Aktywacja autofagii przez ćwiczenia aerobowe u myszy

Ogólnym celem tego eksperymentu jest fizjologiczna aktywacja autofagii u myszy poprzez wymuszone lub dobrowolne bieganie, a następnie zmierzenie poziomu autofagii w określonych tkankach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące autofagii, w szczególności tego, w jaki sposób autofagia i działanie przyczyniają się do korzystnych efektów, w których pośredniczą ćwiczenia aerobowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że ćwiczenia fizyczne to szybkie tlenowe kołysanie między autofagią in vivo przy użyciu myszy.

W tym eksperymencie zacznij od ośmiu do dwunastu tygodni czarnych myszy C57, zawierających gen trans do wykrywania autofagii wywołanej wysiłkiem fizycznym in vivo, znanej jako GFP-LC3. Szczegółowe informacje na temat korzystania z bieżni dla myszy można znaleźć w następującej publikacji JoVE. Ustaw bodziec elektryczny bieżni na niską intensywność.

Podczas pierwszych dwóch sesji przyzwyczaj myszy do otwartej bieżni o dziesięć stopni pod górę. Pierwszego dnia ćwicz myszy przez pięć minut, a bieżnia działa z prędkością ośmiu metrów na minutę. Drugiego dnia biegaj z myszami przez dziesięć minut, początkowo z prędkością ośmiu metrów na minutę, a po pięciu minutach zwiększ prędkość do dziesięciu metrów na minutę.

Trzeciego dnia uruchom myszy przez pełne 90 minut. Uruchom bieżnię z prędkością dziesięciu metrów na minutę i zachęcaj myszy do biegania, delikatnie szturchając, aby uniknąć powtarzających się wstrząsów stopami. Bardzo ważne jest, aby obserwować i manipulować myszami, aby nie otrzymały zbyt wielu wstrząsów elektrycznych podczas 90-minutowego biegu.

Przez cały bieg używaj palców, aby zachęcić myszy do pozostania na bieżni. Po 40 minutach 6zwiększ prędkość o jeden metr na minutę. Po 50 minutach ponownie zwiększ prędkość o jeden metr na minutę.

Po 60 minutach zwiększ prędkość o kolejny metr na minutę. Po 70 minutach zacznij zwiększać prędkość co pięć minut, tak aby ostatnie pięć minut 90-minutowego biegu wynosiło 17 metrów na minutę. Po zakończeniu badania należy natychmiast poddać myszy eutanazji w celu pobrania tkanek, jeśli jest to pożądane.

W tym teście trzymaj myszy indywidualnie. Użyj tego samego szczepu, jak opisano wcześniej. Przygotuj koło do biegania myszy o średnicy 11,4 centymetra z dołączonym licznikiem kilometrów roweru.

Każdy obrót powinien mierzyć 358 milimetrów skoku. Przenieś mysz do klatki zawierającej kółko i pozwól myszy swobodnie z niej korzystać przez dwa tygodnie. Co 24 godziny zapisuj dystans przebyty przez mysz od licznika kilometrów.

Po dwóch tygodniach zbierz tkanki do analizy w razie potrzeby. Aby zmierzyć strumień autofagiczny, potraktuj myszy inhibitorem autofagii, chlorochiną, przez trzy dni. Rozpuść chlorochinę w PBS w ilości pięciu miligramów na mililitr i wstrzyknij ją myszom dootrzewnowo w dawce 50 mikrogramów na gram.

Podawać myszom jedno wstrzyknięcie dziennie przez trzy kolejne dni i pobierać tkanki trzy godziny po ostatnim wstrzyknięciu. W przypadku myszy ćwiczących na bieżni rozpocznij 90-minutowy bieg 90 minut po wstrzyknięciu trzeciego dnia, tak aby bieg zakończył się trzy godziny po wstrzyknięciu. Następnie poddaj myszy eutanazji i natychmiast zbierz ich tkanki.

