Name: Monitorowanie reaktywności i proliferacji astrocytów in vitro w warunkach podobnych do niedokrwiennych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 8 s
Description: Poznaj metodę izolacji pierwotnych astrocytów z mózgów szczurzych szczeniąt do badań reaktywności i proliferacji w warunkach niedokrwiennych. Technika ta umożliwia testowanie neuroprotekcyjnych leków przeciwko udarowi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Paoli López Pieraldi za pomoc techniczną. A.H.M. jest wdzięczna za granty 8G12MD007600 i U54-NS083924, które wsparły tę publikację. Dziękujemy NIH-NIMHD-G12-MD007583 dotację za wsparcie obiektu. D.E.R.A. jest wdzięczna za stypendium zapewnione przez NIHNIGMS-R25GM110513. Jesteśmy wdzięczni za korzystanie ze Wspólnego Obszaru Oprzyrządowania oraz za pomoc dr Priscili Sanabrii w korzystaniu z Zakładu Obrazowania Optycznego programu RCMI w ramach grantu G12MD007583. Ponadto chcemy podziękować Jose Padilli za jego wyjątkową rolę w kręceniu i montażu protokołu wizualnego.

<ol><li>Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrater+reliability+of+the+NIH+stroke+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Neurol%22%5BJournal%5D)">Interrater reliability of the NIH stroke scale.</a> Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).</li>
<li>Hinkle, J. L., Guanci, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ischemic+stroke+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Nurs%22%5BJournal%5D)">Acute ischemic stroke review.</a> J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).</li>
<li>Kassner, A., Merali, Z. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26463696">Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke.</a> Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).</li>
<li>Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+stroke%3A+mechanisms+in+search+of+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The science of stroke: mechanisms in search of treatments.</a> Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).</li>
<li>Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elusive+roles+for+reactive+astrocytes+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases.</a> Front Cell Neurosci. 9, 278(2015).</li>
<li>Broderick, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/articles/17938297/">Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists.</a> Stroke. 38 (6), 2001-2023 (2007).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-glucose+deprivation+induced+glial+scar-like+change+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes.</a> PLoS One. 7 (5), e37574(2012).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+in+neural+repair+and+protection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes in neural repair and protection.</a> The Neuroscientist. 11 (5), 400-407 (2005).</li>
<li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).</li>
<li>Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adult+rat+astrocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of adult rat astrocyte cultures.</a> PLoS One. 8 (3), e60282(2013).</li>
<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HB-EGF+affects+astrocyte+morphology%2C+proliferation%2C+differentiation%2C+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li>
<li>Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+Hypertrophy+Contributes+to+Aberrant+Neurogenesis+after+Traumatic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury.</a> Neural Plast. , 1347987(2016).</li>
<li>Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+and+Intermediary+Metabolism+and+Astrocyte-Neuron+Interactions+Following+Neonatal+Hypoxia-Ischemia+in+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat.</a> Neurochem Res. , (2016).</li>
<li>Cekanaviciute, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+transforming+growth+factor-beta+signaling+reduces+subacute+neuroinflammation+after+stroke+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice.</a> Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+cell+cycle+progression+reduces+reactive+astrogliosis+initiated+by+scratch+injury+in+vitro+and+by+cerebral+ischemia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo.</a> Glia. 55 (5), 546-558 (2007).</li>
<li>Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+over+resting+and+reactive+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Restor+Neurol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes.</a> Restor Neurol Neurosci. 2 (4), 221-228 (1991).</li>
<li>Anderson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+scar+formation+aids+central+nervous+system+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration.</a> Nature. 532 (7598), 195-200 (2016).</li>
<li>Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-like+cells+originate+from+neuroepithelium+in+culture%3A+characterization+and+properties+of+the+macrophage-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells.</a> Int J Dev Neurosci. 9 (1), 1-14 (1991).</li>
<li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cells+in+astroglial+cultures%3A+a+cautionary+note%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4, 26(2007).</li>
<li>Giulian, D., Baker, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ameboid+microglia+isolated+from+developing+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain.</a> J Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J Vis Exp. (71), (2013).</li>
<li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16 (3), 282-292 (1998).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+microglia+from+primary+cellular+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Depletion of microglia from primary cellular cultures.</a> Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).</li>
<li>Svensson, M., Aldskogius, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+density+of+axotomized+hypoglossal+motorneurons+following+pharmacological+blockade+of+the+microglial+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation.</a> Exp Neurol. 120 (1), 123-131 (1993).</li>
<li>Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+rabbit+ocular+fibroblast+proliferation+by+5-fluorouracil+and+cytosine+arabinoside%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ocul+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside.</a> J Ocul Pharmacol. 7 (1), 27-39 (1991).</li>
<li>Nakatsuji, Y., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+dependent+modulation+of+cell+cycle+protein+expression+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes.</a> J Neurosci Res. 66 (3), 487-496 (2001).</li>
<li>Reeves, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+amino+acids+by+lysosomes+incubated+with+amino+acid+methyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters.</a> J Biol Chem. 254 (18), 8914-8921 (1979).</li>
<li>Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+of+the+accessory+cell+necessary+for+mitogen-stimulated+T+and+B+cell+responses+in+human+peripheral+blood%3A+delineation+by+its+sensitivity+to+the+lysosomotropic+agent%2C+L-leucine+methyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester.</a> J Immunol. 131 (5), 2282-2290 (1983).</li>
<li>Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+improved+procedure+for+the+removal+of+microglia+from+confluent+monolayers+of+primary+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).</li>
<li>Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+modulation+of+calcium+channel+activity+in+cultured+rat+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (11), 4345-4348 (1990).</li>
<li>Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+dissolved+oxygen+from+water%3A+A+comparison+of+four+common+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques.</a> Talanta. 41 (2), 211-215 (1994).</li>
<li>Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+oxygen-glucose+deprivation+to+study+ischemic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death.</a> Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).</li>
<li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+testing+of+hypoxia+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and testing of hypoxia in cell culture.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Rivera-Aponte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+reduces+functional+expression+of+astrocytic+Kir4.+1+channels+and+glial+glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake.</a> Neuroscience. 310, 216-223 (2015).</li>
<li>Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharides+do+not+alter+metabolic+disturbances+in+hippocampal+slices+of+fetal+guinea+pigs+after+oxygen-glucose+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+research%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation.</a> Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).</li>
<li>Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+the+anoxic+depolarization+protects+without+functional+compromise+following+simulated+stroke+in+cortical+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices.</a> Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).</li>
<li>Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxic+depolarization+mediates+acute+damage+independent+of+glutamate+in+neocortical+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices.</a> Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje izolację astrocytów od kory szczura. W tej metodzie kluczowe znaczenie ma zmniejszenie zanieczyszczenia innymi typami komórek, takimi jak mikroglej, oligodendrocyty i fibroblasty. Aby zmniejszyć liczbę mikrogleju, można podjąć kilka kroków: zmianę pożywki, wytrząsanie orbitalne i zabiegi chemiczne. Po potwierdzeniu czystości hodowli za pomocą immunofluorescencji przy użyciu selektywnych markerów komórkowych lub dla najbardziej widocznych zanieczyszczeń komórkowych można przeprowadzić eksperymenty. Na...

