Name: Sterowane obrazem, laserowe wytwarzanie sieci mikroprzepływowych pochodzenia naczyniowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Poznaj metodę laserowej degradacji hydrogelu PEGDA sterowaną obrazem do tworzenia biomimetycznych sieci mikroprzepływowych naśladujących naczynia krwionośne. Technika ta umożliwia precyzyjną fabrykację trójwymiarowych struktur dla inżynierii tkankowej i modelowania chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Jeffowi Caplanowi i panu Michaelowi Moore'owi z Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center za ich wsparcie w mikroskopii konfokalnej. Dostęp do sprzętu mikroskopowego był wspierany przez National Institutes of Health (NIH) wspólne granty na oprzyrządowanie (S10 RR0272773 i S10 OD016361) oraz Federalny Program Grantów Badawczo-Rozwojowych Stanu Delaware (16A00471). Badania te były wspierane przez granty z Institutional Development Award (IDeA) z NIH National Institute of General Medical Sciences (P20GM103446), American Cancer Society (14-251-07-IRG), University of Delaware Research Foundation (14A00778), Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) (RR140013) oraz NIH National Library of Medicine (4 R00 LM011390-02).

<ol><li>Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+rules+for+diffusive+drug+delivery+in+tumor+and+normal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (5), 1799-1803 (2011).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips+at+the+frontiers+of+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).</li>
<li>Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+tissues+on+a+chip+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Biomimetic tissues on a chip for drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 17 (3-4), 173-181 (2012).</li>
<li>Jeon, J. S., Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (1), 214-219 (2015).</li>
<li>Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+the+tumor-lymphatic+microenvironment+with+simultaneous+transendothelial+and+luminal+flows+reveals+mechanisms+of+flow+enhanced+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion.</a> Integr. Biol. 7 (5), 525-533 (2015).</li>
<li>Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+Biomimetic+Microfluidic+Networks+in+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels.</a> Adv. Healthc. Mater. , (2016).</li>
<li>Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Self-Assembled+Microvascular+Networks+with+Microfabricated+PEG-Based+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels.</a> Adv. Funct. Mater. 22 (21), 4511-4518 (2012).</li>
<li>Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Biomimetic+Patterning+in+Hydrogels+to+Guide+Cellular+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization.</a> Adv. Mater. 24 (17), 2344-2348 (2012).</li>
<li>Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+functional%2C+perfusable+3D+microvascular+networks+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip.</a> Lab Chip. 13 (8), 1489(2013).</li>
<li>Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Hydrogels+with+Immobilized+EphrinA1+for+Therapeutic+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).</li>
<li>Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-demanded+release+of+VEGF+from+synthetic%2C+biointeractive+cell-ingrowth+matrices+for+vascularized+tissue+growth%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth.</a> FASEB J. , (2003).</li>
<li>He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+assembly+of+3D+perfusable+microfluidic+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 25 (11), 2491-2500 (2014).</li>
<li>Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaotic+mixing+in+three-dimensional+microvascular+networks+fabricated+by+direct-write+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly.</a> Nat. Mater. 2 (4), 265-271 (2003).</li>
<li>Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omnidirectional+Printing+of+3D+Microvascular+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks.</a> Adv. Mater. 23 (24), H178-H183 (2011).</li>
<li>Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Bioprinting+of+Vascularized%2C+Heterogeneous+Cell-Laden+Tissue+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs.</a> Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).</li>
<li>Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microfluidic+model+for+tumor+cell+intravasation+and+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (34), 13515-13520 (2012).</li>
<li>Roudsari, L. C., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+influence+of+angiogenesis+in+in+vitro+cancer+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. , (2015).</li>
<li>Dawson, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+laws+for+capillary+vessels+of+mammals+at+rest+and+in+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+Long.+%5BBiol.%5D%22%5BJournal%5D)">Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise.</a> Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270 (1516), 755-763 (2003).</li>
<li>Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+femtosecond+laser+nanosurgery+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues.</a> Appl. Phys. B. 81 (8), 1015-1047 (2005).</li>
<li>Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Photoablation+of+Guidance+Microchannels+into+Hydrogels+Directs+Cell+Growth+in+Three+Dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions.</a> Biophys. J. 96 (11), 4743-4752 (2009).</li>
<li>Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 116-119 (2009).</li>
<li>Applegate, M. B., Coburn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-based+three-dimensional+multiscale+micropatterning+of+biocompatible+hydrogels+for+customized+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (39), 12052-12057 (2015).</li>
<li>Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser-generated+microtracks+in+3D+collagen+lattices%3A+principles+of+MMP-dependent+and+-independent+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PB%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion.</a> PB. 8 (2), (2011).</li>
<li>Naik, P., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Blood-Brain+Barrier+Models%3A+Current+and+Perspective+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies.</a> J. Pharm. Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).</li>
<li>Choe, Y., Mayerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+Preparation%2C+Imaging%2C+and+Analysis+Protocols+for+Knife-edge+Scanning+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy.</a> JoVE. (58), (2011).</li>
<li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+macro-scale+transmission+imaging+of+microvascular+networks+using+KESM%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM.</a> Biomed. Opt. Express. 2 (10), 2888-2896 (2011).</li>
<li>Chung, J. R., Sung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+Exploration+of+Mouse+Brain+Microstructures+Using+the+Knife-Edge+Scanning+Microscope+Brain+Atlas%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroinform%22%5BJournal%5D)">Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas.</a> Front. Neuroinform. 5, (2011).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Surface+Patterning+Promotes+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2015).</li>
<li>Slater, J. H., Culver, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+and+Modulation+of+the+Cellular+Architecture+of+a+User-Chosen+Cell+of+Interest+Using+Cell-Derived%2C+Biomimetic+Patterning%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning.</a> ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).</li>
<li>Slater, J. H., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+Multifaceted%2C+Micropatterned+Surfaces+and+Image-Guided+Patterning+Using+Laser+Scanning+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography.</a> Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).</li>
<li>DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+immobilization+of+RGDS+on+hydrogel+surfaces+to+direct+cell+alignment+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration.</a> J. Control. Release. 109 (1-3), 139-148 (2005).</li>
