Name: Aktywacja autofagii przez ćwiczenia aerobowe u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Poznaj metodę aktywacji autofagii przez ćwiczenia aerobowe u myszy C57BL/6 z transgenem GFP-LC3. Technika ta pozwala mierzyć poziomy autofagii w tkankach i badać korzyści fizjologiczne wysiłku fizycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratory za techniczne wsparcie i pomoc, oraz Noboru Mizushima (University of Tokyo) za dostarczenie transgenicznych myszy GFP-LC3. A. R. i C. H. byli wspierani przez fundusze startowe z Northwestern University i grant z National Institutes of Health (DK094980).

Wszystkie zabiegi z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Modele myszy
<ol>
	<li>Użyj 8-12 tygodniowych myszy w treningu fizycznym. Aby wykryć autofagię indukowaną wysiłkiem fizycznym in vivo, użyj myszy transgenicznych GFP-LC3 (tło C57BL / 6) do badań obrazowych i myszy C57BL / 6 do analiz biochemicznych.</li>
</ol>
2. Autofagia wywołana wysiłkiem fizycznym
<ol>
	<li>Ustawienie bieżni - ćwiczenia wymuszone
	<ol>
		<li>Zaaklimatyzuj się i trenuj myszy na otwartej bieżni pod kątem 10° pod górę przez 2 dni. W dniu 1 ćwicz myszy przez 5 minut z prędkością 8 m/min, a w dniu 2 ćwicz myszy przez 5 minut z prędkością 8 m/min, a następnie kolejne 5 minut z prędkością 10 m/min10. Zachęcaj myszy do biegania, delikatnie szturchając je ręką.</li>
		<li>W 3 dniu pozwól myszom przejść pojedynczy atak biegania przez 90 minut na bieżni pod kątem 10°, zaczynając od prędkości 10 m/min. Po 40 minutach zwiększaj prędkość bieżni w tempie 1 m/min co 10 minut, w sumie 30 minut, a następnie zwiększaj prędkość w tempie 1 m/min co 5 minut, aż osiągnie 17 m/min, co daje łącznie 90 min czasu ćwiczeń i 1 070 metrów dystansu biegu.</li>
		<li>Ustaw bodziec elektryczny w niskim zakresie intensywności (1.2 Hz) i zachęcaj myszy do biegania, aby uniknąć powtarzających się wstrząsów stopą.</li>
		<li>W celu pobrania tkanek należy poddać myszy eutanazji poprzez inhalację izofluranu, a następnie zwichnięcie szyjki macicy bezpośrednio po wysiłku. Można również zastosować inne zatwierdzone metody eutanazji, takie jak wstrzyknięcie CO2 lub I.P. innych środków znieczulających. Wydaje się, że metody eutanazji nie mają wpływu na poziom autofagii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawienie kółka biegowego - ćwiczenia dobrowolne
	<ol>
		<li>Umieść koło do biegania myszy (o średnicy 11,4 cm) w klatce z pojedynczą myszą.</li>
		<li>Sprawdź wydolność biegową za pomocą licznika kilometrów roweru. Ustaw parametr koła [odległość (w mm) na pełny obrót koła] na 358 (11.4*π). Zmierz dystans biegu po 24 godzinach.</li>
		<li>Pozwól myszy działać dobrowolnie przez 2 tygodnie z kółkiem do biegania. W celu pobrania tkanek poświęć mysz rano po okresie biegu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ocena strumienia autofagii
<ol>
	<li>Aby zmierzyć strumień autofagiczny w warunkach spoczynku i wysiłku, potraktuj myszy chlorochiną inhibitorem autofagii przez trzy dni i porównaj je z myszami leczonymi PBS.
	<ol>
		<li>Rozpuścić chlorochinę w PBS (5 mg/ml) i wstrzyknąć chlorochinę myszom dootrzewnowo w dawce 50 mg/kg/dobę przez trzy kolejne dni. Złóż w ofierze myszy i zbierz tkanki 3 godziny po ostatnim wstrzyknięciu.</li>
		<li>W przypadku myszy ćwiczących należy je wstępnie podawać chlorochiną przez dwa kolejne dni w dawce 50 mg/kg/dobę. Trzeciego dnia wstrzyknij myszom takie samo stężenie chlorochiny, a po 90 minutach pozwól im biegać na bieżni przez kolejne 90 minut.</li>
		<li>Poddaj myszy eutanazji przez inhalację izofluranu, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Zebrać tkanki natychmiast po biegu, tak aby całkowity czas inkubacji chlorochiny był taki sam jak u myszy kontrolnych (w stanie spoczynku) (3 godziny). 
		UWAGA: Alternatywnie, użyj pojedynczego wstrzyknięcia chlorochiny, aby określić strumień autofagii w tkankach myszy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pobieranie i utrwalanie tkanek
<ol>
	<li>Przed pobraniem tkanek należy przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i świeży 4% paraformaldehyd (PFA, uwaga: wymagane środki ochrony osobistej) w PBS o końcowym pH 7,4. Oba roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 30 ml 15 - 20 ml 4% PFA (dla myszy GFP-LC3). Połączyć strzykawkę z igłą do cewnika 20 G.</li>
	<li>Po ćwiczeniach należy poddać myszy eutanazji poprzez inhalację izofluranu, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Połóż zwierzę na czystej powierzchni roboczej na jego grzbiecie. Wytnij i otwórz jamę klatki piersiowej, przecinając przeponę, aby odsłonić serce.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie na wątrobie, aby krew mogła wypłynąć, i wstrzyknij powoli łącznie 15 ml 4% PFA do prawej komory serca przez cewnik, aż płuca i wątroba staną się całkowicie blade. Mysz należy wykonać bezpośrednio po sesji ćwiczeń, używając pompki strzykawkowej o stałym natężeniu przepływu 90 ml/h.</li>
	<li>Po perfuzji wyjmij igłę i zbierz interesujące Cię tkanki (np. brain11 i mięśnie szkieletowe). W przypadku mięśni szkieletowych należy rozciąć obszerny boczny. Krótko pociągnij skórę nogi do tyłu, aby odsłonić mięśnie, zlokalizuj mięsień czworogłowy uda12 i wypreparuj obszerny boczny mięsień, który jest zewnętrznym mięśniem przyczepionym do górnej części kości udowej.</li>
