Name: Ładowanie barwnika wapniowego do zakończeń nerwowych żaby przez kikut nerwowy: przejściowa rejestracja wapnia w połączeniu nerwowo-mięśniowym żaby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 5 s
Description: Poznaj metodę ładowania barwnika wapniowego do zakończeń nerwowych żaby przez kikut nerwowy. Technika umożliwia rejestrację szybkich zmian wapnia w połączeniu nerwowo-mięśniowym i badanie wpływu leków na sygnalizację wapniową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało przeprowadzone w ramach Programu Konkurencyjnego Rozwoju Rządu Rosyjskiego Uniwersytetu Federalnego w Kazaniu oraz grantu od Rosyjskiej Fundacji Badań Podstawowych (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983). Dziękujemy czterem anonimowym recenzentom za pomocne komentarze do wcześniejszych wersji manuskryptu. Wyrażamy naszą wdzięczność Yuliyi Aratskaya za nagranie głosu. Jesteśmy wdzięczni dr Wiktorowi Iljinowi za wiele pomocnych komentarzy i pomoc w ostatecznej redakcji manuskryptu.

Doświadczenia przeprowadzono na izolowanych preparatach nerwowo-mięśniowych mięśnia piersiowego skórnego (musculus cutaneous pectoris) żaby z gatunku Rana ridibunda. Wielkość zwierząt obu płci wynosiła około 5-9 cm. Procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Federalnego w Kazaniu oraz Uniwersytetu Medycznego w Kazaniu, zgodnie z przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Protokół eksperymentalny spełniał wymogi dyrektywy Rady Wspólnot Europejskich 86/609/EWG i został zatwierdzony przez Komisję Etyczną Uniwersytetu Medycznego w Kazaniu.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu Ringera.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór Ringera: 113.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 3.0 mM NaHCO3 oraz 1.8 mM CaCl2. Dostosować pH do poziomu 7.2-7.4.</li>
		<li>Przygotować roztwór Ringera o niskiej zawartości Ca2+ i wysokiej zawartości Mg2+: 113.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 3.0 mM NaHCO3, 6.0 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2. Dostosować pH do poziomu 7.2-7.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu do ładowania barwnika.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór wodny zawierający HEPES-Na w stężeniu 10 mM (pH 7.2-7.4).</li>
		<li>Dodać 14 µL roztworu HEPES do fiolki z barwnikiem30. 
		UWAGA: barwnik wskaźnikowy Ca2+ jest dostarczany w fiolce o objętości 500 µL zawierającej 500 µg proszku.</li>
		<li>Wymieszać na wirówce typu vortex i odwirować, aby dokładnie wymieszać zawartość.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór, aby obniżyć końcowe stężenie wskaźnika Ca2+ do 30 mM. Unikać ekspozycji na światło i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Procedura ładowania barwnika
<ol>
	<li>Wypreparuj mięsień piersiowy skórny za pomocą fragmentu mięsień piersiowy właściwy nerw 
	UWAGA: Procedura sekcji jest dostępna w bezpłatnie pobieranym artykule autorstwa Bliocha i wsp., 196831.
	<ol>
		<li>Do procedury sekcji należy użyć dwóch pęset precyzyjnych oraz nożyczek rogówkowych (patrz Tabela materiałów). Przenieść wypreparowaną tkankę do szalki Petriego powleczonej elastomerem silikonowym, uprzednio wypełnionej roztworem Ringera, a następnie unieruchomić tkankę za pomocą cienkich stalowych szpilek w taki sposób, aby była ona lekko napięta w szalce.</li>
		<li>Napełnić ponownie szalkę Petriego świeżą porcją roztworu Ringera. Usunąć tkankę łączną. Należy uważać, aby nie uszkodzić nerwu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pipetę do napełniania: za pomocą żyletki odetnij fragment o długości ok. 2 mm z części stożkowej standardowej plastikowej 10 µL końcówka do pipety</li>
	<li>Przygotuj kawałek plasteliny, aby zamocować pipetę do napełniania na szalce Petriego.</li>
	<li>Połącz tylną część pipety napełniającej z plastikową strzykawką za pomocą rurki silikonowej i plastikowych adapterów łączących wykonanych z końcówek do pipet.</li>
	<li>Przed procedurą wprowadzania barwnika należy usunąć roztwór Ringera z szalki Petriego za pomocą plastikowej pipety. Osusz preparat mięśnia i nerwu za pomocą cienkiej strzykawki; zapobiegnie to rozcieńczeniu Ca2+ barwnik podczas następnego napełniania pipety do wypełniania.</li>
	<li>Usuń Ca2+ fiolkę z wskaźnikiem z zamrażarki i pozostawić do rozmrożenia w temperaturze pokojowej w ciemnym miejscu.</li>
	<li>Pod kontrolą stereomikroskopu przy niskim powiększeniu (10×) zlokalizuj miejsce połączenia mięśnia z nerwem. Za pomocą precyzyjnej pęsety i nożyczek odetnij mięsień piersiowy właściwy nerw blisko powierzchni mięśnia (patrz krok 2.1). Pozostaw pień nerwu o długości około 2 mm.</li>
	<li>Przymocuj pipetę do napełniania połączoną z rurką oraz strzykawkę na szalce Petriego za pomocą plasteliny modelarskiej.</li>
	<li>Zbliż końcówkę pipety do kikutu nerwu.</li>
	<li>Bez ściskania, delikatnie odessać pień nerwu do końcówki pipety do napełniania.</li>
	<li>Zdejmij rurkę ssącą z tępego końca pipety napełniającej.</li>
	<li>Ostrożnie usuń nadmiar roztworu z pipety do napełniania, używając strzykawki z długą igłą (patrz na Tabela materiałów). Nie przyciskać kikuta nerwu.</li>
	<li>Powoli unieś pionowo końcówkę pipety do napełniania, utrzymując pień nerwu zassanego w końcówce.</li>
	<li>Odizolować aspirowaną część kikutu nerwu od zewnętrznej strony końcówki pipety wypełniającej za pomocą wazeliny.</li>
	<li>W razie potrzeby osuszyć pień nerwu odizolowany w pipecie napełniającej: ostrożnie odessać nadmiar roztworu z pipety napełniającej za pomocą strzykawki z długą igłą.</li>
	<li>Rysuj 0.5 µL roztworu obciążającego barwnikiem (patrz krok 1) za pomocą pipety z długim końcem.</li>
	<li>Ostrożnie wprowadź końcówkę pipety z roztworem ładującym do pipety do napełniania. Wypuść mieszaninę bezpośrednio na pień nerwu.</li>
	<li>Uszczelnić otwarty koniec pipety do napełniania wazeliną.</li>
	<li>Do szalki Petriego należy dodać niewielką alikwot roztworu Ringera, aby zapobiec wysychaniu preparatu.</li>
	<li>Inkubować preparat w temperaturze pokojowej, w ciemności i w warunkach wilgotnych przez 5 h.</li>
	<li>Usuń pipetę wypełniającą z roztworem obciążającym, wypłucz preparat roztworem Ringera i przechowuj go przez noc w lodówce w temperaturze 8 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie tkanki do mikroskopii
<ol>
	<li>Umieść preparat w komorze powlekanej elastomerem silikonowym i przymocuj go za pomocą stalowych mikroirygieł w taki sposób, aby był lekko napięty.</li>
	<li>Przepłucz tkankę porcją świeżego roztworu Ringera.</li>
	<li>Do stymulacji nerwu należy użyć elektrody ssącej; konstrukcja elektrody jest dostępna w bezpłatnie pobranym artykule autorstwa Kazakova i wsp., 201532Ustaw końcówkę elektrody blisko przeciętego końca nerwu i zaspiruj pień nerwu do otworu elektrody.</li>
	<li>Zamocuj komorę preparacyjną na stoliku mikroskopu. Umieść w komorze sondę temperatury oraz wloty i wyloty przewodów.</li>
	<li>Podłącz przewód zasilający do elementu Peltiera.</li>
	<li>Aby przeprowadzić superfuzję preparatu, należy zastosować prosty system grawitacyjny. W celu usunięcia nadmiaru roztworu należy włączyć pompę ssącą do perfuzji.</li>
	<li>Włącz urządzenie termokontrolera.</li>
	<li>Ustaw regulację temperatury na 20 °C.</li>
	<li>Zamontuj osłonę ochrony przed promieniowaniem ultrafioletowym.</li>
	<li>Podłącz drucianą elektrodę stymulującą do stymulatora elektrycznego i obserwuj skurcze mięśni pod mikroskopem przy użyciu obiektywu 4x.</li>
