Analiza białek wiążących czapeczki w komórkach ludzkich wystawionych na fizjologiczne warunki tlenowe

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wychwycenie białek wiążących czapeczkę w warunkach niskiego poziomu tlenu. Metoda ta wykorzystuje analog kapu z siedmioma metyloguanozynami połączonymi z agarozą do zbadania czynników wiążących kap i ich oddziałujących partnerów. Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie syntezy białek, takie jak identyfikacja nowych czynników regulowanych tlenem zaangażowanych w translację zależną od kapu.

Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki są utrzymywane w stacji roboczej do hipoksji aż do momentu lizy. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię raka, ponieważ komórki rakowe w guzie są narażone na bardzo niski poziom tlenu, a kontrola translacyjna odgrywa kluczową rolę w progresji guza. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy przeczytaliśmy niedawną publikację kolegów z Corony, w której donoszą, że natlenienie tkanek jest w rzeczywistości bliższe temu, co nazywamy hipoksją, a nie normaksją, w której rutynowo hoduje się komórki.

Rozpocznij tę procedurę od hodowli komórkowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po zliczeniu komórek za pomocą hemocytometru nakarm 150 milimetrowymi szalkami hodowlanymi zawierającymi 15 mililitrów kompletnej pożywki, aby uzyskać gęstość komórek od 2500 do 5000 komórek na centymetr kwadratowy. Użyj dwóch 150-milimetrowych szalek do każdego testu wiązania nasadki.

Umieść wysiane szalki hodowlane w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowej atmosferze dwutlenku węgla. Po inkubacji komórek przez co najmniej 24 godziny umieść je w stacji roboczej do hipoksji na żądany czas. Następnie należy ustawić stanowisko pracy na odpowiednią fizjeksję.

Podgrzej jeden X soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS i trypsynę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Porcję 980 mikrolitrów buforu do lizy do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mikrolitra dla każdego wykonywanego testu wiązania czapeczek. 10 mikrolitrów koktajlu inhibitorów proteazy 100X i 10 mikrolitrów hydroklorydu fluorku 4-benzenesulfonylu do 980 mikrolitrów buforu do lizy na lodzie.

Wyrzuć pożywkę z każdej 150-milimetrowej naczynia do pojemnika na odpady w stacji roboczej do hipoksji. Następnie umyj komórki trzema do czterech mililitrów ciepłego jednego X PBS i wylej płyn. Dodaj jeden mililitr ciepłej 05-procentowej trypsyny EDTA do każdego naczynia i pozostaw naczynia na dwie minuty lub do momentu, gdy komórki przestaną przylegać do talerza.

Za pomocą pipety przenieś komórki jednej płytki do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Powtórz w razie potrzeby, aby każda płytka komórek została przeniesiona do oddzielnej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Odwiruj probówki do mikrowirówek pod ciśnieniem 6000 razy g przez 90 sekund, aby osadzać komórki.

Po odwirowaniu odessać trypsynę za pomocą pipety, nie naruszając osadu. Umyj komórki ciepłym jednym X PBS, delikatnie pipetując 200 mikrolitrów PBS do probówki tuż nad granulką. Następnie zassać PBS bez naruszania osadu.

Następnie odpipetuj 500 mikrolitrów z jednego mililitra przygotowanego roztworu buforowego do lizy na pierwszy granulat komórkowy. Ponownie zawiesić granulkę w całości, pipetując w górę i w dół. Połącz ponownie zawieszone ogniwa z drugą osadką komórkową i ponownie zawiesić drugą osadkę, pipetując w górę iw dół.

Powtarzaj ten proces, aż wszystkie granulki zostaną połączone i ponownie zawieszone dla każdej próbki. Następnie połącz lizat z pozostałymi 500 mikrolitrami buforu do lizy w 1,5-litrowej probówce do mikrowirówki. Usuń próbki ze stanowiska do hipoksji.

Poddać komórki lizie za pomocą delikatnego mieszania, obracając próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 1,5 do dwóch godzin. Po inkubacji odwirować lizowane komórki w temperaturze 1200 razy g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć resztki komórkowe. Przenieś lizat do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki i wyrzuć osad.