	<li>W celu dalszego utrwalenia i odwodnienia umieść tkanki myszy GFP-LC3 w 4% PFA na 24 godziny w 4 °C, a następnie przenieś je do 15% sacharozy-PBS w 4 °C przez noc lub do momentu, gdy tkanki się uspokoją, a następnie do 30% sacharozy-PBS w 4 °C przez noc lub do dłuższego przechowywania. Próbki należy przechowywać w ciemności tak długo, jak to możliwe, ponieważ mogą być wrażliwe na silne światło.</li>
	<li>W celu analizy western blot należy zamrozić tkanki myszy C57BL/6 bezpośrednio w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Analiza obrazowa GFP-LC3 Puncta
<ol>
	<li>Proces tkankowy
	<ol>
		<li>Tkanki (wcześniej utrwalone w PFA i przechowywane w 30% sacharozy) należy poddać wstępnej obróbce w pożywce do zatapiania, takiej jak "związek o optymalnej temperaturze cięcia" (OCT) przez kilka minut na oznakowanej małej szalce Petriego.</li>
		<li>Przenieść tkankę do oznakowanego kriomoldu zawierającego wystarczającą ilość świeżego OCT do pokrycia tkanki. Zorientuj powierzchnię przekroju w kierunku dna kriomoldu (przekrój poprzeczny dla mięśnia obszernego bocznego i przekrój strzałkowy dla półmózgowia). Unikaj tworzenia się pęcherzyków.</li>
		<li>Zamroź próbki, umieszczając kriomold na kilka minut w przykrytej chłodziarce piankowej wypełnionej suchym lodem, aż OCT zmieni kolor na biały. Zawiń poszczególne próbki w oznaczone folie, zamknij je w plastikowej torbie i przechowuj w temperaturze -80 °C przez noc lub dłużej.</li>
		<li>Za pomocą kriostatu przyciąć skrawki próbki o grubości 10 μm i zamontować je na szkiełkach. Przechowuj szkiełka w temperaturze -20 °C i zawsze trzymaj je z dala od światła, gdy tylko jest to możliwe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie preparatów
	<ol>
		<li>Wyjmij szkiełka z zamrażarki i rozmroź je w temperaturze pokojowej. Przykryj przekrój tkanki kroplą pożywki montażowej z DAPI. Umieść szkiełko nakrywkowe o odpowiednim rozmiarze na wierzchu i unikaj tworzenia się pęcherzyków.</li>
		<li>Użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego, pozostaw lakier do paznokci do wyschnięcia w ciemności w temperaturze pokojowej, a następnie przechowuj szkiełka w światłoszczelnym pojemniku w temperaturze 4 °C lub przystąp do obrazowania GFP-LC3 puncta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja GFP - LC3 puncta za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
	<ol>
		<li>Wykonaj mikroskopię epifluorescencyjną, wykonując zdjęcia w tym samym stanie (ekspozycja i ustawienia) dla wszystkich próbek. W przypadku GFP należy zastosować długość fali emisji 525 nm; dla DAPI użyj 490 nm. Uzyskaj co najmniej dziesięć obrazów na próbkę za pomocą obiektywu 60X dla obszernego bocznego i obszaru kory czołowej mózgu.</li>
		<li>Określ ilościowo liczbę punktów GFP-LC3 w obszarze tkanki 2,500μm2 na każdym obrazie do analizy statystycznej, zaślepionej dla grup eksperymentalnych. Oblicz średnią liczbę z 10 obrazów każdej próbki, korzystając z funkcji automatycznego pomiaru "Liczba obiektów". Ustawienia mięśnia obszernego bocznego to: próg L = 10, H = 200; 2X gładkie; 1X czyste, a ustawienia dla kory czołowej mózgu to: próg L = 11, H = 200; 2X gładkie; 1X czyste.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza Western Blot na markerach autofagii
<ol>
	<li>Proces tkankowy
	<ol>
		<li>Przygotować bufor do lizy: 50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; inhibitor proteazy i inhibitor fosfatazy (świeżo dodany).</li>
		<li>Usuń tkankę myszy C57BL/6 z przechowywania w temperaturze -80 °C. Pokrój tkankę mięśniową na małe kawałki żyletką przed następnym procesem. Do próbki dodać 800 μl (dla półmózgowia) lub 500 μl (dla obszernego bocznego) buforu do lizy na zimno. Homogenizować próbkę w temperaturze 4 °C za pomocą homogenizatora o średniej prędkości.</li>
		<li>Homogenizowaną mieszaninę należy w pełni poddawać lizie przez kolejne 30 minut do 1 godziny w temperaturze 4 °C z rotacją.</li>
		<li>Odwirować homogenat w temperaturze 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, wyrzucić osad i zebrać supernatant do nowej probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza autofagii
	<ol>
		<li>Określ stężenie białek w lizatach tkankowych za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA zgodnie ze specyfikacją producenta. Znormalizować każdą próbkę do tego samego stężenia.</li>
		<li>Połączyć próbkę z 2x buforem próbki Laemmli w stosunku 1:1, gotować w temperaturze 95 °C przez 5 - 10 minut i kontynuować analizę western blot na markerach autofagii13,14, takich jak p62 (przeciwciało anty-p62, rozcieńczenie 1:500) i LC3 (przeciwciało anty-LC3, rozcieńczenie 1:500). Próbki należy zagotować natychmiast po dodaniu buforu do próbek, ponieważ dłuższa inkubacja na lodzie może spowodować powstanie wielu zdegradowanych pasm LC3.</li>
		<li>Określ ilościowo prążki p62 i LC3 za pomocą analizy densytometrycznej przy użyciu ImageJ i znormalizuj wartość do odpowiedniego pasma aktyny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).</li>
<li>Tracy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BNIP3+is+an+RB%2FE2F+target+gene+required+for+hypoxia-induced+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy.</a> Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).</li>
<li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+renovation+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li>
<li>Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+the+physiology+and+pathology+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system.</a> Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).</li>