Udar mózgu jest definiowany jako "ostra dysfunkcja neurologiczna pochodzenia naczyniowego z nagłym lub szybkim rozwojem objawów i oznak, odpowiadających zaangażowaniu ogniskowych obszarów w mózgu"1,2. Istnieją dwa rodzaje udaru: krwotoczny i niedokrwienny. Gdy dysfunkcja naczyń krwionośnych jest spowodowana tętniakiem lub nieprawidłowym funkcjonowaniem tętnic żylnych, któremu towarzyszy osłabienie z tylnym pęknięciem tętnicy, nazywa się to udarem krwotocznym3, który w większości przypadków prowadzi do śmierci. Kiedy skrzeplina lub zator utrudnia przepływ krwi, powodując tymczasowe pozbawienie tlenu i glukozy w obszarze mózgu, nazywa się to udarem niedokrwiennym4. Brak odżywienia komórek wokół dotkniętego obszaru lub niedokrwionego rdzenia prowadzi do zaburzenia równowagi homeostatycznej i metabolicznej, dysfunkcji energetycznej, śmierci neuronów i stanu zapalnego5, co może wywołać niepełnosprawność pacjentów na całe życie6.
Udar niedokrwienny to wieloczynnikowy uraz obejmujący kilka typów komórek, które reagują i wywierają swoje efekty w różnych punktach czasowych. Wiele interakcji tworzy trudne środowisko do badania zachowania poszczególnych komórek. Jak więc badać udział określonego typu komórek w tak złożonym środowisku? Przyjęty model niedokrwienia in vitro polega na wystawieniu komórek na działanie deprywacji tlenu i glukozy (OGD) przez pewien czas, po czym następuje przywrócenie komórek do normalnego środowiska. System ten symuluje udar niedokrwienny, po którym następuje reperfuzja krwi. W tej metodzie komórki lub tkanki są wystawione na działanie pożywki wolnej od glukozy w środowisku oczyszczonym z tlenu, przy użyciu specjalistycznej komory hipoksyjnej. Czas inkubacji OGD może wahać się od kilku minut do 24 godzin, w zależności od hipotezy, która ma być testowana. Badania wykazały, że w zależności od czasu wystąpienia OGD i normoksycznego środowiska, można osiągnąć określone fenotypy udaru (tj. ostre lub podprzewlekłe). Pierwotne izolowane astrocyty, wystawione na OGD z tylnym przywróceniem do warunków normoksyjnych, są dobrze zbadanym modelem komórkowym naśladującym udar in vitro7. Za pomocą OGD możliwe jest ujawnienie niezależnych mechanizmów molekularnych izolowanych komórek w środowisku podobnym do udaru.
Wraz ze wzrostem naszej wiedzy na temat biologii astrocytów, stało się oczywiste, że są one kluczowe dla utrzymania synaps i podtrzymania naprawy, rozwoju i plastyczności neuronów8. W normalnych warunkach astrocyty uwalniają i reagują na cytokiny, chemokiny, czynniki wzrostu i glioprzekaźniki, utrzymując równowagę metaboliczną i homeostazę w synapsach5,9. W ostrym zapaleniu układu nerwowego, takim jak udar niedokrwienny, komórki te mogą stać się reaktywne, wykazywać długotrwałą nadekspresję kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) i wykazywać przerost w swojej morfologii5,10,11,12. Wraz z rozwojem zawału niedokrwiennego homeostaza zapewniana przez astrocyty ulega zmianie, w odniesieniu do prawidłowego wychwytu glutaminianu, metabolizmu energetycznego, wymiany aktywnych cząsteczek i aktywności przeciwutleniającej13.
Reaktywowane astrocyty namnażają się wokół tkanki zawału, podczas gdy leukocyty migrują w kierunku obszaru uszkodzonego14. Proliferację astrocytów można mierzyć za pomocą markerów, takich jak antygen jądrowy proliferacji komórek (PCNA), Ki67 i bromodeoksyurydyna (BrdU)15. Ta odpowiedź proliferacyjna jest generowana w sposób zależny od czasu i pomaga w tworzeniu blizny glejowej, szeregu nieodwracalnie reaktywnych astrocytów wzdłuż miąższu uszkodzonego miejsca po urazie9. Jedną z początkowych funkcji tej blizny jest ograniczenie wynaczynienia komórek odpornościowych z tego obszaru. Jednak badania wykazały, że blizna staje się fizyczną przeszkodą dla rozszerzania aksonów, ponieważ uwalniają cząsteczki hamujące wzrost aksonów i tworzą fizyczną barierę zapobiegającą rozszerzaniu się aksonów wokół uszkodzonego obszaru16. Niemniej jednak istnieją dowody naukowe wskazujące, że po urazie rdzenia kręgowego całkowite zapobieganie tworzeniu się blizn glejowych może upośledzać regenerację aksonów17. W związku z tym kontekst, w którym mierzona jest specyficzna odpowiedź astrocytowa, musi być rozważany w ramach badanego urazu.
Przedstawiona metodologia może być zastosowana do badania zindywidualizowanej funkcji astrocytów po niedoborze tlenu glukozy i może być modyfikowana w zależności od pytań, na które badacz chce odpowiedzieć. Na przykład, oprócz zmian morfologicznych i markerów wyrażanych w różnych czasach ODD, supernatanty z astrocytów wystawionych na działanie OGD mogą być dalej analizowane w celu zidentyfikowania rozpuszczalnych czynników uwalnianych przez te komórki lub wykorzystane jako pożywka kondycjonowana do oceny jej wpływu na inne komórki mózgowe. Takie podejście umożliwia badania nad reaktywnością astrocytów, które mogą prowadzić do wyjaśnienia czynników rządzących i modulujących ich odpowiedź w scenariuszu udaru niedokrwiennego.

