Obrazowanie fagosomu neutrofili i cytoplazmy za pomocą ratiometrycznego wskaźnika pH

Ten manuskrypt opisuje prostą metodę pomiaru pH i powierzchni fagosomalnej oraz cytoplazmatycznego pH neutrofili ludzkich i mysich za pomocą wskaźnika ratiometrycznego seminaphthorhodafluor (SNARF)-1 lub S-1. Osiąga się to za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek i analizy obrazu.

Ogólnym celem tej techniki mikroskopii konfokalnej jest zobrazowanie pH i obszaru wakuoli fagocytarnej neutrofili i cytoplazmy. Metoda ta umożliwia monitorowanie i kwantyfikację dynamicznych zmian pH w wakuoli fagocytarnej i cytoplazmie, a także objętości wakuoli fagocytarnej. Pomiary te zmieniają się wraz z aktywnością oksydazy NADPH i mogą być stosowane jako zastępcze markery jej funkcji i przepływów jonów przez błonę wakuoli fagocytarnej.

Główną zaletą tej techniki jest to, że zarówno fagosom, jak i cytoplazma mogą być jednocześnie obrazowane za pomocą barwnika o szerokim zakresie pH. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować podwielokrotność estru sukcynimidylu karboksy-S-1, rozcieńczając 50 mikrogramów w 100 mikrolitrach wysokiej jakości DMSO. Dobrze wymieszaj.

Następnie przygotuj jeden mililitr od jednego razy 10 do ósmego zabitego ciepła lub HK Candida w 0,1 molowym wodorowęglanie sodu w 15 mililitrowej probówce. Dodaj 100 mikrolitrów karboksy-S-1 po jednej kropli na raz do HK Candida, mieszając w wirze z prędkością 2 000 obr./min. Następnie owiń rurkę folią aluminiową i umieść ją na wałku w temperaturze pokojowej na godzinę.

Po godzinie przemyć HKC-S-1 trzykrotnie przez odwirowanie przy 2,250 g przez 10 minut za każdym razem. W przypadku pierwszych dwóch prań ponownie zawiesić osad w 15 mililitrach 0,1-molowego wodorowęglanu sodu. Po trzecim praniu ponownie zawieś go w jednym mililitrze bufora BSS.

Przenieść zawiesinę HKC-S-1 do probówek o pojemności 100 mikrolitrów i przechowywać je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby opsonizować HKC-S-1 dla ludzkich neutrofili, dodaj 100 mikrolitrów ludzkiej surowicy IGG do 100 mikrolitrów rozmrożonego HKC-S-1. Mieszaj na wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 1 1000 obr./min przez 60 do 90 minut, a następnie na wałku w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Następnie przemyć próbkę trzykrotnie w buforze BSS przez odwirowanie w ilości 17 000 g przez jedną minutę każde. Następnie ponownie zawiesić próbkę w 100 mikrolitrach buforu BSS. W przypadku neutrofili krwi obwodowej należy pobrać 15 mililitrów krwi przez nakłucie żyły od zdrowego dawcy i przenieść ją do 20-mililitrowej strzykawki zawierającej 90 mikrolitrów roztworu sodu heparyny w stężeniu 1 000 j.m. na mililitr.

Za pomocą końcówki pipety wstrzyknąć do strzykawki 1,5 mililitra roztworu 10% dekstranu. Odwróć go delikatnie trzy razy, a następnie pozostaw pionowo na ławce na 30 do 60 minut. Po 30 do 60 minutach krew powinna podzielić się mniej więcej na pół, z górną warstwą kożucha w kolorze słomkowym i dolną warstwą zawierającą erytrocyty.

Ostrożnie wypchnij wierzchnią warstwę przez igłę lub usuń ją końcówką pipety, a następnie przenieś ją do 15-mililitrowej probówki i unikaj wyjmowania czerwonej warstwy. Używając pięciomililitrowej pipety, dodaj trzy do czterech mililitrów pożywki o gradiencie gęstości na dno probówki, poniżej warstwy kożuchowego płaszcza, aby uzyskać dwie odrębne warstwy. Następnie odwirować próbkę o masie 900 g przez 10 minut.

Odlewać supernatant i pozostawiać czerwoną osadkę. Następnie delikatnie wiruj, aby zakłócić granulkę. Następnie dodaj siedem mililitrów destylowanej wody autoklalawowanej do granulki i odwróć ją na 20 sekund, aby ponownie zawiesić osad.

Następnie dodaj siedem mililitrów 2x soli fizjologicznej i odwróć ją kilka razy, aby wymieszać, liza pozostałych czerwonych krwinek, a następnie odwirować próbkę w temperaturze 300 razy g przez pięć minut. Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze BSS do około czterech razy od 10 do szóstej na mililitr. W tej procedurze należy wstępnie potraktować ośmiodołkową płytkę mikroskopową 200 mikrolitrami poli-L-lizyny w każdym dołku przez 40 do 60 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć poli-L-lizynę i dwukrotnie umyć studzienki 200 mikrolitrami wody destylowanej.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów przygotowanej zawiesiny komórkowej do każdej studzienki i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez 30 do 60 minut. Następnie przygotuj porcję estru S-1-AM, dodając 100 mikrolitrów wysokiej jakości DMSO do probówki i wiruj do wymieszania. W małej probówce dodaj 1,7 mililitra buforu BSS i 20 mikrolitrów S-1-AM i zwiruj mieszaninę.