Zarezerwuj część supernatantu do wykorzystania jako kontrola wejściowa lizatu całych komórek do analizy western blot. Aby przygotować się do testu wiązania nasadki, użyj nożyczek, aby usunąć końcówkę pipety, aby ułatwić zbieranie zawiesiny kulek. Do każdej próbki przenieść 50 mikrolitrów ślepej zawiesiny kontrolnej kulek agarozy i 50 mikrolitrów zawiesiny kulek połączonych agarozą C10 m7GTP do oddzielenia 1,5 mililitrowych probówek wirówek.

Następnie granuluj kulki, odwirowując gnojowicę 500 razy g przez 30 sekund. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 500 mikrolitrach TBS. Po powtórzeniu tych kroków granulować kulki 500 razy g przez 30 sekund i usunąć supernatant.

Następnie przenieś supernatant zawierający lizat do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówki zawierającej ślepe kulki agarozy. Inkubować przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając. Po 10 minutach granulować puste kulki agarozy, odwirowując 500 razy g przez 30 sekund.

Po odwirowaniu przenieś lizat, który nie wiąże się z kulkami, do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówki zawierającej kulki połączone z agarozą C10 m7GTP. Umyć puste kulki agarozy, ponownie zawieszając kulki w 500 mikrolitrach buforu do lizy, granulując kulki przez odwirowanie w czasie 500 g przez 30 sekund i odrzucając supernatant. Powtórz to cztery razy, w sumie pięć prań.

Ponownie zawiesić puste kulki agarozy w jednym buforze próbki X SDS-PAGE. I gotuj koraliki przez 90 sekund w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Przechowuj próbkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza do przyszłej analizy western blot w celu obserwacji, czy białko będące przedmiotem zainteresowania wiąże się niespecyficznie z kulką.

Inkubować lizat z kulkami połączonymi z agarozą C10 m7GTP, delikatnie mieszając przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby wychwycić białka wiążące czapeczkę. Po wymieszaniu osadzać kulki połączone agarozą C10 m7GTP, wirując w temperaturze 500 razy g przez 30 sekund. Po wyrzuceniu supernatantu umyj kulki połączone z agarozą C10 m7GTP tak jak poprzednio.

Ponownie zawiesić kulki w 600 mikrolitrach buforu do lizy i dodać GTP do końcowego stężenia jednego milimola. Inkubować kulki połączone z agarozą C10 m7GTP oraz jeden milimolowy GTP z delikatnym mieszaniem przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Spowoduje to dysocjację białek, które niespecyficznie oddziałują z m7GTP.

Granulki połączone agarozą C10 m7GTP osadzać przez odwirowanie w temperaturze 500 g przez 30 sekund. Przenieść supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki i dodać 200 mikrolitrów z czterech do próbek X SDS-PAGE. Po umyciu kulek jak poprzednio, ponownie zawieś je w jednym buforze do próbek X SDS-PAGE i gotuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 90 sekund.

Pokazano tutaj reprezentatywne western blot typowego oczyszczania powinowactwa m7GTP dwóch głównych białek wiążących czapeczkę w odpowiedzi na wahania tlenu w pierwotnych ludzkich komórkach nabłonka kanalików proksymalnych nerkowych. Lizaty komórkowe były wystawione na działanie ośmiu procent, pięciu procent, trzech procent lub jednego procenta tlenu przez 24 godziny. Pasy obejmują 10 procent lizatu całej komórki jako wejście, GTP płukany w celu zmierzenia specyficzności dla m7GTP oraz białka związane z kulkami m7GTP po płukaniu GTP.

Dane z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów zostały określone ilościowo za pomocą obrazu J i wyrażone jako względne jednostki gęstości w stosunku do 10 procent wejścia całego lizatu komórkowego. Wyniki wskazują, że ludzkie komórki hodowane w fizjologicznym tlenie wykorzystują dwa białka wiążące kap do rekrutacji różnych mRNA do translacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wychwytywać białka wiążące czapeczkę w warunkach niskiego poziomu tlenu.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o utrzymywaniu komórek w stacji roboczej hipoksji aż do momentu lizy, ponieważ tlen może szybko zmienić właściwości biochemiczne tych czynników inicjujących translację. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak frakcjonowanie polisomów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, które białka wiążące czapeczkę wiążą się z aktywną translacją w warunkach niskiego poziomu tlenu.