<li>Rocchi, A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+autophagy+in+metabolism+and+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+biology%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders.</a> Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).</li>
<li>Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cancer.</a> Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).</li>
<li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+BCL2-regulated+autophagy+is+required+for+muscle+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis.</a> Nature. 481, 511-515 (2012).</li>
<li>He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+induces+autophagy+in+peripheral+tissues+and+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain.</a> Autophagy. 8, 4(2012).</li>
<li>Kuramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+activation+by+novel+inducers+prevents+BECN2-mediated+drug+tolerance+to+cannabinoids%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids.</a> Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).</li>
<li>Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Treadmill+Fatigue+Test%3A+A+Simple%2C+High-throughput+Assay+of+Fatigue-like+Behavior+for+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse.</a> JoVE. , (2016).</li>
<li>Navone, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+and+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells.</a> Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li>
<li>Bjørkøy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687908036124">Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1.</a> Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%283rd+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12, 1-222 (2016).</li>
<li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+the+Pathogenesis+of+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy in the Pathogenesis of Disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+rapamycin+treatment+has+differential+effects+on+metabolism+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice.</a> Cell Metab. 17, 456-462 (2013).</li>
<li>Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+functions+of+mTOR+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory functions of mTOR inhibition.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).</li>
<li>Miller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin-mediated+lifespan+increase+in+mice+is+dose+and+sex+dependent+and+metabolically+distinct+from+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction.</a> Aging Cell. 13, 10(2014).</li>
<li>Grumati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+exercise+stimulates+autophagy+in+normal+skeletal+muscles+but+is+detrimental+for+collagen+VI-deficient+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles.</a> Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).</li>
<li>Lira, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+required+for+exercise+training-induced+skeletal+muscle+adaptation+and+improvement+of+physical+performance%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal+%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).</li>
<li>Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25483961">Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity.</a> Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).</li>
<li>Kregel, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.the-aps.org/mm/SciencePolicy/AnimalResearch/Publications/Animal-Exercise-Protocols">Resource book for the design of animal exercise protocols.</a> American Physiological Society. , 152(2006).</li>
<li>Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11740298">Interstrain variation in murine aerobic capacity.</a> Med Sci Sports Exerc. 33, 5(2001).</li>
<li>Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximal+metabolic+rates+during+voluntary+exercise%2C+forced+exercise%2C+and+cold+exposure+in+house+mice+selectively+bred+for+high+wheel-running%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+biology%22%5BJournal%5D)">Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running.</a> The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).</li>
<li>Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sprint+exercise+on+oxidative+stress+in+skeletal+muscle+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver.</a> European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).</li>
<li>Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high-intensity+intermittent+swimming+on+glucose+transport+in+rat+epitrochlearis+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle.</a> J Appl Physiol. 84, 4(1998).</li>
<li>Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+submaximal+oxygen+consumption+during+treadmill+running+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice.</a> Can J Physiol Pharmacol. 71, 4(1993).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Autofagia to proces kataboliczny, który dostarcza energii i zmniejsza cytotoksyczność poprzez lizosomalną degradację składników cytoplazmy lub uszkodzonych organelli. Badanie autofagii jest ważne, aby zrozumieć regulację homeostazy komórkowej i mechanizmy reakcji na stres. W dziedzinie badań pojawiają się nowe modele i metodologie15, aby zbadać, w jaki sposób upośledzona autofagia przyczynia się do wielu procesów patologicznych 16,17.
...