<li>DeForest, C. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytocompatible+click-based+hydrogels+with+dynamically-tunable+properties+through+orthogonal+photoconjugation+and+photocleavage+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions.</a> Nat. Chem. 3 (12), 925-931 (2011).</li>
<li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable+Hydrogels+for+Dynamic+Tuning+of+Physical+and+Chemical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties.</a> Science. 324 (5923), 59-63 (2009).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+two-photon+photodegradation+of+PEG+hydrogels+to+study+and+manipulate+subcellular+interactions+on+soft+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials.</a> Soft Matter. 6 (20), 5100-5108 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowe znaczenie dla zastąpienia standardowych funkcji oprogramowania mikroskopu w celu umożliwienia użycia wirtualnych masek do degradacji laserowej sterowanej obrazem, makro mikroskopu musi być starannie skonfigurowane i manipulowane. Sposób, w jaki oprogramowanie mikroskopu łączy się z mikroskopem makro, może być czasami sprzeczny z intuicją, dlatego włożono wiele wysiłku w określenie optymalnych ustawień w obu programach, aby opracować tę metodę. Zaleca się ogólne zrozumienie podstaw korzystania z laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, zwłaszcza w przypadku okien "Stage" i "Focus" w celu znalezienia i prawidłowego ustawienia hydrożelu w wymiarach x, y i z, przed przystąpieniem do degradacji laserowej. Ponadto wykonanie kanału wlotowego ma kluczowe znaczenie dla protokołu; Zawieszone formy fluorescencyjne muszą być w stanie przedostać się do systemów mikroprzepływowych w celu pomyślnego obrazowania i charakteryzacji sieci. Należy zauważyć, że protokół ten ma zastosowanie do określonego skaningowego mikroskopu konfokalnego ze skaningiem laserowym skonfigurowanego z określonym laserem impulsowym femtosekundowym, z uruchomionymi określonymi wersjami oprogramowania mikroskopu i mikroskopu makro (patrz szczegóły w Wykazie określonych materiałów/sprzętu). Odkryliśmy, że nowsze wersje mikroskopu makro nie mają niezbędnej kontroli i funkcjonalności potrzebnej do sterowania laserowego sterowanego obrazem. Chociaż można stosować inne platformy mikroskopowe i impulsowe źródła laserowe, protokół ten dotyczy konkretnie tego systemu i będzie wymagał modyfikacji w zależności od zaimplementowanej platformy, źródła lasera i oprogramowania. Zasady leżące u podstaw tego protokołu nadal jednak obowiązują.
Potencjalna modyfikacja tego protokołu polega na zmianie składu hydrożelu. W tym przypadku wykorzystaliśmy hydrożele PEGDA o stężeniu 5% wag., 3,4 kDa, ale degradacja laserowa (do celów innych niż generowanie sieci mikroprzepływowych) została zaimplementowana w celu degradacji zarówno syntetycznych, jak i naturalnych hydrożeli, w tym PEGylowanego fibrynogenu21,22, hydrożeli białka jedwabiu23 i kolagenu24. Regulacja mocy lasera, prędkości skanowania, odstępów między warstwami Z i liczby powtórzeń pomoże w określeniu optymalnych parametrów wytwarzania sieci mikroprzepływowych w innych preparatach hydrożelowych.
Jednym z obecnych ograniczeń tej techniki jest całkowita objętość hydrożelu, który może ulec degradacji w rozsądnym czasie. Aby utworzyć otwarte puste przestrzenie lub cechy mikroprzepływowe w hydrożelu, czas przebywania lasera musi wynosić co najmniej 8,96 μs/piksel (lub prędkość skanowania laserowego 0,021 μm/μs) przy użyciu fluencji lasera 37,7 nJ/μm2. Przy tych ustawieniach degradacja naczyń w objętości 0,014 mm3 zajmuje 1,4 godziny (jak pokazano na rysunku 1). Przy czasie przebywania lasera wynoszącym 4,48 μs/piksel lub niższym, dostarczana energia nie jest wystarczająca do pełnej degradacji zastosowanej tutaj formuły hydrożelowej. Wdrożenie innego składu hydrożelu mogłoby przezwyciężyć to ograniczenie. Stosowanie żeli fotolabilnych, które zawierają składniki wrażliwe na światło34-36 lub hydrożeli o dużych przekrojach wielofotonowych21-24 są dobrymi opcjami, które umożliwiłyby użycie mniejszej ilości energii i skutkowałyby szybszą degradacją. Ze względu na ograniczenia wymiarowe, w hydrożelu7 zastosowano elementy o głębokości do 1,5 mm. Osiągalna głębokość zależy od odległości roboczej obiektywu i może być zwiększona za pomocą obiektywów o bardzo dużej odległości roboczej zoptymalizowanych pod kątem obrazowania in vivo . Najmniejszy zmierzony kanał7 utworzony przy użyciu obiektywu 20X (NA1.0) zanurzonego w wodzie miał szerokość 3,3 μm i głębokość 8,9 μm, co jest na równi z rozmiarem najmniejszych kanałów wygenerowanych na rysunku 1. Podczas gdy inne laboratoria używały niższych obiektywów NA21,23,24, przewidujemy, że sieci mikroprzepływowe o mniejszych cechach mogą być generowane przy użyciu wyższych obiektywów NA kosztem zmniejszonej odległości roboczej. Ostatecznie jednak rozdzielczość techniki jest funkcją funkcji rozproszenia punktowego skupionej wiązki laserowej, właściwości skanowania laserowego, ilości energii dostarczanej przez laser oraz właściwości absorpcji lasera przez degradowany materiał.
Ponadto właściwości lasera (prędkość, fluencja, odstępy między wirtualnymi maskami i liczba powtórzeń) muszą być zoptymalizowane w oparciu o właściwości hydrożelu (gęstość usieciowania, masa cząsteczkowa makromeru/monomeru, procent wagowy i rodzaj hydrożelu: na bazie białka vs. syntetyczny), ponieważ będą one z natury zmieniać interakcje z laserem, a tym samym ostateczną rozdzielczość procesu. Ze względu na to, że na dostarczaną energię wpływa również zastosowany cel, przy przełączaniu między celami wymagana jest dodatkowa optymalizacja. Jeśli chodzi o związane z tym koszty, wymagany jest dostęp do mikroskopu z laserem impulsowym i chociaż można używać wielu różnych obiektywów, te o wysokim NA i dużej odległości roboczej (do obrazowania in vivo ) mogą być drogie.
Poza opisanym tutaj protokołem, sieci mikroprzepływowe wygenerowane przy użyciu tej techniki mogą być również funkcjonalizowane za pomocą peptydów adhezyjnych po kanale w celu wywołania adhezji komórek śródbłonka i tworzenia światła7. Dodatkowo, włączenie degradowalnych przez komórki sekwencji peptydowych do materiału sypkiego9 przed degradacją kanału może pozwolić na badanie migracji komórek do hydrożelu i przez niego. W celu ciągłej fluidyzacji sieci mikroprzepływowej w hydrożelu, hydrożele mogą być fotopolimeryzowane w większych urządzeniach lub obudowach fluidycznych, jak pokazano na rysunkach 2 i 37.
Generowanie sieci naczyniowych poprzez samoorganizację naczyniopochodną lub angiogenną8-12 zapewnia proste podejście do indukowania unaczynienia w stosunkowo dużej objętości hydrożelu. Chociaż takie podejście skutkuje perfuzyjnymi sieciami fluidycznymi, trudno jest bezpośrednio kontrolować rozmiar, zawiłość, gęstość i ogólną architekturę sieci. Ze względu na to ograniczenie, profil przepływu i szybkości ścinania w układzie naczyniowym mogą się różnić w zależności od eksperymentu. Alternatywnie, techniki mikrowytwarzania13-16 pozwalają na bezpośrednią kontrolę nad architekturą sieci, ale często są ograniczone przez ich niezdolność do generowania małych, kapilarnych kanałów lub wytwarzanie gęstych sieci, które naśladują architekturę naczyniową in vivo. Podczas gdy opisana tutaj technika degradacji hydrożelu oparta na laserze została na nowo wykorzystana do generowania mikroprzepływów, jednocześnie pokonuje zarówno kontrolę architektoniczną, jak i ograniczenia oparte na rozmiarze istniejących metod mikrowytwarzania, umożliwiając tworzenie biomimetycznych sieci mikroprzepływowych 3D, które podsumowują gęstość, krętość, zakres rozmiarów i ogólną architekturę in vivo unaczynienie. Co więcej, w jednym hydrożelu można wygenerować wiele sieci fluidycznych, co pozwala na badanie transportu międzysieciowego7. Do zastosowań w inżynierii tkankowej, które dążą do ściślejszego odtworzenia procesów transportu in vivo in vitro, dobrze nadają się przedstawione tutaj sieci mikroprzepływowe o wysokiej rozdzielczości, osadzone w hydrożelu. Przewidujemy, że protokół ten będzie przydatny w opracowywaniu konstruktów tkankowych, które dokładniej naśladują transport in vivo, do wykorzystania jako urządzenia do badań przesiewowych leków i modele chorób in vitro.