<table><tbody><tr><td>Instrumenty do chirurgii - Krok 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyce operacyjne 5,5"</td><td>Roboz Company</td><td>RS-6812</td><td>Narzędzia używane do dekapitacji szczurów.</td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione 7" &nbsp;</td><td>Roboz Company</td><td>RS-5271</td><td>Przytrzymuje skórę szczura podczas usuwania czaszki.</td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji 4" &nbsp;</td><td>Roboz Company</td><td>RS-5882</td><td>Tnie zarówno skórę, jak i czaszkę szczura.</td></tr><tr><td>Kleszczyki mikropreparacyjne 4" kątowe, drobno ostre&nbsp;</td><td>Roboz Company</td><td>RS-5095</td><td>Przytrzymuje skórę szczura podczas usuwania czaszki.</td></tr><tr><td>Kleszcze mikropreparacyjne 4" lekko zakrzywione 0,8</td><td>Roboz Company</td><td>RS-5135</td><td>Narzędzie służące do oddzielania kory.</td></tr><tr><td>Pęseta do mikropreparacji</td><td>Firma Roboz</td><td>RS-4972</td><td>Peeling opon mózgowych.</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Ważny przy usuwaniu opony mózgowej z kory mózgowej.</td></tr><tr><td>DMEM Przygotowanie - krok 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni (DMEM)</td><td>GibCo. Firma</td><td>11995-065</td><td>Wspomaga wzrost komórek.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S7277</td><td>Suplement do pożywek do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>GibCo. Firma</td><td>10437-010</td><td>Surowica-suplement do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp;</td><td>GibCo. Firma</td><td>15140-148</td><td>Hamuje rozwój bakterii w hodowli komórkowej.</td></tr><tr><td>System filtracyjny 1L z porami 0,22um</td><td>Corning</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>Hodowla astrocytów - krok 3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 5 ml</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>Do pipetowania DMEM do pojemników z komórkami.</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 10 ml</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>Do pipetowania DMEM do pojemników z komórkami.</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 25 ml</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td>Do pipetowania DMEM do pojemników z komórkami.</td></tr><tr><td>Probówka stożkowa wirówki 15 ml</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200250</td><td></td></tr><tr><td>Probówka z bezpiecznym zamkiem 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki barierowe 200 uL</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-201725</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki barierowe 1 ml</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-201727</td><td></td></tr><tr><td>Pomarańczowa torba Biohazard 14 x 19"</td><td>VWR</td><td>14220-048</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego 60 mm</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne gaziki</td><td>Honeywell Safety</td><td>89133-086</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Biomaster</td><td>Sewar Lab System</td><td>030010019</td><td>Trójcier tkanki mózgowej.</td></tr><tr><td>Stomacher 80 Blender Sterylne worki</td><td>Sewar Lab System</td><td>BA6040</td><td>Sterylna torba do homogenizatora komórek stomachera.</td></tr><tr><td>Zlewka 400mL</td><td>Pyrex</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne sito dysocjacyjne komórek, siatka #60&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S1020</td><td>Aby uzyskać jednolitą zawiesinę jednokomórkową.</td></tr><tr><td>Sterylne sito dysocjacyjne komórek, siatka #100</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S3895</td><td>Aby uzyskać jednolitą zawiesinę jednokomórkową.</td></tr><tr><td>Mikroskop z odwróconymi fazami</td><td>Nikon</td><td>Eclypse Ti-S</td><td>Sprawdź komórki pod kątem zanieczyszczenia lub nieprawidłowego wzrostu komórek.