Autofagia to ewolucyjnie zachowana ścieżka degradacji, która jest indukowana w odpowiedzi na różne warunki stresu, takie jak głód i niedotlenienie1,2. Podczas autofagii pęcherzyki z podwójną błoną, zwane autofagosomami, zawierają niepotrzebne lub uszkodzone składniki subkomórkowe i transportują je do lizosomów w celu degradacji3. Podstawowa autofagia jest niezbędna dla funkcji komórkowych i rozwoju organizmu, a upośledzona podstawowa autofagia jest związana z wieloma zaburzeniami, w tym neurodegeneracją, nowotworzeniem i cukrzycą typu 24,5,6.
Najbardziej znanym fizjologicznym induktorem autofagii jest głód. Ma jednak dwa zasadnicze ograniczenia. Po pierwsze, głód zajmuje dużo czasu, aby skutecznie wywołać autofagię u zwierząt, np. 48 godzin ograniczenia pokarmu u myszy w większości narządów. Po drugie, głód ledwo indukuje autofagię mózgu, ze względu na stosunkowo stabilne zaopatrzenie w składniki odżywcze w mózgu. W rzeczywistości trudno jest również wykryć indukcję autofagii przez induktory małocząsteczkowe, ponieważ wiele leków nie może przejść przez barierę krew-mózg. Tak więc, aby lepiej przeanalizować funkcję aktywacji autofagii w patogenezie choroby, niedawno odkryliśmy, że ćwiczenia są silniejszą fizjologiczną metodą indukowania autofagii w krótkim czasie7,8,9. W porównaniu z głodem, autofagia jest skutecznie indukowana przez bieganie na bieżni tak szybko, jak 30 minut. Tak więc ćwiczenia są wygodnym i silnym fizjologicznym podejściem do badania mechanizmu autofagii w pośredniczeniu w korzyściach zdrowotnych i zapobieganiu chorobom.
Istnieje kilka markerów białkowych do wykrywania aktywności autofagii, w tym LC3 i p62. LC3 (białko związane z mikrotubulami 1A / 1B-łańcuch lekki 3) jest białkiem cytozolowym (forma LC3-I), które jest sprzężone z PE (fosfatydyloetanoloaminą) po indukcji autofagii. LC3 lipidowany PE (forma LC3-II) jest rekrutowany na błony autofagosomalne i może być używany do wizualizacji autofagosomów po znakowaniu GFP. Jego translokacja z cytozolu do punktowych struktur autofagosomów pod mikroskopem wskazuje na indukcję autofagii. P62 jest receptorem ładunkowym dla substratów autofagii (takich jak białka ubikwitynacji) i jest również wbudowywany w autofagosomy. Ponieważ białko jest degradowane w lizosomach wraz z autofagosomami, jego poziomy można wykorzystać do pomiaru strumienia autofagii. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać te markery do ilościowego określenia autofagii w różnych tkankach myszy indukowanej ćwiczeniami aerobowymi, w tym ćwiczeniami wymuszonymi (bieżnia) i ćwiczeniami dobrowolnymi (koła do biegania). Te same procedury można również zastosować do pomiaru autofagii in vivo po leczeniu innymi induktorami.