Układ naczyniowy, składający się zarówno z układu limfatycznego, jak i sercowo-naczyniowego, tworzy bardzo gęste sieci, które są niezbędne do transportu składników odżywczych i tlenu oraz do usuwania produktów przemiany materii. W związku z tym komórki znajdujące się w unaczynionych tkankach nigdy nie znajdują się dalej niż 50-100 μm od naczynia1. Zdolność do odtworzenia architektury naczyniowej in vivo in vitro ma kluczowe znaczenie dla dokładnego modelowania procesów transportowych in vivo przy użyciu konstrukcji inżynieryjnych. W związku z niedawnym dążeniem do opracowania urządzeń typu organ-on-a-chip2 do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków3,4 i modelowania chorób5,6, metody tworzenia sieci mikroprzepływowych, które rekapitulują transport in vivo w syntetycznych lub naturalnych hydrożelach, cieszą się dużym zainteresowaniem. Aby poprawić biomimikrę mikrotkanek stosowanych w tych urządzeniach, opracowaliśmy sterowaną obrazem, laserową metodę degradacji hydrożelu, która wykorzystuje trójwymiarowe (3D) stosy obrazów natywnego naczynia krwionośnego jako szablony do generowania naczyniowych sieci mikroprzepływowych osadzonych w hydrożelach PEGDA7. Protokół ten przedstawia zastosowanie dostępnego na rynku laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w femtosekundowy laser impulsowy do wytwarzania biomimetycznych sieci mikroprzepływowych pochodzenia naczyniowego w hydrożelach PEGDA poprzez degradację sterowaną obrazem na bazie lasera.
Obecne podejścia do fluidyzacji hydrożeli obejmują indukcję naczyniotwórczych8-10 lub angiogennych10-12 technik samoorganizacji komórek śródbłonka i mikrofabrykacji w celu stworzenia predefiniowanych kanałów do śródbłonka13-16. Podczas gdy sieci samoorganizujące się podsumowują gęstość i złożoną architekturę mikrokrążenia, często są one bardziej przepuszczalne niż sieci in vivo 11,17,18, co może być problematyczne w modelowaniu transportu do zastosowań przesiewowych leków. Samoorganizujące się sieci składają się z fizjologicznie istotnych naczyń o rozmiarach kapilary, ale mogą być trudne do zintegrowania z przepływem płynu objętościowego ze względu na ograniczenia w generowaniu większych naczyń wielkości tętniczki. Ponieważ nie ma bezpośredniej kontroli nad montażem tych sieci, ostateczna architektura może się różnić w zależności od próbki, co utrudnia wielokrotne tworzenie sieci o tych samych właściwościach przepływu i transportu płynów.
Aby wygenerować 3D, osadzone w hydrożelu sieci mikroprzepływowe o powtarzalnej geometrii i dobrze zdefiniowanej architekturze, opracowano szereg technik mikrofabrykacji, w tym modułowy montaż13, druk 3D materiałów ofiarnych16, montaż bezpośredniego zapisu14 i druk dookólny15. Stosując te metody, architektura mikroprzepływowa, a tym samym właściwości przepływu i transportu płynów, mogą być wielokrotnie wytwarzane w wielu konstrukcjach. Głównym ograniczeniem tych podejść jest jednak niemożność stworzenia sieci mikroprzepływowych o cechach kapilarnych, od 4 do 10μm19. Większość technik mikrowytwarzania jest często ograniczona do elementów o średnicy od 150 do 650 μm13,16. Niektóre istniejące techniki są w stanie generować sieci hierarchiczne z kanałami w szerokim zakresie średnic, od 10 do 300 μm dla montażu bezpośredniego zapisu14 i od 18 do 600 μm dla drukowania dookólnego15, ale ich zdolność do generowania gęstych sieci lub wytwarzania wielu sieci mikroprzepływowych w bliskiej odległości w ramach jednego konstruktu7 jest ograniczona.
Aby przezwyciężyć niektóre z tych ograniczeń, opracowaliśmy sterowaną obrazem, laserową technikę degradacji hydrożelu, która pozwala na powtarzalne wytwarzanie biomimetycznych, hierarchicznych sieci mikroprzepływowych, które podsumowują architekturę mikrokrążenia in vivo. W tym celu laser impulsowy o długości fali 790 nm i napaści 140 femtosekund (fs) pracujący z częstotliwością 80 MHz jest skanowany rastrowo w żądanych lokalizacjach 3D w hydrożelu, zgodnie z obrazami naczyń krwionośnych in vivo. Spekulujemy, że proces degradacji przebiega poprzez indukowany laserem optyczny rozkład wody, wynikające z tego tworzenie się plazmy, następującą po niej szybką termoelastyczną ekspansję wody i lokalną degradację hydrożelu w miarę rozszerzania się wody20. Mechanizm ten różni się nieznacznie od laserowej degradacji hydrożeli na bazie białek21-24. W przeciwieństwie do PEGDA, która ma niski przekrój wielofotonowy, białka często mają duży przekrój wielofotonowy i dlatego ulegają degradacji w wyniku pęknięcia chemicznego wywołanego absorpcją wielofotonową23. Aby wygenerować sterowane obrazem sieci mikroprzepływowe, migawka laserowa jest kontrolowana przez wirtualne maski pochodzące z obrazu, które składają się z mozaiki obszarów zainteresowania9 definiujących architekturę mikroprzepływową. Korzystając z tego podejścia, wykazaliśmy zdolność do wytwarzania biomimetycznych sieci mikroprzepływowych 3D pochodzących z naczyń krwionośnych, które rekapitulują gęstą i krętą architekturę naczyń krwionośnych in vivo, w celu lokalnej kontroli porowatości hydrożeli poprzez zmianę ilości energii dostarczanej podczas degradacji. Udało nam się również wygenerować dwie niezależne sieci mikroprzepływowe, które przeplatają się w bliskiej odległości (15 μm), ale nigdynie łączą się bezpośrednio7. Wykazaliśmy również zdolność do endotelializacji mikrokanałów zdegradowanych laserowo poprzez funkcjonalizację po degradacji za pomocą sekwencji peptydowej ligującej integryny, argininy-glicyny-kwasu asparaginowego-seryny (RGDS), w celu promowania adhezji komórek śródbłonka i tworzenia światła7.
Dzięki temu protokołowi, generowanie złożonych sieci mikroprzepływowych w hydrożelach PEGDA jest możliwe dzięki sterowanej obrazem, laserowej degradacji za pomocą komercyjnie dostępnego mikroskopu dostępnego na wielu kampusach uniwersyteckich. Ponieważ proces degradacji jest kierowany przez cyfrowe, wirtualne maski, ta technika wytwarzania jest podatna na kreatywne projektowanie sieci mikroprzepływowych, co pozwala na jej wykorzystanie w szerokiej gamie zastosowań. Przewidujemy, że opisana tu metoda będzie najkorzystniejsza w projektowaniu biomimetycznych urządzeń narządowych i human-on-a-chip, zdolnych do replikacji procesów transportu biologicznego, istotnych w modelowaniutransportu leków2. Ta technika wytwarzania może być również interesująca dla generowania modeli chorób in vitro, w tym przerzutów raka5,6 i modeli bariery krew-mózg25. Ponieważ degradacja hydrożelu na bazie lasera była wcześniej wykorzystywana do tworzenia ścieżek do kierowania wzrostem neuronów21-23, sterowane obrazem rozszerzenie tej techniki może okazać się przydatne w zaawansowanych strategiach inżynierii tkankowej do pozycjonowania komórek w zdefiniowanych przez użytkownika układach przestrzennych 3D.

