Obrazowanie fagosomu neutrofili i cytoplazmy za pomocą ratiometrycznego wskaźnika pH

Ogólnym celem tej techniki mikroskopii konfokalnej jest obrazowanie pH oraz powierzchni wakuoli fagocytycznej i cytoplazmy neutrofila. Metoda ta umożliwia monitorowanie i kwantyfikację dynamicznych zmian pH w wakuoli fagocytycznej i w cytoplazmie, a także objętości wakuoli fagocytycznej. Pomiary te zmieniają się wraz z aktywnością NADPH oksydazy i mogą służyć jako markery zastępcze jej funkcji oraz strumieni jonowych przez błonę wakuoli fagocytycznej.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość jednoczesnego obrazowania fagosomu i cytoplazmy przy użyciu barwnika o szerokim zakresie pH. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować alikwot karboksy-S-1 estru succinimidylowego, rozcieńczając 50 µg substancji w 100 µL wysokiej jakości DMSO. Wymieszać dokładnie za pomocą wortexa.

Następnie przygotuj jeden mililitr roztworu HK Candida (zabite termicznie) o stężeniu 10⁸ w 0,1 M wodorowęglanie sodu w probówce o pojemności 15 ml. Dodawaj po jednej kropli 100 µl carboxy-S-1 do HK Candida, mieszając na wortexie przy 2 000 RPM. Następnie owiń probówkę folią aluminiową i pozostaw na rotatorze w temperaturze pokojowej na jedną godzinę.

Po godzinie wypłucz HKC-S-1 trzykrotnie poprzez wirowanie z prędkością 2 250 ×g przez 10 minut podczas każdego cyklu. Podczas dwóch pierwszych płukań zawiesić osad w 15 ml 0,1 M wodorowęglanu sodu. Po trzecim płukaniu zawiesić go w 1 ml buforu BSS.

Przenieś zawiesinę HKC-S-1 do probówek w alikwotach po 100 µL i przechowuj je w temperaturze -20 °C. Aby przeprowadzić opsonizację HKC-S-1 dla ludzkich neutrofili, dodaj 100 µL ludzkiego serum IgG do 100 µL rozmrożonej zawiesiny HKC-S-1. Mieszaj na wytrząsarce termicznej w temperaturze 37 °C i przy 1000 RPM przez 60 do 90 minut, a następnie na walcarku w temperaturze 4 °C przez dwie godziny.

Następnie trzykrotnie przemyj próbkę w buforze BSS, odwirugowując ją przy 17 000 ×g przez jedną minutę w każdym cyklu. Po tym czasie ponownie zawieś próbkę w 100 µL buforu BSS. W przypadku neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej, pobierz 15 mL krwi drogą wenerunkcją od zdrowego dawcy i przenieś ją do strzykawki o pojemności 20 mL zawierającej 90 µL roztworu heparyny sodowej o stężeniu 1 000 IU/mL.

Za pomocą końcówki do pipety wstrzyknij 1,5 mililitra 10% roztworu dekstranu do strzykawki. Delikatnie odwróć ją trzy razy, a następnie pozostaw w pozycji pionowej na blacie przez 30 do 60 minut. Po upływie 30 do 60 minut krew powinna rozdzielić się w przybliżeniu na pół, z przypominającą kolor słomy górną warstwą tzw. buffy coat oraz dolną warstwą zawierającą erytrocyty.

Ostrożnie wypchnij górną warstwę za pomocą igły lub usuń ją końcówką pipety, a następnie przenieś ją do probówki o pojemności 15 mililitrów, unikając pobrania warstwy czerwonej. Używając pipety o pojemności pięciu mililitrów, dodaj od trzech do czterech mililitrów medium do gradientu gęstości na dno probówki, poniżej warstwy leukocytarnej (buffy coat), aby uzyskać dwie wyraźne warstwy. Następnie odwiruj próbkę przy 900 ×g przez 10 minut.

Odlej supernatant, pozostawiając czerwony osad. Następnie delikatnie wymieszaj próbkę w wortexie, aby rozbić osad. Potem dodaj do osadu siedem mililitrów destylowanej wody autoklawowanej i odwracaj probówkę przez 20 sekund, aby ponownie zawiesić osad.

Następnie dodaj siedem mililitrów 2x soli fizjologicznej i odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać zawartość i zlizować pozostałe krwinki czerwone, a następnie odwiruj próbkę przy 300 ×g przez pięć minut. Odlej nadsącz i przesuspenduj osad w buforze BSS do stężenia około 4 × 10⁶ na mililitr. W tej procedurze poddaj płytkę mikroskopową z ośmioma dołkami obróbce wstępnej, dodając 200 µL poli-L-lizyny do każdego dołka na 40 do 60 minut w temperaturze pokojowej, następnie usuń poli-L-lizynę i przemyj dołki dwukrotnie 200 µL wody destylowanej.

