Name: Obrazowanie fagosomu neutrofili i cytoplazmy za pomocą ratiometrycznego wskaźnika pH (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Poznaj metodę pomiaru pH fagosomu i cytoplazmy neutrofili ludzkich i mysich przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego SNARF-1. Technika ta wykorzystuje konfokalną mikroskopię fluorescencyjną komórek żywych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Wellcome Trust, Radę Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi oraz Irwin Joffe Memorial Fellowship.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie prace ze zwierzętami były wykonywane z licencją i zgodą brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych. Udział ludzi w tych badaniach został zatwierdzony przez Wspólne Komitety UCL/UCLH ds. Etyki Badań na Ludziach. Wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę.
1. Przygotowanie C. albicans
<ol>
	<li>Wyhoduj krążek Candida (patrz Lista materiałów) na płytce agarowej YPD zgodnie z instrukcjami producenta. Wybierz kolonię i dodaj ją do 15 ml bulionu YPD. Inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C i prędkości 200 obr./min, aż bulion stanie się mętny (zwykle około 2 dni lub do stężenia około 1 x 109/ml).</li>
	<li>Odkręć pożywkę Candida i zawieś ją ponownie w 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wirować przy 3 000 x g przez 10 min. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Umieścić probówkę zawierającą 50 ml pożywki PBS/Candida w łaźni wodnej podgrzanej do 60 °C, tak aby cała probówka była zanurzona na 1 godzinę.
	<ol>
		<li>Aby potwierdzić, że Candida zostały zabite termicznie, należy umieścić próbkę na płytce agarowej YPD i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C. Dostosuj stężenie Candida zabitego termicznie (HK) do 5-9 x 108/ml, w zależności od wzrostu Candida, i przechowuj je w podwielokrotnościach o pojemności 1 ml w zamrażarce o temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Wszystkie zliczenia komórek w tym protokole zostały przeprowadzone przy użyciu automatycznego licznika komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sprzęganie S-1 z Candida zabijanym termicznie (HK)
<ol>
	<li>Przygotować podwielokrotność estru sukcynimidylowego karboksy-S-1 (50 μg), rozcieńczając go w 100 μl wysokojakościowego dimetylosulfotlenku (DMSO). Dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Przygotuj 1 ml 1 x 108 HK Candida w 0,1 M wodorowęglanie sodu (pH 8,3) w probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodaj 100 μl karboksy-S-1 po jednej kropli na raz do HK Candida, mieszając w wirze z prędkością około 2000 obr./min (średnia do wysokiej prędkości). Owiń rurkę folią aluminiową i umieść ją na wałku w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.</li>
	<li>Umyć HK Candida-S-1(HKC-S-1) trzy razy przez odwirowanie przy 2,250 x g przez 10 minut każdy. W przypadku pierwszych dwóch płukań ponownie zawiesić granulki w 15 ml 0,1 M wodorowęglanu sodu (pH 8,3). Po trzecim przemyciu ponownie zawiesić go w 1 ml zbilansowanego roztworu soli (BSS) (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Przenieść zawiesinę HKC-S-1 do probówek w podwielokrotnościach 100 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Jeśli to możliwe, należy używać probówek z materiałem o niskiej zawartości wiązania powierzchniowego, ponieważ cząstki HKC-S-1 mogą przyklejać się do ścianek normalnych probówek wirówkowych.</li>
	<li>Opsonizacja HKC-S-1
	<ol>
		<li>W przypadku neutrofili ludzkich dodać 100 μl ludzkiej surowicy IgG do 100 μl rozmrożonego HKC-S-1.</li>
		<li>W przypadku neutrofili mysich dodaj 50 μl normalnej surowicy myszy i 50 μl mysiej surowicy immunologicznej Candida (wygenerowanej z myszy C57B6, którym wstrzyknięto HK Candida)5 do 100 μL HKC-S-1.</li>
		<li>Mieszać na wytrząsarce w temperaturze 37 °C i prędkości 1 100 obr./min przez 60-90 minut, a następnie na wałku o temperaturze 4 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Przemyć trzykrotnie w buforze BSS przez odwirowanie przy 17 200 x g przez 1 minutę każdy. Zawiesić w 100 μl buforu BSS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja neutrofili
<ol>
	<li>W przypadku neutrofili w ludzkiej krwi obwodowej należy pobrać 15 ml krwi przez nakłucie dożylne od zdrowego dawcy i umieścić ją w strzykawce o pojemności 20 ml zawierającej 90 μl roztworu sodu heparyny o stężeniu 1 000 j.m./ml (60 μl heparyny/10 ml krwi).</li>
	<li>Za pomocą końcówki pipety wstrzyknąć do strzykawki 1,5 ml 10% roztworu dekstranu. Odwróć go delikatnie 3 razy i pozostaw pionowo na ławce.</li>
	<li>Odczekaj 30-60 minut, aż krew podzieli się mniej więcej na pół, z górną warstwą kożucha w kolorze słomkowym i dolną warstwą zawierającą erytrocyty.</li>
	<li>Ostrożnie wypchnij wierzchnią warstwę przez igłę lub usuń ją końcówką pipety. Umieść go w probówce o pojemności 15 ml. Unikaj wyjmowania czerwonej warstwy. Za pomocą pipety o pojemności 5 ml dodaj 3-4 ml pożywki o gradientzie gęstości (patrz Lista materiałów) na dno probówki pod warstwą kożuchówki, aby uzyskać dwie odrębne warstwy. Wirować przy 913 x g przez 10 min. 
	UWAGA: W przypadku używania neutrofili mysich (patrz reference17 dla izolacji neutrofili myszy), należy zamiast tego użyć zawiesiny komórkowej, która została wypłukana ze szpiku kostnego.</li>
	<li>Odlej supernatant, pozostawiając czerwoną granulkę. Delikatnie wiruj, aby zakłócić osad. Dodać 7 ml destylowanego, autoklawizowanegoH2Odo osadu i odwracać przez 20 s w celu ponownego zawieszenia osadu. Dodaj 7 ml 2x soli fizjologicznej i odwróć kilka razy, aby wymieszać, liza pozostałych czerwonych krwinek.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 min. Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze BSS do około 4 x 106/mL. 
	UWAGA: Aby uzyskać optymalną mikroskopię komórek, utrzymuj stężenie zawiesiny komórek w zakresie 1,5-6 x 106/ml.</li>
</ol>
4. Przygotowanie slajdów
<ol>
	<li>Na 8-dołkowej płytce mikroskopowej (patrz lista materiałów) należy wstępnie potraktować 200 μl poli-L-lizyny (0,01% roztwór) w każdym dołku przez 40-60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć poli-L-lizynę (może być ponownie użyta) i umyć studzienki dwukrotnie 200 μl destylowanegoH2O.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 200 μl zawiesiny komórkowej przygotowanej w kroku 3.6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30-60 minut.</li>
	<li>Przygotować podwielokrotność 5-(i-6)-karboksylowego estru S-1 acetoksymetylowego (S-1-AM) (50 μg), dodając 100 μl wysokiej jakości DMSO do jednej probówki. Wirować do mieszania. Nieużywany przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Do małej probówki dodaj 1,7 ml buforu BSS i 20 μl S-1-AM. Wirować do mieszania.</li>
	<li>Przemyć studzienki dwukrotnie 200 μl buforu BSS, a następnie zastąpić bufor roztworem S-1-AM. Należy uważać, aby nie naruszyć monowarstwy komórek przymocowanych do dna studzienki, delikatnie pipetując ścianki studzienek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 25 minut.</li>
	<li>Przemyć studzienki dwukrotnie 200 μl buforu BSS. Aby przetestować inhibitor, należy przygotować "mieszankę główną" odpowiedniego leku w buforze BSS. Umyć studzienki dwukrotnie w roztworze inhibitora. 
	UWAGA: Upewnij się, że użyłeś tej samej ilości nośnika leku (np. DMSO lub etanolu) w studzience kontrolnej, jaka została użyta w przypadku inhibitora. W przypadku badania działania chlorku należy użyć buforu BSS bez KH2PO4 (HEPES może buforować sam roztwór), ponieważ wytrąca się z fosforanem.</li>
	<li>Sonikować opsonizowany HKC-S-1 (sekcja 6.2) przez około 3 s przy amplitudzie 5 μm. Dodać 10 μL do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 15-20 minut, aby umożliwić fagocytozę, przygotowując komórki do obrazowania w celu uzyskania migawek fagocytozy.</li>
</ol>
5. Mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Za pomocą mikroskopu konfokalnego dostosuj długość fali lasera tak, aby komórki były wzbudzane przy 555 nm, a emisja była wykrywana przez dwa kanały lub detektory: 560-600 nm i ponad 600 nm. 
	UWAGA: Konkretne parametry mikroskopu będą się różnić dla każdego mikroskopu i muszą zostać zoptymalizowane przez badacza.</li>
	<li>Zobacz komórki za pomocą obiektywu 63X z olejem. Użyj ustawienia skanowania kafelka przy ciągłym skanowaniu, aby wyświetlić środkowy kafelek. Korzystając z intensywności fluorescencji i wzmocnienia kanałów detektora, dostosuj ostrość i intensywność lasera oraz wzmocnienie dwóch kanałów, aby zoptymalizować obraz.</li>
	<li>Podziel obraz za pomocą ustawień, aby wyświetlić oba kanały; sprawdź, czy nie ma nasycenia intensywności fluorescencji w cytoplazmie lub wakuolach. Nasycenie jest wyświetlane jako czerwone kropki. Zmniejsz intensywność lasera, aby liczba czerwonych kropek była minimalna, ale komórki i fagosomy były wystarczająco jasne, aby widzieć wyraźnie.</li>
	<li>Gdy będziesz zadowolony, kliknij "Rozpocznij eksperyment". Generowany jest obraz skanowania z 9 kafelkami. Zapisz obraz jako złożony plik zalecany przez oprogramowanie, który zawiera złożony obraz dwóch kanałów (nie jpeg lub tiff).</li>
</ol>
6. Eksperymenty kalibracyjne
<ol>
	<li>Skonstruuj krzywą wzorca pH z samą Candidą.
	<ol>
		<li>Przygotować o pH od 3,0 do 13,0, zgodnie z tabelą 1.</li>
		<li>Pobrać jedną porcję (100 μl) HKC-S-1. Wiruj przez 1 minutę przy 17 200 x g. Zawiesić go ponownie w 500 μl przypisanego buforu.</li>
		<li>Zaczynając od najniższego zakresu pH, dodaj zawiesinę do jednego wstępnie potraktowanego dołka (od kroku 4.2). Umieść szkiełko w mikroskopie konfokalnym na podgrzewanym stoliku ustawionym na 37 °C.</li>
		<li>Rejestruj fluorescencję co minutę przez 10 minut. Powtórz dla każdego buforu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krzywa standardowa saponiny.
	<ol>
		<li>Wyizoluj 1 x 107 ludzkich neutrofili5 i ponownie zamieść je w 1 ml buforu o najniższym pH.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z metodą opisaną w punkcie 4 w celu pomiaru pH fagosomalnego w neutrofilach.</li>
		<li>Po inkubacji z zawiesiną Candida przez 20 minut, dodać 0,3% saponiny (15 μl 10% bulionu do jednego wstępnie potraktowanego dołka (z kroku 4.2)) do szalki, a następnie inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Rób zdjęcie co minutę przez 10 minut. Powtórz te czynności dla każdego bufora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzorcowe krzywe pH cytozolu przy użyciu techniki wysokiego K+/nigerycyny5,18,19.
	<ol>
		<li>Uzupełnić opisane w tabeli 1 o pH 4,0 do 13,0.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z krokami 4.1-4.7, pozostawiając tylko neutrofile we wstępnie poddanych obróbce studzienkach - każda studzienka zawiera inny bufor. Dodać szkiełko do podgrzewanego w temperaturze 37 °C stage i rejestrować fluorescencję co minutę przez 10 minut.</li>
		<li>Uwaga: Może minąć trochę czasu, zanim pH cytozolu ustabilizuje się z roztworem zewnętrznym, ale po tym momencie wartość stosunku S-1 staje się stała. Pomiar zewnątrzkomórkowego HKC-S-1 w każdym eksperymencie może służyć jako kontrola w celu sprawdzenia, czy dodane inhibitory nie zakłócają fluorescencji emitowanej przez S-1 ani nie wpływają na pH buforu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Analiza obrazu
UWAGA: Tutaj znajdują się instrukcje dotyczące analizy obrazu (ilościowego oznaczania fluorescencji) za pomocą darmowego oprogramowania ImageJ. Zaleca się korzystanie z ImageJ.
<ol>
	<li>Pobierz i zainstaluj ImageJ w wersji >1.46r zgodnie z instrukcjami programisty (https://imagej.nih.gov/ij/). Zainstaluj plik z kodem uzupełniającym dołączony do tego protokołu o nazwie "Pomiar fagosomalny".</li>
	<li>Otwórz Obraz J i załaduj plik obrazu wybrany do analizy na pasek narzędzi. Aby połączyć te dwa kanały, użyj polecenia Image>Color>Make Composite.</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać plik, w którym mają być przechowywane wyniki.</li>
	<li>Kliknij narzędzie linii na pasku narzędzi i kliknij dwukrotnie, aby zwiększyć szerokość do "2".</li>
	<li>Narysuj linię na szerokości fagosomu, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby "zmierzyć pH". Uzyskuje się średnią intensywność dwóch kanałów, a ich stosunek jest obliczany automatycznie przez plik kodu w ImageJ.</li>
	<li>Po zakończeniu pomiarów kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać "zapisz plik".</li>
	<li>Aby zmierzyć obszar fagosomu, użyj czwartej ikony wzdłuż paska narzędzi, aby narysować odręcznie wokół obszaru. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać "zmierz obszar" 
	UWAGA: Wyniki są zapisywane, a plik dziennika jest generowany w wybranym katalogu. Wyniki mogą być przetwarzane za pomocą arkusza kalkulacyjnego, R lub równoważnego oprogramowania. Zależność między stosunkiem fluorescencji a pH jest w przybliżeniu sigmoidalna, a wartości współczynnika wygenerowane w analizie ImageJ można przeliczyć na pH przy użyciu uogólnionej funkcji logistycznej lub sigmoidalnej lub przez interpolację liniową lub sześcienną splajnu.</li>
	<li>Aby zmierzyć cytoplazmę, narysuj linię w poprzek cytoplazmy i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby "zmierzyć pH".</li>
</ol>

