Sterowane obrazem, laserowe wytwarzanie sieci mikroprzepływowych pochodzenia naczyniowego
3 stycznia 2017
Ten protokół opisuje implementację sterowanej obrazem, laserowej degradacji hydrożelu do wytwarzania naczyniowych, biomimetycznych sieci mikroprzepływowych osadzonych w hydrożelach diakrylanowych z poli(glikolu etylenowego) (PEGDA). Te biomimetyczne systemy mikroprzepływowe mogą być przydatne w zastosowaniach inżynierii tkankowej, generowaniu modeli chorób in vitro i wytwarzaniu zaawansowanych urządzeń "na chipie".
Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania mikroskopu konfokalnego wyposażonego w femtosekundowy laser impulsowy do generowania trójwymiarowych, biomimetycznych sieci mikroprzepływowych pochodzących z naczyń krwionośnych osadzonych w hydrożelach diakrylanowych glikolu polietylenowego przy użyciu degradacji opartej na laserze sterowanym obrazem. Istotną zaletą tej techniki jest możliwość generowania trójwymiarowych biomimetycznych sieci mikroprzepływowych, które dokładnie odwzorowują gęstość, krętość, zakres rozmiarów i ogólną architekturę układu naczyniowego in vivo w syntetycznych konstruktach. To podejście oparte na wytwarzaniu mikroprzepływowym zwiększy naszą zdolność do generowania większej liczby in vivo, takich jak konstrukty inżynierii tkankowej, modele chorób biomimetycznych i urządzenia o ultra wysokiej gęstości na chipie.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ prawidłowa konfiguracja i implementacja oprogramowania mikroskopu nie jest intuicyjna, ale ma kluczowe znaczenie w tworzeniu pożądanych sieci mikroprzepływowych. Wiele kroków przygotowawczych jest omówionych w protokole tekstowym, w tym generowanie wirtualnych masek, konfiguracja mikroskopu i przesyłanie wirtualnych masek do oprogramowania mikroskopu. Aby fotopolimeryzować hydrożel PEGDA, najpierw przymocuj pierścień dwustronnego kleju do 60-milimetrowej szalki Petriego, która ma 20-milimetrowy otwór wycięty w dnie.
Następnie w dygestorium dodaj jeden mililitr HBS z TEOA do pokrytej folią dwumililitrowej bursztynowej probówki wirówkowej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów jednomilimolowej soli disodowej eozyny Y do probówki. Teraz odpipetuj niewielką objętość NVP do szklanej zlewki za pomocą szklanej pipety.
Z tej objętości weź 3,5 mikrolitra NVP i przenieś go do mieszaniny. Następnie dodaj 10 miligramów 3,4 kilodaltonowego PEGDA do drugiej tubki pokrytej folią. Następnie dodaj 0,2 mililitra mieszaniny, aby uzyskać 5% wagowy roztwór prepolimeru PEGDA.
Teraz wiruj roztwór prepolimeru, aż PEGDA całkowicie się rozpuści. Następnie pipetować 60 mikrolitrów na formę PDMS bez wprowadzania żadnych pęcherzyków. Teraz wyśrodkuj akrylowe szkiełko nakrywkowe o grubości 40 milimetrów i średnicy 1,5 nad roztworem na przekładkach PDMS.
Następnie umieść zespół pod białym źródłem światła skalibrowanym na dostarczanie 95 miliwatów. Utwardzaj polimer przez trzy minuty. Następnie przelej wodę destylowaną między formę a szkiełko nakrywkowe, aby oddzielić hydrożel od PDMS i spłukać hydrożel.
Następnie ostrożnie osusz krawędzie szkiełka nakrywkowego, nie odprowadzając wody z hydrożelu. Teraz przyklej szkiełko nakrywkowe do przygotowanej szalki Petriego. Pomaga odrobina nacisku.
Następnie zanurz hydrożel w wodzie destylowanej. Ustaw laserowy skaningowy mikroskop konfokalny zgodnie z opisem w protokole tekstowym i rozpocznij konfigurację wizualizacji hydrożelowej. Następnie dopasuj hydrożel i szalkę Petriego do wkładki scenicznej i umieść ją na stoliku.
Następnie napełnij szalkę Petriego co najmniej pięcioma mililitrami wody destylowanej i opuść obiektyw zanurzenia w wodzie tuż nad hydrożelem, nie wchodząc z nim w kontakt. Teraz kliknij na żywo, aby włączyć linię lasera argonowego. Następnie skup się na hydrożelu, aż sygnał Eozyny Y będzie widoczny na górnej stronie hydrożelu.