	<li>Napełnij system perfuzyjny roztworem Ringera z niską zawartością Ca.2+ i wysokomagnezowe2+ Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia. 
	UWAGA: Roztwór ten jest stosowany w celu zapobiegania skurczom mięśni. Obniżenie stężenia wapnia zewnętrznego oraz podwyższenie stężenia magnezu zewnętrznego prowadzą do zmniejszenia amplitudy Ca2+ stany przejściowe. Jednakże, w oparciu o wcześniejsze doświadczenia, 0,9 mM CaCl2 oraz 6 mM MgCl22 nadal wystarczają do wiarygodnego określenia amplitudy Ca2+ stany przejściowe. Warto wspomnieć, że istnieją inne sposoby zmniejszenia skurczów mięśni bez redukcji poziomu Ca2+ stężenie. Na przykład zastosowanie d-tubokuraryny lub alfa-bungaratoksyny, specyficznych blokerów nikotynowych receptorów acetylocholiny, spowodowałoby całkowite lub częściowe zablokowanie drgawek mięśni17,27,28,30Jednak dodatek tych toksyn może również wpływać na presynaptyczny napływ jonów wapnia33Aby tego uniknąć, µ-można zastosować konotoksynę GIIIA27.</li>
	<li>Włącz pompę i rozpocznij superfuzję preparatu roztworem Ringera o niskiej zawartości Ca.2+ i wysoka zawartość Mg2+.</li>
	<li>Przełącz mikroskop na obiektyw 40×.</li>
	<li>Włącz monochromator (patrz w Tabela materiałów).</li>
	<li>W oprogramowaniu sterującym monochromatorem należy wybrać długość fali emisji 488 nm oraz tryb ciągłego oświetlania.</li>
	<li>Przy dużym powiększeniu w trybie fluorescencji należy upewnić się, że zakończenia nerwowe zostały załadowane barwnikiem.</li>
</ol>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna neuronów, struktura komórkowa, wizualizacja dendrytów, obrazowanie mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55122/55122fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Nerw i zakończenia z załadowanym wskaźnikiem Ca2+. (A) Nerw wypełniony wskaźnikiem Ca2+ po procedurze ładowania. Pasek skali = 200 µm. (B) Zakończenia nerwowe wypełnione wskaźnikiem Ca2+. Pasek skali = 20 µm. (C) Fluorescencja wskaźnika Ca2+ jest wyraźnie widoczna w zakończeniu nerwowym. Pasek skali = 20 µm. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55122/55122fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<ol start="17">
	<li>Pozostawić preparat do wyrównania potencjałów przez co najmniej 30 min w roztworze z niską zawartością Ca2+ i wysoką zawartością Mg2+.</li>
</ol>
4. Rejestracja wideo za pomocą cyfrowej kamery CCD
Uwaga: Szczegóły rejestrowania sygnałów fluorescencji są specyficzne dla każdego typu mikroskopu i kamery, jednak kluczowym aspektem jest prędkość przechwytywania obrazu.
<ol>
	<li>W przypadku rejestracji pojedynczych przejściowych zmian stężenia Ca2+ w NMJ należy zastosować minimalną częstotliwość próbkowania 1 kHz. 
	UWAGA: Do obrazowania fluorescencyjnego niezbędne są szybkie cyfrowe kamery CCD (patrz: Tabela materiałów). System akwizycji danych oraz oprogramowanie (patrz: Tabela materiałów) zostały tutaj wykorzystane do synchronizacji kamery, monochromatora i stymulatora. W skrócie, protokół ten umożliwia generowanie impulsów synchronizujących na wyjściach cyfrowych systemu akwizycji danych w celu otwarcia migawki, przechwycenia sygnału wideo i rozpoczęcia stymulacji. Wszystkie parametry czasowe można ustawić w protokołach i/lub na urządzeniach. Typowy protokół obejmuje serię 500 klatek pozyskiwanych z częstotliwością 1 kHz (80 x 80 pikseli). Naświetlanie światłem wzbudzenia może prowadzić do wybielenia wskaźnika Ca2+ oraz fotouszkodzenia tkanki komórkowej. Należy zatem unikać długiej ekspozycji na światło wzbudzenia. W tym protokole migawka pozostaje otwarta tylko przez czas niezbędny do przechwycenia obrazu wideo. Pozyskaj dwadzieścia serii dla każdego konkretnego zakończenia nerwowego. Celem jest monitorowanie tych samych obszarów w grupie kontrolnej oraz po podaniu leku.</li>
	<li>Przy użyciu obiektywu 4X mikroskopu, wykorzystaj tryb jasnego pola, aby zwizualizować mięśnie i odgałęzienia nerwów.</li>
	<li>Przełącz na obiektyw 40X i, korzystając z trybu epifluorescencji oraz długości fali wzbudzenia 488 nm, wyszukaj załadowane barwnikiem zakończenia nerwowe. Zidentyfikuj obszar zainteresowania (ROI) w obrębie zakończenia nerwowego.</li>
	<li>Na tubusie trójokularowym mikroskopu wybierz poziomy wymiany drogi światła: 100% światła do kamery.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie akwizycyjne dla kamery CCD.</li>
	<li>W trybie „Live” znajdź ROI i ustaw ostrość.</li>
	<li>Wybierz menu ustawień „Change”.</li>
	<li>W sekcji „Basic Configuration” ustaw wartość 1 000 klatek na sekundę (fps) przy rozdzielczości 80 x 80.</li>
	<li>Ustaw liczbę klatek wejściowych na 500.</li>
	<li>Wpisz nazwę eksperymentu.</li>
	<li>Wybierz opcję „External Trigger”.</li>
	<li>Ustaw czas pre-triggera na 10 ms.</li>
	<li>Ustaw liczbę powtórzeń na 20.</li>
	<li>W oprogramowaniu sterującym monochromatorem wybierz długość fali emisji 488 nm oraz tryb „external trigger illumination”.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych.</li>
	<li>Załaduj protokół stymulacji.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem nagrywania wideo przechwyć klatkę ciemną (dark frame) za pomocą oprogramowania do akwizycji wideo.</li>
	<li>Uruchom protokół stymulacji.</li>
	<li>Wybierz ROI i sprawdź zarejestrowany sygnał.</li>
</ol>
5. Analiza danych
UWAGA: Do analizy danych należy wykorzystać oprogramowanie kamery CCD oraz program ImageJ; dane są przedstawione w formie krzywej w arkuszu kalkulacyjnym. W oprogramowaniu kamery CCD należy wyciągnąć średnią z 20 powtórzeń i wyeksportować wyniki do pliku obsługiwanego przez ImageJ. W programie ImageJ należy zaznaczyć ROI oraz tło. Od ROI należy odjąć wartość tła. Dane należy przedstawić jako stosunek: (ΔF/F0 -1) x 100%, gdzie ΔF to intensywność fluorescencji podczas stymulacji, a F0 to intensywność fluorescencji w spoczynku.
<ol>
	<li>W oprogramowaniu do akwizycji obrazu dla kamery CCD kliknij Plik &gt; Average Files. Wybierz pliki i oblicz ich średnią.</li>
	<li>Zapisz plik uśredniony jako plik .fit, klikając „Save as Fit file”.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie ImageJ. Wykonaj następujące kroki:</li>
	<li>Kliknij Image &gt; adjust &gt; brightness/contrast.</li>
	<li>Kliknij Image &gt; stacks &gt; tools &gt; stack sorter.</li>
	<li>Kliknij Analysis &gt; tools &gt; ROI manager.</li>
	<li>Przeciągnij i upuść uśredniony plik .fit do okna programu ImageJ.</li>
	<li>Powiększ widok w oknie, aby uzyskać lepszą widoczność.</li>
	<li>Przesuwając kursor, wybierz ostatnią klatkę i usuń ją (jest to klatka ciemna)</li>
	<li>Wybierz prostokątny obszar ROI w miejscu uznanym za tło. Dodaj go do ROI manager</li>
	<li>Zmierz tło, klikając More &gt; Multi Measure. Zanotuj wartość MEAN. Skopiuj dane, wyeksportuj je do programu arkusza kalkulacyjnego i oblicz średnią wartość progu dla stosunku.</li>
	<li>Odejmij próg od stosu obrazów, klikając Process &gt; Main &gt; Subtract. Wprowadź uśrednioną wartość progu.</li>
	<li>Wybierz prostokątny obszar ROI wokół zakończenia nerwowego. Dodaj go do ROI manager.</li>
	<li>Wykonaj pomiar, klikając More &gt; Multi Measure. Zanotuj wartość MEAN. Skopiuj i wyeksportuj ją do programu arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Oblicz średni offset sygnałów. 
	UWAGA: Użyj pierwszych kilkudziesięciu punktów wykazujących podstawową fluorescencję barwnika bez stymulacji; jest to fluorescencja spoczynkowa.</li>
	<li>Podziel sygnały przez fluorescencję spoczynkową.</li>
	<li>Odejmij „1” i pomnóż przez 100%.</li>
	<li>Wykreśl sygnał i oblicz amplitudę przejściowego wzrostu stężenia Ca2+.</li>
</ol>