</td></tr><tr><td>75cm2 sterylne kolby</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Płytka wielodołkowa</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe Micro (szkiełka nakrywkowe), 18mm, okrągłe</td><td></td><td></td> Hemacytometr <td></td></tr><tr><td>Bright-Line</td> Firma <td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek estru metylowego L-leucyny 98% (LME)</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>L1002</td><td>Wspomaga eliminację komórek mikrogleju w pierwotnej kulturze astrocytów korowych.</td></tr><tr><td>Cytozyna &beta;-D-arabinofuranozyd (Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny, mol wt 70,000-150,000</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>GibCo. Firma</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy w tabletkach soli fizjologicznej (PBS)</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Przygotowanie podłoża OGD - etap 5</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa wirówki 50 ml</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średnio wolna glukoza</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>D5030</td><td>Wspomaga wzrost komórek.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S7277</td><td>Suplement do pożywek do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp;</td><td>GibCo. Firma</td><td>15140-148</td><td>Hamuje rozwój bakterii w hodowli komórkowej.</td></tr><tr><td>200mM&nbsp; L-glutamina&nbsp;</td><td>GibCo. Firma</td><td>25030-081</td><td>Aminokwas, który wspomaga wzrost komórek.</td></tr><tr><td>Tabletki z buforem soli fizjologicznej (PBS)</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>System filtracyjny 50 ml z porem 0,22um</td><td>Corning</td><td>430320</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa 50 ml</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Pojedynczy przepływomierz&nbsp;</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>SMF3001</td><td>Pomiar przepływu gazu podczas przedmuchiwania tlenem.</td></tr><tr><td>Komora inkubatora hipoksji&nbsp;</td><td>StemCell</td><td>27310</td><td>Generuje środowisko hipoksyjne dla hodowli komórkowej.</td></tr><tr><td>Identyfikowalny miernik tlenu rozpuszczonego</td><td>VWR</td><td>21800-022</td><td></td></tr><tr><td>95% mieszaniny gazów N2 / 5% CO2</td><td>Linde</td><td></td><td>oczyszcza środowisko z tlenu.</td></tr><tr><td><silna>pierwotna immunofluorescencja astrocytów - etap 6< / silny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>bufor fosforanowy w tabletkach soli fizjologicznej (PBS)</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny Neutralny bufor 10%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>Roztwór stosowany do utrwalania komórek.</td></tr><tr><td>Metanol&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>A4544</td><td>Roztwór stosowany do naprawy komórek.</td></tr><tr><td>Niejonowy środek powierzchniowo czynny (Triton X-100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>GibCo. Firma</td><td>10437-010</td><td>Surowica-suplement do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Sygnalizacja komórkowa</td> <td>anty-NeuN</td><td>24307</td><td>Wykrywa dojrzałe neurony, służy do walidacji kultury astrocytów.</td></tr><tr><td>Sygnalizacja komórkowa</td> <td>anty-PCNA</td><td>2586</td><td>Wykrywa proliferujące komórki.</td></tr><tr><td>Jodek propidyny (PI)</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>P4170</td><td>Barwienie apoptozą.</td></tr><tr><td>Anti-Olig1</td><td>Abcam</td><td>AB68105</td><td>Wykrywa dojrzałe oligodendrocyty.</td></tr><tr><td>Anti-Iba1+</td><td>Wako</td><td>016-20001</td><td>Wykrywa komórki mikrogleju.</td></tr><tr><td>Anty-GFAP sprzężony z Cy3&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>C9205</td><td>Wykrywa reaktywne astrocyty w leczonych komórkach.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probe Life Technology</td><td>A1101</td><td>Przeciwciało wtórne przeciw myszy.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555</td><td>Sonda molekularna Life Technology</td><td>A21428</td><td>Przeciwciało wtórne przeciwko królikowi.</td></tr><tr><td>4',6'-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>D9542</td><td>Barwienie jądrowe.</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie reaktywności i proliferacji astrocytów in vitro w warunkach podobnych do niedokrwiennych

