Ładowanie barwnika wapniowego do zakończeń nerwowych żaby przez kikut nerwowy: przejściowa rejestracja wapnia w połączeniu nerwowo-mięśniowym żaby

Cześć, nazywam się Dimitry Samigullin, pracuję w laboratorium Biofizyki Procesów Synaptycznych Instytutu Biochemii i Biofizyki w Kazaniu Rosyjskiej Akademii Nauk. W naszym laboratorium badamy szerokie możliwości sygnalizacji wapniowej w Zespole Nerwowo-Mięśniowym. Jedną z najbardziej przystępnych metod pomiaru synaptycznego poziomu wapnia jest zapis optyczny.

Tutaj opisujemy metodę ładowania barwnika wrażliwego na wapń przez kikut nerwowy w zakończeniach nerwowych żaby. Przedstawiamy również protokół pomiaru i analizy ogromnego stanu przejściowego wapnia w końcach żab. Za pomocą tej metody możliwe jest badanie wpływu aktywnych leków na presynaptyczny poziom wapnia podczas aktywności synaptycznej.

Przygotowanie roztworu do ładowania barwnika. Barwnik wapniowy Oregon Green BAPTA firmy Fluoresceina jest dostępny w 500 mikrolitrach w niewielkiej ilości 500 mikrogramów proszku. Do proszku dodać 14 mikrolitrów roztworu zawierającego HEPES.

Roztwór do ładowania wirowego i odwirować, aby dokładnie wymieszać. Owinąć fiolkę z roztworem nasycającym folią, aby uniknąć ekspozycji na światło. Roztwór naczyń należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w zamrażarce.

Procedura ładowania barwnika. Wyciąć mięsień piersiowy skóry od zwierzęcia. Zamontuj wypreparowaną tkankę na wyłożonej srebrem szalce Petriego.

Rozciągnij tkankę za pomocą cienkich szpilek ze stali nierdzewnej. Dodaj roztwór Ringera do szalki Petriego. Za pomocą żyletki odetnij mały kawałek, około 2 milimetry rurki pipety o pojemności dziesięciu mikrolitrów od cienkiego końca.

Przygotuj kawałek plasteliny do przytrzymania pipety napełniającej na szalce Petriego. Połącz pipetę napełniającą z plastikową strzykawką przez silikonową rurkę i adaptery wykonane z probówek do pipet. Usunąć tymczasowy roztwór Ringera z szalki Petriego za pomocą plastikowej pipety.

Preparat na sucho za pomocą strzykawki. Zapobiegnie to zasysaniu roztworu z pipety napełniającej. Wyjąć fiolkę z roztworem napełniającym z zamrażarki i pozostawić do rozmrożenia w temperaturze pokojowej w ciemnym miejscu.

Za pomocą cienkiej pęsety i nożyczek, pod kontrolą wzrokową, pod sterylnym mikroskopem, przeciąć nerw blisko mięśnia. Pozostaw około dwóch milimetrów kikuta nerwowego. Zamocuj pipetę napełniającą z rurką i strzykawką na szalce Petriego za pomocą plasteliny.

Przesuń go blisko gałęzi nerwowej. Delikatnie zassać kikut nerwowy w pipecie napełniającej. Wyjmij rurkę ssącą z końca pipety napełniającej.

Osuszyć kikut nerwowy w pipecie do napełniania za pomocą strzykawki. Przesuń pipetę napełniającą w górę z kikutem nerwowym. Odizoluj kikut nerwowy od zewnątrz za pomocą wazeliny.

Jeszcze raz osusz kikut nerwowy w pipecie napełniającej za pomocą strzykawki. Narysuj punkt zerowy pięć mikrolitrów roztworu ładującego za pomocą pipety z długą końcówką do pipet. Delikatnie włóż końcówkę pipety z roztworem ładującym do pipety napełniającej.

Wyrzuć mieszaninę bezpośrednio do kikuta nerwu. Uszczelnij otwarty koniec pipety napełniającej wazeliną. Dodać niewielką ilość roztworu do szalki Petriego.

Preparat inkubować w temperaturze pokojowej w zaciemnionym i wilgotnym miejscu przez pięć godzin. Po procedurze inkubacji należy pobrać preparat i wyjąć pipetę napełniającą z roztworem ładującym. Umieść preparat w kąpieli i zmyj go roztworem Ringera.

