Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych
19 stycznia 2018
Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.
Ogólnym celem tego protokołu jest wykorzystanie zaawansowanej komory grzbietowego fałdu skórnego do szczegółowego zbadania rozwoju naczyń krwionośnych związanych z nowotworem w modelu mysim. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka, takie jak poprawa terapii i zrozumienie progresji guza. Główną zaletą tej techniki jest to, że procesy są badane we właściwym kontekście, w prawdziwym życiu i że procesy te można badać w czasie.
Ta procedura zostanie zademonstrowana przez doktor Ann Seynhaeve, starszego badacza w moim laboratorium. Od nietransgenicznej myszy dawcy należy pobrać niemartwiczy fragment guza o średnicy 10 mm w celu implantacji w komorze okna grzbietowego myszy biorcy. Użyj normalnego dawcy myszy w przypadku guza syngenicznego lub dawcy myszy z niedoborem odporności w przypadku ksenoprzeszczepu.
Mysz biorca musi mieć co najmniej 12 tygodni i ważyć dwadzieścia lub więcej gramów. Wszystkie zabiegi chirurgiczne należy wykonywać w warunkach aseptycznych. Na przykład autoklawuj narzędzia chirurgiczne i materiały komór.
Po uspokojeniu myszy biorcy usuń włosy z całej strony grzbietowej za pomocą elektrycznego trymera, a następnie użyj żelu do depilacji. Spłucz skórę do czysta i osusz ją. Na koniec wyszoruj wydepilowaną skórę do czysta etanolem.
Teraz zaznacz poziomą linię środkową wzdłuż kręgosłupa. Następnie ustaw okno podglądu co najmniej 2 mm poniżej linii i zaznacz obwód okna na skórze. Następnie za pomocą skalpela i nożyczek ostrożnie usuń skórę w obrębie linii obwodu, nie uszkadzając leżącej pod spodem powięzi.
Następnie pociągnij fałd skórny i za pomocą dziurkacza do uszu wprowadź 1 mm otwory po obu stronach okna na utrzymujące okno na miejscu. Umieść tylną ramkę na myszy i zabezpiecz ramę, umieszczając nakrętki na. Następnie przeciągnij skórę od dwóch do trzech milimetrów nad ramą, aby upewnić się, że pasuje.
Jeśli tak, wbij igły o rozmiarze 23 przez dwa otwory na szwy w górnej części ramy. Zabezpiecz ramę, dokręcając nakrętki i przytrzymując je za pomocą uchwytów igieł zaciskowych, nie dokręcaj zbyt mocno nakrętek i nie dopuść do obracania się skóry wokół. Następnie zastąp igły szwami, aby przymocować ramę do skóry.
Teraz obróć mysz na bok. Pod tym kątem należy wprowadzić gruby kawałek szkła wypełniającego i standardową 12-milimetrową szklankę nakrywkową. Zabezpiecz oba pierścieniem ustalającym, aby deska rozdzielcza ściśle przylegała do szkła.
Następnym krokiem jest nawodnienie okna za pomocą 0,9% chlorku sodu. Pozwól, aby kilka kropel spadło na obszar view i wchłonij nadmiar. Teraz, tuż pod oknem, użyj igły o rozmiarze 25 z wygięciem pod kątem 90 stopni, aby zrobić głęboką kieszeń w powięzi, która może pomieścić milimetr sześcienny tkanki nowotworowej.
Następnie włóż tkankę nowotworową do kieszeni. Na koniec zamknij obszar widoku okna za pomocą standardowej 12-milimetrowej szyby osłonowej i pierścienia ustalającego. Wszelkie pęcherzyki powietrza rozproszą się w ciągu godziny.
Przed uśpieniem myszy ogrzej wykonaną na zamówienie platformę z kontrolowaną temperaturą do 37 stopni Celsjusza. Po uśpieniu myszy umieść ją na rozgrzanej platformie. Podłącz nosek, aby dostarczyć izofluran, a jeśli ocena zajmie więcej niż pięć minut, umów się na wizytę okulistyczną.
Teraz przykręć komorę za pomocą okna do specjalnie wykonanego uchwytu i przymocuj uchwyt do platformy. Następnie wyczyść szklane okno wodą i bawełną. Teraz pod mikroskopem sprawdź rozwój naczyń w guzie za pomocą obiektywu 10 razy, w jasnym polu i świetle fluorescencyjnym.
Po oględzinach należy włączyć lasery konfokalne. Ustaw panel sterowania mikroskopu na inteligentne wzmocnienie 100 woltów na obrót. Inteligentne przesunięcie 10% na obrót, średni zoom, średnie pozycjonowanie X i Y oraz 100 mikronów pozycji Z na obrót.