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2015a</td><td>nazwany "oprogramowaniem do programowania" w protokole; szczegółowe informacje na temat algorytmu</td></tr><tr><td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td> <td>NIH</td><td>wersja 1.51a</td><td>o nazwie "oprogramowanie do przetwarzania obrazu" w protokole</td></tr><tr><td>LSM 780 Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss nazwany</td><td></td><td>"laserowo-skaningowy mikroskop konfokalny" w protokole; dla hydrożelu na bazie lasera degradacja</td></tr><tr><td>Zen 2010B SP1</td><td>Zeiss</td><td>wydanie wersji 6.0</td><td>o nazwie "oprogramowanie mikroskopu" w protokole; do użytku w Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Multitime, 2010</td><td>Zeiss</td><td>v16.0</td><td>o nazwie "mikroskop makro" w protokole; do użytku w Zeiss LSM-780 (w połączeniu z Zen)</td></tr> <tr><td>Obiektyw W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0,17 M27 75 mm</td><td>Zeiss</td><td>421452-9880-000</td><td>do użytku z Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser</td><td>Coherent</td><td></td><td>nazwany w protokole "laserem impulsowym o dużej mocy"</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Trietanoloamina (TEOA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td>łatwopalny; działa drażniąco na skórę i oczy; praca z w dygestoriach</td></tr><tr><td>Sód wodorotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>150 ml Próżniowe kubki filtracyjne z 0,2 i mikro; m Membrana PES</td><td>VWR</td><td>10040-460</td><td></td></tr><tr><td>PEGDA</td><td>syntetyzowana we własnym zakresie</td><td></td><td>Metody syntezy można znaleźć w źródle 33; przechowywać pod argonem</td></tr><tr><td>Eozyna Y sól disodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>1-winylo-2-pirolidynon (NVP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3409-5G</td><td>przechowywać w atmosferze argonu; rakotwórcze; praca z w dygestoriach</td></tr><tr><td>3M Podwójnie powlekana taśma, 9500 sztuk, 6,0 mil</td><td>Thomas Goldkamp</td><td>37728</td><td></td></tr><tr><td>Flexmark 90 PFW Liner</td><td>FLEXcon</td><td>FLX000620</td><td>nośnik do obsługi podwójnie powlekanej taśmy</td></tr><tr><td>Model SC Ploter (obcinarka do kleju)</td><td>USCutter</td><td>SC631E</td><td>służy do cięcia kleju w kształcie pierścienia do łączenia szkiełek nakrywkowych z szalkami Petriego</td></tr><tr><td>Szalka Petriego 60 mm z otworem 20 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P60-20-F-NON</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz o wysokiej intensywności (źródło światła białego)</td><td>Fiber-Lite</td><td>4715MS-12WB10</td><td></td></tr><tr><td>Miernik mocy</td><td>Newport</td><td>1916-R</td><td>wykrywa moc przy 524 nm podczas korzystania ze źródła światła białego</td></tr><tr><td>Wąska matryca Wykrywacz różdżek</td><td>Newport</td><td>918D-ST</td><td>do użytku z miernikiem mocy</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>używany do produkcji form PDMS; Zapoznaj się ze źródłem 7, aby zapoznać się z metodami</td></tr><tr><td>Formowane TMPSA #1.5 Szkiełka nakrywkowe, 40 mm okrągłe</td><td>syntetyzowane we własnym zakresie</td><td></td>, <td>patrz źródło 7 dla metod</td></tr><tr><td>Dekstran, Fluoresceina, 2 000 000 MW, Anionowa, Lizyna Fixable</td><td>Life Technologies</td><td>D7137</td><td>może używać alternatywnego oznaczonego dekstransu; 2,000 kDa nie dyfunduje łatwo do 5% 3,4 kDa hydrożel PEGDA</td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka, Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Acrodisc, 0,2 i mikro; m Membrana Supor, o niskim poziomie wiązania białek</td><td>Pall</td><td>PN 4602</td><td></td></tr><tr><td>sticky-Slide VI0,4&nbsp; </td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>urządzenia mikroprzepływowe, które mogą być używane do przechowywania hydrożeli</td></tr></tbody></table>