Aby pomóc w znalezieniu hydrożelu, spróbuj tymczasowo zwiększyć procentową moc lub rozmiar otworu. Zaznacz położenie górnej i dolnej części hydrożelu oraz dna studni. Następnie użyj joysticka, aby poruszać się w poprzek i znajdź krawędzie studni.
W oknie ostrości upuść płaszczyznę ostrości o 150 mikronów w dół hydrożelu za pomocą strzałki w dół obok pola pozycji Z. Następny krok ma kluczowe znaczenie. Wyzeruj położenie X i Y w oknie stołu montażowego, a następnie usuń wszystkie inne zaznaczone lokalizacje i zaznacz tylko wyzerowane położenie.
Teraz, aby rozpocząć proces tworzenia kanału wlotowego, najpierw przyciągnij obraz, a następnie za pomocą przycisku prostokąta w oknie regionów obrysuj region, który będzie wlotem do sieci naczyniowej. Następnie przejdź do konfiguracji tworzenia kanałów. Szczegóły znajdują się w protokole tekstowym.
Tam w oknie stosu Z kliknij środkowe przyciski u góry i powyżej przesunięcia, aby wyśrodkować stos Z w bieżącej pozycji. Następnie, w zależności od tego, jak duży ma być wlot, ustaw liczbę plasterków w odstępie jeden. Teraz sprawdź, czy prędkość jest ustawiona na trzy, a procent mocy jest ustawiony na 100.
Następnie kontynuuj zapisywanie konfiguracji i kliknij przycisk rozpocznij eksperyment. Aby zobrazować hydrożel podczas degradacji kanału, zwiększ wzmocnienie główne w oknie kanałów, jeśli obszar w polu widzenia jest, lub zmniejsz wzmocnienie główne, jeśli obszar jest biały. Po degradacji upewnij się, że wlot został utworzony, wracając do konfiguracji wizualizacji hydrożelu i klikając na żywo.
Najpierw w oknie regionów załaduj dowolny plik ovl ze stosu wirtualnych masek Z i kliknij przycisk strzałki, aby zobaczyć ROI w polu view. Następnie kliknij na żywo, aby zeskanować konfigurację wizualizacji hydrożelu i użyj joysticka lub okna stolika, aby ustawić hydrożel tak, aby wlot łączył się z właściwym miejscem w sieci naczyniowej. Następnie upuść płaszczyznę ostrości do pierwszej pozycji w mikroskopie makro, która znajduje się o 50 mikronów w dół od poprzedniego wyśrodkowanego położenia Z, używając rozmiaru kroku w oknie ostrości i klikając strzałkę w dół.
Ponownie ważne jest, aby ponownie wyzerować lokalizacje X i Y, usunąć wszystkie inne oznaczone lokalizacje i oznaczyć tylko tę lokalizację jako nowy punkt zerowy. Pamiętaj, aby zapisać tę nową konfigurację. Teraz w konfiguracji tworzenia kanału wybierz tylko szeregi czasowe i okna wybielania.
Następnie otwórz makro i wybierz zakładkę zapisywania. Wybierz wcześniej wykonany przepis i kliknij zastosuj. Pamiętaj, aby nie kliknąć sklepu, w przeciwnym razie przepis zostanie nadpisany.
Po zweryfikowaniu ustawień ponownie zapisz konfigurację tworzenia kanałów, a następnie kliknij przycisk Aktualizuj w makrze mikroskopu. Kliknij przycisk nie, aby zastąpić bieżącą listę lokalizacji, a następnie kliknij przycisk start w makrze mikroskopu, aby rozpocząć przepis. Po zakończeniu procesu degradacji należy użyć konfiguracji wizualizacji hydrożelu przy niższej mocy lasera, aby umożliwić oglądanie dekstranu znakowanego FITC, który ma jaśniejszy sygnał niż natywny sygnał Eozyny Y hydrożelu.
Przed wprowadzeniem znakowanego fluorescencyjnie dekstranu należy pobrać trochę wody ze studni do hydrożelu. Następnie odpipetować 10 mikrolitrów przefiltrowanego dekstranu znakowanego FITC. Opisana procedura została wykorzystana do przekształcenia dużej ilości obrazów mikronaczyniowych w serię wirtualnych masek do tworzenia sieci mikroprzepływowych sterowanych obrazem.