Ustaw tryb akwizycji na XYZ lub XYZT. Wybierz rozdzielczość. Wybierz prędkość akwizycji dwie lub 400 Hz.
Ustaw otwór na jedną przewiewną jednostkę. I wybierz dwukierunkową opcję X. Podczas oceny wielu fluoroforów z możliwym nakładającym się zakresem widmowym, wybierz skanowanie sekwencyjne między klatkami, aby zapobiec przedostawaniu się i ustaw prawidłowe ścieżki wiązki.
Ustaw średnią wiersza na cztery, a na koniec wybierz nowy zestaw danych do eksperymentu. Teraz skoncentruj się na tkance, która Cię interesuje, najlepiej używać suchych soczewek o wyższych przysłonach numerycznych. Następnie użyj szybkiego skanowania na żywo, aby uzyskać najlepszy możliwy stosunek sygnału do szumu, dostosowując wzmocnienie i przesunięcie do miejsca, w którym nie ma prześwietlenia.
Teraz wybierz stos Z na karcie pozyskiwania. Wykonaj szybkie skanowanie Z. W szybkim skanowaniu zdecyduj o pozycji początkowej i końcowej pełnego skanowania.
Następnie ustaw rozmiar kroku Z zgodnie z rozmiarem otworu i kontynuuj pełne skanowanie. Myszy gospodarzy wykazujące ekspresję znaczników fluorescencyjnych zobrazowano po implantacji guza przy użyciu opisanego protokołu. Etykieta eNOStag-GFP ulega ekspresji w Golgim i błonie komórkowej komórek śródbłonka.
Etykieta ROSAmT/mG wyraża wszechobecny czerwony kwiatostan i zielony kwiatostan w komórkach eksprymujących rekombinazę Cre. Jednym z zastosowań tej technologii jest badanie rozwoju naczyń krwionośnych, ponieważ wszystkie etapy są widoczne w nowotworach. Na przykład można zobaczyć, jak fronty śródbłonka wyrastają w obszarach nieunaczynionych.
Guzy mają również uszkodzone naczynia i utworzone łożyska naczyniowe z dojrzałymi naczyniami rozgałęzionymi. Innym zastosowaniem jest badanie tworzenia światła, przepływu krwi i wynaczynienia poprzez nakładanie etykiet na krew, takich jak nanocząsteczki, które fluoryzują. W ten sposób przepływ krwi można zaobserwować w świetle rurek naczyniowych i w pobliżu komórek wierzchołka śródbłonka.
W komórkach końcówki można zaobserwować tworzenie się światła zapasu. Mikroskopia przyżyciowa może być również stosowana do badania wpływu chemioterapeutyków. Na przykład 24 godziny po wstrzyknięciu nanocząstek zwierzęciu eNOStag-GFP nanocząstki pozostały w układzie naczyniowym z minimalnym wynaczynieniem do śródmiąższu guza.
Jednak, gdy nanocząstki podawano w połączeniu z TNF, obserwowano wynaczynienie do śródmiąższu guza. Jest to dowód na wzrost dostarczania leków między nowotworami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zainstalować komorę okienną grzbietowego fałdu skórnego i jak badać procesy związane z nowotworem za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie zaawansowanej komory fałdu skóry grzbietu do obrazowania intravitalnego naczyń krwionośnych związanych z guzem u myszy transgenicznych. Ta nieinwazyjna technika obrazowania umożliwia wysokorozdzielcze obserwacje procesów biologicznych w czasie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Obrazowanie intravitalne dostarcza wiedzy na temat żywych systemów biologicznych.
- Myszy transgeniczne z markerami fluorescencyjnymi umożliwiają wizualizację specyficznych typów komórek.
- Metoda ta jest szczególnie przydatna w badaniu progresji nowotworów oraz odpowiedzi na terapię.
- Możliwe jest prowadzenie badań podłużnych w celu obserwacji zmian w czasie.
Cel badania
- Zbadanie rozwoju naczyń krwionośnych związanych z guzem w modelu mysim.
- Poprawa zrozumienia progresji nowotworu oraz interwencji terapeutycznych.
- Wykorzystanie zaawansowanych technik obrazowania do obserwacji w czasie rzeczywistym.
Zastosowane metody
- Implantacja fragmentów guza do grzbietowej komory okiennej.
- Procedury chirurgiczne przeprowadzone w warunkach aseptycznych.
