniu po indukcji. Suplementacja diety przeciwzapalnej opóźnia wczesne wystąpienie zapalenia jelita grubego, podczas gdy działanie ochronne jest tylko marginalne w późniejszych punktach czasowych. Interwencja dietetyczna może również zapobiec indukowanemu przez DSS wzrostowi przepuszczalności nabłonka jelitowego, a także skróceniu długości jelita grubego.

Barwienie hematoksyliną i eozyną w tkankach dalszej okrężnicy zatopionych w parafinie ujawnia, że próbki kontrolne wykazują normalną morfologię, podczas gdy zwierzęta leczone DSS wykazują typowe objawy zapalenia jelita grubego. Warto zauważyć, że równoległe leczenie z suplementacją diety wyraźnie łagodzi zmiany morfologiczne wywołane zapaleniem jelita grubego o ogólnej morfologii podobnej do grupy kontrolnej. Barwienie immunofluorescencyjne dystalnej tkanki okrężnicy wskazuje również, że ścisłe cząsteczki połączenia inadherens są internalizowane podczas zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS i że kolokalizacja tych białek jest częściowo tracona przy kontaktach z komórkami nabłonka krypty.

Co ważne, ta internalizacja jest zmniejszona, gdy myszy leczone DSS otrzymują przeciwzapalny i przeciwutleniający suplement diety. Co więcej, silna rekrutacja neutrofili do jelita grubego w odpowiedzi na zapalenie jelita grubego wywołane przez DSS jest przeciwdziałana przez suplementację diety, co skutkuje jednoczesną poprawą stresu oksydacyjnego wywołanego neutrofilami i nieznacznym zmniejszeniem produkcji cytokin zapalnych. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak pomiary w komorze sączącej, w celu analizy oporu elektrycznego bariery nabłonkowej w okrężnicy.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad zapaleniem jelita grubego i badaniem molekularnego mechanizmu patogenezy wrzodziejącego zapalenia jelita grubego w powtarzalnym modelu mysim. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować rozwój zapalenia jelita grubego i korzystny wpływ suplementów diety na funkcje bariery nabłonkowej jelit. Nie zapominaj, że praca z żywymi zwierzętami wymaga przestrzegania wysokich standardów etycznych, aby uniknąć niepotrzebnego cierpienia.