<ol><li>Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidases+as+electrochemical+generators+to+produce+ion+fluxes+and+turgor+in+fungi%2C+plants+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidases as electrochemical generators to produce ion fluxes and turgor in fungi, plants and humans.</a> Open Biol. 6 (5), 515-517 (2016).</li>
<li>Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+neutrophils+kill+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">How neutrophils kill microbes.</a> Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).</li>
<li>Cross, A. R., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NADPH+oxidase+of+professional+phagocytes+-+Prototype+of+the+NOX+electron+transport+chain+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">The NADPH oxidase of professional phagocytes - Prototype of the NOX electron transport chain systems.</a> BBA Bioenergetics. 1657 (1), 1-22 (2004).</li>
<li>Demaurex, N., El Chemaly, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+of+voltage-gated+proton+channels+in+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological roles of voltage-gated proton channels in leukocytes.</a> J Physiol. 588 (23), 4659-4665 (2010).</li>
<li>Levine, A. P., Duchen, M. R., de Villiers, S., Rich, P. R., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkalinity+of+neutrophil+phagocytic+vacuoles+is+modulated+by+HVCN1+and+has+consequences+for+myeloperoxidase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Alkalinity of neutrophil phagocytic vacuoles is modulated by HVCN1 and has consequences for myeloperoxidase activity.</a> PLoS One. 10 (4), 0125906(2015).</li>
<li>Reeves, E. P., Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+activity+of+neutrophils+is+mediated+through+activation+of+proteases+by+K%2B+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux.</a> Nature. 416 (6878), 291-297 (2002).</li>
<li>Menegazzi, R., Busetto, S., Dri, P., Cramer, R., Patriarca, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+ion+efflux+regulates+adherence%2C+spreading%2C+and+respiratory+burst+of+neutrophils+stimulated+by+tumor+necrosis+factor-alpha+%28TNF%29+on+biologic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chloride ion efflux regulates adherence, spreading, and respiratory burst of neutrophils stimulated by tumor necrosis factor-alpha (TNF) on biologic surfaces.</a> J Cell Biol. 135 (2), 511-522 (1996).</li>
<li>Ohkuma, S., Poole, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probe+measurement+of+the+intralysosomal+pH+in+living+cells+and+the+perturbation+of+pH+by+various+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents.</a> Cell Biol. 75 (7), 3327-3331 (1978).</li>
<li>Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+the+phagosomal+pH+in+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of the phagosomal pH in neutrophils.</a> J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Indicators+of+Ion+Concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Indicators of Ion Concentrations.</a> Methods in Cell Biol. 30, 127-156 (1989).</li>
<li>Lavis, L. D., Rutkoski, T. J., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+pK+a+of+Fluorescein+to+Optimize+Binding+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Tuning the pK a of Fluorescein to Optimize Binding Assays.</a> Anal Chem. 79 (17), 6775-6782 (2007).</li>
<li>Hurst, J. K., Albrich, J. M., Green, T. R., Rosen, H., Klebanoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase-dependent+fluorescein+chlorination+by+stimulated+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase-dependent fluorescein chlorination by stimulated neutrophils.</a> J Biol Chem. 259 (8), 4812-4821 (1984).</li>
<li>Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Phagosome+pH+by+Ratiometric+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy.</a> J Vis Exp. (106), e53402(2015).</li>
<li>Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+phagosome+pH+regulation+and+maturation+in+human+M1+and+M2+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages.</a> Mol Biol Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).</li>
<li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> J Vis Exp. (109), e53622(2016).</li>
<li>Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+new+pH-sensitive+fluoroprobe+%28carboxy-SNARF-1%29+for+intracellular+pH+measurement+in+small%2C+isolated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl+%C3%BCgers+Archiv+EJP%22%5BJournal%5D)">Application of a new pH-sensitive fluoroprobe (carboxy-SNARF-1) for intracellular pH measurement in small, isolated cells.</a> Pfl ügers Archiv EJP. 417 (2), 234-239 (1990).</li>
<li>El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hv1+proton+channels+differentially+regulate+the+pH+of+neutrophil+and+macrophage+phagosomes+by+sustaining+the+production+of+phagosomal+ROS+that+inhibit+the+delivery+of+vacuolar+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leuko+Biol%22%5BJournal%5D)">Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases.</a> J Leuko Biol. 95 (5), 827-839 (2014).</li>
<li>Morgan, D., Capasso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+proton+channels+maintain+pH+in+human+neutrophils+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated proton channels maintain pH in human neutrophils during phagocytosis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 18022-18027 (2009).</li>
<li>Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH+measurements+in+Ehrlich+ascites+tumor+cells+utilizing+spectroscopic+probes+generated+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ.</a> Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).</li>
<li>Levine, A. P., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NADPH+Oxidase+and+Microbial+Killing+by+Neutrophils%2C+With+a+Particular+Emphasis+on+the+Proposed+Antimicrobial+Role+of+Myeloperoxidase+within+the+Phagocytic+Vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">The NADPH Oxidase and Microbial Killing by Neutrophils, With a Particular Emphasis on the Proposed Antimicrobial Role of Myeloperoxidase within the Phagocytic Vacuole.</a> Microbiol Spectr. 4 (4), (2016).</li>
<li>Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+burst+of+phagocytic+cells+is+associated+with+a+rise+in+vacuolar+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH.</a> Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).</li>
<li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+%28C-SNARF-4%29+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li>
<li>Van Erp, P. E. J., Jansen, M. J. J. M., De Jongh, G. J., Boezeman, J. B. M., Schalkwijk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+measurement+of+intracellular+pH+in+cultured+human+keratinocytes+using+carboxy-SNARF-1+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Ratiometric measurement of intracellular pH in cultured human keratinocytes using carboxy-SNARF-1 and flow cytometry.</a> Cytometry. 12 (2), 127-132 (1991).</li>
<li>Minamikawa, T., Takamatsu, T., Kashima, S., Fushiki, S., Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/096843289390031U">Confocal calcium imaging with ultraviolet laser- scanning microscopy and indo-1.</a> Micron. 24 (6), 551-556 (1993).</li>
<li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10508230">Measurement of Intracellular Calcium.</a> Physiol Rev. 79 (4), (1999).</li>
<li>Hillson, E. J., Dewitt, S., Hallett, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+methods+for+the+measurement+and+manipulation+of+cytosolic+free+calcium+in+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical methods for the measurement and manipulation of cytosolic free calcium in neutrophils.</a> Methods Mol Biol. 412, Clifton, N.J. 125-137 (2007).</li>
<li>Bernardo, J., Long, H. J., Simons, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+cytoplasmic+and+phagosomal+consequences+of+human+neutrophil+exposure+to+Staphylococcus+epidermidis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Initial cytoplasmic and phagosomal consequences of human neutrophil exposure to Staphylococcus epidermidis.</a> Cytometry Part A. 77 (3), 243-252 (2010).</li>
<li>Riazanski, V., Gabdoulkhakova, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC6+channel+translocation+into+phagosomal+membrane+augments+phagosomal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">TRPC6 channel translocation into phagosomal membrane augments phagosomal function.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (47), 6486-6495 (2015).</li>
<li>Martínez-Zaguilán, R., Martínez, G. M., Lattanzio, F., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+intracellular+pH+and+Ca2%2B+using+the+fluorescence+of+SNARF-1+and+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of intracellular pH and Ca2+ using the fluorescence of SNARF-1 and fura-2.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 260 (2), (1991).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Po skonfigurowaniu odpowiednich odczynników, ustawień mikroskopu i eksperymentów kalibracyjnych metoda ta jest stosunkowo prosta do wykonania. Do krytycznych kroków należą: oznaczenie Candidy za pomocą S-1, aby upewnić się, że nie ma przeciążenia barwnika, kalibracja i analiza obrazu.
S-1 jest odczynnikiem odpowiednim do bardziej zasadowych środowisk pH, co jest szczególnie ważne w przypadku neutrofili21 , ale ogranicza jego zastosowanie w niektórych typach komórek. W przypadku bardziej kwaśnych środowisk, takich jak fagosomy makrofagów, SNARF-4 lub S-4 jest bardziej odpowiedni ze względu na niższe pKa22. Ponadto, aby uzyskać dokładniejsze odczyty cytoplazmatyczne, lepiej jest użyć S-4, ponieważ standardowa krzywa dla S-1 pokazuje, że współczynniki fluorescencji zaczynają stabilizować się poniżej pH 6 (ryc. 3). Inne barwniki, takie jak 2',7'-bis-(2-karboksyetylo)-5-(i-6)-karboksyfluoresceina (BCECF) lub czerwień pHrodo mogą być również bardziej odpowiednie w kontekście, który prawdopodobnie będzie kwaśny. Jednak barwienie cytoplazmą jest nadal konieczne do prawidłowej identyfikacji fagosomów zawierających Candida.
Ważną cechą fagosomalnego wskaźnika pH jest to, że nie jest on nieodwracalnie zmieniany przez reaktywne środowisko fagosomalne. S-1 wydaje się być odporny na środowisko neutrofili. Pokazują to Levine i wsp.5 (patrz film uzupełniający 4 w odnośniku5), które pokazują fagocytozę, a następnie uwalnianie cząstki Candida znakowanej S-1 przez neutrofile Hvcn1-/- . Po fagocytozy cząstka zmienia kolor z żółto-pomarańczowego na czerwony (pH obojętne do zasadowego), ale gdy cząstka jest uwalniana przez neutrofile, wraca do swojego pierwotnego koloru.
Należy wspomnieć o niektórych ograniczeniach związanych z używaniem S-1. Fakt, że barwnik ten ma dwa widma emisyjne umożliwiające pomiar ratiometryczny, jest zaletą, ale do pozyskiwania obrazów potrzebny jest specjalistyczny sprzęt; Mikroskop używany do eksperymentów musi być w stanie zarejestrować dwa obrazy jednocześnie lub z nieznacznym opóźnieniem czasowym. Autorzy zakładają, że badacz próbujący zastosować ten protokół ma doświadczenie w stosowaniu mikroskopii konfokalnej lub ma dostęp do przeszkolonego specjalisty. Nie możemy wymienić wszystkich konkretnych parametrów mikroskopu, ponieważ będą one różne dla każdego mikroskopu i muszą być zoptymalizowane przez badacza. Ester acetoksymetylowy sprzężony z S-1, który umożliwia dyfuzję barwnika do cytoplazmy komórki, jest degradowany przez niespecyficzne esterazy w cytoplazmie komórki, tworząc cząsteczkę fluorescencyjną. Esterazy, takie jak fosfataza alkaliczna, są obecne w surowicy ludzkiej i płodowej surowicy bydlęcej, które są stosowane do uzupełniania pożywek do hodowli komórkowych. W związku z tym pożywka, w której komórki są załadowane S-1-AM (sekcja 4.5), nie może zawierać surowicy. Może to okazać się trudne, jeśli używa się komórek, które wymagają bardziej bogatej w składniki odżywcze pożywki do ich podtrzymania niż zbilansowany roztwór soli stosowany w tym protokole. Podobnie inne składniki pożywki fluorescencyjnej, takie jak czerwień fenolowa, mogą zakłócać pomiary S-1.
Słupki błędów na rysunku 3 wskazują, że istnieją pewne różnice w pomiarach proporcji dla każdego pH. Odpowiednia liczba powtórzeń każdego eksperymentu (co najmniej n = 3) i tyle pojedynczych pomiarów w każdym pojedynczym eksperymencie jest potrzebna do przezwyciężenia zmienności międzywakuolarnej. Dlatego zaleca się zmierzenie pH co najmniej 100 fagosomów dla każdego stanu i tylu obszarów fagosomalnych, które wydają się zawierać tylko jedną Candida. Fagosomy, które mają być mierzone w celu oceny ilościowej, powinny być tymi, które całkowicie pochłonęły cząsteczkę Candida (tj. Tymi całkowicie otoczonymi przez cytoplazmę). Aby zapobiec niezamierzonym błędom systematycznym w doborze komórek/fagosomów do oceny ilościowej, wszystkie analizy powinny być wykonywane w ślepej oślepieniu na warunki eksperymentalne.
W tym miejscu opisujemy izolację neutrofili przez sedymentację dekstranem krwi pełnej, a następnie odwirowanie warstwy osocza przez gradient gęstości. Używamy tej techniki, ponieważ szybko i skutecznie wytwarza czystą (>95%) populację neutrofili, chociaż dostępne są inne metody, takie jak odwirowanie krwi pełnej za pomocą innych wzorów gradientu gęstości lub negatywna selekcja neutrofili przy użyciu specjalistycznych zestawów z przeciwciałami lub kulkami magnetycznymi. Jednak to ostatnie może być zbyt kosztowne dla większości grup, które rutynowo izolują neutrofile. Ponadto używamy heparyny przeciwzakrzepowej w probówce do pobierania krwi, podczas gdy inni badacze mogą być bardziej przyzwyczajeni do stosowania kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) lub kwaśnego cytrynianu sodu (ACD). Ponieważ istnieje wiele różnych metod do wyboru, zależy to od osobistych preferencji badacza.
Ponadto podczas izolowania i manipulowania neutrofilami należy obchodzić się z nimi z pewną ostrożnością, aby uniknąć nadmiernej aktywacji. Kroki ostrożności obejmują: używanie wyłącznie wyrobów z tworzyw sztucznych, bez szkła; przefiltrować i wysterylizować wszystkie w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczających endotoksyn; Podczas wirowania neutrofili upewnij się, że wirówka jest dobrze wyważona, aby uniknąć nadmiernych wibracji; ograniczyć w jak największym stopniu czas, w którym neutrofile pozostają w osadzie po odwirowaniu; nie utrzymywać neutrofili w roztworze większym niż 5 x 106/ml; i przeprowadzić eksperyment tak szybko, jak to możliwe po izolacji.
Metodę tę można dostosować do pomiaru zmian pH i obszaru fagosomalnego w czasie przy użyciu podgrzewanego stolika ustawionego na 37 °C pod mikroskopem i wykonywania zdjęć raz na 30-60 s z tej samej pozycji, zgodnie z opisem dla etapów kalibracji. Teoretycznie można go również zaadaptować do eksperymentów o wyższej przepustowości, takich jak na płytkach 96-dołkowych, oraz do eksperymentów z cytometrią przepływową, gdzie S-1 może być używany jako wskaźnik pH23. Jednak w tych ustawieniach nacisk na aktywność poszczególnych komórek zostaje zastąpiony bardziej globalnym wpływem na populację komórek.
Metoda ta ma na celu zapewnienie stosunkowo prostej konfiguracji eksperymentalnej, na podstawie której poszczególni badacze mogą dostosować się do swojego obszaru zainteresowań. Naukowcy mogą chcieć zbadać pH i obszar fagosomalów neutrofili, jednocześnie mierząc ruch innych jonów, na przykład wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia. Istnieje kilka fluorescencyjnych wskaźników Ca2 + łatwo dostępnych do mikroskopii konfokalnej, takich jak Indo-1, który ma również widma podwójnej emisji przy 400 i 475 nm24. Te długości fal emisyjnych nie pokrywają się z widmami emisyjnymi S-1, ale długość fali wzbudzenia znajduje się na końcu widma w ultrafiolecie (UV), co może być szkodliwe dla komórek, a laser UV nie jest powszechny we wszystkich mikroskopach. Kompleksowy przegląd różnych wskaźników do pomiaru wewnątrzkomórkowego przepływu wapnia jest omówiony przez Takahashi i wsp.25 oraz Hillson i wsp.Lokal mieszkalny 26.
Podsumowując, dostępne są inne metody pomiaru pH fagosomalnego przy użyciu różnych barwników fluorescencyjnych, takich jak Nunes i wsp. wykazałysię 13, a także inne grupy27,28. Inni badacze również używali S-1 do pomiaru cytozolowego pH29 lub phagosomalnegopH 14. Jednak protokół ten jest unikalny w jednoczesnym pomiarze pH zarówno cytozolu, jak i fagosomu, co daje możliwość obserwowania zmian w obszarze przekroju poprzecznego fagosomalnego i rozróżnienia między neutrofilami typu dzikiego i Hvcn1-/- myszy oraz neutrofiliami ludzkimi z działającą oksydazą NADPH i bez niej.