<table><tbody><tr><td>Bieżnia</td><td>Columbus Instruments</td><td>150-RM Exer 3/6</td><td></td></tr><tr><td>Kółko do biegania</td><td>myszy Super Pet</td><td></td><td>100079365 średnica 11,4 cm</td></tr><tr><td>Dzwonek licznika kilometrów</td><td></td><td>DASHBOARD 100</td><td></td></tr><tr><td>Pompka strzykawkowa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>Model: mikroskop odwrócony ECLIPSE</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td>Cryostat</td><td>Leica CM 1850UV</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IKA</td><td>003737001 / Model: T10 Basic S1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorochina</td><td>CAYMAN CHEMICAL COMPANY</td><td>14194</td><td></td></tr><tr><td>Parafolmaldehye</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P6148</td><td>Wymagane środki ochrony osobistej. Ten produkt może uwalniać formaldehyd, substancję chemiczną, o której wiadomo, że powoduje raka.</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe</td><td>Vector Laboratories</td> Przeciwciało <td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>p62</td><td>BD Biosciences</td><td>610833</td><td></td></tr><tr><td>LC3</td><td>przeciwciało Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample</td><td>Buffer Bio-Rad Laboratories</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aktywacja autofagii przez ćwiczenia aerobowe u myszy

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autofagia to lizosomalny szlak degradacji niezbędny dla homeostazy, funkcji i różnicowania komórek. W warunkach stresowych autofagia jest indukowana i celuje w różne ładunki, takie jak cytozol luzem, uszkodzone organelle i nieprawidłowo sfałdowane białka, w celu degradacji w lizosomach. Powstałe cząsteczki składników odżywczych są zawracane z powrotem do cytozolu w celu syntezy nowych białek i produkcji ATP. Regulacja w górę autofagii ma korzystny wpływ na patogenezę wielu chorób, a także opisano farmakologiczne i fizjologiczne strategie aktywacji autofagii. Ćwiczenia aerobowe zostały niedawno zidentyfikowane jako skuteczny induktor autofagii w wielu narządach u myszy, w tym w mięśniach, wątrobie, sercu i mózgu. Tutaj pokazujemy procedury indukcji autofagii in vivo poprzez wymuszone ćwiczenia na bieżni lub dobrowolne bieganie na kółkach. Demonstrujemy również mikroskopowe i biochemiczne metody ilościowej analizy poziomów autofagii w tkankach myszy, przy użyciu białek markerowych LC3 i p62, które są transportowane i degradowane w lizosomach wraz z autofagosomami.

Niniejszy protokół opisuje dwie różne metody indukowania autofagii w tkankach mysich za pomocą ćwiczeń aerobowych: łącznie 90 min wymuszonego wysiłku na wielotorowej bieżni poprzedzonego dwudniową aklimatyzacją lub dwa tygodnie dobrowolnego wysiłku na kołowrotku użytkowanego przez myszy przetrzymywane pojedynczo. W każdym z protokołów ćwiczeń przepływ autofagii można zmierzyć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz analizy western blot w różnych narządach.
<p class="jove_content" ...

Aktywacja autofagii jest korzystna w zapobieganiu wielu chorobom. Jednym z fizjologicznych podejść do indukcji autofagii in vivo są ćwiczenia fizyczne. Tutaj pokazujemy, jak aktywować autofagię poprzez ćwiczenia aerobowe i mierzyć poziom autofagii u myszy.