<ol><li>Llinás, R., Sugimori, M., Silver, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdomains+of+high+calcium+concentration+in+a+presynaptic+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microdomains of high calcium concentration in a presynaptic terminal.</a> Science. 256, 677-679 (1992).</li>
<li>Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+does+calcium+trigger+neurotransmitter+release%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">How does calcium trigger neurotransmitter release?</a> Curr Opin Neurobiol. 11, 320-326 (2001).</li>
<li>Burnashev, N., Rozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Ca2%2B+dynamics%2C+Ca2%2B+buffers+and+synaptic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy.</a> Cell Calcium. 37, 489-495 (2005).</li>
<li>Schneggenburger, R., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+calcium+and+control+of+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic calcium and control of vesicle fusion.</a> Curr Opin Neurobiol. 15, 266-274 (2005).</li>
<li>Pang, Z. P., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+Ca2%2B-triggered+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 496-505 (2010).</li>
<li>Borst, J. G., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+influx+and+transmitter+release+in+a+fast+CNS+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium influx and transmitter release in a fast CNS synapse.</a> Nature. 383, 431-434 (1996).</li>
<li>Borst, J. G., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+current+during+a+single+action+potential+in+a+large+presynaptic+terminal+of+the+rat+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium current during a single action potential in a large presynaptic terminal of the rat brainstem.</a> J Physiol. 506, 143-157 (1998).</li>
<li>Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+presynaptic+calcium+and+calcium-activated+potassium+currents+regulating+neurotransmitter+release+at+cultured+Xenopus+nerve-muscle+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses.</a> J Neurosci. 17, 2990-3001 (1997).</li>
<li>Molgó, J., Mallart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Anemonia+sulcatatoxin+II+on+presynaptic+currents+and+evoked+transmitter+release+at+neuromuscular+junctions+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Effects of Anemonia sulcatatoxin II on presynaptic currents and evoked transmitter release at neuromuscular junctions of the mouse.</a> Pflugers Arch. 405 (4), 349-353 (1985).</li>
<li>Slutsky, I., Rashkovan, G., Parnas, H., Parnas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-independent+feedback+inhibition+of+acetylcholine+release+in+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ca2+-independent feedback inhibition of acetylcholine release in frog neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 22 (9), 3426-3433 (2002).</li>
<li>Haugland, R. P. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+fluorescent+probes+and+research+products%22">Handbook of fluorescent probes and research products</a>. Gregory, J. , MolecularProbes. Eugene,Oregon. 771-826 (2002).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2538708">Fluorescent indicators of ion concentrations.</a> Methods Cell Biol. 30, 127-156 (1989).</li>
<li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20194474">How calcium indicators work.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (3), (2010).</li>
<li>DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+detection+of+action+potential-induced+presynaptic+calcium+transients+at+a+Xenopus+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction.</a> J Physiol. 505, 585-592 (1997).</li>
<li>Sabatini, B. L., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+presynaptic+calcium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of presynaptic calcium currents.</a> Biophys J. 74, 1549-1563 (1998).</li>
<li>Suzuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+dynamics+at+the+frog+motor+nerve+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Pflug+Arch+Eur+J+Phisiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal.</a> Pflug Arch Eur J Phisiol. 440, 351-365 (2000).</li>
<li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896627302005731">The life cycle of Ca2+ ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li>
<li>Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-pixel+optical+fluctuation+analysis+of+calcium+channel+function+in+active+zones+of+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 31, 11268-11281 (2011).</li>
<li>Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRegehr%2C+WG+%22Imaging+in+neuroscience+and+development%3A+a+laboratory+manual%22">Imaging in neuroscience and development: a laboratory manual</a>. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 307-314 (2005).</li>
<li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+Application+of+Indicators+for+Calcium+Imaging+at+the+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Topical Application of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 786-790 (2012).</li>
<li>Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye+loading+with+Patch+Pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dye loading with Patch Pipettes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (4), 277-281 (2009).</li>
<li>Coleman, W. L., Bill, C. A., Simsek-Duran, F., Lonart, G., Samigullin, D., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsin+II+and+calcium+regulate+vesicle+docking+and+the+cross-talk+between+vesicle+pools+at+the+mouse+motor+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals.</a> J Physiol. 586 (19), 4649-4673 (2008).</li>
<li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Injection+of+Indicators+for+Calcium+Imaging+at+the+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct Injection of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 797-801 (2012).</li>
<li>Talbot, J. D., David, G., Barrett, E. F., Barrett, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dependence+of+damage+to+mouse+motor+nerve+terminals+following+oxygen%2Fglucose+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Calcium dependence of damage to mouse motor nerve terminals following oxygen/glucose deprivation.</a> Exp Neurol. 234 (1), 95-104 (2012).</li>
<li>Peng, Y. Y., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+LHRH+is+linearly+related+to+the+time+integral+of+presynaptic+Ca2%2B+elevation+above+a+threshold+level+in+bullfrog+sympathetic+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca2+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia.</a> Neuron. 10, 465-473 (1993).</li>
<li>Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Latrotoxin+releases+calcium+in+frog+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">alpha-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 20 (23), 8685-8692 (2000).</li>
<li>Newman, Z., Malik, P., Wu, T. Y., Ochoa, C., Watsa, N., Lindgren, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+mediate+muscarine-induced+synaptic+depression+at+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction.</a> Eur J Neurosci. 25 (6), 1619-1630 (2007).</li>
<li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward-filling+of+dextran-conjugated+indicators+for+calcium+imaging+at+the+drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 3440-3450 (2012).</li>
<li>Wu, L. G., Betz, W. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8893033">Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).</li>
<li>Blioch, Z. L., Glagoleva, I. M., Liberman, E. A., Nenashev, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+mechanism+of+quantal+transmitter+release+at+a+chemical+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A study of the mechanism of quantal transmitter release at a chemical synapse.</a> J Physiol. (1), 11-35 (1968).</li>
<li>Kazakov, A., Aleksandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. <a target="_blank" href="http://research-journal.org/en/biology-en/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/">A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects.</a> Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. 40 (9), In Russian 13-16 (2015).</li>
<li>Khaziev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine-induced+inhibition+of+presynaptic+calcium+signals+and+transmitter+release+in+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction.</a> Front Physiol. 7 (621), 1-10 (2016).</li>
<li>Bélair, E. L., Vallée, J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+modulation+of+synaptic+efficacy+at+the+neuromuscular+junction+of+Rana+pipiens+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo modulation of synaptic efficacy at the neuromuscular junction of Rana pipiens frogs.</a> J Physiol. 569 (1), 163-178 (2005).</li>
<li>Samigullin, D., Fatikhov, N., Khaziev, E., Skorinkin, A., Nikolsky, E., Bukharaeva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+presynaptic+calcium+currents+and+endogenous+calcium+buffers+at+the+frog+neuromuscular+junction+with+two+different+calcium+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Synaptic+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes.</a> Front Synaptic Neurosci. 6 (29), 1-10 (2015).</li>
<li>Angleson, J. K., Betz, W. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11152728">Intraterminal Ca2+ and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction.</a> J Neurophysiol. 85 (1), 287-294 (2001).</li>
<li>Shahrezaei, V., Cao, A., Delaney, K. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17182774">Ca2+ from one or two channels controls fusion of a single vesicle at the frog neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 26 (51), 13240-132499 (2006).</li>
<li>Troncone, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+and+reversible+blocker+of+presynaptic+calcium+channels+in+frog+and+crayfish+neuromuscular+junctions+from+Phoneutria+nigriventer+spider+venom%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous and reversible blocker of presynaptic calcium channels in frog and crayfish neuromuscular junctions from Phoneutria nigriventer spider venom.</a> J Neurophysiol. 90 (5), 3529-3537 (2003).</li>
<li>Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Sudakov, I. A., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12668-016-0318-6">Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction.</a> BioNanoSci. 7 (1), 162-166 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy przedstawiono metodę przeprowadzania ładowania barwnika wrażliwego naCa2+ do zakończeń nerwowych żaby przez kikut nerwu. Pod koniec procedury ładowania wszystkie zakończenia w bliższej części nerwu mają znaczny poziom fluorescencji. Oszacowano, że stężenie wewnątrzkońcowe sondy waha się od 40 do 150 μM17.
Procedura inkubacji przebiega w dwóch etapach: w temperaturze pokojowej, a następnie w niższej temperaturze w lodówce. Ważne jest, aby kontrolować czas inkubacji tkanek z barwnikiem w temperaturze pokojowej. W zależności od rzeczywistej długości kikuta nerwowego, konkretnego barwnika i temperatury, czas inkubacji może się różnić. W przypadku prześwietlenia zakończenia w częściach proksymalnych w pobliżu kikuta nerwowego mogą być przeciążone. Jednak w środkowej części nerwu nadal można znaleźć zakończenia, które są zadowalająco obciążone. Podczas długiej inkubacji w lodówce barwnik jest równomiernie rozprowadzany na zakończeniach nerwowych.
Nasze własne obserwacje33,35, jak również dane innych badaczy30, dowodzą braku jakiegokolwiek istotnego wpływu procedury obciążenia na amplitudę odpowiedzi postsynaptycznej lub na częstotliwość miniaturowych potencjałów płytek końcowych. Dobra trwałość została udokumentowana w załadowanych preparatach. Jest kilka ważnych punktów, na które chcielibyśmy zwrócić uwagę. Bardzo ważne jest, aby umieścić kikut nerwowy w roztworze ładującym barwnik w ciągu kilku minut po wycięciu, aby barwnik mógł dostać się do aksonów przeciętego nerwu; Opóźnienia mogą powodować nieefektywne obciążenie, prawdopodobnie z powodu ponownego uszczelnienia aksonów nerwowych27,36. Niektórzy badacze zanurzają kikut nerwu w 100 mM EDTA (chelator Ca2 + i Mg2 +) natychmiast po wycięciu nerwu, aby zapobiec ponownemu uszczelnieniu przeciętych aksonów. Bufor usuwa się po 1-2 minutach i zastępuje roztworem barwiącym37. Użycie studzienki z wazeliną zamiast plastikowej rurki do procedury załadunku pozwala na użycie krótszego kikuta nerwowego. Przy zastosowaniu tego podejścia nerw jest przecinany po zanurzeniu go w roztworze HEPES z barwnikiem, a aksony nie zamykają się ponownie z powodu braku jonów dwuwartościowych w roztworze barwnika27,28.
W naszym badaniu zamiast dekstranu użyliśmy rozpuszczalnej w wodzie formy soli wskaźnika Ca2+ . Koniugaty dekstranu dyfundują w aksonie wolniej niż tworzy się sól. Jednak zastosowanie koniugatu dekstranu zmniejsza podział barwnika na przedziały i obchodzenie się z nim przez nerwy i NMJ. Konjugat dekstranu Calcium Green 1-3,000 MW ma dobrą szybkość dyfuzji i wykazuje zmniejszoną kompartmentalizację38.
Bardzo ważne jest, aby unikać długiego okresu fluorescencyjnego oświetlenia tkanki, ponieważ wpływa to na jej zdrowie i przeżycie. Używamy optyki Nomarskiego w kanale światła widzialnego do poszukiwania zakończeń nerwowych. Podczas nagrania ograniczamy oświetlane pole za pomocą przysłony.
Warto zauważyć, że ta metoda ładowania jest odpowiednia tylko dla preparatów, które mogą wytrzymać długie inkubacje. Aby skrócić czas ładowania barwnika, gdy badania są prowadzone na bardziej delikatnych tkankach (np. synapsach zwierząt stałocieplnych), konieczne jest zmniejszenie długości kikuta nerwowego i użycie mikropipet do ładowania29,39.
Ta technika ładowania dobrze nadaje się do obrazowania zmian w cytozolowym Ca2 +, ze wskaźnikami fluorescencyjnymi zarówno pod wpływem stymulacji pojedynczego nerwu, jak i rytmicznej aktywności synaptycznej 17,27,35. Analiza amplitudy przejściowej Ca2+ może być wykorzystana do zbadania wpływu różnych substancji na wnikanie wapnia, który uczestniczy w uwalnianiu neuroprzekaźników33.