Następnie do każdego dołka należy dodać 200 µL przygotowanej zawiesiny komórkowej i inkubować ją w temperaturze pokojowej od 30 do 60 minut. Po tym czasie należy przygotować alikwot estru S-1-AM, dodając 100 µL wysokiej czystości DMSO do probówki i mieszając za pomocą wibratora typu vortex. W małej probówce należy połączyć 1,7 ml buforu BSS oraz 20 µL S-1-AM, a następnie wymieszać mieszaninę w wibratorze typu vortex.

Następnie przemyj studzienki dwukrotnie 200 µL buforu BSS i zastąp bufor roztworem S-1-AM. Należy uważać, aby nie uszkodzić monowarstwy komórek przytwierdzonej do dna studzienek, pipetując płyn ostrożnie po ściance studni. Następnie inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 25 minut.

Następnie należy dwukrotnie wypłukać studzienki, używając 200 µL buforu BSS. Aby przetestować inhibitor, przygotowuje się master mix odpowiedniego leku w buforze BSS i dwukrotnie płucze nim studzienki. Następnie poddaje się opsonizowane HKC-S-1 sonikacji przez około trzy sekundy przy pięciu mikronach i dodaje 10 µL zawiesiny do każdej studzienki, po czym inkubuje płytkę w temperaturze 37 °C przez 15–20 minut, przygotowując komórki do obrazowania w celu wykonania zdjęć fagocytozy.

Używając mikroskopu konfokalnego, należy dostosować długość fali lasera tak, aby komórki były wzbudzane przy 555 nanometrach, a emisję wykrywały dwa detektory w zakresie od 560 do 600 nanometrów oraz powyżej 610 nanometrów. Następnie należy obejrzeć komórki, używając obiektywu imersyjnego 63X. Aby obejrzeć centralne pole, należy zastosować obrazowanie mozaikowe (tile scan) w trybie ciągłym.

Wykorzystując intensywność fluorescencji oraz wzmocnienie kanałów detekcji, należy dostosować ostrość i intensywność lasera oraz wzmocnienie obu kanałów, aby zoptymalizować obraz. Następnie, przy użyciu odpowiednich ustawień, należy rozdzielić obraz, aby widzieć oba kanały. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy sprawdzić, czy w cytoplazmie lub wakuolach nie występuje nasycenie intensywności fluorescencji, które objawiałoby się w postaci czerwonych punktów.

Jeśli tak, należy zmniejszyć intensywność lasera tak, aby liczba czerwonych punktów była minimalna, ale komórki i fagosomy pozostawały wystarczająco jasne i wyraźne do obserwacji. W tej procedurze otwórz program ImageJ i wczytaj na pasek narzędzi plik obrazu wybrany do analizy. Aby połączyć dwa kanały, wybierz Image, Color, a następnie Make Composite.

Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać plik do zapisu wyników. Następnie kliknij narzędzie Line Tool na pasku narzędzi i kliknij dwukrotnie, aby zwiększyć szerokość do dwóch. Narysuj linię w poprzek szerokości fagosomu, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zmierzyć pH.

pH cytoplazmy można zmierzyć w ten sam sposób, rysując linię przez cytoplazmę. Po zakończeniu pomiarów kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać Save File. Aby zmierzyć powierzchnię fagosomu, użyj czwartej ikony na pasku narzędzi, aby obrysować ten obszar odręcznie.

Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać Measure Area. Poniżej znajduje się jakościowy klucz wizualny przybliżonego koloru fagosomów barwionych S-1 w zależności od pH. Kolor żółty wskazuje na większą kwasowość, natomiast kolor czerwony na większą zasadowość.

Na tym obrazie przedstawiono neutrofile z szpiku kostnego myszy pozbawione kanału Hvcn1 20 minut po fagocytozie. Fagosomy wydają się bardzo czerwone, zasadowe i obrzęknięte. Czerwona strzałka wskazuje tutaj wewnątrzkomórkowe Candida, natomiast ta strzałka wskazuje zewnątrzkomórkowe Candida.

Na tym obrazie przedstawiono neutrofile z szpiku kostnego myszy typu dzikiego, które pochłonęły Candida. Wykazują one znacznie mniejszą zasadowość niż neutrofile z nokautem genu Hvcn1. Obraz ten przedstawia neutrofile z ludzkiej krwi obwodowej w tym samym punkcie czasowym po fagocytozie.

Wykazują one nieco bardziej zasadowy odczyn niż komórki dzikiego typu myszy, jednak fagocyty wciąż nie są tak duże i czerwone jak w komórkach z nokautem Hvcn1; na tym obrazie widoczne są ludzkie neutrofile, które fagocytowały Candida w obecności pięciu mikromola diphenylene iodonium. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje około czterech do pięciu godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zachować ostrożność podczas izolacji neutrofili, tak aby nie doszło do ich aktywacji.

Aby ustalić, czy obserwowane zmiany pH wakuol lub cytozolu oraz objętości wakuol wynikają ze zmian w wyrzucie oddechowym, można zmierzyć ten wyrzut oddechowy innymi metodami, które bezpośrednio oceniają produkcję wolnych rodników lub zużycie tlenu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak izolować ludzkie neutrofile, a następnie barwić i obrazować fagosom oraz cytoplazmę. Należy pamiętać, że praca z próbkami ludzkiej krwi może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i odzieży ochronnej.