sterowane obrazem, laserowe wytwarzanie sieci mikroprzepływowych pochodzenia naczyniowego

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Ten szczegółowy protokół opisuje implementację sterowanej obrazem, laserowej degradacji hydrożelu do produkcji sieci mikroprzepływowych pochodzenia naczyniowego osadzonych w hydrożelach PEGDA. W tym miejscu opisujemy tworzenie wirtualnych masek, które pozwalają na sterowanie laserem sterowane obrazem; fotopolimeryzacja mikroformowanego hydrożelu PEGDA, odpowiedniego do wytwarzania sieci mikroprzepływowych i przepływu sterowanego ciśnieniem; ustawienie i użycie dostępnego na rynku laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego w połączeniu z femtosekundowym impulsowym laserem Ti:S w celu wywołania degradacji hydrożelu; oraz obrazowanie wytworzonych sieci mikroprzepływowych przy użyciu form fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej. Znaczna część protokołu koncentruje się na prawidłowej konfiguracji i implementacji oprogramowania mikroskopu i mikroskopu makro, ponieważ są to kluczowe kroki w użyciu komercyjnego mikroskopu do celów produkcji mikroprzepływowej, która zawiera szereg zawiłości. Komponent sterowany obrazem tej techniki pozwala na implementację stosów obrazów 3D lub modeli 3D generowanych przez użytkownika, umożliwiając w ten sposób kreatywne projektowanie mikroprzepływowe i wytwarzanie złożonych układów mikroprzepływowych o praktycznie dowolnej konfiguracji. Metody opisane w niniejszym protokole, mające oczekiwany wpływ na inżynierię tkankową, mogą pomóc w wytwarzaniu zaawansowanych biomimetycznych konstruktów mikrotkanek dla urządzeń narządowych i urządzeń typu human-on-a-chip. Naśladując złożoną architekturę, krętość, rozmiar i gęstość naczyń krwionośnych in vivo, można odtworzyć w tych konstruktach podstawowe procesy transportu biologicznego, co prowadzi do dokładniejszego modelowania in vitro farmakokinetyki leków i choroby.