Otrzymaną sieć mikroprzepływową porównano z układem naczyniowym in vivo, z którego pochodzi. Sterowana obrazem degradacja hydrożelu na bazie lasera umożliwiła wytworzenie biomimetycznych sieci mikroprzepływowych 3D, które odwzorowują rozmiar, krętość i złożoną architekturę naczyń krwionośnych in vivo. Zarówno głowice ciśnieniowe, jak i pompy strzykawkowe zostały użyte do zainicjowania przepływu płynu w tych wbudowanych sieciach mikroprzepływowych.
Znakowane fluorescencyjnie kulki dekstranu o grubości 70 kilodaltonów i polistyrenu o grubości 10 mikronów poruszały się od lewej do prawej pod wpływem przepływu wywołanego ciśnieniem. Alternatywnie, przepływ napędzany pompą strzykawkową zainicjowano poprzez fotopolimeryzację hydrożelu wewnątrz wtórnego urządzenia mikroprzepływowego. Korzystając z tego samego protokołu, który opisano tutaj, degradacja oparta na laserze została następnie zaimplementowana w celu wytworzenia sieci pochodzącej z naczyń krwionośnych 2D w umieszczonej umieszczonej hydrożelu do przepływu napędzanego pompą strzykawkową i obfitości dekstranu 65 kilodaltonów.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w femtosekundowy laser impulsowy do generowania biomimetycznych sieci mikroprzepływowych za pomocą kontrolowanej obrazem degradacji hydrożelu na bazie lasera. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że parametry lasera, w tym moc, długość fali i prędkość skanowania, muszą być dostosowane i zoptymalizowane w oparciu o degradowaną formułę hydrożelu.
Dziękuję i życzę powodzenia w eksperymentach.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie laserowej degradacji hydrożelu sterowanej obrazowaniem w celu tworzenia biomimetycznych sieci mikroprzepływowych pochodzenia naczyniowego w hydrożelach PEGDA. Technika ta ma na celu usprawnienie inżynierii tkankowej, modelowania chorób in vitro oraz rozwoju zaawansowanych urządzeń typu on-a-chip.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biomateriały
- Inżynieria tkankowa
Wstęp
- Sieci mikrofluidyczne mogą naśladować naczynia krwionośne in vivo.
- Hydrożele PEGDA są powszechnie stosowane w inżynierii tkankowej.
- Techniki sterowane obrazowaniem zwiększają precyzję wytwarzania układów mikrofluidycznych.
- Mikroskopia konfokalna jest niezbędna do wizualizacji struktur hydrożelowych.
Cel badania
- W celu wytworzenia biomimetycznych sieci mikroprzepływowych, które replikują architekturę naczyniową.
- W celu usprawnienia rozwoju konstruktów inżynierii tkankowej.
- W celu stworzenia modeli in vitro do badania chorób.
Zastosowane metody
- Mikroskopia konfokalna z laserem impulsowym femtosekundowym do degradacji hydrożelu.
- Przygotowanie hydrożelu PEGDA i fotopolimeryzacja.
- Konfiguracja oprogramowania mikroskopu do precyzyjnego obrazowania.
- Tworzenie sieci naczyniowych poprzez kontrolowaną degradację.
Główne wyniki
- Skuteczne utworzenie trójwymiarowych sieci mikroprzepływowych.
- Precyzyjne odwzorowanie gęstości i architektury naczyń.
- Wykazany potencjał w zakresie usprawnionych zastosowań w inżynierii tkankowej.
- Wsparcie wizualne poprawiło konfigurację i wykonanie protokołu.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia niezawodne podejście do wytwarzania struktur biomimetycznych.
- Techniki z prowadzeniem obrazowym są kluczowe dla osiągnięcia pożądanych rezultatów.
- Niniejszy protokół może przyczynić się do postępów w modelowaniu chorób oraz w rozwoju urządzeń typu on-chip.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia wytwarzanie biomimetycznych sieci mikroprzepływowych, które odwzorowują in vivo architekturę naczyniową, co pozwala na dokładniejsze modelowanie in vitro farmakokinetyki leków i mechanizmów chorobowych. Poprzez odtworzenie gęstości, krętości i architektury naczyń w konstrukcjach syntetycznych, metoda ta wspiera rozwój platform typu human-on-a-chip do testów przedklinicznych. Podejście oparte na laserze i prowadzone pod kontrolą obrazowania zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i identyfikacji związków wiodących, zapewniając fizjologicznie relewantne środowiska przepływowe do przesiewania związków i badań mechanistycznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna analiza i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w środowiskach naśladujących naczynia krwionośne, które odwzorowują hemodynamikę i transport masy in vivo.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez umożliwienie obserwacji efektów działania związków w fizjologicznie istotnych warunkach przepływu.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do oddziaływania na cel i modulacji szlaków poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej występującej w statycznych systemach hodowli.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne platformy mikrofluidyczne do ilościowej oceny przepuszczalności związków, dyfuzji oraz odpowiedzi komórkowej w kontrolowanym przepływie.
