Aktywacja autofagii przez ćwiczenia aerobowe u myszy

Ogólnym celem tego eksperymentu jest fizjologiczna aktywacja autofagii u myszy poprzez wymuszony lub dobrowolny bieg, a następnie pomiar poziomu autofagii w określonych tkankach. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące autofagii, w szczególności w kwestii tego, jak autofagia i wysiłek przyczyniają się do korzystnych efektów wywołanych ćwiczeniami aerobowymi. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że wysiłek fizyczny stanowi szybki sposób na wywołanie autofagii in vivo u myszy.

W tym doświadczeniu należy zastosować myszy szczepu C57 black six w wieku od ośmiu do dwunastu tygodni, posiadające transgen GFP-LC3, który umożliwia wykrywanie autofagii indukowanej wysiłkiem fizycznym in vivo. Szczegółowe informacje na temat korzystania z bieżni dla myszy znajdują się w następnej publikacji JoVE. Ustaw stymulację elektryczną bieżni na niską intensywność.

Podczas dwóch pierwszych sesji poddaj myszy aklimatyzacji na otwartej bieżni z nachyleniem dziesięciu stopni pod górę. Pierwszego dnia ćwicz myszy przez pięć minut przy prędkości bieżni wynoszącej 8 m/min. Drugiego dnia prowadź bieg przez dziesięć minut, początkowo z prędkością 8 m/min, a po pięciu minutach zwiększ prędkość do 10 m/min.

Trzeciego dnia poddaj myszy biegowi trwającemu pełne 90 minut. Uruchom bieżnię z prędkością 10 m/min i zachęcaj myszy do biegu, stosując delikatne popchnięcia, aby uniknąć powtarzających się wstrząsów elektrycznych stóp. Kluczowe jest obserwowanie i manipulowanie myszami w taki sposób, aby nie otrzymały zbyt wielu wstrząsów elektrycznych podczas 90-minutowego biegu.

Przez cały czas trwania biegu zachęcaj myszy palcami do pozostania na bieżni. Po 40 minutach zwiększ prędkość o jeden metr na minutę. Po 50 minutach ponownie zwiększ prędkość o jeden metr na minutę.

Po 60 minutach zwiększ prędkość o kolejny jeden metr na minutę. Po 70 minutach zacznij zwiększać prędkość co pięć minut w taki sposób, aby w ciągu ostatnich pięciu minut z 90-minutowego biegu prędkość wyniosła 17 metrów na minutę. Po zakończeniu próby natychmiast uśmierć myszy w celu pobrania tkanek, jeśli jest to wymagane.

W tym teście należy trzymać myszy indywidualnie. Należy użyć tej samej linii, która została opisana wcześniej. Przygotować kołowrotek dla myszy o średnicy 11,4 centymetra z przymocowanym cyklokomputerem.

Każdy obrót powinien odpowiadać przebyciu drogi o długości 358 milimetrów. Umieść mysz w klatce z kołowrotkiem i pozwól jej swobodnie z niego korzystać przez dwa tygodnie. Co 24 godziny odczytuj z liczniku dystans pokonany przez mysz.

Po dwóch tygodniach pobierz tkanki do analizy, zgodnie z potrzebami. W celu pomiaru strumienia autofagii podawaj myszom chlorochinę, która jest inhibitorem autofagii, przez trzy dni. Rozpuść chlorochinę w PBS w stężeniu 5 mg/mL i wstrzykuj myszom doglebowo w dawce 50 µg/g.

Wykonuj u myszy jeden zastrzyk dziennie przez trzy kolejne dni, a tkanki pobierz trzy godziny po ostatnim zastrzyku. W przypadku myszy poddawanych ćwiczeniom na bieżni, rozpocznij 90-minutowy bieg 90 minut po zastrzyku w trzecim dniu, tak aby bieg zakończył się trzy godziny po wstrzyknięciu preparatu. Następnie poddaj myszy eutanazji i niezwłocznie pobierz tkanki.

Przygotuj się do perfuzji zwierzęcia w ciągu 90 minut od zakończenia ćwiczeń, przygotowując utrwalacz. Napełnij strzykawkę o pojemności 30 ml od 15 do 20 ml świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu i połącz strzykawkę z igłą cewnikową o rozmiarze 20 G. Podłącz napełnioną strzykawkę do pompy i ustaw ciągły przepływ na poziomie 90 ml/h.

