Monitorowanie reaktywności i proliferacji astrocytów in vitro w warunkach podobnych do niedokrwiennych
21 października 2017
Udar niedokrwienny jest złożonym zdarzeniem, w którym trudno jest zbadać specyficzny wpływ astrocytów na dotknięty obszar mózgu narażony na tlen, deprywację glukozy (OGD). W artykule przedstawiono metodologię otrzymywania izolowanych astrocytów oraz badania ich reaktywności i proliferacji w warunkach OGD.
Poniższy protokół ma na celu pokazanie izolacji pierwszorzędowych astrocytów z mózgów młodych szczurów w celu przeprowadzenia deprywacji tlenu glukozy lub OGD. Ekspozycja oczyszczonych astrocytów, na środowisko pozbawione tlenu i glukozy, jest modułem, który pozwala nam przetestować reakcję na niektóre stany występujące w udarach niedokrwiennych. Metodyczne zmiany po ekspozycji na tlen można zaobserwować i zmierzyć za pomocą selektywnych markerów astrocytów, takich jak GFAP.
Podsumowując, te wyizolowane komórki wystawione na stany podobne do niedokrwiennych mogą być wykorzystane do testowania nowych dróg częściowych aktywowanych w warunkach niedotlenienia i innych leków, które chronią przed udarem niedokrwiennym. W tej części protokołu astrocyty zostaną wyizolowane z kory zębów szczurów. Celem tej procedury jest uzyskanie pierwotnej hodowli komórek astrocytarnych w celu przeprowadzenia eksperymentów z deprywacją tlenu i glukozy.
Materiały do tej procedury są następujące: Autoklaw wszystkie materiały przed użyciem ich w tej procedurze. I wystaw kaptur na działanie co najmniej 20 minut światła UV przed rozpoczęciem protokołu. Aby rozpocząć tę procedurę, odpipetuj od trzech do pięciu mililitrów kompletnego podłoża DME na każdej płytce.
Zostanie ona podzielona w następujący sposób, po jednym dla każdego mózgu myszy, dwa dla całej kory mózgowej i trzy dla wszystkich kory mózgowej bez opon mózgowych. Odetnij głowę szczeniakowi po dezynfekcji 70% etanolem. Wykonaj nacięcie zaczynając od tyłu głowy w kierunku nosa.
Usuń czaszkę zakrzywionym kleszczem i delikatnie zeskrob móżdżek, odsłaniając korę. Usuń odsłonięty mózg za pomocą pęsety i umieść mózg na pierwszej szalce Petriego z pożywką. Powtórz te kroki dla wszystkich pozostałych szczeniąt.
Oddziel półkule mózgowe, delikatnie dzieląc wzdłuż szczeliny linii środkowej ostrym końcem mikrokleszczy preparacyjnych. Obierz korę, usuwając istotę białą i hipokamp za pomocą pęsety ruchem szczypiącym, pozostawiając je w tyle. Przenieś korki skórki na szalkę Petriego oznaczoną numerem dwa.
Powtórz procedurę dla wszystkich mózgów, łącząc wszystkie wypreparowane kory na szalce Petriego. Delikatnie potrząśnij naczyniem, aby równomiernie rozprowadzić pożywkę między wszystkimi korami. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby zidentyfikować opony mózgowe wyściełające złuszczoną korę.
Opony mózgowe to bardzo cienka przezroczysta warstwa, którą można zidentyfikować, szukając małych czerwonych naczyń włosowatych otaczających tkankę. Dokładnie sprawdź i usuń opony mózgowe wyściełające korę i delikatnie oderwij je od poszczególnych płatów korowych za pomocą cienkiej pęsety po obu stronach każdej kory. Umieść czystą korę na nowej szalce Petriego oznaczonej numerem trzy.
W celu dysocjacji tkanek metodą żołądka lub blendera, wlej czyste, obrane korki i pożywkę z szalki Petriego do sterylnej torby blendera. I dodaj tyle nośnika, aby całkowita objętość torby wynosiła pięć mililitrów. Umieść worek w stomacherze 80, pozostawiając około dwóch centymetrów worka widocznych nad zamkniętymi drzwiczkami.
Dysocjacja komórek w tym instrumencie odbywa się po 2,5 minuty z dużą prędkością. Alternatywnie, dysocjację tkanek można wykonać, zamykając sterylną torebkę i delikatnie ubijając tkankę zlewką w kapturze, aż cząsteczki tkanki staną się drobną zawiesiną. Upewnij się, że używasz szmatki między torbą a zlewką, aby uniknąć tarcia i pęknięcia torby.