Aktywacja autofagii przez ćwiczenia aerobowe u myszy

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest fizjologiczna aktywacja autofagii u myszy poprzez wymuszony lub dobrowolny bieg, a następnie pomiar poziomu autofagii w określonych tkankach. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące autofagii, w szczególności w kwestii tego, jak autofagia i wysiłek przyczyniają się do korzystnych efektów wywołanych ćwiczeniami aerobowymi. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że wysiłek fizyczny stanowi szybki sposób na wywołanie autofagii in vivo u myszy.W tym doświadczeniu należy zastosować myszy szczepu C57 black six w wieku od ośmiu do dwunastu tygodni, posiadające transgen GFP-LC3, który umożliwia wykrywanie autofagii indukowanej wysiłkiem fizycznym in vivo. Szczegółowe informacje na temat korzystania z bieżni dla myszy znajdują się w następnej publikacji JoVE. Ustaw stymulację elektryczną bieżni na niską intensywność.Podczas dwóch pierwszych sesji poddaj myszy aklimatyzacji na otwartej bieżni z nachyleniem dziesięciu stopni pod górę. Pierwszego dnia ćwicz myszy przez pięć minut przy prędkości bieżni wynoszącej 8 m/min. Drugiego dnia prowadź bieg przez dziesięć minut, początkowo z prędkością 8 m/min, a po pięciu minutach zwiększ prędkość do 10 m/min.Trzeciego dnia poddaj myszy biegowi trwającemu pełne 90 minut. Uruchom bieżnię z prędkością 10 m/min i zachęcaj myszy do biegu, stosując delikatne popchnięcia, aby uniknąć powtarzających się wstrząsów elektrycznych stóp. Kluczowe jest obserwowanie i manipulowanie myszami w taki sposób, aby nie otrzymały zbyt wielu wstrząsów elektrycznych podczas 90-minutowego biegu.Przez cały czas trwania biegu zachęcaj myszy palcami do pozostania na bieżni. Po 40 minutach zwiększ prędkość o jeden metr na minutę. Po 50 minutach ponownie zwiększ prędkość o jeden metr na minutę.Po 60 minutach zwiększ prędkość o kolejny jeden metr na minutę. Po 70 minutach zacznij zwiększać prędkość co pięć minut w taki sposób, aby w ciągu ostatnich pięciu minut z 90-minutowego biegu prędkość wyniosła 17 metrów na minutę. Po zakończeniu próby natychmiast uśmierć myszy w celu pobrania tkanek, jeśli jest to wymagane.W tym teście należy trzymać myszy indywidualnie. Należy użyć tej samej linii, która została opisana wcześniej. Przygotować kołowrotek dla myszy o średnicy 11,4 centymetra z przymocowanym cyklokomputerem.Każdy obrót powinien odpowiadać przebyciu drogi o długości 358 milimetrów. Umieść mysz w klatce z kołowrotkiem i pozwól jej swobodnie z niego korzystać przez dwa tygodnie. Co 24 godziny odczytuj z liczniku dystans pokonany przez mysz.Po dwóch tygodniach pobierz tkanki do analizy, zgodnie z potrzebami. W celu pomiaru strumienia autofagii podawaj myszom chlorochinę, która jest inhibitorem autofagii, przez trzy dni. Rozpuść chlorochinę w PBS w stężeniu 5 mg/mL i wstrzykuj myszom doglebowo w dawce 50 µg/g.Wykonuj u myszy jeden zastrzyk dziennie przez trzy kolejne dni, a tkanki pobierz trzy godziny po ostatnim zastrzyku. W przypadku myszy poddawanych ćwiczeniom na bieżni, rozpocznij 90-minutowy bieg 90 minut po zastrzyku w trzecim dniu, tak aby bieg zakończył się trzy godziny po wstrzyknięciu preparatu. Następnie poddaj myszy eutanazji i niezwłocznie pobierz tkanki.Przygotuj się do perfuzji zwierzęcia w ciągu 90 minut od zakończenia ćwiczeń, przygotowując utrwalacz. Napełnij strzykawkę o pojemności 30 ml od 15 do 20 ml świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu i połącz strzykawkę z igłą cewnikową o rozmiarze 20 G. Podłącz napełnioną strzykawkę