Jony wapnia (Ca2+) uczestniczą w wielu neuronalnych procesach sygnalizacyjnych, w tym w inicjacji, utrzymaniu i plastyczności uwalniania mediatora1,2,3,4,5. Po nadejściu potencjału czynnościowego zewnątrzkomórkowy Ca2 + dostaje się do zakończenia nerwowego i inicjuje uwalnianie neuroprzekaźnika. W niektórych synapsach prąd wapnia może być mierzony bezpośrednio metodami elektrofizjologicznymi6,7,8. W przypadku połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) nie można stosować bezpośredniego zacisku krosowego i dwuelektrodowego zacisku napięciowego ze względu na niewielki rozmiar zakończeń nerwowych.
Zapisy wewnętrznych prądów Ca2+ z zakończeń nerwowych w NMJ mogą być wykonywane za pomocą pośrednich metod elektrofizjologicznych9,10. Jednak metody te wymagają wstępnego leczenia synapsy blokerami kanałów jonowych sodu i potasu. Metody optyczne nie wymagają farmakologicznej separacji prądów jonowych w końcówce nerwowej i pozwalają na zapis napływuCa2+, wywołanego potencjałami czynnościowymi, a następnie podniesienia jonów Ca2+ w aksoplazmie11,12,13,14. Metody te opierają się na zapisach zmian fluorescencji określonych barwników wrażliwych na Ca2+ po związaniu wolnych jonów Ca2+ 15,16,17,18,19.
Ca2+ wskaźniki mogą być ładowane do komórek różnymi metodami, w zależności od celu eksperymentu. Badacze stosują w kąpieli przepuszczalne dla membrany formy barwnika20,21, ładowanie za pomocą pipety krosowej22, lub mikroiniekcja23,24,25. Jednak wszystkie te metody mają pewne ograniczenia w przypadku NMJ ze względu na jego specyfikę w architekturze synaptycznej. W przypadku NMJ najwygodniejszą i najskuteczniejszą metodą jest załadowanie barwnika przez kikut nerwowy, metoda wypełniania do przodu26,27,28,29. Technika ta może być stosowana do ładowania różnych barwników fluorescencyjnych do zakończeń nerwów obwodowych. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana w <przypadku zakończeń nerwowych >Drosophila class="xref">28, nerwu ruchowego jaszczurki 28 oraz zakończeń nerwu ruchowego żaby17,26,27,30. W zależności od badanego obiektu, szczegóły metodyczne mogą się różnić. Szklana mikropipeta może być stosowana do małych nerwów od larw28. Kilku badaczy opisało metodę27,28, w której świeżo odcięty koniec nerwu unerwiającego mięsień jest zanurzany w studzience wstępnie wypełnionej barwnikiem. Preparat pozostawia się następnie na kilka godzin, aby nasącznić barwnik. Barwnik jest wchłaniany przez aksony i transportowany do zakończeń nerwowych. W artykule opisano metodę ładowania wskaźnika fluorescencji do zakończeń nerwu ruchowego żaby przez kikut nerwowy. Nasz protokół wykorzystuje plastikową końcówkę pipety do inkubacji tkanki z barwnikiem. Opisujemy również, jak pozyskiwać i analizować stany przejściowe fluorescencjiCa2+.