Wlej zawiesinę komórkową na środek rękawa z oczkiem numer 60. Wlej przefiltrowane komórki do środka siatki numer 100, pozwalając jej przefiltrować grawitacyjnie. Wlej przefiltrowaną zawiesinę komórkową do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.
Środkowe fugetowanie zawiesiny ogniw przy 200 razy G w środkowej fuzie, najlepiej za pomocą huśtawki kubełkowej przez pięć minut. Usunąć supernatant i wyrzucić do zlewki. Dodaj cały świeży nośnik do palety komórek.
Za pomocą pipety serologicznej ponownie zawiesić i zdysocjować paletę komórek w maksymalnie pięciu mililitrach pożywki. Dodać żądaną ilość zawiesiny komórek do kolby i uzupełnić pożywką. Dodać ponownie zawieszoną paletę do kolby z podłożem.
Rozmieść komórki równomiernie w kolbie i umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Pamiętaj, aby wymieniać nośniki co trzy dni. Poniższa metodologia ma na celu pozbawienie komórek tlenu i glukozy w kontrolowanym środowisku.
Celem tego modelu jest zbadanie odpowiedzi astrocytów w stanie podobnym do udaru niedokrwiennego. Materiały użyte do tej procedury to: Oczyść pożywkę wolną od glukozy, wkładając pipetę serologiczną podłączoną do instalacji gazowej. Bąbelkować roztwór mieszaniną gazów przez 10 minut przy przepływie od 10 do 15 litrów na minutę.
Po upływie 10 minut dostosuj pH pożywki OGD do 7,4. Przefiltruj oczyszczone medium wolne od glukozy za pomocą systemu filtrów rurkowych o pojemności 50 mililitrów. Ważne jest, aby zawsze przygotowywać świeżą pożywkę OGD do każdego eksperymentu.
Zapewni to, że podłoże zostanie oczyszczone z tlenu. Usuń pożywkę astrocytów i przemyj komórkowym PBS dwa razy, aby usunąć glukozę z komórek. Dodaj pożywkę OGD do studzienek.
Umieść naczynie wielodołkowe z otwartą pokrywką w komorze hipoksji. Podłączyć mieszaninę gazów do zaworu wejściowego i pozostawić zawór wylotowy otwarty. Przepłukać komorę mieszaniną gazów w ilości od 10 do 15 śmieci na minutę przez pięć do siedmiu minut.
Zatrzymaj przepływ gazu i najpierw zamknij zacisk na zaworze wylotowym. Następnie zamknij zacisk na rurce zaworu wlotowego gazu. Umieścić komorę hipoksyjną w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza na żądany czas w OGD.
Po upływie czasu inkubacji odessać pożywkę OGD i ostrożnie dodać cały DMEM do komórek w celu uzyskania warunków normoksycznych. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze hodowlanym na zero 24 i 48 godzin w warunkach normoksyjnych. Protokół ten opisuje izolację astrocytów od kory noworodków szczurów.
Po sprawdzeniu czystości kultur pierwotnych przeprowadzono eksperymenty z OGD. W tym modelu niedokrwiennym niedobór glukozy i tlenu wywołał bardziej morfologiczną zmianę, która była monitorowana przez immunofluorescencję przy użyciu markerów astrocytowych, takich jak GFAP lub markerów proliferacji, takich jak PCNA. Jedną z zalet tego modelu jest to, że pozwala nam badać odpowiedź określonego typu komórki.
Chociaż ograniczeniem w tej technice jest brak interakcji między komórkami ze względu na izolację astrocytów. Jednym z możliwych sposobów przezwyciężenia tego ograniczenia jest wystawienie astrocytów na działanie pożywek kondycjonujących z innych typów komórek lub kokultury. Podsumowując, metoda deprywacji glukozy tlenem w izolowanym układzie komórkowym, pozwala nam bezpośrednio przetestować działanie różnych neuronalnych cząsteczek ochronnych lub neurotoksycznych.
Jest to również ważne narzędzie do badania biologii astrocytów. Wreszcie, model ten stanowi solidną podstawę do badania leków rozwojowych w warunkach eksperymentalnych przy użyciu modeli in vivo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół izolacji pierwotnych astrocytów z mózgów szczurzych noworodków w celu zbadania ich odpowiedzi na deprywację tlenu i glukozy (OGD), stan naśladujący udar niedokrwienny. Zastosowana metodologia pozwala badaczom na obserwację zmian w reaktywności i proliferacji astrocytów w warunkach OGD.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Badania nad udarem
Wstęp
- Udar niedokrwienny wiąże się ze złożonymi odpowiedziami komórkowymi.
- Astrocyty odgrywają kluczową rolę w uszkadzaniu i regeneracji mózgu.
- Badanie astrocytów w warunkach OGD może dostarczyć istotnych informacji.