Neutrofile to najliczniejsza wrodzona komórka odpornościowa w organizmie. Jego główna funkcja polega na patrolowaniu krwiobiegu oraz pochłanianiu i trawieniu obcych cząstek, które może napotkać w procesie znanym jako fagocytoza1,2. Cząstki są rozkładane w przedziale wewnątrzkomórkowym zwanym fagosomem. Aktywacja oksydazy neutrofilowej NADPH, izoformy NOX2, inicjuje kaskadę reakcji biochemicznych, których kulminacją jest śmierć patogenu. Podjednostki białka NOX2 tworzą kompleks łańcucha transportu elektronów w błonie fagosomalnej3. Po aktywacji transportuje elektrony z NADPH przez błonę do tlenu cząsteczkowego wewnątrz fagosomu, wytwarzając aniony ponadtlenkowe i dalsze reaktywne formy tlenu. Jest to znane jako wybuch oddechowy i uważa się, że jest niezbędne do skutecznego zabijania i trawienia drobnoustrojów2. Jednak ten wyłączny ruch ładunku ujemnego przez błonę wkrótce dezaktywowałby NOX2, gdyby nie został skompensowany przez ładunek dodatni poruszający się do środka i / lub ładunek ujemny przemieszczający się z fagosomu. Ustalono, że większość kompensacji ładunku w neutrofilach jest realizowana przez kanał protonowy HVCN14,5. Kanał ten pozwala na pasywny ruch protonów w dół ich gradientu elektrochemicznego z cytozolu do fagosomu. Stężenie protonów jest odzwierciedlane przez pH, więc dla danego poziomu aktywności oksydazy pomiar pH w fagosomie może dostarczyć informacji na temat względnego udziału szlaków protonowych i nieprotonowych w kompensacji ładunku.
Ludzki fagosom neutrofilowy ma zasadowe pH około 8,5 przez 20-30 min po fagocytozie5. Oznacza to istnienie dodatkowych kanałów jonów nieprotonowych w kompensacji ładunku indukowanej NOX2, ponieważ fuzja i uwalnianie zawartości kwaśnych granulek oraz wyłączna kompensacja przez HVCN1 utrzymałyby kwaśne środowisko, w przeciwieństwie do obserwowanego. Ruch jonów w celu skompensowania tego ujemnego ładunku może również powodować zmiany wielkości fagosomu poprzez osmozę. Mogą to być jony obecne w neutrofilach w wysokich stężeniach fizjologicznych: wykazano, że jony potasu przemieszczają się do fagosomu6, a ruch jonów chlorkowych jest kolejnym kandydatem ważnym dla funkcji neutrofili7.
Regulacja pH w fagosomie jest niezbędna dla aktywności proteazy przeciwdrobnoustrojowej5. Mieloperoksydaza (MPO) wydaje się mieć optymalną aktywność przy pH 6, podczas gdy dla katepsyny G i elastazy optymalne poziomy to odpowiednio pH 7-9 i pH 8-105. Dlatego przejściowa zmiana pH fagosomalnego może zapewnić nisze aktywności dla funkcjonowania różnych enzymów. Zrozumienie, w jaki sposób pH bierze udział w zabijaniu mikroorganizmów obojętnochłonnych, może dostarczyć przydatnych informacji do projektowania nowych środków mikrobiologicznych zwiększających liczbę neutrofili.
Fagosom neutrofilowy jest wysoce reaktywnym środowiskiem. Utrudnia to dokładną ocenę pH, ponieważ barwniki mogą łatwo ulegać utlenianiu, co prowadzi do powstania artefaktów technicznych. Historycznie rzecz biorąc, izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) był barwnikiem wybieranym do pomiaru wewnątrzkomórkowego pH8,9. Istnieją jednak pewne wady jego stosowania w pomiarze pH fagosomalnego neutrofili. Ma pKa 6,410, co oznacza, że może być dokładnie używany tylko do oceny poziomu pH od 5 do 7,58, ponieważ nasyca się przy pH < 811. Ponieważ pH fagosomalne neutrofili może stać się znacznie bardziej zasadowe5, FITC nie jest w stanie uchwycić pełnego zakresu potencjalnych zmian pH. Kolejnym istotnym problemem związanym z FITC w kontekście neutrofili jest to, że uważa się, że jest on fotobielony przez MPO12. Inhibitor MPO, azydek sodu, może być stosowany w celu ograniczenia fotowybielania13, ale wykazano, że azydek sodu bezpośrednio obniża pH fagosomalne w sposób niezależny od MPO i dlatego nie nadaje się do stosowania w takich testach5.
W porównaniu do innych barwników wewnątrzkomórkowych, S-1 ma stosunkowo wysokie pKa wynoszące 7,510. W warunkach kwaśnych cząsteczka jest protonowana i wytwarza sygnał emisyjny o długości fali od 560 do 600 nm po wzbudzeniu przy długości fali 488 nm lub wyższej. Gdy cząsteczka jest deprotonowana w bardziej zasadowych warunkach, długość fali emisji wynosi ponad 600 nm. Stosunek intensywności fluorescencji przy tych dwóch długościach fal wskazuje na przesunięcie emisji, które jest bardziej wiarygodne niż pomiary pojedynczej fluorescencji, ponieważ nie ma na nią wpływu stężenie fluoroforu i struktura komórki. S-1 może być sprzężony z materiałem antygenowym, takim jak zymosan14, chociaż preferowany jest Candida albicans zabijany termicznie (HK), ponieważ większa powierzchnia daje bardziej spójny odczyt fluorescencji.
Użyliśmy również modyfikacji tej metody do badania czasowych zmian pH (Rysunek 3)5. Ta metoda pomiaru pH cytozolowego może być łatwo zastosowana do innych typów komórek, jak opisano w innym miejscu15,16, oraz komórek z bardziej alkalicznymi fagosomami14.