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Udar niedokrwienny mózgu to złożony uraz mózgu spowodowany przez skrzeplinę lub zator utrudniający przepływ krwi do części mózgu. Prowadzi to do pozbawienia tlenu i glukozy, co powoduje awarię energetyczną i śmierć neuronów. Po udarze niedokrwiennym astrocyty stają się reaktywne i namnażają się wokół miejsca urazu w miarę jego rozwoju. W tym scenariuszu trudno jest zbadać specyficzny wkład astrocytów w obszar mózgu narażony na niedokrwienie. W związku z tym w niniejszym artykule przedstawiono metodologię badania pierwotnej reaktywności i proliferacji astrocytów w modelu in vitro środowiska podobnego do niedokrwienia, zwanego deprywacją glukozy tlenowej (OGD). Astrocyty wyizolowano od 1-4 dniowych nowonarodzonych szczurów, a liczbę niespecyficznych komórek astrocytarnych oceniono za pomocą selektywnego markera astrocytów Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) i barwienia jądrowego. Okres, w którym astrocyty są poddawane warunkowi OGD, można dostosować, a także procent tlenu, na który są narażone. Ta elastyczność pozwala naukowcom scharakteryzować czas trwania stanu podobnego do niedokrwiennego w różnych grupach komórek in vitro. W artykule omówiono ramy czasowe OGD, które indukują reaktywność astrocytów, morfologię przerostową i proliferację mierzoną za pomocą immunofluorescencji przy użyciu antygenu jądrowego komórki proliferującej (PCNA). Oprócz proliferacji, astrocyty poddają się stresowi energetycznemu i oksydacyjnemu oraz reagują na OGD poprzez uwalnianie rozpuszczalnych czynników do pożywki komórkowej. Pożywkę tę można zebrać i wykorzystać do analizy wpływu cząsteczek uwalnianych przez astrocyty w pierwotnych kulturach neuronalnych bez interakcji między komórkami. Podsumowując, ten pierwotny model hodowli komórkowej może być skutecznie wykorzystany do zrozumienia roli izolowanych astrocytów po uszkodzeniu.