<table><tbody><tr><td>Wskaźnik Ca2 +</td><td>Sondy molekularne, USA</td><td>Oregon Green 488 Sól sześciopotasowa BAPTA-1, O6806</td><td>500 &mu; g</td></tr><tr><td>Elastomer silikonowy</td><td>Dow Corning, USA</td><td>Sylgard 184 elastomer</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Biohit, Rosja</td><td>720210</td><td>0,5-10 i mikro; L</td></tr><tr><td>Końcówka do pipet</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>02-707-175</td><td>10&micro; L</td></tr><tr><td>Końcówka do pipet</td><td>Biohit, Rosja</td><td>781349</td><td>10&micro; L</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Drobne narzędzia do cięcia, Kanada</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Mini-nożyczki rogówkowe</td><td>MT MEDI CORP, Kanada</td><td>S-1111</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze jubilerskie</td><td>MT MEDI CORP, Kanada</td><td>F-9610</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze jubilerskie</td><td>MT MEDI CORP, Kanada</td><td>F-9611</td><td></td></tr><tr><td>Modelowanie glina</td><td>lokalny producent</td><td></td><td>może zostać zastąpiony przez dowolnego lokalnego producenta</td></tr><tr><td>Wazelina</td><td>lokalny producent</td><td></td><td>może zostać zastąpiony przez dowolnego lokalnego producenta</td></tr><tr><td>Microspin FV 2400&nbsp;</td><td>Biosan, Latva</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>Multi-spin MSC 3000</td><td>Biosan, Latva</td><td>BS-010205-AAN</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe igły podskórne</td><td>Bbraun</td><td>100 Sterican</td><td>0,4 razy; 40mm</td></tr><tr><td>Syrynge</td><td>lokalny producent</td><td></td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H0887</td><td>Mikroskop 100 ml</td></tr><tr><td>, BX51</td><td>Olympus, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System akwizycji danych&nbsp;</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>Oprogramowanie Digitdata 1550</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Molecular Devices, USA</td><td>Oprogramowanie pClamp, protokół w wersji 10</td><td>można pobrać ze strony: http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro</td></tr><tr><td>Wanna i regulator temperatury kąpieli</td><td>Eksperymentalny konstruktor</td><td></td><td>może być zastąpiony przez dowolną komorę z regulacją temperatury. Na przykład z https://www.warneronline.com/&nbsp;</td></tr><tr><td>Monochromator</td><td>Till Photonics, Niemcy</td><td>Polychrome V</td><td>nie jest już dostępny, można go zastąpić innym&nbsp; &nbsp; stabilne źródło światła Oprogramowanie</td></tr><tr><td>sterujące monochromatorem</td> 488 nm <td>Till Photonics, Niemcy</td><td>Polycon</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera CCD</td><td>Obrazowanie Redshirt, USA</td><td>Neuro CCD SMQ</td><td></td></tr><tr><td>Model 2100 Izolowany stymulator impulsów</td><td>AM Systems, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie akwizycyjne do kamery CCD</td><td>Redshirt, USA</td><td>Oprogramowanie</td><td></td>Turbo SM</tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Program arkuszy kalkulacyjnych</td><td>Microsoft, USA</td><td>Microsoft Office Excel&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