<table><tbody><tr><td>Candida albicans ATCC 10231 Vitroids&nbsp; 80 CFU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RQC14003-10EA</td><td>Umieścić bezpośrednio na rozprowadzonej płytce agarowej zgodnie z instrukcjami producenta</td></tr><tr><td>Rosół YPD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1375</td><td>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Dekstran Klasa kliniczna MW = 200 000-300 000</td><td>MP Biomedicals</td><td>2101514</td><td>Używaj rękawiczek&nbsp;</td></tr><tr><td>Heparyna Roztwór sodowy do infuzji (bez konserwantów), 1 000 j.m./ml&nbsp;</td><td>Fannin, Wockhardt UK Ltd</td><td>FP1077</td><td>Zakupiliśmy w aptece szpitalnej UCH</td></tr><tr><td>SNARF-1 Kwas karboksylowy, octan, ester sukcynimidylowy - specjalne opakowanie</td><td>Thermo Scientific/Invitrogen</td><td>SS22801</td><td>Rękawice 5</td></tr><tr><td>-(i-6)-Karboksyl SNARF-1, Ester acetoksymetylowy, Octan</td><td>Thermo Scientific/Invitrogen</td><td>C1272</td><td>Używaj rękawiczek</td></tr><tr><td>Vivaglobin ludzka IgG&nbsp; 160 mg/ml roztwór</td><td>CSL Behring</td><td>otrzymał w prezencie</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Normalna surowica myszy</td><td>Abcam</td><td>ab7486</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Lymphoprep (medium gradientu gęstości)</td> <td>Alere Ltd</td><td>1114547</td><td>Zachowaj sterylność i z dala od bezpośredniego światła słonecznego, może być zastąpiony przez Ficoll-Paque</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>Toksyczny, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>Toksyczny, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Sulfoxide dimetylu (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Toksyczny, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Istnieją różni dostawcy Tris</td></tr><tr><td>(hydroksymetylo)aminometan (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503&nbsp;</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>Różne istnieją</td></tr><tr><td>dostawcy Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Etanol absolutny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Jodonium difenylenowy (DPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2926</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Chlorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td>Istnieją różni dostawcy, nie należy rozcieńczać na bazie fosforanów, ponieważ spowoduje to wytrącenie</td></tr><tr><td>poli L lizyny</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>Konfokalny skaning laserowy mikroskop (Zeiss LSM 700)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Mikroskop musi być w stanie wzbudzić przy 555 nm i mierzyć emisję w dwóch kanałach jednocześnie (560-600 nm, >610 nm)</td></tr><tr><td>Ibidi i mikro; szkiełko 8 dobrze ibiTreat</td><td>Thistle Scientific</td><td>IB-80826</td><td>Inne odpowiednie naczynia do obrazowania można zastąpić</td></tr><tr><td>Soniprep 150</td><td>MSE</td><td></td><td>Wystarczy dowolny odpowiedni sonikator</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek TC20</td><td>BioRad</td><td></td><td>Istnieją różni dostawcy</td></tr><tr><td>1,5 ml probówek białkowych</td><td>LoBind Sigma-Aldrich</td><td>Z666505-100EA</td><td>Specjalnie stosowany jako Candida może przyklejać się do normalnych eppendorfów</td></tr></tbody></table>