Aby zademonstrować implementację sterowanej obrazem, laserowej degradacji hydrożelu w celu wytworzenia trójwymiarowej sieci mikroprzepływowej pochodzenia naczyniowego, wykorzystano stos obrazów 3D unaczynienia mózgu myszy, uzyskany za pomocą mikroskopii skanującej z ostrzem noża (KESM)26,27. Wybrany obszar 3D z większego zbioru danych mikro naczyniowych przekształcono w serię wirtualnych masek do sterowanego obrazem formowania sieci mikroprzepływowej, zgodnie z powyższym opisem. Po wykonaniu, powstałą sieć mikroprzepływową przepłukano roztworem dekstranu 2 0 kDa znakowanego FITC i obrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Stos obrazów unaczynienia in vivo, który definiował architekturę sieci (Rycina 1A i C), oraz wykonana sieć mikroprzepływowa (Rycina 1B i D) posłużyły do wygenerowania projekcji Z (Rycina 1A i B) oraz renderingów 3D (Rycina 1C i D). Porównanie obrazów wykazuje, że sterowana obrazem, laserowa degradacja hydrożelu umożliwia wykonanie biomimetycznych sieci mikroprzepływowych 3D, które odtwarzają rozmiar, krętość i złożoną architekturę unaczynienia in vivo. Technika ta nadaje się do wytwarzania sieci o szerokim zakresie średnic; na Rycynie 1 wygenerowano kanały o średnicach od 3,3 do 28,8 µm. Należy zauważyć, że większa prostokątna struktura w lewym górnym rogu Ryciny 1B oraz w lewym rogu Ryciny 1D stanowi kanał wlotowy służący do wprowadzenia przepływu do sieci.
<img alt="Układ naczyniowy in vivo a sieć mikrofluidyczna, projekcja Z i renderowanie 3D, analiza mikroskopowa." src="/files/ftp_upload/55101/55101fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Mikrofluidyczna sieć pochodzenia naczyniowego. Seria masek wirtualnych, pochodnych ze stosu obrazów naczyń krwionośnych mózgu myszy (A i C), wykorzystano do stworzenia biomimetycznej trójwymiarowej sieci mikrofluidycznej osadzonej w hydrożelu PEGDA (B i D) poprzez laserową degradację pod kontrolą obrazowania. Sieć mikroprzepływową przemyto dekstranem znakowanym FITC o masie 2 0 kDa i obrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Projekcje Z (A i B) oraz renderowania 3D (C i D) z tych dwóch sieci wykazują zdolność do generowania sieci mikroprzepływowych, które odwzorowują gęstość, organizację i ogólną architekturę in vivo układ naczyniowy. Strzałka (D) oznacza prostokątny wlot wykonany w celu wprowadzenia dekstranu. Pasek skali reprezentuje 50 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
W celu zainicjowania przepływu płynu w tych zatopionych sieciach mikroprzepływowych zastosowaliśmy dwie metody: słupy cieczy oraz pompy strzykawkowe. Przykładowo, w celu połączenia dwóch studni w mikroformowanym hydrożelu PEGDA wykonano prostokątny kanał o wymiarach 30 na 30 µm (Rycyna 2A), a przepływ płynu był wymuszany przez słup cieczy7. Słup cieczy wytworzony w lewej studni indukował przepływ przez mikrokanał do studni po prawej stronie. Na Rycynie 2A, przy użyciu mikroskopii poklatkowej, zaobserwowano początkowy front dekstranu o masie 70 kDa znakowanego tetrametylorodaminą (TRITC) przemieszczający się przez kanał. Następnie, na Rycynie 2B, fluorescencyjna kula polistyrenowa o średnicy 10 µm przepłynęła z lewej studni, przez kanał, do studni po prawej stronie. Ponieważ czas trwania przepływu jest kontrolowany przez objętość płynu znajdującego się w mikroformowanej studni wlotowej, a szybkość przepływu jest regulowana przez gradient hydrostatyczny wytworzony między studnią wlotową a wylotową, przepływ wymuszony słupem cieczy w mikroformowanych hydrożelach stanowi prostą metodę indukcji przepływu, która nie wymaga zewnętrznej obudowy ani pompy strzykawkowej.
<img alt="Proces dyfuzji, dekstran 70 kDa i sfera 10 µm; obrazy z mikroskopii poklatkowej, analiza transportu." src="/files/ftp_upload/55101/55101fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przepływ napędzany ciśnieniem w mikrowytłoczonym hydrożelu PEGDA. PEGDA poddano mikroformowaniu w celu wytworzenia hydrożelu zawierającego dwie studzienki połączone wbudowanym mikrokanałem. W lewej studzience wytworzono ciśnienie hydrostatyczne, aby zainicjować przepływ dekstranu o masie 70 kDa, znakowanego TRITC (A1-A3) i 10-µm kulka polistyrenowa (B1-B3) przez 30 na 30 µm prostokątny kanał łączący jeden dołek z drugim. Pasek skali przedstawia 50 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Alternatywnie, aby uzyskać stały przepływ cieczy w sieciach mikrofluidycznych, można zainicjować przepływ sterowany pompą strzykawkową poprzez fotopolimeryzację hydrożelu wewnątrz drugiego urządzenia mikrofluidycznego z portami wlotowymi i wylotowymi do interfejsu pompy strzykawkowej. Na Rysunku 3A przedstawiono dostępny komercyjnie, prefabrykowany układ mikrofluidyczny z 1-mm pasmem hydrożelu sfotopolimeryzowanym na całej szerokości urządzenia7. Degradacja laserowa została zastosowana do wytworzenia kanałów i sieci mikrofluidycznych w hydrożelach osadzonych w urządzeniach, zgodnie z tym samym protokołem, który opisano tutaj dla wolnostojących hydrożeli. Przepływ generowany przez pompę strzykawkową widoczny jest na Rysunku 3B, gdzie w hydrożelu umieszczonym w urządzeniu mikrofluidycznym wytworzono cylindryczny kanał o średnicy 20-µm. W tym kanale o średnicy 20-µm poszczególne fluorescencyjne sfery polistyrenowe o średnicy 2-µm są łatwo rozróżnialne przy braku przepływu cieczy (Rysunek 3B1), natomiast przy zastosowaniu natężenia przepływu 5 µL/s sfery poruszają się przez pole widzenia, co objawia się powstawaniem smug (Rysunek 3B2). Tę samą metodę zastosowano do wywołania przepływu przez dwuwymiarową sieć pochodzenia naczyniowego w celu monitorowania przepływu znakowanego TRITC dekstranu o masie 65 kDa przez sieć oraz jego dyfuzji do otaczającego hydrożelu (Rysunek 3C).
<img alt="Układ mikroprzepływowy; wyniki mikroskopii fluorescencyjnej; przepływ cząstek przy 0 i 5 μL/s; poklatkowo." src="/files/ftp_upload/55101/55101fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przepływ wymuszony pompą strzykawkową w hydrożelach PEGDA spolimeryzowanych w obudowach mikrofluidycznych. komercyjnie dostępny, prefabrykowany układ mikrofluidyczny (A) z mikrokanałem o wymiarach 17 x 3,8 x 0,53 mm (x,y,z) zawiera fotopolimeryzowany hydrożel PEGDA o wymiarach 1 x 3,8 x 0,53 mm (x,y,z), wskazany czarną strzałką. 20-µm średnica kanału cylindrycznego uległa degradacji w obrębie hydrożelu, a 2-µm przez urządzenie przepompowano sfery polistyrenowe (B). Sfery są wyraźnie rozdzielone przy braku przepływu płynu (B1), lecz przy natężeniu przepływu wynoszącym 5 µL/s (B2). W innym hydrożelu osłonowym wytworzono dwuwymiarową sieć pochodzenia naczyniowego, przez którą pompowano dekstran o masie 65 kDa znakowany TRITC (C). Do monitorowania fluorescencyjnego dekstranu podczas wypełniania kanałów i dyfundowania do otaczającego hydrożelu zastosowano mikroskopię poklatkową. Białe strzałki na (B) i (C) wskazują kierunek przepływu cieczy. Pasek kalibracyjny w (C) wskazuje intensywność fluorescencji dekstranu. Paski skali reprezentują 20 µm w (B1) oraz (B2) i 50 µm w (C). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje implementację sterowanej obrazem, laserowej degradacji hydrożelu do wytwarzania naczyniowych, biomimetycznych sieci mikroprzepływowych osadzonych w hydrożelach diakrylanowych z poli(glikolu etylenowego) (PEGDA). Te biomimetyczne systemy mikroprzepływowe mogą być przydatne w zastosowaniach inżynierii tkankowej, generowaniu modeli chorób in vitro i wytwarzaniu zaawansowanych urządzeń "na chipie".

Sterowane obrazem, laserowe wytwarzanie sieci mikroprzepływowych pochodzenia naczyniowego