- Zastosowanie mikroskopii konfokalnej do obrazowania rozwoju naczyń krwionośnych.
- Wykorzystanie markerów fluorescencyjnych do badania przepływu krwi i tworzenia naczyń.
Główne wyniki
- Wizualizacja frontów śródbłonkowych i formowania się światła naczyń w nowotworach.
- Obserwacja dynamiki przepływu krwi i ekstrawazacji nanocząsteczek.
- Dowody na zwiększoną dostarczalność leku do przestrzeni śródmiąższowej guza po zastosowaniu TNF.
- Wykazanie użyteczności techniki w badaniach nad rakiem.
Wnioski
- Komora skórna na grzbiecie jest skutecznym narzędziem do badania unaczynienia guzów.
- Obrazowanie intravitalne może dostarczyć kluczowych informacji na temat biologii nowotworów.
- Metoda ta znajduje potencjalne zastosowanie w ocenie strategii terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dynamiczna mikroskopia intravitalna o wysokiej rozdzielczości naczyń krwionośnych związanych z nowotworem umożliwia ocenę w czasie rzeczywistym rozwoju naczyń, dostarczania leków oraz odpowiedzi terapeutycznej w przedklinicznych modelach onkologicznych. Podejście to eliminuje ograniczenia statycznej histologii, dostarczając kluczowych informacji czasowych i przestrzennych, niezbędnych do walidacji celu i ograniczania ryzyka mechanistycznego. Integracja transgenicznych modeli fluorescencyjnych i zaawansowanych komór obrazujących zwiększa pewność prognostyczną w kluczowych punktach odkryć i punktach zwrotnych w badaniach translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację powstawania i przebudowy naczyń nowotworowych in vivo.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez śledzenie dynamiki komórek wierzchołkowych śródbłonka i tworzenia światła naczynia.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów naczyniowych za pomocą obrazowania podłużnego.
- Zwiększa pewność prognostyczną w przypadku terapii antyangiogennych i celowanych naczyniowo.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowaną, powtarzalną platformę do oceny wpływu związków na naczyń krwionośnych guza.
- Generuje dane ilościowe, takie jak przepływ krwi, ekstrawasacja i integralność naczyniowa.
- Umożliwia standaryzację parametrów obrazowania w celu porównywalności między badaniami.
- Wspiera skrining dostarczania nanocząsteczek i chemioterapeutyków w fizjologicznie istotnym kontekście.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie przedklinicznych reakcji naczyniowych do mikrośrodowisk nowotworowych istotnych dla przebiegu choroby.
- Pozwala na ocenę terapeutycznej modulacji przepuszczalności naczyniowej oraz lokalizacji leku.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrywania po przedkliniczną walidację interwencji celowanych w naczynia.
- Dostarcza translacyjnych informacji o biomarkerach w zakresie odpowiedzi naczyniowej i skuteczności dostarczania leku.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten schemat obrazowania intravitalnego łączy wczesne etapy odkryć, identyfikację wiodących kandydatów na leki oraz walidację przedkliniczną, umożliwiając ilościową ocenę unaczynienia guzów oraz odpowiedzi terapeutycznej w czasie rzeczywistym w transgenicznych modelach mysich.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących rozwoju naczyń, zachowania komórek wierzchołkowych oraz zmian naczyniowych indukowanych lekami.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania do oceny związków i standaryzacji testów.
- Analityka: Zapewnia wysokotreściowe odczyty dotyczące przepływu krwi, ekstrawazacji i integralności naczyń do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Dostosowuje wyniki obrazowania do fenotypów naczyniowych istotnych dla choroby oraz punktów końcowych dostarczania leków.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania dla różnorodnych programów z zakresu onkologii i biologii naczyniowej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły obrazowania w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności badań.
- Wartość strategiczna: Ułatwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) poprzez dostarczanie praktycznych danych o odpowiedzi naczyniowej w czasie rzeczywistym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów ukierunkowanych na naczynia oraz systemy dostarczania leków z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie implantacji chirurgicznej oraz zaawansowanej mikroskopii konfokalnej.
- Wymagany jest dostęp do transgenicznych linii myszy fluorescencyjnych oraz infrastruktury obrazowej.
- Konieczna jest standaryzacja parametrów obrazowania i schematów analizy danych pomiędzy zespołami.
- Możliwa może być konieczność adaptacji metody dla różnych modeli nowotworowych lub modalności terapeutycznych.
- Potencjalne ograniczenia obejmują złożoność zabiegów chirurgicznych oraz kwestie dobrostanu zwierząt.