obrazowanie fagosomu neutrofili i cytoplazmy za pomocą ratiometrycznego wskaźnika ph

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrofile są kluczowe dla wrodzonej obrony gospodarza i w związku z tym stanowią ważny obszar badań medycznych. Fagosom, przedział wewnątrzkomórkowy, w którym odbywa się zabijanie i trawienie pochłoniętych cząstek, jest główną areną zabijania patogenów neutrofili, która wymaga ścisłej regulacji. Fagosomalne pH jest jednym z aspektów, który jest dokładnie kontrolowany, co z kolei reguluje aktywność proteazy przeciwdrobnoustrojowej. Do wizualizacji środowiska fagosomalnego użyto wielu fluorescencyjnych barwników wrażliwych na pH. S-1 ma kilka zalet w porównaniu z innymi barwnikami wrażliwymi na pH, w tym podwójne widma emisyjne, odporność na fotowybielanie i wysokie pKa. Za pomocą tej metody wykazaliśmy, że fagosom neutrofilów jest niezwykle zasadowy w porównaniu z innymi fagocytami. Stosując różne biochemiczne koniugacje barwnika, fagosom można oddzielić od cytoplazmy, dzięki czemu można ocenić zmiany w wielkości i kształcie fagosomu. Pozwala to na dalsze monitorowanie ruchu jonowego.