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser impulsowy femtosekundowy do generowania trójwymiarowych biomimetycznych sieci mikrofluidycznych pochodzenia naczyniowego, osadzonych w hydrożelach polietylenoglikolu diakrylanu, z wykorzystaniem degradacji laserowej sterowanej obrazem. Istotną zaletą tej techniki jest możliwość tworzenia trójwymiarowych biomimetycznych sieci mikrofluidycznych, które w konstrukcjach syntetycznych dokładnie odtwarzają gęstość, krętość, zakres wielkości oraz ogólną architekturę naczyń krwionośnych in vivo. To podejście do wytwarzania układów mikrofluidycznych zwiększy nasze możliwości tworzenia konstruktów z inżynierii tkankowej bardziej przypominających warunki in vivo, biomimetycznych modeli chorób oraz urządzeń typu on-a-chip o ultrawysokiej gęstości.Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ prawidłowa konfiguracja i wdrożenie oprogramowania mikroskopu nie są intuicyjne, a stanowią niezbędny element tworzenia pożądanych sieci mikrofluidycznych. Wiele kroków przygotowawczych zostało opisanych w protokole tekstowym, w tym generowanie masek wirtualnych, konfiguracja mikroskopu oraz przesyłanie masek wirtualnych do oprogramowania mikroskopu. Aby przeprowadzić fotopolimeryzację hydrożelu PEGDA, należy najpierw przymocować pierścień dwustronnej taśmy klejącej do 60 milimetrowej szalki Petriego, w której dnie wycięto otwór o średnicy 20 milimetrów.Następnie, w dygestorium, należy dodać 1 ml HBS z TEOA do bursztynowej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml, zakrytej folią. Następnie do probówki należy dodać 10 µL 1 mM soli dwusodowej Eozyny Y. Teraz, za pomocą pipety szklanej, należy nalać niewielką objętość NVP do zlewki szklanej.Z tej objętości pobierz 3,5 µL NVP i przenieś do mieszaniny. Następnie dodaj 10 mg PEGDA o masie 3,4 kDa do drugiej probówki przykrytej folią. Następnie dodaj 0,2 mL mieszaniny, aby przygotować 5% (w/v) roztwór prepolimeru PEGDA.Następnie mieszaj roztwór prepolimeru w wirówce typu vortex aż do całkowitego rozpuszczenia PEGDA. Potem pipetuj 60 µL na formę z PDMS, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Teraz wycentruj akrylowaną szklaną lamellkę nr 1,5 o średnicy 40 mm nad roztworem na dystansach z PDMS.Następnie umieść zespół pod białym źródłem światła skalibrowanym do dostarczania mocy 95 mW. Utwardzaj polimer przez trzy minuty. Następnie wprowadź wodę destylowaną pomiędzy formę a szkiełko nakrywkowe, aby oddzielić hydrożel od PDMS, i wypłucz hydrożel.Następnie ostrożnie osusz krawędzie szkiełka nakrywkowego, uważając, aby nie odsysać wody z hydrożelu. Teraz przytwierdź szkiełko nakrywkowe do przygotowanej szalki Petriego. Delikatny docisk ułatwia ten proces.Następnie zanurz hydrożel w wodzie destylowanej. Skonfiguruj konfokalny mikroskop skaningowy zgodnie z opisem w protokole tekstowym i uruchom go w konfiguracji wizualizacji hydrożelu. Następnie dopasuj hydrożel i szalkę Petriego do wkładki stolika i umieść je na stoliku.Następnie wypełnij szalkę Petriego co najmniej pięcioma mililitrami wody destylowanej i opuść obiektyw imersyjny tuż nad hydrożel, nie dotykając go. Teraz kliknij „live”, aby włączyć linię lasera argonowego. Następnie ustaw ostrość na hydrożelu, aż sygnał Eozyny Y stanie się widoczny na górnej stronie hydrożelu.Aby ułatwić zlokalizowanie hydrożelu, należy spróbować tymczasowo zwiększyć moc procentową lub rozmiar otworu (pinhole). Należy zaznaczyć położenie górnej i dolnej krawędzi hydrożelu oraz dna studzienki. Następnie za pomocą dżojstika należy przesuwać się poprzecznie, aby odnaleźć krawędzie studzienki.W oknie ustawiania ostrości obniż płaszczyznę ogniskowania o 150 mikronów w głąb hydrożelu, korzystając ze strzałki w dół obok pola pozycji Z. Następny krok jest krytyczny. Wyzeruj położenie X i Y w oknie sterowania stolikiem, a następnie usuń wszystkie pozostałe zaznaczone lokalizacje i zaznacz jedynie lokalizację wyzerowaną.Aby rozpocząć proces tworzenia kanału wlotowego, należy najpierw wykonać zdjęcie, a następnie za pomocą przycisku prostokąta w oknie obszarów (regions) obrysować region, który będzie stanowić wlot do sieci naczyniowej. Następnie należy przejść do konfiguracji tworzenia kanału. Szczegółowe informacje znajdują się w protokole tekstowym.Po przejściu do okna stosu Z (Z stack), kliknij przyciski wyśrodkowania na górze oraz nad polem offset, aby wycentrować stos Z w aktualnej pozycji. Następnie, w zależności od wymaganej wielkości wlotu, ustaw liczbę plastrów (slices) z interwałem wynoszącym jeden. Teraz sprawdź, czy prędkość jest ustawiona na trzy, a moc procentowa na 100%.Następnie należy zapisać konfigurację i kliknąć przycisk start experiment. Aby zwizualizować hydrożel podczas degradacji kanału, należy zwiększyć gain master w oknie kanałów, jeśli obszar w polu widzenia jest czarny, lub zmniejszyć gain master, jeśli obszar jest biały. Po zakończeniu degradacji należy upewnić się, że wlot został utworzony, wracając do konfiguracji wizualizacji hydrożelu i klikając live.Najpierw, w oknie obszarów (regions), wczytaj dowolny plik ovl ze stosu Z wirtualnych masek i kliknij przycisk strzałki, aby wyświetlić ROI w polu widzenia. Następnie kliknij live, aby przeskanować konfigurację wizualizacji hydrożelu i użyj joysticka lub okna stolika, aby ustawić hydrożel tak, aby wlot łączył się z właściwym miejscem w sieci naczyniowej. W kolejnym kroku obniż płaszczyznę ostrości do pierwszej pozycji w makrze mikroskopu, która znajduje się 50 µm poniżej poprzedniej wycentrowanej lokalizacji Z, korzystając z rozmiaru kroku w oknie ostrości i klikając strzałkę w dół.Ponownie, krytyczne jest teraz ponowne wyzerowanie pozycji X i Y, usunięcie wszystkich innych zaznaczonych pozycji i oznaczenie tylko tej pozycji jako nowego punktu zero. Należy upewnić się, że nowa konfiguracja została zapisana. Teraz w konfiguracji formowania kanałów należy wybrać wyłącznie okna serii czasowej i blaknięcia.Następnie otwórz makro i wybierz kartę zapisu. Wybierz wcześniej utworzony przepis i kliknij zastosuj. Należy upewnić się, że nie kliknięto przycisku zapisz, w przeciwnym razie przepis zostanie nadpisany.Po zweryfikowaniu ustawień ponownie zapisz konfigurację formowania kanałów, a następnie kliknij update w makrze mikroskopu. Kliknij no, aby nadpisać aktualną listę lokalizacji, a następnie kliknij start w makrze mikroskopu, aby rozpocząć procedurę. Po zakończeniu procesu degradacji użyj konfiguracji wizualizacji hydrożelu przy niższej mocy lasera, aby umożliwić obserwację dekstranu znakowanego FITC, który wykazuje silniejszy sygnał niż natywny sygnał Eozyny Y hydrożelu.Przed wprowadzeniem znakowanego fluorescencyjnie dekstranu, należy odssać nadmiar wody z dołka w hydrożelu. Następnie za pomocą pipety należy nanieść 10 µL przefiltrowanego dekstranu znakowanego FITC. Opisana procedura została wykorzystana do przekształcenia dużej liczby obrazów mikro naczyniowych w serię wirtualnych masek służących do tworzenia mikrofluidycznych sieci pod kontrolą obrazowania.Powstałą sieć mikrofluidyczną porównano z naczyniami krwionośnymi in vivo, na których została ona oparta. Degradacja hydrożelu za pomocą lasera sterowanego obrazowaniem umożliwiła wykonanie biomimetycznych sieci mikrofluidycznych 3D, które odtwarzają rozmiar, krętość i złożoną architekturę naczyń krwionośnych in vivo. Do zainicjowania przepływu cieczy w tych osadzonych sieciach mikrofluidycznych wykorzystano zarówno słupy ciśnienia, jak i pompy strzykawkowe.Obserwowano ruch fluorescencyjnie znakowanego dekstranu o masie 70 kilodalton oraz kulek polistyrenowych o średnicy 10 micron z lewej strony na prawą, wywołany przepływem indukowanym przez ciśnienie hydrostatyczne. Alternatywnie, przepływ sterowany pompą strzykawkową zainicjowano poprzez fotopolimeryzację hydrożelu wewnątrz wtórnego urządzenia mikrofluidycznego. Stosując ten sam opisany tutaj protokół, wdrożono następnie degradację laserową w celu wytworzenia 2D sieci pochodzenia naczyniowego w osadzonym hydrożelu dla przepływu sterowanego pompą strzykawkową i perfuzji dekstranu o masie 65 kilodalton.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak używać konfokalnego mikroskopu skaningowego wyposażonego w laser femtosekundowy do generowania biomimetycznych sieci mikrofluidycznych przy użyciu degradacji hydrożelu indukowanej laserem pod kontrolą obrazu. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że parametry lasera, w tym moc, długość fali i prędkość skanowania, muszą zostać dostosowane i zoptymalizowane w zależności od składu degradowanego hydrożelu.Dziękujemy i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