Ładowanie barwnika wapniowego do zakończeń nerwowych żaby przez kikut nerwowy: przejściowa rejestracja wapnia w połączeniu nerwowo-mięśniowym żaby

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Jedną z najbardziej realnych metod pomiaru presynaptycznego poziomu wapnia w presynaptycznych zakończeniach nerwowych jest zapis optyczny. Opiera się na zastosowaniu wrażliwych na wapń barwników fluorescencyjnych, które zmieniają swoją intensywność emisji lub długość fali w zależności od stężenia wolnego wapnia w komórce. Istnieje kilka metod barwienia komórek barwnikami wapniowymi. Najczęściej spotykane są procesy ładowania barwników przez mikropipetę lub wstępnej inkubacji z formami estrów acetoksymetylowych barwników. Jednak metody te nie mają pełnego zastosowania do połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ) ze względu na pojawiające się problemy metodologiczne. W tym artykule przedstawiamy metodę ładowania barwnika wrażliwego na wapń przez kikut nerwu żaby do zakończeń nerwowych. Ponieważ wnikanie zewnętrznego wapnia do zakończeń nerwowych i późniejsze wiązanie się z barwnikiem wapnia następuje w skali milisekundowej, konieczne jest użycie systemu szybkiego obrazowania w celu zarejestrowania tych interakcji. W tym miejscu opisujemy protokół rejestrowania stanu nieustalonego wapnia za pomocą szybkiej kamery CCD.

Po załadowaniu barwnika i po stymulacji nerwu ruchowego w zakończeniach nerwowych można wykryć wzrost amplitudy sygnału fluorescencyjnego (przejściowy wzrost stężenia Ca2+) (patrz Rysunek 2). Parametry przejść Ca2+ przedstawiono w Tabeli 1. Ilościowo parametry przejść Ca2+ zmierzone w naszym badaniu są zbliżone do danych uzyskanych przez innych naukowców w synapsach zwierząt zmiennocieplnych15,34. Parametry przejść Ca2+ zależą od szybkości wiązania Ca2+ z barwnikiem i jego późniejszej dysocjacji. Szybkość wnikania Ca2+ do zakończenia nerwowego, oddziaływanie z barwnikiem oraz dyfuzja w cytoplazmie wpływają na czas narastania sygnału Ca2+. Czas zaniku sygnału fluorescencyjnego zależy od powinowactwa barwnika, szybkości oddziaływania Ca2+ z buforami wewnątrzkomórkowymi oraz usuwania jonów przez pompy jonowe35. Analiza amplitudy przejść Ca2+ może być wykorzystana do badania wpływu różnych substancji na napływ wapnia uczestniczący w uwalnianiu neuroprzekaźnika33.
<img alt="Wykres absorpcji przejściowej, ∆F/F₀ w funkcji czasu, pokazujący odpowiedź na pobudzenie fotoniczne w milisekundach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55122/55122fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Średnia odpowiedź przejściowa Ca2+ zmierzona w żabim NMJ. Przejściowy wzrost poziomu Ca2+ obliczono na podstawie średniej z sygnałów pochodzących z 13 żabich NMJ. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55122/55122fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Szczytowa wartość ΔF/F (%)</td>
			<td>Czas narastania 20%–80% (ms)</td>
			<td>τ (ms)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12,6 ± 1,1 (n = 13)</td>
			<td>4,6 ±0,5 (n = 13)</td>
			<td>115,3 ± 8,3 (n = 13)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Średnie parametry przejściowego stężeniaCa2+. Dane przedstawiono jako średnia ± SE; n oznacza liczbę pomiarów w oddzielnych NMJ. Szczytowe ΔF/F to średnia amplituda ΔF/F.

Tutaj opisujemy metodę ładowania barwnika wrażliwego na wapń przez pień nerwu żaby do zakończeń nerwowych. Przedstawiamy również protokół rejestracji i analizy szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych.