Następnie dwukrotnie przemyć studzienki 200 mikrolitrami buforu BSS i zastąpić bufor roztworem S-1-AM. Uważaj, aby nie naruszyć monowarstwy komórek przymocowanej do dna studzienki, delikatnie pipetując płyn w dół ścianki studzienki. Następnie należy inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 25 minut.

Następnie dwukrotnie umyj studzienki 200 mikrolitrami buforu BSS. Aby przetestować inhibitor, należy przygotować główną mieszankę odpowiedniego leku w buforze BSS i dwukrotnie przemyć nią studzienki. Następnie poddaj sonizację opsonizowanemu HKC-S-1 przez około trzy sekundy przy pięciu mikronach i dodaj 10 mikrolitrów do każdej studzienki, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut, przygotowując komórki do obrazowania w celu uzyskania migawek fagocytozy.

Za pomocą mikroskopu konfokalnego dostosuj długość fali lasera tak, aby komórki były wzbudzone na 555 nanometrach, a emisja była wykrywana przez dwa detektory na długości od 560 do 600 nanometrów i ponad 610 nanometrach. Następnie wyświetl komórki za pomocą soczewki zanurzeniowej z olejkiem 63X. Użyj ustawienia skanowania obrazu kafelka w trybie ciągłym, aby wyświetlić środkowy kafelek.

Korzystając z intensywności fluorescencji i wzmocnienia kanałów detektora, dostosuj ostrość i intensywność lasera oraz wzmocnienie dwóch kanałów, aby zoptymalizować obraz. Następnie podziel obraz za pomocą ustawień, aby wyświetlić oba kanały. Przed rozpoczęciem eksperymentu sprawdź, czy nie ma nasycenia intensywnością fluorescencji w cytoplazmie lub wakuolach, które wyglądałyby jak czerwone kropki.

Jeśli tak, zmniejsz intensywność lasera, aby liczba czerwonych kropek była minimalna, ale komórki i fagosomy były wystarczająco jasne i wyraźne, aby je zobaczyć. W tej procedurze otwórz ImageJ i załaduj plik obrazu wybrany do analizy na pasek narzędzi. Aby połączyć te dwa kanały, użyj opcji Obraz, Kolor, a następnie Utwórz kompozyt.

Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać plik do przechowywania wyników. Następnie kliknij narzędzie Linia na pasku narzędzi i kliknij dwukrotnie, aby zwiększyć szerokość do dwóch. Narysuj linię na całej szerokości fagosomu, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zmierzyć pH.

pH cytoplazmatyczne można zmierzyć w ten sam sposób, rysując linię w poprzek cytoplazmy. Po zakończeniu pomiarów kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać Zapisz plik. Aby zmierzyć obszar fagosomu, użyj czwartej ikony wzdłuż paska narzędzi, aby narysować odręcznie wokół obszaru.

Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać Obszar pomiaru. Oto jakościowy klucz wizualny przybliżonego koloru fagosomów barwionych S-1 odpowiadających pH. Żółty kolor wskazuje na większą kwasowość, podczas gdy czerwony wskazuje na większą zasadowość.

To zdjęcie pokazuje neutrofile szpiku myszy pozbawione kanału Hvcn1 20 minut po fagocytozie. Fagosomy są bardzo czerwone, zasadowe i spuchnięte. Czerwona strzałka wskazuje tutaj na wewnątrzkomórkową Candida, podczas gdy ta strzałka wskazuje na zewnątrzkomórkową Candida.

Ten obraz przedstawia neutrofile szpiku kostnego myszy typu dzikiego, które połknęły Candida. Są znacznie mniej zasadowe niż neutrofile z nokautem Hvcn1. To zdjęcie pokazuje ludzkie neutrofile krwi obwodowej w tym samym punkcie czasowym po fagocytozie.

Wydają się nieco bardziej zasadowe niż mysie komórki typu dzikiego, ale fagosomy nadal nie są tak duże i czerwone jak komórki nokautujące Hvcn1, a ten obraz pokazuje ludzkie neutrofile, które fagocytozowały Candidę w obecności pięciu mikromolowych difenylenu jodonium. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około cztery do pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zachowaniu ostrożności podczas izolowania neutrofili, aby nie zostały aktywowane.

Aby określić, czy obserwowany wpływ na zmiany pH wakuolarnego lub cytozolowego lub objętości wakuolarnej jest spowodowany zmianami w wybuchu oddechowym, ten wybuch oddechowy można zmierzyć na inne sposoby, które bezpośrednio mierzą produkcję wolnych rodników lub zużycie tlenu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować ludzkie neutrofile, a następnie wybarwić i zobrazować fagosom i cytoplazmę. Nie zapominaj, że praca z próbkami ludzkiej krwi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i odzieży ochronnej.