Rysunek 1 przedstawia ujęcia neutrofili pochodzących z różnych źródeł, aby zademonstrować zróżnicowane środowiska fagosomalne. Aby ułatwić analizę ilościową, ważne jest wysianie do studzienek odpowiedniej liczby komórek: zbyt duża liczba spowoduje nakładanie się komórek jedna na drugą, co utrudni dokładną obserwację zamkniętych fagosomów; zbyt mała liczba dostarczy oczywiście mniej wyników, zwłaszcza że nie każdy neutrofil przeprowadzi fagocytozę. Rysunek 2 przedstawia obraz z prześwietleniem (nasyceniem); można to ocenić, rozdzielając obraz na dwa kanały (używając oprogramowania mikroskopowego zalecanego w liście materiałów lub równoważnego) — czerwone kropki wskazują miejsca, w których wykryto maksymalną fluorescencję. Można temu przeciwdziałać poprzez zmniejszenie intensywności lasera. Krzywe kalibracyjne z wykorzystaniem różnych systemów buforowych pokazano na Rysunku 3, zaadaptowanym z pracy Levine et al.5. Słupki błędów wskazują na pewną zmienność fluorescencji między pomiarami. Rysunek 4 przedstawia przykład prezentacji danych dotyczących pH i powierzchni fagosomów. Takie podejście pozwala na wyświetlenie każdego pojedynczego pomiaru wraz z nałożonym wykresem pudełkowym. Dane można jednak przedstawić również w formie histogramu słupkowego.
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający zależną od pH odpowiedź komórkową ze skalą kolorystyczną, pasek skali 10 μm." src="/files/ftp_upload/55107/55107fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Odpowiednie obrazy migawkowe neutrofili pochodzących od ludzi i myszy. Po prawej stronie znajduje się jakościowy klucz wizualny przybliżonego koloru fagosomów barwionych S-1 w zależności od wartości pH. Kolor żółty wskazuje na większą kwasowość, natomiast kolor czerwony na większą zasadowość.A) przedstawia Hvcn1-/- neutrofile z szpiku kostnego myszy 20 min po fagocytozie. Fagosomy wydają się bardzo czerwone, zasadowe i obrzęknięte. Czerwona strzałka w prawym dolnym rogu obrazu wskazuje na wewnątrzkomórkowy Kandida, podczas gdy strzałka w lewym górnym rogu wskazuje na cząsteczkę pozakomórkową. (B) przedstawia neutrofile z szpiku kostnego myszy typu dzikiego, które pochłonęły Candida; są one znacznie mniej zasadowe niż Hvcn1-/- komórki. (C) przedstawia ludzkie neutrofile z krwi obwodowej w tym samym punkcie po fagocytozie. Wykazują one nieco bardziej zasadowy odczyn niż komórki mysie typu dzikiego, jednak fagosomy nadal nie są tak duże i czerwone jak Hcvn1-/- komórki. (D) przedstawia ludzkie neutrofile, które fagocytowały Kandydy w obecności 5 µM jodopek diphenylenowy (DPI). Wszystkie fagosomy są bardzo kwasowe, o pH wynoszącym 6 lub mniej; lek hamuje oksydazę NADPH, w związku z czym nie dochodzi do kompensacyjnego ruchu jonów. Protony uwalniane z kwasowych ziarnistości, które łączą się z fagosomem, powodują kwasowe pH20or zwiększony poziom rekrutacji V-ATPazy do błony fagosomu po zastosowaniu DPI9Cytoplazma wykazuje również bardziej zasadowy odczyn w porównaniu z komórkami z pozostałych grup badawczych. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej: obrazowanie dwukanałowe, rekonstrukcja kompozytowa, kwantyfikacja cząstek." src="/files/ftp_upload/55107/55107fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Przesycenie Hvcn1-/- neutrofile z szpiku kostnego myszy. Ważne jest, aby wykluczyć z analizy obrazy, w których dane fluorescencyjne są przesycone. Zgodnie z opisem w sekcji 5.3, obraz kompozytowy zostaje rozdzielony na dwa obrazy (lewa góra, czerwona strzałka), w których oba kanały są przedstawione indywidualnie. W tym oprogramowaniu zaznaczono wskaźnik zakresu (lewa dół, czerwona strzałka), dzięki czemu wszystkie przesycone piksele są wyświetlane w jasnoczerwonym kolorze. Przesycenie występuje w obu kanałach (1 i 2). Powiększenie niektórych komórek i obszarów pozakomórkowych Kandydy widoczny jest w prawym dolnym rogu, a strzałki wskazują obszary dotknięte zmianami. Analiza tych punktów doprowadziłaby do błędnego pomiaru ratiometrycznego. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykres stosunku S-1 w zależności od pH; analiza cytoplazmy, saponiny i Tris; porównanie danych w badaniach biochemicznych." src="/files/ftp_upload/55107/55107fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Standardowe krzywe kalibracyjne dla konwersji stosunków fluorescencji S-1 na pomiary pH. Krzywe standardowe dla Candida same w różnych buforach (oznaczonych jako „Tris”) oraz w przypadku permeabilizacji komórek saponiną („Saponin”) są bardzo zbliżone, co pokazuje, że odczyty S-1 wewnątrz i na zewnątrz komórki (fagosom i medium zewnątrzkomórkowe) są porównywalne. Słupki błędów reprezentują średnią ± SD. Krzywa stosunku S-1/pH jest skrócona w przypadku testowania w cytoplazmie („Cytoplasm”), co należy wziąć pod uwagę podczas analizy obrazu. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Levinea i wsp.5. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza powierzchni fagosomów; wykres pudełkowy stosunku S-1 do pH; pomiary pH komórkowego." src="/files/ftp_upload/55107/55107fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Ilościowe oznaczenie pH i powierzchni fagosomów. Rysunek ten przedstawia przykład prezentacji danych. Wykresy zostały wygenerowane przy użyciu oprogramowania programistycznego R. A: przedstawia stosunek fagosomów oraz odpowiadające im pH dla A (Hvcn1-/- mouse bone marrow neutrophils), B: neutrofile z szpiku kostnego myszy typu dzikiego, C: neutrofile z ludzkiej krwi obwodowej oraz D: neutrofile ludzkie z 5 µM DPI n = 3/30. Poszczególne pomiary przedstawiono jako małe kwadraty, z nałożonym wykresem pudełkowym z medianą i rozstępem międzykwartylowym. Czerwony pasek reprezentuje średnią. Jak widać na zdjęciach w Rysunek 1, Hvcn1-/- komórki mają bardzo zasadowe fagosomy w porównaniu z neutrofilami myszy i ludzi typu dzikiego. Mają one również większą powierzchnię fagosomów (Rysunek 4B, n = 3/300). Fagocytozy neutrofili ludzkich są nieco bardziej zasadowe i większe niż fagocytozy neutrofili myszy typu dzikiego, podczas gdy neutrofile ludzkie inkubowane z DPI wykazują bardzo kwasowe i małe fagocytozy. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Bufor zrównoważonego roztworu soli (BSS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>156 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO₄4</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl₂2</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukoza</td>
			<td>10 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">pH 7,4 przy użyciu NaOH lub HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">bulion YPD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pożywka YPD</td>
			<td>50 g</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda destylowana</td>
			<td>1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Autoklawować w 121 °C przez 15 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">W przypadku agaru YPD: przed autoklawowaniem dodać 15 g/L agaru</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">10% roztwór dekstranu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dekstran klasy klinicznej</td>
			<td></td>
			<td>50 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td>4,5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda destylowana</td>
			<td></td>
			<td>50 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Przenieść do szklanej butelki i wysterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Roztwór soli fizjologicznej 2x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td>18 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda destylowana </td>
			<td></td>
			<td>1 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Przenieść do szklanej butelki i wysterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">10% roztwór zapasu saponiny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor BSS</td>
			<td></td>
			<td>50 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponina</td>
			<td></td>
			<td>5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Podgrzać bufor BSS do 37 °Cdodać saponinę i wymieszać.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Dodać 0,1% azotku sodu jako konserwant, przechowywać mieszaninę w 4 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Bufory kalibracyjne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Krzywa standardowa dla Candida</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">W pierwszej kolejności należy przygotować 0,15 M roztwór macierzysty każdego z buforów.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Przygotowanie 0,15 M roztworu NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">objętość końcowa 15 ml: 5 ml 0,15 M pożądanego roztworu buforowego + 10 ml 0,15 M roztworu NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 3</td>
			<td>10 mM NaCl</td>
			<td>50 mM glicyny</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 4</td>
			<td>10 mM NaCl</td>
			<td>50 mM octanu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 5</td>
			<td>10 mM NaCl</td>
			<td>50 mM octanu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 6</td>
			<td>10 mM NaCl</td>
			<td>50 mM octanu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7</td>
			<td>10 mM NaCl</td>
			<td>50 mM Tris</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 8</td>
			<td>10 mM NaCl</td>
			<td>50 mM Tris</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 9</td>
			<td>10 mM NaCl</td>
			<td>50 mM Tris</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 10</td>
			<td>10 mM NaCl</td>
			<td>50 mM glicyna</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 1</td>
			<td>10 mM NaCl</td>
			<td>fosforan 50 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 12</td>
			<td>10 mM NaCl</td>
			<td>fosforan 50 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 13</td>
			<td>10 mM NaCl</td>
			<td>50 mM fosforan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Krzywa wzorcowa dla frakcji cytozolowej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Należy użyć wcześniej przygotowanych roztworów buforów stokowych o stężeniu 0,15 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Przygotowanie 0,15 M roztworu KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Objętość końcowa 15 ml: 5 ml 0,15 M pożądanego buforu + 10 ml 0,15 M roztworu KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">dodać roztwór zapasowy nigericyny o stężeniu 10 mM w etanolu 15 µL do każdego roztworu o objętości końcowej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 3</td>
			<td>10 mM KCl</td>
			<td>50 mM glicyny</td>
			<td>10 µM nigerycyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 4</td>
			<td>10 mM KCl</td>
			<td>50 mM octanu</td>
			<td>10 µM nigerycyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 5</td>
			<td>10 mM KCl</td>
			<td>50 mM octanu</td>
			<td>10 µM nigerycyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 6</td>
			<td>10 mM KCl</td>
			<td>50 mM octanu</td>
			<td>10 µM nigerycyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7</td>
			<td>10 mM KCl</td>
			<td>50 mM Tris</td>
			<td>10 µM nigerycyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 8</td>
			<td>10 mM KCl</td>
			<td>50 mM Tris</td>
			<td>10 µM nigerycyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 9</td>
			<td>10 mM KCl</td>
			<td>50 mM Tris</td>
			<td>10 µM nigerycyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 10</td>
			<td>10 mM KCl</td>
			<td>50 mM glicyny</td>
			<td>10 µM nigerycyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 1</td>
			<td>10 mM KCl</td>
			<td>50 mM fosforan</td>
			<td>10 µM nigerycyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 12</td>
			<td>10 mM KCl</td>
			<td>50 mM fosforan</td>
			<td>10 µM nigerycyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 13</td>
			<td>10 mM KCl</td>
			<td>50 mM fosforan</td>
			<td>10 µM nigerycyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Dostosować pH wszystkich roztworów kalibracyjnych za pomocą HCl lub NaOH</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład buforów. Tabela ta opisuje odpowiednie składy poszczególnych buforów wykorzystywanych w protokole.