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Witam, nazywam się Dimitry Samigullin i pracuję w laboratorium Biofizyki Procesów Synaptycznych w Kazańskim Instytucie Biochemii i Biofizyki Rosyjskiej Akademii Nauk. W naszym laboratorium badamy różnorodne mechanizmy sygnalizacji wapniowej w złączu nerwowo-mięśniowym. Jedną z najbardziej dostępnych metod pomiaru synaptycznego poziomu wapnia jest rejestracja optyczna.W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę wprowadzania barwnika wrażliwego na jony wapnia przez kikut nerwu do zakończeń nerwowych żaby. Przedstawiamy również protokół pomiaru oraz analizy rozległego przejścia wapniowego w terminalach nerwowych żaby. Zastosowanie tej metody umożliwia badanie wpływu aktywnych substancji leczniczych na presynaptyczny poziom wapnia podczas aktywności synaptycznej.Przygotowanie roztworu ładującego barwnik. Barwnik wapniowy fluoresceiny Oregon Green BAPTA dostarczany jest w ilości 500 µL w postaci niewielkiej ilości 500 µg proszku. Do proszku należy dodać 14 µL roztworu zawierającego HEPES.Wymieszaj roztwór do ładowania za pomocą vortexa, a następnie odwiruj, aby dokładnie go wymieszać. Owiń fiolkę z roztworem do ładowania folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło. Przechowuj roztwór do ładowania w temperaturze -20 °C w zamrażarce.Procedura ładowania barwnika. Wypreparuj mięsień piersiowy skórny z organizmu zwierzęcia. Umieść wypreparowaną tkankę w wyłożonej srebrem szalce Petriego.Napiąć tkankę za pomocą cienkich stalowych pinsetów. Dodać roztwór Ringera do szalki Petriego. Za pomocą żyletki odciąć mały fragment, o wielkości około 2 milimetrów, z cienkiego końca rurki pipety o pojemności 10 µL.Przygotuj kawałek plasteliny do zamocowania pipety napełniającej na szalce Petriego. Połącz pipetę napełniającą z plastikową strzykawką za pomocą rurki silikonowej i adapterów wykonanych z końcówek do pipet. Usuń tymczasowy roztwór Ringera z szalki Petriego za pomocą plastikowej pipety.Przygotowanie na sucho za pomocą strzykawki. Zapobiegnie to zassaniu roztworu do pipety napełniającej. Wyjąć fiolkę z roztworem ładującym z zamrażarki i pozostawić do rozmrożenia w temperaturze pokojowej w ciemnym miejscu.Za pomocą precyzyjnej pęsety i nożyczek, pod kontrolą wizualną przy użyciu sterylnego mikroskopu, przetnij nerw blisko mięśnia. Pozostaw około dwóch milimetrów kikutu nerwu. Przymocuj pipetę do napełniania wraz z probówką i strzykawką do szalki Petriego za pomocą plasteliny.Przesuń go blisko odgałęzienia nerwu. Ostrożnie odessań kikut nerwu do pipety napełniającej. Usuń rurkę ssącą z tępego końca pipety napełniającej.Osusz pień nerwu w pipecie do napełniania za pomocą strzykawki. Unieś pipetę do napełniania wraz z pniem nerwu. Odizoluj pień nerwu od otoczenia za pomocą wazeliny.Ponownie osusz kikut nerwu w pipecie wypełniającej za pomocą strzykawki. Pobierz 0,5 µL roztworu obciążającego, używając pipety z długim końcem. Ostrożnie wprowadź końcówkę pipety z roztworem obciążającym do pipety wypełniającej.Wstrzyknij mieszaninę bezpośrednio do kikutu nerwu. Zamknij otwarty koniec pipety wypełniającej wazeliną. Dodaj niewielką ilość roztworu do szalki Petriego.Inkubować preparat w temperaturze pokojowej, w zaciemnionym i wilgotnym miejscu przez pięć godzin. Po zakończeniu inkubacji wyjąć preparat i usunąć pipetę wypełniającą z roztworem ładującym. Umieścić preparat w kąpieli i wypłukać go roztworem Ringera.Przechowywać kąpiel z preparatem przez noc w lodówce w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza. Przygotować tkankę do badania mikroskopowego. Wyjąć preparat z kąpieli.Zamocuj preparat w komorze wyłożonej srebrem i lekko rozciągnij tkankę. Przepłucz tkankę świeżym roztworem Ringera. Pobierz elektrodę do stymulacji ssącej.Umieść elektrodę ssącą do stymulacji w komorze, tak aby jej końcówka znajdowała się blisko przeciętego końca nerwu. Przyciągnij nerw do elektrody. Konstrukcja elektrody została opisana w artykule Khazokoffa, a link do tego artykułu znajduje się w materiałach.Zamocuj komorę preparacyjną na stole mikroskopu. Umieść sondę temperatury. Podłącz przewody doprowadzające ciecz oraz kabel zasilający element Peltiera w komorze preparacyjnej.Umieść rurkę odpływową w komorze preparacyjnej. Włącz pompę perfuzyjną. Włącz jednostkę sterownika temperatury.Ustaw temperaturę na jednostce sterującej tak, aby osiągnęła 20 °C. Zamontuj osłonę ochronną przed promieniowaniem ultrafioletowym. Skonfiguruj czas opóźnienia oraz okres stymulacji na stymulatorze.Połącz przewodem elektrodę ssącą ze stymulatorem. Włącz urządzenie. Używając obiektywu o niskim powiększeniu, sprawdź skurcz mięśni, włączając stymulację.Napełnij system perfuzyjny roztworem Ringera z niską zawartością wapnia i wysoką zawartością magnezu. Ustaw szybkość perfuzji na około 2 mL/min. Wymień obiektyw na taki o powiększeniu 40x.Włącz długość fali emisji oraz tryb oświetlenia ciągłego w Polychrome V.Select. Otwórz migawkę. Przy użyciu obiektywu z 40-krotnym powiększeniem, w trybie oświetlenia fluorescencyjnego, upewnij się, że terminale są załadowane.Zlokalizuj zakończenie i ustaw na nim ostrość. Na rysunku przedstawiono załadowany nerw oraz dobrze załadowane zakończenia nerwów ruchowych. Przechwytywanie obrazu wideo wykonano za pomocą kamery Red-Short Neuro CCD Camera.Uruchom oprogramowanie Turbo-SM. Wybierz Change Settings. Wprowadź liczbę klatek wynoszącą 500.Wprowadź nazwę eksperymentu. Podstawowa konfiguracja to 1000 klatek na sekundę. 80 na 80.Wybierz zewnętrzny wyzwalacz. Wprowadź czas przed wyzwalaniem. Minus dziesięć milisekund.Wprowadź liczbę powtórzeń, 20. W oprogramowaniu Polychrome wybierz tryb oświetlenia wyzwalany zewnętrznie. Uruchom oprogramowanie Clampex.Wczytaj protokół stymulacji. Protokół jest dostępny do pobrania na stronie naszego laboratorium w witrynie Uniwersytetu Federalnego w Kazaniu. Przed rozpoczęciem rejestracji wykonaj klatkę ciemną w oprogramowaniu Turbo-SM.Na kostce trinokularnej wybierz poziom przekierowania ścieżki światła. 100 procent dla kamery. Uruchom protokół stymulacji.Wybierz obszar zainteresowania i sprawdź sygnał. W odpowiedzi na stymulację nerwu rejestrujemy zmianę intensywności fluorescencji, która odzwierciedla napływ wapnia do zakończenia nerwowego. Analiza danych.W oprogramowaniu Turbo-SM wybierz plik. Następnie wybierz opcję uśredniania plików (average files). Wybierz pliki.Wprowadź nazwę pliku uśredniającego i wykonaj uśrednianie. Zapisz plik uśredniony jako plik fit. Wybierz i zapisz jako plik fit.Wprowadź nazwę pliku i zapisz go. Uruchom program Image J, a następnie otwórz poniższe narzędzia: Analiza, Narzędzia, ROI Manager.Znajdź zapisany plik ze średnią w formacie fit. Przeciągnij i upuść go do programu Image J. Powiększ okno, aby uzyskać lepszą widoczność. Zaznacz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) w miejscu, które uznajesz za tło.Dodaj do menedżera ROI. W menedżerze ROI wybierz „More”, a następnie „Multi-measure”. Pobierz wartości średnie.Skopiuj dane i wyeksportuj je do programu Excel. W programie Excel użyj funkcji średniej, aby obliczyć średnią wartość tła dla danego stosunku. Bez zamykania programu Excel wróć do programu Image J. Zamknij okno z obliczeniami tła bez zapisywania zmian.Użyj ROI Manager, aby usunąć prostokątny rysunek tła. Otwórz proces instrumentu, wybierz funkcję matematyczną „subtract” (odejmowanie). Wprowadź obliczoną średnią wartość progu z programu Excel i odejmij tło od stosów obrazów.Wybierz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) wokół zakończenia nerwowego. Dodaj go do Menedżera ROI (ROI Manager). W Menedżerze ROI wybierz opcję More, następnie Multi-measure, zaznacz Mean i zatwierdź.Skopiuj i wklej do okna programu Excel. Użyj wykresu instrumentu w programie Excel. Przed rozpoczęciem sygnału zaznacz obszar płaski.Wczytaj wykres z danymi dotyczącymi pierwszych wartości fluorescencji w spoczynku, aż do początku sygnału. Następnie określ liczbę punktów do uśrednienia wartości fluorescencji spoczynkowej. Wyznacz średnią z tych wartości, a następnie oblicz średnią wartość fluorescencji w spoczynku.Podziel sygnały przez fluorescencję spoczynkową. Odejmij jeden i pomnóż przez 100 procent. Wykres sygnału i oblicz amplitudę przejściowego wzrostu poziomu wapnia.Parametry czasowe sygnałów fluorescencji zależą od szybkości reakcji bezpośredniej i/lub odwrotnej tworzenia kompleksu barwnika z wapniem. Czas narastania sygnału wapniowego odzwierciedla dynamikę dopływu wapnia: jego dyfuzję w terminalu oraz oddziaływanie wapnia z barwnikiem.Zanik przejściowego wzrostu stężenia wapnia zależy od powinowactwa barwnika oraz szybkości buforowania i usuwania jonów wapnia. Analiza amplitudy przejściowego wzrostu stężenia wapnia może być wykorzystana do badania wpływu różnych substancji aktywnych na napływ wapnia uczestniczący w uwalnianiu neuroprzekaźników. Ta technika ładowania jest odpowiednia do obrazowania zmian w cytozolowym stężeniu wapnia.Z wykorzystaniem wskaźników fluorescencyjnych oraz zarówno pojedynczej stymulacji nerwu, jak i rytmicznej aktywności synaptycznej. Analiza amplitudy przejściowych zmian stężenia wapnia może służyć do badania wpływu różnych substancji na napływ jonów wapnia biorących udział w uwalnianiu neuroprzekaźników. Istnieje kilka istotnych kwestii, na które chcemy zwrócić uwagę.Procedura inkubacji składa się z dwóch etapów: inkubacji w temperaturze pokojowej oraz w lodówce. Ważne jest, aby kontrolować czas inkubacji z barwnikiem w temperaturze pokojowej.W zależności od długości kikutu nerwu, zastosowanego barwnika oraz temperatury w pomieszczeniu, czas inkubacji może się różnić. W przypadku zbyt długiej ekspozycji, terminale przedoperacyjne i części proksymalne, znajdujące się blisko kikutu nerwu, mogą zostać przeładowane. Dzięki długiej inkubacji w lodówce barwnik rozkłada się równomiernie wzdłuż zakończeń nerwowych.Kluczowe jest umieszczenie nerwu w roztworze ładującym barwnik w ciągu kilku minut po przecięciu, aby umożliwić przeniknięcie barwnika do wnętrza nerwu, ponieważ dłuższe odstępy czasowe prowadziły do nieefektywnego ładowania, prawdopodobnie z powodu zamknięcia ujścia nerwu. Aby ograniczyć kompartymentację barwnika, można zastosować jego formę przedłużoną. Bardzo ważne jest zapobieganie długotrwałemu naświetlaniu tkanki światłem fluorescencyjnym, ponieważ wpływa ono na jej przeżywalność.W kanale światła widzialnego wykorzystujemy optykę Nomarskiego do wyszukiwania zakończeń. Podczas rejestracji ograniczamy pole widzenia za pomocą przysłony. Długi czas procesu ładowania można skrócić, stosując stempel migawkowy nerwu.W takim przypadku można zastosować szklany mikro-bypass.