Kąpiel z preparatem należy przechowywać przez noc w lodówce w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza. Przygotuj tkankę do mikroskopii. Weź preparat z kąpieli.

Zamontuj preparat w posrebrzanej komorze i lekko rozciągnij tkankę. Opłucz chusteczkę świeżym roztworem Ringera. Weź elektrodę ssącą do stymulacji.

Umieść elektrodę ssącą do stymulacji w komorze tak, aby jej końcówka znajdowała się blisko odciętego końca nerwu. Przyciągnij nerw do elektrody. Budowa elektrody jest opisana w artykule Khazokoffa, link do artykułu znajduje się w materiałach.

Zamocuj komorę przygotowawczą na stoliku mikroskopu. Umieść sondę temperatury. Podłączyć rurki dopływowe w przewodzie zasilającym do elementu Peltiera w komorze przygotowawczej.

Umieścić rurkę odpływową w komorze przygotowawczej. Włącz pompę perfuzyjną. Włączyć termiczną jednostkę sterującą.

Ustaw temperaturę na jednostce sterującej tak, aby osiągnęła 20 stopni Celsjusza. Zainstaluj osłonę chroniącą przed promieniowaniem ultrafioletowym. Ustaw czas trwania opóźnienia i okres na stymulatorze.

Połącz przewód z elektrody ssącej ze stymulatorem. Włącz to. W obiektywie o małym powiększeniu sprawdź skurcz mięśni, włączając bodziec.

Napełnij system perfuzyjny roztworem Ringera o niskiej zawartości wapnia i wysokiej zawartości magnezu. Ustaw szybkość perfuzji na około dwa mililitry na minutę. Wymień obiektyw na 40-krotne powiększenie.

Włącz Polychrome V.Select długość fali emisji i oświetlenie w trybie ciągłym. Otwórz migawkę. Obiektyw o powiększeniu poniżej 40 razy, w trybie fluorescencji podświetlenia zapewniają, że zaciski są załadowane.

Znajdź terminal i skup się na nim. Obciążony nerw i dobrze obciążone zakończenia nerwów ruchowych są przedstawione na rysunku. Przechwytywanie wideo za pomocą kamery Red-Short Neuro CCD.

Uruchom oprogramowanie Turbo-SM. Wybierz, Zmień ustawienia. Wejściowa liczba ramek wynosi 500.

Wpisz nazwę eksperymentu. Podstawowa konfiguracja to 1000 klatek na sekundę. 80 na 80.

Wybierz wyzwalacz zewnętrzny. Wprowadź czas przed wyzwoleniem. Minus dziesięć milisekund.

Wprowadź liczbę powtórzeń, 20. W oprogramowaniu Polychrome wybierz tryb podświetlenia zewnętrznego spustu. Uruchom oprogramowanie Clambene.

Protokół stymulacji obciążenia. Protokół jest dostępny do pobrania ze strony naszego laboratorium na stronie internetowej Kazańskiego Uniwersytetu Federalnego. Przed nagrywaniem uchwyć ciemną klatkę w oprogramowaniu Turbo-SM.

Na trójokularowym sześcianie wybierz poziomy wymiany ścieżki światła. 100 procent dla kamery. Uruchom protokół stymulacji.

Wybierz interesujący Cię region i sprawdź sygnał. W odpowiedzi na stymulację nerwów rejestrujemy zmianę intensywności fluorescencji, która odzwierciedla wejście wapnia do zakończenia nerwowego. Analiza danych.

W oprogramowaniu Turbo-SM wybierz plik. Następnie wybierz uśrednione pliki. Wybierz pliki.

Wprowadź nazwę przeciętnego pliku i uśrednij je. Zapisz plik średniej jako plik dopasowania. Wybierz, zapisz jako plik dopasowania.

Wprowadź nazwę pliku i zapisz go. Uruchom Image J i otwórz poniższe instrumenty. Analiza, narzędzia, ROI Manager.

Znajdź zapisany plik średniej w formacie dopasowania. Przeciągnij i upuść go na Obraz J.Powiększ okno, aby uzyskać lepszy widok. Zaznacz prostokątny obszar zainteresowania na tle, które uważasz za tło.