- Wartość operacyjna: Umożliwia skalowalne przygotowanie sieci pochodzenia naczyniowego do zastosowań w wysokoprzepustowym screeningu w procesach poszukiwania nowych leków.
- Gotowość do analizy: Ułatwia ponowne wykorzystanie platformy w wielu kampaniach badawczych dzięki stabilnej, prowadzonej obrazowo fabrykacji złożonych trójwymiarowych architektur naczyniowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z fazą przedkliniczną poprzez tworzenie istotnych dla danej choroby systemów mikroprzepływowych, które naśladują ludzkie sieci naczyniowe w celu profilowania farmakokinetycznego i farmakodynamicznego.
- Dopasowanie biomarkerów: Wspiera identyfikację i walidację biomarkerów translacyjnych dzięki obrazowaniu w czasie rzeczywistym znaczników fluorescencyjnych i transportu kulek w przepływie wymuszonym ciśnieniem lub pompą.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go) poprzez umożliwienie mechanistycznej redukcji ryzyka terapii celowanych w naczynia krwionośne w konstrukcjach mikrotykankowych przypominających ludzkie.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z continuum odkrywczym, od wczesnej walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną, zapewniając możliwość wielokrotnego tworzenia środowisk mimetycznych dla naczyń krwionośnych, co zwiększa istotność fizjologiczną na wszystkich etapach.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie obserwacji procesów biologicznych w czasie rzeczywistym wewnątrz trójwymiarowych sieci naczyniowych w warunkach przepływu.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy systemy mikrofluidyczne o zestandaryzowanej geometrii i powtarzalnych wzorach degradacji, co zapewnia wiarygodne przesiewanie związków.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty za pomocą fluorescencyjnego dekstranu i śledzenia kulek w celu oceny dynamiki przepływu, przepuszczalności oraz transportu komórkowego w kontrolowanych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy się z walidacją przedkliniczną poprzez replikację ludzkiej architektury naczyniowej w celu lepszego przewidywania zachowania leków in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia konfigurowalny, kierowany obrazem proces wytwarzania, który można dostosować do różnorodnych modeli naczyniowych i planów eksperymentalnych w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną dzięki zastosowaniu fizjologicznie istotnych środowisk płynowych, które ograniczają liczbę wyników fałszywie dodatnich w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki laserowej kontroli wspomaganej obrazowaniem oraz fabricatingowi opartemu na wirtualnych maskach.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego ograniczania ryzyka w przypadku kandydatów celowanych w układ naczyniowy, co redukuje liczbę niepowodzeń na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając danych na temat zachowania związków w ludzkich systemach mikroprzepływowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Pomyślna konfiguracja i wykonanie wymagają wiedzy z zakresu mikroskopii konfokalnej, bezpieczeństwa laserowego oraz fotochemii hydrożeli.
- Metoda jest zależna od wykorzystania skaningowego mikroskopu konfokalnego z możliwością generowania impulsów femtosekundowych oraz kompatybilnego oprogramowania do sterowania za pomocą makr.
- W celu zapewnienia powtarzalności wytwarzania sieci niezbędna jest standaryzacja generowania masek wirtualnych oraz konfiguracji mikroskopu pomiędzy zespołami.
- Zastosowanie protokołu do różnych formulacji hydrożeli lub szablonów naczyniowych wymaga uwzględnienia odpowiednich adaptacji.
- Metoda jest ograniczona koniecznością starannej optymalizacji mocy lasera, długości fali i prędkości skanowania w zależności od składu hydrożelu i progów degradacji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Preparation and Photopolymerization of a PEGDA Hydrogel
3:23
Preparing a Hydrogel for Microfluidic Network Formation via Laser-based Degradation
6:25
Generating and Visualizing the Microfluidic Network
8:40
Results: Comparing Fabricated Networks with Their In Vivo Counterparts and Initiating Fluid Flow
10:05
Conclusion