Uzupełniający plik kodu. Plik ten zawiera szereg makr napisanych przez A. P. Levine, które są niezbędne do analizy obrazów. Autorzy chętnie odpowiedzą na wszelkie pytania związane z wykorzystaniem tego kodu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55107/Phagosomal_measurement.txt" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten manuskrypt opisuje prostą metodę pomiaru pH i powierzchni fagosomalnej oraz cytoplazmatycznego pH neutrofili ludzkich i mysich za pomocą wskaźnika ratiometrycznego seminaphthorhodafluor (SNARF)-1 lub S-1. Osiąga się to za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek i analizy obrazu.

Obrazowanie fagosomu neutrofili i cytoplazmy za pomocą ratiometrycznego wskaźnika pH

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Ogólnym celem tej techniki mikroskopii konfokalnej jest obrazowanie pH oraz powierzchni wakuoli fagocytycznej i cytoplazmy neutrofila. Metoda ta umożliwia monitorowanie i kwantyfikację dynamicznych zmian pH w wakuoli fagocytycznej i w cytoplazmie, a także objętości wakuoli fagocytycznej. Pomiary te zmieniają się wraz z aktywnością NADPH oksydazy i mogą służyć jako markery zastępcze jej funkcji oraz strumieni jonowych przez błonę wakuoli fagocytycznej.Główną zaletą tej techniki jest możliwość jednoczesnego obrazowania fagosomu i cytoplazmy przy użyciu barwnika o szerokim zakresie pH. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować alikwot karboksy-S-1 estru succinimidylowego, rozcieńczając 50 µg substancji w 100 µL wysokiej jakości DMSO. Wymieszać dokładnie za pomocą wortexa.Następnie przygotuj jeden mililitr roztworu HK Candida (zabite termicznie) o stężeniu 10⁸ w 0,1 M wodorowęglanie sodu w probówce o pojemności 15 ml. Dodawaj po jednej kropli 100 µl carboxy-S-1 do HK Candida, mieszając na wortexie przy 2 000 RPM. Następnie owiń probówkę folią aluminiową i pozostaw na rotatorze w temperaturze pokojowej na jedną godzinę.Po godzinie wypłucz HKC-S-1 trzykrotnie poprzez wirowanie z prędkością 2 250 ×g przez 10 minut podczas każdego cyklu. Podczas dwóch pierwszych płukań zawiesić osad w 15 ml 0,1 M wodorowęglanu sodu. Po trzecim płukaniu zawiesić go w 1 ml buforu BSS.Przenieś zawiesinę HKC-S-1 do probówek w alikwotach po 100 µL i przechowuj je w temperaturze -20 °C. Aby przeprowadzić opsonizację HKC-S-1 dla ludzkich neutrofili, dodaj 100 µL ludzkiego serum IgG do 100 µL rozmrożonej zawiesiny HKC-S-1. Mieszaj na wytrząsarce termicznej w temperaturze 37 °C i przy 1000 RPM przez 60 do 90 minut, a następnie na walcarku w temperaturze 4 °C przez dwie godziny.Następnie trzykrotnie przemyj próbkę w buforze BSS, odwirugowując ją przy 17 000 ×g przez jedną minutę w każdym cyklu. Po tym czasie ponownie zawieś próbkę w 100 µL buforu BSS. W przypadku neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej, pobierz 15 mL krwi drogą wenerunkcją od zdrowego dawcy i przenieś ją do strzykawki o pojemności 20 mL zawierającej 90 µL roztworu heparyny sodowej o stężeniu 1 000 IU/mL.Za pomocą końcówki do pipety wstrzyknij 1,5 mililitra 10% roztworu dekstranu do strzykawki. Delikatnie odwróć ją trzy razy, a następnie pozostaw w pozycji pionowej na blacie przez 30 do 60 minut. Po upływie 30 do 60 minut krew powinna rozdzielić się w przybliżeniu na pół, z przypominającą kolor słomy górną warstwą tzw. buffy coat oraz dolną warstwą zawierającą erytrocyty.Ostrożnie wypchnij górną warstwę za pomocą igły lub usuń ją końcówką pipety, a następnie przenieś ją do probówki o pojemności 15 mililitrów, unikając pobrania warstwy czerwonej. Używając pipety o pojemności pięciu mililitrów, dodaj od trzech do czterech mililitrów medium do gradientu gęstości na dno probówki, poniżej warstwy leukocytarnej (buffy coat), aby uzyskać dwie wyraźne warstwy. Następnie odwiruj próbkę przy 900 ×g przez 10 minut.Odlej supernatant, pozostawiając czerwony osad. Następnie delikatnie wymieszaj próbkę w wortexie, aby rozbić osad. Potem dodaj do osadu siedem mililitrów destylowanej wody autoklawowanej i odwracaj probówkę przez 20 sekund, aby ponownie zawiesić osad.Następnie dodaj siedem mililitrów 2x soli fizjologicznej i odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać zawartość i zlizować pozostałe krwinki czerwone, a następnie odwiruj próbkę przy 300 ×g przez pięć minut. Odlej nadsącz i przesuspenduj osad w buforze BSS do stężenia około 4 × 10⁶ na mililitr. W tej procedurze poddaj płytkę mikroskopową z ośmioma dołkami obróbce wstępnej, dodając 200 µL poli-L-lizyny do każdego dołka na 40 do 60 minut w temperaturze pokojowej, następnie usuń poli-L-lizynę i przemyj dołki dwukrotnie 200 µL wody destylowanej.Następnie do każdego dołka należy dodać 200 µL przygotowanej zawiesiny komórkowej i inkubować ją w temperaturze pokojowej od 30 do 60 minut. Po tym czasie należy przygotować alikwot estru S-1-AM, dodając 100 µL wysokiej czystości DMSO do probówki i mieszając za pomocą wibratora typu vortex. W małej probówce należy połączyć 1,7 ml buforu BSS oraz 20 µL S-1-AM, a następnie wymieszać mieszaninę w wibratorze typu vortex.Następnie przemyj studzienki dwukrotnie 200 µL buforu BSS i zastąp bufor roztworem S-1-AM. Należy uważać, aby nie uszkodzić monowarstwy komórek przytwierdzonej do dna studzienek, pipetując płyn ostrożnie po ściance studni. Następnie inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 25 minut.Następnie należy dwukrotnie wypłukać studzienki, używając 200 µL buforu BSS. Aby przetestować inhibitor, przygotowuje się master mix odpowiedniego leku w buforze BSS i dwukrotnie płucze nim studzienki. Następnie poddaje się opsonizowane HKC-S-1 sonikacji przez około trzy sekundy przy pięciu mikronach i dodaje 10 µL zawiesiny do każdej studzienki, po czym inkubuje płytkę w temperaturze 37 °C przez 15–20 minut, przygotowując komórki do obrazowania w celu wykonania zdjęć fagocytozy.Używając mikroskopu konfokalnego, należy dostosować długość fali lasera tak, aby komórki były wzbudzane przy 555 nanometrach, a emisję wykrywały dwa detektory w zakresie od 560 do 600 nanometrów oraz powyżej 610 nanometrów. Następnie należy obejrzeć komórki, używając obiektywu imersyjnego 63X. Aby obejrzeć centralne pole, należy zastosować obrazowanie mozaikowe (tile scan) w trybie ciągłym.Wykorzystując intensywność fluorescencji oraz wzmocnienie kanałów detekcji, należy dostosować ostrość i intensywność lasera oraz wzmocnienie obu kanałów, aby zoptymalizować obraz. Następnie, przy użyciu odpowiednich ustawień, należy rozdzielić obraz, aby widzieć oba kanały. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy sprawdzić, czy w cytoplazmie lub wakuolach nie występuje nasycenie intensywności fluorescencji, które objawiałoby się w postaci czerwonych punktów.Jeśli tak, należy zmniejszyć intensywność lasera tak, aby liczba czerwonych punktów była minimalna, ale komórki i fagosomy pozostawały wystarczająco jasne i wyraźne do obserwacji. W tej procedurze otwórz program ImageJ i wczytaj na pasek narzędzi plik obrazu wybrany do analizy. Aby połączyć dwa kanały, wybierz Image, Color, a następnie Make Composite.Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać plik do zapisu wyników. Następnie kliknij narzędzie Line Tool na pasku narzędzi i kliknij dwukrotnie, aby zwiększyć szerokość do dwóch. Narysuj linię w poprzek szerokości fagosomu, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zmierzyć pH.pH cytoplazmy można zmierzyć w ten sam sposób, rysując linię przez cytoplazmę. Po zakończeniu pomiarów kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać Save File. Aby zmierzyć powierzchnię fagosomu, użyj czwartej ikony na pasku narzędzi, aby obrysować ten obszar odręcznie.Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać Measure Area. Poniżej znajduje się jakościowy klucz wizualny przybliżonego koloru fagosomów barwionych S-1 w zależności od pH. Kolor żółty wskazuje na większą kwasowość, natomiast kolor czerwony na większą zasadowość.Na tym obrazie przedstawiono neutrofile z szpiku kostnego myszy pozbawione kanału Hvcn1 20 minut po fagocytozie. Fagosomy wydają się bardzo czerwone, zasadowe i obrzęknięte. Czerwona strzałka wskazuje tutaj wewnątrzkomórkowe Candida, natomiast ta strzałka wskazuje zewnątrzkomórkowe Candida.Na tym obrazie przedstawiono neutrofile z szpiku kostnego myszy typu dzikiego, które pochłonęły Candida. Wykazują one znacznie mniejszą zasadowość niż neutrofile z nokautem genu Hvcn1. Obraz ten przedstawia neutrofile z ludzkiej krwi obwodowej w tym samym punkcie czasowym po fagocytozie.Wykazują one nieco bardziej zasadowy odczyn niż komórki dzikiego typu myszy, jednak fagocyty wciąż nie są tak duże i czerwone jak w komórkach z nokautem Hvcn1; na tym obrazie widoczne są ludzkie neutrofile, które fagocytowały Candida w obecności pięciu mikromola diphenylene iodonium. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje około czterech do pięciu godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zachować ostrożność podczas izolacji neutrofili, tak aby nie doszło do ich aktywacji.Aby ustalić, czy obserwowane zmiany pH wakuol lub cytozolu oraz objętości wakuol wynikają ze zmian w wyrzucie oddechowym, można zmierzyć ten wyrzut oddechowy innymi metodami, które bezpośrednio oceniają produkcję wolnych rodników lub zużycie tlenu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak izolować ludzkie neutrofile, a następnie barwić i obrazować fagosom oraz cytoplazmę. Należy pamiętać, że praca z próbkami ludzkiej krwi może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i odzieży ochronnej.