loading-calcium-dye-into-frog-nerve-endings-through-nerve-stump

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wapń jest powszechnie występującym przekaźnikiem w układzie nerwowym, niezbędnym do wyzwalania uwalniania neuroprzekaźników oraz zmian w sile synaptycznej. W niniejszym materiale prezentujemy technikę wprowadzania wskaźników Ca2+ do zakończeń nerwowych Drosophila. Przedstawiamy również sposób wykonania niezbędnej aparatury i podkreślamy kwestie kluczowe dla sukcesu tej techniki.

Obciążanie zakończeń nerwowych Drosophila wskaźnikami wapnia

W niniejszej pracy przedstawiamy metodologię szybkiego obrazowania fluorescencyjnego z wysoką rozdzielczością przy użyciu barwników wrażliwych na napięcie w celu analizy szczegółowej aktywności neuronów w zwoju stomatogastrycznym kraba.

Obrazowanie optyczne neuronów w zwoju stomatogastrycznym kraba z wykorzystaniem barwników napięciowo-czułych

Opisujemy prostą i niskokosztową technikę wprowadzania wysokich stężeń barwników fluorescencyjnych i czułych na wapń do neuronów lub dowolnego szlaku neuronalnego z wykorzystaniem polietylenowej pipety ssącej.

Retrogradne znakowanie nerwów, szlaków i korzeni rdzeniowych barwnikami fluorescencyjnymi

W tym filmie włókna nerwowe larw Drosophila są zanurzone w barwniku FM, który wiąże się z lipidami błony komórkowej. Mikroelektroda ssąca i impulsy elektryczne stymulują proces endocytozy, wprowadzając barwnik FM do nowo powstałych pęcherzyków endocytarnych. Ta metoda, która wizualizuje presynaptyczne etapy neuroprzekaźnictwa, jest przydatna do badania funkcji synaptycznych i uwalniania neuroprzekaźników.

Ładowanie i rozładowywanie barwnika FM za pośrednictwem mikroelektrod w komórkach nerwowych larw Drosophila

Źródło: Heredia, D. J., et. al. Obrazowanie ex vivo specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy. J. Vis. Exp. (2018) Ten film przedstawia obrazowanie fluorescencyjne dynamiki wapnia w połączeniach nerwowo-mięśniowych (NMJ) u transgenicznej myszy wykazującej ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników wapnia. NJM jest identyfikowany przez fluorescencyjnie znakowane receptory acetylocholiny w przeponie z nerwem przeponowym . Rozdzielacz obrazu służy do...

Obrazowanie fluorescencyjne dynamiki wapnia w połączeniach nerwowo-mięśniowych w przeponie transgenicznej myszy

Źródło: Zhilyakov, N. V. et al., Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2021)Ten film przedstawia technikę obrazowania polegającą na rejestrowaniu szybkich stanów przejściowych wapnia na zakończeniach nerwowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Stymulując nerw i wychwytując zmiany fluorescencji spowodowane barwnikami wiążącymi wapń, wizualizuje dynamiczny napływ i usuwanie...

Obrazowanie szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwowych myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to sieć neuronów i komórek glejowych znajdujących się w ścianie jelita, która kontroluje odruchy jelitowe. Protokół ten opisuje metody rejestrowania aktywności neuronów jelitowych i gleju w żywych preparatach ENS przy użyciu obrazowania Ca2+.

In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

Tutaj opisujemy protokół pomiaru i analizy reakcji na temperaturę w opuszce węchowej Xenopus laevis. Neurony receptorów węchowych i komórki mitralne są barwione różnicowo, po czym rejestrowane są zmiany wapnia, odzwierciedlające wrażliwość niektórych sieci neuronowych w bańce na spadki temperatury wywołane w nosie.

Rejestrowanie aktywności neuronalnej wywołanej temperaturą poprzez monitorowanie zmian wapnia w opuszce węchowej Xenopus laevis

Cykl pęcherzyków synaptycznych (SV) jest podstawowym mechanizmem komunikacji międzykomórkowej w synapsach neuronalnych. Wychwyt i uwalnianie barwnika FM są podstawowymi sposobami ilościowego oznaczania endo- i egzocytozy SV. Tutaj porównujemy wszystkie metody stymulacji w celu napędzania cyklu FM1-43 w synapsie modelu połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila (NMJ).

Cykl barwnika FM w synapsie: porównanie wysokiej depolaryzacji potasu, stymulacji elektrycznej i rodopsyny kanałowej

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Protokół opisuje metodę ładowania fluorescencyjnego barwnika wapniowego przez przecięty nerw do zakończeń nerwu ruchowego myszy. Ponadto przedstawiono unikalną metodę rejestracji szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Poznaj metodę ładowania barwnika wapniowego do zakończeń nerwowych żaby przez kikut nerwowy. Technika umożliwia rejestrację szybkich zmian wapnia w połączeniu nerwowo-mięśniowym i badanie wpływu leków na sygnalizację wapniową.

Ładowanie barwnika wapniowego do zakończeń nerwowych żaby przez kikut nerwowy: przejściowa rejestracja wapnia w połączeniu nerwowo-mięśniowym żaby (Wideo) | JoVE Journal

Ładowanie barwnika wapniowego do zakończeń nerwowych żaby przez kikut nerwowy: przejściowa rejestracja wapnia w połączeniu nerwowo-mięśniowym żaby

Przeglądaj więcej filmów