do pompy i ustaw ciągły przepływ na poziomie 90 ml/h.Kładąc zwierzę na czystej powierzchni roboczej w pozycji na plecach, rozcień jamę klatki piersiowej przez przeponę, aby odsłonić serce. Następnie wprowadź igłę cewnika do prawej komory. Na koniec wykonaj małe nacięcie na wątrobie, aby odprowadzić krew i uruchomić pompę.Wstrzykuj utrwalacz, aż płuca i wątroba całkowicie zbledną. Zazwyczaj wystarczające będzie 15 ml utrwalacza. Po perfuzji wyjmij igłę i pobierz interesujące tkanki.Aby pobrać mięsień szkieletowy, wypreparuj mięsień obszerny boczny. Delikatnie odsunąć skórę nogi do tyłu, aby odsłonić mięśnie i zlokalizować mięsień czworogłowy uda. Następnie wypreparuj mięsień obszerny boczny, który jest mięśniem zewnętrznym przyczepionym do górnej części kości udowej.W celu dalszej fiksacji i odwodnienia umieść pobrane tkanki w 4% paraformaldehydzie na 24 godziny w temperaturze 4 °C. Następnego dnia przenieś tkanki do PBS z 15% sacharozą i pozostaw je do namoczenia w temperaturze 4 °C przez noc lub do momentu opadnięcia tkanek na dno naczynia. Następnie przenieś tkanki do PBS z 30% sacharozą w temperaturze 4 °C na noc lub na dłuższy czas.Podczas tych kąpieli należy w miarę możliwości przechowywać tkanki w ciemności. Następnie umieść tkanki w medium do zatapiania, takim jak OCT, i w razie potrzeby podziel je na mniejsze fragmenty. Następnie pozostaw je na kilka minut w małej szalce Petriego w celu aklimatyzacji.Następnie przenieść je do form do mrożenia (cryomolds) z ilością OCT wystarczającą do ich całkowitego przykrycia. W formach zorientować powierzchnie do cięcia w stronę dna i unikać tworzenia pęcherzyków powietrza. Następnie zamrozić próbki w zakrytym styropianowym pojemniku wypełnionym suchym lodem, aż OCT stanie się białe.Następnie poszczególne próbki należy zawinąć w podpisane folie, zamknąć w plastikowej torbie i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu ich przetworzenia. Wykorzystując LC3 znakowany GFP jako system raportujący, obserwowano indukcję autofagii u myszy poddanych ćwiczeniom zgodnie z opisem. Po stymulacji autofagii LC3 przemieścił się z cytosolu do autofagosomu w postaci struktur punktowych.U myszy poddanych ćwiczeniom odnotowano znacznie więcej punktów GFP-LC3 zarówno w mięśniach szkieletowych, jak i w korze mózgu w porównaniu z myszami w stanie spoczynku. Analiza Western blot z użyciem przeciwciała przeciwko LC3 wykazała, że ćwiczenia znacząco indukowali generowanie koniugatu lipidowego LC3-II, co sugeruje zwiększoną konwersję LC3-I z cytozolu do LC3-II. Następnie zmierzono degradację receptora ładunku autofagicznego, p62.90 minut aktywności na bieżni spowodowało silniejszą degradację p62 w mięśniach szkieletowych niż w warunkach spoczynku. Efekt ten został zniesiony poprzez wstrzyknięcie chlorochiny przed wysiłkiem. Ponieważ chlorochina jest inhibitorem degradacji lizosomalnej, dane te wskazują, że obserwowalne zjawisko wynika ze zwiększonego przepływu autofagocytarnego, a nie z blokady degradacji autofagosomów.Po opracowaniu techniki tej pojawiły się jej prekursory w dziedzinie autofagii, służące do badania wpływu mechanizmu ćwiczeń fizycznych na degradację metabolizmu oraz zachowania zwierząt. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest monitorowanie myszy w trakcie biegu. Po zakończeniu tej procedury stosuje się metody takie jak mikroskopia elektronowa.Mikroskopia tkanek zwierzęcych może być przeprowadzona w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak wpływ wysiłku fizycznego na wybrane szlaki autofagii, na przykład mitofagię i lipofagię.