Jednym z głównych problemów w przypadku pierwotnych kultur astrocytów jest obecność innych komórek, takich jak neurony, oligodendrocyty, fibroblasty i mikroglej. W Rysunek 1izolowane komórki z kory szczura poddawano wymianie pożywki co 3 dni, a następnie pozostawiano bez obróbki lub traktowano dodatkiem LME przez 1 h. Po 24 h przeprowadzono u komórek immunohistochemiczne barwienie na GFAP oraz barwienie kontrastowe DAPI. W komórkach niepoddanych obróbce odnot...

Udar niedokrwienny jest złożonym zdarzeniem, w którym trudno jest zbadać specyficzny wpływ astrocytów na dotknięty obszar mózgu narażony na tlen, deprywację glukozy (OGD). W artykule przedstawiono metodologię otrzymywania izolowanych astrocytów oraz badania ich reaktywności i proliferacji w warunkach OGD.

Monitorowanie reaktywności i proliferacji astrocytów in vitro w warunkach podobnych do niedokrwiennych

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Poniższy protokół ma na celu przedstawienie izolacji pierwotnych astrocytów z mózgów młodych szczurów w celu przeprowadzenia deprywacji tlenowo-glukozowej (OGD). Poddanie oczyszczonych astrocytów środowisku z deprywacją tlenowo-glukozową jest modułem, który pozwala badać reakcję na niektóre warunki występujące podczas udarów niedokrwiennych. Zmiany metodyczne po ekspozycji na deprywację tlenowo-glukozową można obserwować i mierzyć przy użyciu selektywnych markerów astrocytów, takich jak GFAP.Podsumowując, te wyizolowane komórki poddane warunkom imitującym niedokrwienie mogą być wykorzystywane do testowania nowych szlaków aktywowanych w warunkach hipoksji oraz innych leków chroniących przed udarem niedokrwiennym. W tej części protokołu astrocyty zostaną wyizolowane z kory mózgu młodych szczurów. Celem tej procedury jest uzyskanie pierwotnej hodowli astrocytów do przeprowadzenia eksperymentów z deprywacjątlenowo-glukozową.Materiały niezbędne do przeprowadzenia tej procedury to poniższe; należy autoklawować wszystkie materiały przed ich użyciem w tej procedurze. Przed rozpoczęciem protokołu należy naświetlać komorę dygestorium światłem UV przez co najmniej 20 minut. Aby rozpocząć proc

monitoring-astrocyte-reactivity-proliferation-vitro-under-ischemic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy artykuł opisuje nowy protokół oraz zestaw odczynników opracowanych do czułego pomiaru efektów neurotoksyczności związków i metod leczenia w kokulturach neuronów i astrocytów z wykorzystaniem analizy wysokotreściowej (high content analysis). Wyniki wskazują, że analiza wysokotreściowa stanowi obiecującą, nową technologię w ocenie neurotoksyczności.