Kładąc zwierzę na czystej powierzchni roboczej w pozycji na plecach, rozcień jamę klatki piersiowej przez przeponę, aby odsłonić serce. Następnie wprowadź igłę cewnika do prawej komory. Na koniec wykonaj małe nacięcie na wątrobie, aby odprowadzić krew i uruchomić pompę.

Wstrzykuj utrwalacz, aż płuca i wątroba całkowicie zbledną. Zazwyczaj wystarczające będzie 15 ml utrwalacza. Po perfuzji wyjmij igłę i pobierz interesujące tkanki.

Aby pobrać mięsień szkieletowy, wypreparuj mięsień obszerny boczny. Delikatnie odsunąć skórę nogi do tyłu, aby odsłonić mięśnie i zlokalizować mięsień czworogłowy uda. Następnie wypreparuj mięsień obszerny boczny, który jest mięśniem zewnętrznym przyczepionym do górnej części kości udowej.

W celu dalszej fiksacji i odwodnienia umieść pobrane tkanki w 4% paraformaldehydzie na 24 godziny w temperaturze 4 °C. Następnego dnia przenieś tkanki do PBS z 15% sacharozą i pozostaw je do namoczenia w temperaturze 4 °C przez noc lub do momentu opadnięcia tkanek na dno naczynia. Następnie przenieś tkanki do PBS z 30% sacharozą w temperaturze 4 °C na noc lub na dłuższy czas.

Podczas tych kąpieli należy w miarę możliwości przechowywać tkanki w ciemności. Następnie umieść tkanki w medium do zatapiania, takim jak OCT, i w razie potrzeby podziel je na mniejsze fragmenty. Następnie pozostaw je na kilka minut w małej szalce Petriego w celu aklimatyzacji.

Następnie przenieść je do form do mrożenia (cryomolds) z ilością OCT wystarczającą do ich całkowitego przykrycia. W formach zorientować powierzchnie do cięcia w stronę dna i unikać tworzenia pęcherzyków powietrza. Następnie zamrozić próbki w zakrytym styropianowym pojemniku wypełnionym suchym lodem, aż OCT stanie się białe.

Następnie poszczególne próbki należy zawinąć w podpisane folie, zamknąć w plastikowej torbie i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu ich przetworzenia. Wykorzystując LC3 znakowany GFP jako system raportujący, obserwowano indukcję autofagii u myszy poddanych ćwiczeniom zgodnie z opisem. Po stymulacji autofagii LC3 przemieścił się z cytosolu do autofagosomu w postaci struktur punktowych.

U myszy poddanych ćwiczeniom odnotowano znacznie więcej punktów GFP-LC3 zarówno w mięśniach szkieletowych, jak i w korze mózgu w porównaniu z myszami w stanie spoczynku. Analiza Western blot z użyciem przeciwciała przeciwko LC3 wykazała, że ćwiczenia znacząco indukowali generowanie koniugatu lipidowego LC3-II, co sugeruje zwiększoną konwersję LC3-I z cytozolu do LC3-II. Następnie zmierzono degradację receptora ładunku autofagicznego, p62.

90 minut aktywności na bieżni spowodowało silniejszą degradację p62 w mięśniach szkieletowych niż w warunkach spoczynku. Efekt ten został zniesiony poprzez wstrzyknięcie chlorochiny przed wysiłkiem. Ponieważ chlorochina jest inhibitorem degradacji lizosomalnej, dane te wskazują, że obserwowalne zjawisko wynika ze zwiększonego przepływu autofagocytarnego, a nie z blokady degradacji autofagosomów.

Po opracowaniu techniki tej pojawiły się jej prekursory w dziedzinie autofagii, służące do badania wpływu mechanizmu ćwiczeń fizycznych na degradację metabolizmu oraz zachowania zwierząt. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest monitorowanie myszy w trakcie biegu. Po zakończeniu tej procedury stosuje się metody takie jak mikroskopia elektronowa.

Mikroskopia tkanek zwierzęcych może być przeprowadzona w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak wpływ wysiłku fizycznego na wybrane szlaki autofagii, na przykład mitofagię i lipofagię.