Przygotuj się do obfitego użycia, w ciągu 90 minut od ćwiczeń, przygotowując utrwalacz. Załaduj 30-mililitrową strzykawkę z 15 do 20 mililitrami świeżo przygotowanego czteroprocentowego paraformaldehydu i połącz strzykawkę z igłą do cewnika o rozmiarze 20. Podłącz załadowaną pompę strzykawkową i ustaw ją na 90 mililitrów na godzinę ciągłego przepływu.

Trzymając zwierzę na czystej powierzchni roboczej, w pozycji leżącej, rozetnij klatkę piersiową przez przeponę, aby odsłonić serce. Teraz włóż igłę cewnika do prawej komory. Następnie wykonaj małe nacięcie na wątrobie, aby spuścić krew i uruchomić pompę.

Utrwalacz należy wstrzykiwać do momentu, gdy płuca i wątroba całkowicie zbledną. Zwykle wystarczy 15 mililitrów utrwalacza. Po obfitości wyjmij igłę i zbierz interesujące tkanki.

Aby zebrać mięśnie szkieletowe, wypreparuj obszerny boczny. Na krótko pociągnij skórę nogi do tyłu, aby odsłonić mięśnie i zlokalizować mięsień czworogłowy uda. Następnie wypreparuj obszerny boczny, który jest zewnętrznym mięśniem przyczepionym do górnej części kości udowej.

W celu dalszego utrwalenia i odwodnienia umieść pobrane tkanki w czteroprocentowym paraformaldehydzie na 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś tkanki do 15-procentowego PBS sacharozy i pozwól im moczyć się w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc lub do momentu, gdy osiądą w roztworze. Następnie przenieś tkanki do 30-procentowego PBS sacharozy w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc lub dłużej.

Podczas tych kąpieli utrzymuj chusteczki w ciemności tak bardzo, jak to możliwe. Następnie umieść tkanki w podłożu do zatapiania, takim jak OCT i pokrój je na mniejsze kawałki, jeśli to konieczne. Następnie pozwól im zaaklimatyzować się przez kilka minut na małej szalce Petriego.

Następnie przenieś je do krioform z wystarczającą ilością OCT do przykrycia. W foremkach ustaw powierzchnie przekrojowe w kierunku dołu i unikaj tworzenia się pęcherzyków. Następnie zamroź próbki w zakrytej piankowej chłodziarce wypełnionej suchym lodem, aż OCT zmieni kolor na biały.

Teraz zawiń poszczególne próbki w oznakowane folie, zamknij je w plastikowej torbie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą mogły zostać przetworzone. Używając GFP oznaczonego LC3 jako systemu reporterowego, zaobserwowano indukcję autofagii u myszy ćwiczonych zgodnie z opisem. Po stymulacji autofagii LC3 translokował się z cytozolu do autofagosomu w strukturach punktowych.

Ćwiczone myszy miały znacznie więcej punktów GFP-LC3 zarówno w mięśniach szkieletowych, jak i korze mózgowej w porównaniu z myszami w stanie spoczynku. Analiza Western blot przy użyciu przeciwciała LC3 wykazała, że ćwiczenia znacząco indukowały wytwarzanie koniugacyjnego LC3-II z lipidami, co sugeruje, że nastąpiła zwiększona konwersja cytozolowego LC3-I do LC3-II. Następnie zmierzono degradację autofagicznego receptora ładunkowego, p62.

90 minut aktywności na bieżni spowodowało większą degradację p62 w mięśniach szkieletowych niż w stanie spoczynku. Efekt ten został uratowany przez wstrzyknięcie chlorochiny przed ćwiczeniami. Ponieważ chlorochina jest inhibitorem degradacji lizosomalnej, dane te wskazują, że obserwowane zjawiska są spowodowane zwiększonym strumieniem autofobicznym, a nie blokadą degradacji autofagosomów.

Po swoim opracowaniu technika ta miała prekursorów w dziedzinie autofagii w celu zbadania wpływu na mechanizm ćwiczeń w degradacji metabolizmu i zachowań zwierząt. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby monitorować myszy podczas ich biegu. Po tej procedurze stosuje się metody takie jak mikroskopia elektryczna.

Mikroskopia zwierzęca może być wykonana w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak ćwiczenia w wybranych szlakach autofagii, takich jak mitofagia i lipofagia.