- Do oceny zmian w astrocytach stosuje się selektywne markery, takie jak GFAP.
Cel badania
- Wyizolowanie pierwotnych astrocytów do analizy eksperymentalnej.
- Zbadanie zachowania astrocytów w warunkach symulujących niedokrwienie.
- Przetestowanie potencjalnych leków ochronnych przeciwko udarowi niedokrwiennemu.
Zastosowane metody
- Izolacja pierwotnych astrocytów z kory mózgu szczurzych noworodków.
- Poddanie astrocytów deprywacji tlenowo-glukozowej.
- Pomiar reaktywności astrocytów z wykorzystaniem markerów GFAP.
- Ocena odpowiedzi komórkowych na warunki hipoksyjne.
Główne wyniki
- Izolowane astrocyty wykazują mierzalne zmiany w warunkach OGD.
- Markery GFAP wskazują na aktywację astrocytów.
- Można zidentyfikować potencjalne szlaki aktywowane w odpowiedzi na hipoksję.
- Wyniki mogą dostarczyć informacji dla strategii terapeutycznych w udarze niedokrwiennym.
Wnioski
- Protokół ten zapewnia wiarygodną metodę izolacji astrocytów.
- Zrozumienie reakcji astrocytów może wspomóc badania nad udarem.
- Przyszłe badania mogą skupić się na analizie skuteczności leków w ochronie astrocytów.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Reaktywność i proliferacja astrocytów w warunkach imitujących niedokrwienie są kluczowe dla zrozumienia mechanizmów komórkowych, które napędzają uszkodzenie i naprawę mózgu po udarze. Ten model OGD in vitro umożliwia precyzyjne badanie specyficznych odpowiedzi astrocytów, co zwiększa pewność prognostyczną w wczesnej walidacji celów neuroprotekcyjnych. Podejście to pozwala na optymalizację procesu rozwoju kandydatów na leki neuroterapeutyczne poprzez izolację szlaków zależnych od astrocytów oraz efektów czynników rozpuszczalnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez izolację reakcji astrocytów na stres niedokrwienny.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez ilościową analizę markerów GFAP i PCNA.
- Ułatwia badanie szlaków sygnałowych w celu przesiewania związków neuroprotekcyjnych lub neurotoksycznych.
- Zapewnia kontrolowany system do weryfikacji hipotez dotyczących biologii astrocytów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, powtarzalne modele in vitro do screeningu związków w warunkach OGD.
- Standaryzuje ilościowe odczyty reaktywności i proliferacji astrocytów na potrzeby opracowywania testów.
- Umożliwia pozyskiwanie pożywki warunkowanej astrocytami do dalszych analiz neuronów.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy w programach dotyczących neurozapalenia i neuroprotekcji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki uzyskane in vitro z istotnymi dla choroby mechanizmami niedokrwiennymi obserwowanymi in vivo.
- Umożliwia translacyjną eksplorację biomarkerów poprzez analizę czynników rozpuszczalnych z kultur astrocytów.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację strategii neuroprotekcyjnych.
- Umożliwia predykcyjne ograniczanie ryzyka przy wyborze kandydatów przed rozpoczęciem badań na zwierzętach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model astrocytów oparty na OGD wpisuje się w kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, stanowiąc pomost między wczesnymi badaniami mechanistycznymi a badaniami translacyjnymi w obszarze udarów i neuroprotekcji.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w izolowanych układach astrocytów.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny związków w warunkach stresu typu niedokrwiennego.
- Analityka: Umożliwia pomiar GFAP, PCNA oraz czynników rozpuszczalnych w celu przeprowadzenia analizy porównawczej w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy odpowiedzi astrocytów in vitro z biomarkerami i wynikami funkcjonalnymi in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku dla procesów badawczo-rozwojowych w zakresie neurozapalenia i neuroprotekcji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w odkrywaniu leków neuroterapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, odtwarzalność i skalowalność testów istotnych dla badania niedokrwienia.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów na leki neuroprotekcyjne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w izolacji pierwotnych komórek oraz w modelowaniu hipoksji in vitro.
- Wymaga dostępu do komór hipoksyjnych, systemów kontroli gazów oraz analiz immunofluorescencyjnych.
- Konieczna jest standaryzacja parametrów ekspozycji na OGD oraz kwantyfikacji markerów pomiędzy zespołami.
- W zależności od potrzeb portfolio może być wymagana adaptacja dla różnych gatunków lub obszarów mózgu.
- Metoda jest ograniczona brakiem oddziaływań międzykomórkowych; dla szerszej istotności translacyjnej może być konieczne zastosowanie kokultur lub mediów warunkujących.