image-guided-laser-based-fabrication-vascular-derived-microfluidic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Platforma mikrokanałów na chipie została opracowana przez połączenie techniki fotorezystu fotolitografii rozpływowej, miękkiej litografii i mikrofluidyki. Platforma mikrokanalizacyjna naśladuje trójwymiarową (3D) geometrię mikronaczyń in vivo, działa w kontrolowanym ciągłym przepływie perfuzyjnym, umożliwia wysokiej jakości obrazowanie w czasie rzeczywistym i może być stosowana do badań mikronaczyniowych.

Procedura opracowywania wielogłębokościowych, okrągłych, śródbłonkowych mikrokanałów o przekroju międzybłonkowym na chipie

Prezentujemy metodę mikroprzepływowego osadzania wzorzystej genipiny i fibronektyny na podłożach PDMS, pozwalając na przedłużoną żywotność tkanek gęstych od komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Ta metoda wytwarzania tkanek jest połączona z poprzednią technologią cienkich warstw naczyń mięśniowych w celu pomiaru kurczliwości naczyń w czasie istotnym dla choroby.

Technika mikroprzepływowego osadzania genipiny do rozszerzonej hodowli cienkich warstw mięśniowych naczyń krwionośnych

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.

Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

Protokół opisuje, jak zaprojektować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie. Mikrośrodowisko otaczające sferoidę jest zaprojektowane tak, aby indukować angiogenezę i łączyć sferoidę z mikrokanałami w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda pozwala na perfuzję sferoidy, co jest długo oczekiwaną techniką w kulturach trójwymiarowych.

Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

Zmodyfikowane tkanki w dużym stopniu polegają na odpowiednich sieciach naczyniowych, które dostarczają niezbędnych składników odżywczych i gazów oraz usuwają odpady metaboliczne. W tej pracy protokół stopniowego wysiewu komórek śródbłonka i komórek podporowych tworzy wysoce zorganizowane sieci naczyniowe na wysokoprzepustowej platformie do badania rozwijającego się zachowania naczyń w kontrolowanym środowisku 3D.

Stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych

W tym protokole, do badania interakcji między komórkami leukocytów w chorobie zapalnej stosuje się biomimetyczne badanie mikropłynów, które może odtworzyć fizjologicznie istotne środowisko mikrokrążenia i odtworzyć całą kaskadę adhezji/migracji leukocytów.

System mikrofizjologiczny do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka podczas stanu zapalnego

Zaprojektowane klapy wymagają wbudowanej funkcjonalnej sieci naczyniowej. W tym protokole przedstawiamy metodę wytwarzania wydrukowanego w 3D płata tkankowego zawierającego hierarchiczną sieć naczyniową i jej bezpośrednie zespolenia mikrochirurgiczne z tętnicą udową szczura.

Wytwarzanie zaprojektowanych płatów naczyniowych przy użyciu technologii druku 3D

Ten protokół przedstawia fizjologicznie istotny model guza na chipie do przeprowadzenia wysokoprzepustowych podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem u ludzi, postępu w badaniach przesiewowych leków, modelowania chorób i spersonalizowanych podejść medycznych z opisem procedur ładowania, konserwacji i oceny.

Ustanowienie fizjologicznego unaczynionego modelu mikroguza człowieka do badań nad rakiem

W tym miejscu przedstawiamy protokół budowy systemu narządów na chipie (OOC) mającego naśladować pneumonektomię. System ten bada potencjalną korelację między upośledzeniem glikokaliksu a powikłaniami po pneumonektomii.

Modelowanie glikokaliksu śródbłonka po pneumonektomii w chipie fluidycznym 3D - podejście do wytwarzania systemu narządów na chipie opartych na naczyniach krwionośnych

Poznaj metodę laserowej degradacji hydrogelu PEGDA sterowaną obrazem do tworzenia biomimetycznych sieci mikroprzepływowych naśladujących naczynia krwionośne. Technika ta umożliwia precyzyjną fabrykację trójwymiarowych struktur dla inżynierii tkankowej i modelowania chorób.

Sterowane obrazem, laserowe wytwarzanie sieci mikroprzepływowych pochodzenia naczyniowego

Przeglądaj więcej filmów