Test kokultury neuronów i astrocytów do wysokoprzepustowej analizy treści (high content analysis) w badaniach neurotoksyczności

Astrocyty zostały uznane za wszechstronne komórki uczestniczące w podstawowych procesach biologicznych, które są niezbędne do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu oraz naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Tutaj przedstawiamy szybką procedurę uzyskiwania czystych hodowli astrocytów myszy w celu zbadania biologii tej głównej klasy komórek ośrodkowego układu nerwowego.

Izolacja i hodowla astrocytów korowych myszy

Tutaj opisujemy adaptację protokołów używanych do indukowania plastyczności homeostatycznej w neuronach do badania plastyczności receptorów sprzężonych z białkiem G astrocytów. Metoda ta, ostatnio wykorzystana do badania zmian w mGluR grupy astrocytarnej I u młodych myszy, może być stosowana do pomiaru skalowania różnych astrocytarnych GPCR w tkance dorosłych myszy in situ i in vivo oraz do lepszego zrozumienia wrażliwości receptorów astrocytarnych na zmiany aktywności neuronalnej.

Indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Astrocyty w OUN zmieniają swoje właściwości funkcjonalne i strukturalne w odpowiedzi na szkodliwe bodźce. W artykule przedstawiono protokół oceny trójwymiarowej morfologii astrocytów w stanach chorobowych lub po interwencjach terapeutycznych.

Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów

Astrocyty są jednymi z najważniejszych kluczowych graczy w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). W tym miejscu przedstawiamy praktyczną metodę protokołu hodowli astrocytów w hipokampie płciowym w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw funkcji astrocytów u młodych noworodków płci męskiej i żeńskiej po niedokrwieniu in vitro.

Różnice płci w astrocytach hipokampa myszy po niedokrwieniu in vitro

Utrzymanie zasięgu bariery krew-mózg jest kluczowe dla homeostazy ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje techniki in vitro w celu nakreślenia podstawowych i patologicznych procesów, które modulują pokrycie bariery krew-mózg.

In vitro Testy oceniające tworzenie i rozrywanie naczyń przypominających siatkę bariery krew-mózg

Opisany tutaj protokół AWESAM jest optymalny do hodowli mysich astrocytów w izolacji od innych komórek mózgowych w szybki, prosty i tani sposób. Astrocyty AWESAM wykazują spontaniczną sygnalizację Ca2 +, morfologię i profile ekspresji genów podobne do astrocytów in vivo.

Hodowla mysich astrocytów podobnych do vivo przy użyciu szybkiego, prostego i niedrogiego protokołu AWESAM

Tutaj prezentujemy proste podejście wykorzystujące specyficzne podłoża hodowlane, które pozwala na tworzenie kultur wzbogaconych o neurony i astrocyty, lub kultur gleju neuronów z kory embrionalnej, o wysokiej wydajności i odtwarzalności.

Model hodowli komórkowej do badania roli interakcji neuron-glej w niedokrwieniu

Tutaj opisujemy protokół, który ułatwia różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w funkcjonalne astrocyty specyficzne dla przodomózgowia. Umożliwia to badania nad rolą komórek glejowych w patogenezie zaburzeń neurorozwojowych, takich jak zespół łamliwego chromosomu X, oraz modelowanie innych zaburzeń mózgu.

Wytwarzanie i charakterystyka indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych astrocytów pochodzących z komórek macierzystych, pozbawionych kruchej rybonukleoproteiny przekaźnika X

Ten protokół zapewnia zintegrowaną metodę, która obejmuje dostarczenie wirusowe, implantację optrodu, indukcję fototrombotyczną, jednoczesne rejestrowanie aktywności astrocytów i neuronów oraz optogenetyczną stymulację astrocytów. Ta zintegrowana metoda ma na celu zapewnienie jednoczesnego badania relacji astrocyt-neuron na wszystkich etapach przewlekłych udaru niedokrwiennego.

Zintegrowana metoda modelowania udaru fototrombotycego i in vivo rejestracji optrodem aktywności neuronowej i astrocytów u myszy wykonujących zachowania

Poznaj metodę izolacji pierwotnych astrocytów z mózgów szczurzych szczeniąt do badań reaktywności i proliferacji w warunkach niedokrwiennych. Technika ta umożliwia testowanie neuroprotekcyjnych leków przeciwko udarowi.

Monitorowanie reaktywności i proliferacji astrocytów in vitro w warunkach podobnych do niedokrwiennych

Przeglądaj więcej filmów