imaging-neutrophil-phagosome-cytoplasm-using-ratiometric-ph

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy sposób wykorzystania mikroskopii dwufotonowej do obserwacji dynamiki granulocytów neutrofilnych w zainfekowanych płucach podczas fagocytowania patogenów lub wytwarzania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NETs).

Bezpośrednia obserwacja fagocytozy i tworzenia sieciy z neutrofili (NET) w zakażonych płucach przy użyciu mikroskopii dwufotonowej

Ten film demonstruje test do monitorowania niezależnych zdarzeń fagocytozy krwinek czerwonych (RBC) za pośrednictwem makrofagów. Mysie immunoglobuliny G (IgG) opsonizowane ludzkie erytrocyty są inkubowane z mysimi makrofagami i obserwowane pod mikroskopem konfokalnym. Erytrocyty są pochłaniane przez makrofagi poprzez tworzenie miseczki fagocytarnej i ukierunkowane na degradację lizosomalną.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym fagocytozy makrofagów krwinek czerwonych z opsonizowanymi IgG

Ten film demonstruje technikę mikroskopii TIRF (total internal reflection fluorescence) o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji w czasie rzeczywistym powstawania i zamykania fagosomów podczas fagocytozy za pośrednictwem makrofagów opsonizowanych IgG-opsonizowanych czerwonych krwinek (RBC) przyczepionych do powierzchni naczynia o szklanym dnie. Makrofagi rozciągają pseudopodia wokół erytrocytów i pochłaniają je wewnątrz fagosomów, odrywając je od powierzchni szkła.

Wizualizacja powstawania i zamykania fagosomów oparta na mikroskopii TIRF

Tutaj prezentujemy protokół ilościowego oznaczania fagocytozy cząstek fluorescencyjnych za pomocą przylegającej linii komórkowej makrofagów przy użyciu metody fluorometrycznej. Metoda ta ułatwia wysokoprzepustową kwantyfikację internalizacji cząstek, a także wynikającą z niej polimeryzację aktyny.

Wysokoprzepustowa technika fluorometryczna do oceny fagocytozy makrofagów i polimeryzacji aktyny

pH fagosomalne wpływa na dojrzewanie fagosomów, produkcję utleniaczy, zabijanie fagosomalów, a także na prezentację antygenu. W tym miejscu opisujemy ratiometryczną metodę pomiaru zmian pH w czasie i punkcie końcowym w poszczególnych fagosomach w żywych fagocytach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Pomiar pH fagosomu za pomocą ratiometrycznej mikroskopii fluorescencyjnej

Opisujemy eksperymentalny układ do wizualizacji z bezprecedensową wysoką rozdzielczością tworzenia i zamykania fagosomów w trzech wymiarach u żywych makrofagów, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Umożliwia monitorowanie podstawy miseczki fagocytarnej, rozciągających się pseudopodów, a także dokładnego miejsca rozszczepienia fagosomu.

"Test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

Tutaj opisujemy technikę opartą na mikroskopie, aby wizualizować i kwantyfikować wczesne kaskady zdarzeń podczas fagocytozy patogenów, takich jak grzyby Candida albicans i cząstki większe niż 0,5 μm, w tym kulki pokryte zymozanem i IgG.

Wizualizacja wczesnych stadiów fagocytozy

Tutaj opisujemy protokół oceny aktywności przeciwgrzybiczej pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencyjnych konidiów reporterowych Aspergillus w połączeniu z mikroskopią wideo żywych komórek i cytometrią przepływową. Wygenerowane dane dostarczają informacji na temat interakcji między komórką gospodarza a Aspergillus, takich jak działanie grzybobójcze, fagocytoza, migracja komórek i hamowanie wzrostu grzybów.

Obrazowanie na żywo aktywności przeciwgrzybiczej przez ludzkie pierwotne neutrofile i monocyty w odpowiedzi na A. fumigatus

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Choroby neurodegeneracyjne są związane z rozregulowanymi funkcjami mikrogleju. W artykule przedstawiono test in vitro fagocytozy komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC. Odczyty z mikroskopii ilościowej opisano zarówno dla obrazowania poklatkowego żywych komórek, jak i obrazowania o wysokiej zawartości komórek stałych.

Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC

Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Poznaj metodę pomiaru pH fagosomu i cytoplazmy neutrofili ludzkich i mysich przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego SNARF-1. Technika ta wykorzystuje konfokalną mikroskopię fluorescencyjną komórek żywych.

Obrazowanie fagosomu neutrofili i cytoplazmy za pomocą ratiometrycznego wskaźnika pH

Przeglądaj więcej filmów