Dodaj go do menedżera ROI. W Menedżerze ROI wybierz więcej. Wielozadaniowy. Średnia obciążenia.

Kopiowanie danych, eksportowanie do programu Excel. W programie Excel użyj funkcji średniej, aby obliczyć średnią wartość tła dla stosunku. Bez zamykania programu Excel wróć do obrazu J.Zamknij okno z obliczeniami tła bez zapisywania.

Użyj Menedżera ROI, usuń prostokątny rysunek tła. Otwarty proces instrumentu, matematyka, odejmowanie. Wprowadź obliczoną uśrednioną wartość progu z Excela i odejmij teren od stosów.

Wybierz prostokątny obszar zainteresowania wokół zakończenia nerwowego. Dodaj go do Menedżera ROI. W Menedżerze ROI wybierz, więcej, Multi-measure, load down, mean.

Skopiuj i wklej w oknie Excela. Użyj wykresu wykresu instrumentu programu Excel. Wybierz płaski obszar przed uruchomieniem sygnału.

Załaduj wykres szczegółami od pierwszych wartości fluorescencji w sposze, do początku sygnału. Następnie określ liczbę punktów do uśrednienia spoczynkowych wartości fluorescencji. Uśrednij te wartości, a następnie znajdź średnią liczbę fluorescencji w reszcie.

Podziel sygnały przez fluorescencję w reszcie. Odejmij jeden i pomnóż przez 100 procent. Wykreślić sygnał i obliczyć amplitudę stanu przejściowego wapnia.

Parametry czasowe sygnałów fluorescencyjnych zależą od szybkości reakcji do przodu i/lub do tyłu powstawania kompleksu wapniowo-barwnikowego. Czas narastania sygnału wapnia reprezentuje dynamikę wprowadzania wapnia. To dyfuzja w końcówce i interakcja wapnia z barwnikiem.

Rozpad przejściowego wapnia zależy od powinowactwa do barwnika i szybkości buforowania wapnia oraz jego wycofania. Analiza przejściowej amplitudy wapnia może być wykorzystana do zbadania wpływu różnych substancji czynnych na wnikanie wapnia, które uczestniczą w uwalnianiu neuroprzekaźników. Ta technika ładowania doskonale nadaje się do obrazowania zmian w cytosomalnym wapniu.

Ze wskaźnikami fluorescencyjnymi i zarówno stymulacją pojedynczego nerwu, jak i rytmiczną aktywnością synaptyczną. Analiza amplitudy przejściowej wapnia może być wykorzystana do zbadania wpływu różnych substancji na wnikanie wapnia, który uczestniczy w uwalnianiu neuroprzekaźników. Jest kilka ważnych punktów, na które chcemy zwrócić uwagę.

Procedura inkubacji składa się z dwóch etapów. Inkubacja w temperaturze pokojowej i w lodówce. Ważne jest, aby kontrolować czas inkubacji z barwnikiem w temperaturze pokojowej.

W zależności od długości kikuta nerwowego, barwnika i temperatury w pomieszczeniu, czas inkubacji może się różnić. W przypadku prześwietlenia końcówek przedoperacyjnych i części proksymalnych, w pobliżu kikuta nerwowego, może dojść do przeciążenia. Ze względu na długą inkubację w lodówce barwnik jest równomiernie rozprowadzany wzdłuż zakończeń nerwowych.

Konieczne jest umieszczenie nerwu w roztworze ładującym barwnik w ciągu kilku minut po przecięciu, aby barwnik mógł dostać się do nerwu, ponieważ dłuższe odstępy czasu powodowały nieefektywne obciążenie, prawdopodobnie z powodu odbioru zamkniętego nerwu. Aby zmniejszyć podział barwnika na przedziały, możliwe jest użycie rozszerzonej formy barwnika. Bardzo ważne jest, aby zapobiec długiemu fluorescencyjnemu oświetleniu tkanki, ponieważ wpływa to na jej przeżycie.

Używamy optyki Nomarski w kanale światła widzialnego do wyszukiwania terminali. Podczas nagrywania ograniczamy oświetlony widok, przez przysłonę. Długi czas trwania procesu ładowania można skrócić za pomocą stempla migawki nerwu.

W takim przypadku można zastosować szklane mikro-obejście.