activating-autophagy-by-aerobic-exercise-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pokazano metodę oceny wytrzymałości wysiłkowej u myszy laboratoryjnych bez użycia siatki uderzeniowej. Metoda ta jest humanitarnym udoskonaleniem, które może zmniejszyć zakłócający wpływ stresu na parametry eksperymentalne.

Ocena wytrzymałości wysiłkowej myszy bez użycia siatki uderzeniowej: alternatywa dla ćwiczeń wymuszonych

Aktywna autofagia jest związana z produktywną regeneracją mięśni, która jest niezbędna do aktywacji komórek macierzystych mięśni (MuSC). W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania in situ LC3, markera autofagii w MyoD-dodatnich MuSC skrawków tkanki mięśniowej od myszy kontrolnych i rannych.

In Situ Barwienie immunofluorescencyjne autofagii w komórkach macierzystych mięśni

Trening o wysokiej intensywności w niedotlenieniu to protokół, który, jak udowodniono, wywołuje adaptacje naczyniowe, potencjalnie korzystne u niektórych pacjentów i poprawia zdolność sportowców do powtarzalnego sprintu. Tutaj testujemy wykonalność szkolenia myszy przy użyciu tego protokołu i identyfikujemy te adaptacje naczyniowe za pomocą oceny funkcji naczyń krwionośnych ex vivo.

Supramaksymalna intensywność ćwiczeń hipoksyjnych i ocena funkcji naczyń krwionośnych u myszy

Krótka sesja (≤10 min) trening interwałowy o wysokiej intensywności (HIIT) pojawia się jako alternatywa dla dłuższych metod ćwiczeń, jednak krótsze warianty rzadko są modelowane w badaniach na zwierzętach. Tutaj opisujemy 10-minutowy, 3 dni w tygodniu, protokół HIIT na bieżni pod górę, który zwiększa wydolność fizyczną u myszy w wieku męskim i żeńskim.

Krótka sesja treningu interwałowego o wysokiej intensywności i ocena bieżni u starszych myszy

Ta procedura opisuje tłumaczalny model treningu oporu z progresywnym kołem do biegania u myszy. Podstawową zaletą tego modelu treningu oporowego jest to, że jest on całkowicie dobrowolny, co zmniejsza stres dla zwierząt i obciążenie badacza.

Prosty i niedrogi model koła do jazdy do progresywnego treningu oporowego u myszy

Obecny protokół opisuje indukcję autofagii w ciele tłuszczowym larw Drosophila melanogaster poprzez wyczerpanie składników odżywczych i analizuje zmiany w autofagii za pomocą transgenicznych szczepów much.

Analiza autofagii wywołanej głodem w ciele tłuszczowym larw Drosophila melanogaster

Ten artykuł przedstawia reakcje morfometryczne i wyniki treningu według protokołu treningu interwałowego o wysokiej intensywności (HIIT) w szczurzym modelu otyłości wywołanej dietą metodą Sprague'a-Dawleya. Celem tego protokołu była maksymalizacja intensywności ćwiczeń i określenie fizjologicznych reakcji na HIIT u szczupłych i otyłych szczurów.

Przewlekły trening interwałowy o wysokiej intensywności i model otyłości wywołanej dietą w celu maksymalizacji wysiłku fizycznego i wywołania zmian fizjologicznych u szczurów

Na podstawie eksperymentów in vitro, badanie to ujawniło mechanizm działania krocetyny w naprawie uszkodzeń kardiomiocytów spowodowanych stresem oksydacyjnym poprzez wpływ na mitofagię, w której ważną rolę odgrywa szlak sygnałowy PINK1/Parkin.

Ochrona komórek mięśnia sercowego H9c2 przed stresem oksydacyjnym przez krocetynę za pośrednictwem mitofagii, w której pośredniczy szlak PINK1 / Parkin

Ten protokół zapewnia prostą metodę tworzenia statycznego sprzętu treningowego dla myszy. Urządzenie utrzymuje izometryczny skurcz mięśni kończyn myszy, aby zweryfikować interwencyjny wpływ tradycyjnych ćwiczeń na cukrzycę typu 2 (T2DM) i zapewnia nową terapię ruchową w klinicznym leczeniu cukrzycy typu 2.

Metoda treningu siły statycznej dla myszy z cukrzycą typu 2

W niniejszym filmie zaprezentowano podejście z wykorzystaniem kontrolowanego środowiska do badania degradacji lignocelulozowych tkanek roślinnych przez grzyby tlenowe. Możliwość kontrolowania źródeł składników odżywczych oraz wilgotności jest kluczową zaletą mikrokosmosów w blokach agarowych, jednak podejście to często przynosi niejednoznaczne rezultaty. Omówiliśmy krytyczne pułapki, aby umożliwić uzyskanie powtarzalnych wyników o niskiej zmienności.

Mikrokosmy z bloków agarowych do kontrolowanego rozkładu tkanek roślinnych przez grzyby tlenowe

Poznaj metodę aktywacji autofagii przez ćwiczenia aerobowe u myszy C57BL/6 z transgenem GFP-LC3. Technika ta pozwala mierzyć poziomy autofagii w tkankach i badać korzyści fizjologiczne wysiłku fizycznego.

Aktywacja autofagii przez ćwiczenia aerobowe u myszy

Przeglądaj więcej filmów