Name: Produkcja i podawanie terapeutycznych sferoid mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) przygotowanych w hodowlach 3D w warunkach wolnych od ksenotypów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Poznaj metodę produkcji sferoid MSC w warunkach wolnych od ksenotypów, która poprawia przeżywalność i funkcjonalność komórek po transplantacji. Technika ta eliminuje immunogenne produkty zwierzęce, zwiększając kliniczną przydatność terapii komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana z grantu P40RR17447 z National Institute of Health oraz RP150637 z Cancer Prevention and Research Institute of Texas. Chcielibyśmy podziękować dr Darwinowi J. Prockopowi za wsparcie w projekcie.

<ol><li>Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+New+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: New directions.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).</li>
<li>English, K., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+in+transplantation+rejection+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect.Med%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance.</a> Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560(2013).</li>
<li>Le Blanc, K., Mougiakakos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stromal+cells+and+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Immunol%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system.</a> Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).</li>
<li>Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Paracrine+Immunomodulatory+Potential+of+Mesenchymal+Stromal+Cells+in+Three-Dimensional+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+B.Rev%22%5BJournal%5D)">Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture.</a> Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).</li>
<li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells Int. , 9176357(2016).</li>
<li>Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+formation%2C+use+and+understanding+of+multi-cellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids.</a> Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).</li>
<li>Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+aggregates+of+mesenchymal+stem+cells%3A+cellular+mechanisms%2C+biological+properties%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+B.Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications.</a> Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).</li>
<li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+%28MSCs%29+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li>
<li>Potapova, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+support+migration%2C+extracellular+matrix+invasion%2C+proliferation%2C+and+survival+of+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro.</a> Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).</li>
<li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+C.Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).</li>
<li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+hMSCs+Improve+Myocardial+Infarction+in+Mice+because+Cells+Embolized+in+Lung+Are+Activated+to+Secrete+the+Anti-inflammatory+Protein+TSG-6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6.</a> Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).</li>
<li>Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compaction+of+human+mesenchymal+stem%2Fprecursor+cells+into+spheres+self-activates+caspase-dependent+il1+signaling+to+enhance+secretion+of+modulators+of+inflammation+and+immunity+%28PGE2%2C+TSG6%2C+and+STC1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1).</a> Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).</li>
<li>Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+cultured+as+spheroids+are+self-activated+to+produce+prostaglandin+E2+that+directs+stimulated+macrophages+into+an+anti-inflammatory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype.</a> Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).</li>
<li>Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+characteristics+of+human+mesenchymal+stromal%2Fprogenitor+cells+pre-activated+in+3-dimensional+cultures+under+different+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions.</a> Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).</li>
<li>Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White. , 
 <a target="_blank" href=" http://www.medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html"> http://www.medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html</a> (2016).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li>
<li>Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+Mesenchymal+Stromal+Cells%27+Paracrine+Immunomodulatory+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.Med.Rev%22%5BJournal%5D)">Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells' Paracrine Immunomodulatory Effects.</a> Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).</li>
<li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E%282%29-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+interleukin-10+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Med%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production.</a> Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).</li>
<li>Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+two+negative+feedback+loops+place+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+at+the+center+of+early+regulators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation.</a> Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).</li>
<li>Krampera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell+%27licensing%27%3A+a+multistep+process%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell 'licensing': a multistep process.</a> Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).</li>
<li>Saleh, F. A., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+round%3A+multipotent+stromal+cells%2C+a+three-dimensional+revolution%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution?</a> Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).</li>
<li>Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compaction%2C+fusion%2C+and+functional+activation+of+three-dimensional+human+mesenchymal+stem+cell+aggregate%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+A%22%5BJournal%5D)">Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate.</a> Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).</li>
<li>Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium-dependent+regulation+of+spheroid+formation+and+cardiomyogenic+differentiation+for+MSCs+on+chitosan+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes.</a> Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+bullet+formation+via+E-cadherin+promotes+therapeutic+potency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Ther%22%5BJournal%5D)">Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction.</a> Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Optymalny MSC do stosowania w niektórych zastosowaniach badawczych i klinicznych powinien być wysoce aktywowany, aby zmaksymalizować ich korzyści, i preferencyjnie przygotowany w chemicznie zdefiniowanych warunkach XF, aby zminimalizować dostarczanie potencjalnych antygenów ze składników pożywki ksenogenicznej, takich jak FBS. W opisanych tutaj protokołach pokazaliśmy metody 1) aktywacji MSCs w hodowli 3D poprzez tworzenie sferoidów, 2) osiągnięcia aktywacji 3D MSCs w warunkach XF, 3) oceny poziomów aktywacji sferoidalny...

Mezenchymalne komórki macierzyste/zrębowe (MSC) wykazały duży potencjał dla różnych podejść medycyny regeneracyjnej. MSCs zostały początkowo wyizolowane jako składnik zrębowy szpiku kostnego, ale od tego czasu uzyskano je z wielu innych tkanek dorosłych, w tym tkanki tłuszczowej1,2,3. Co ciekawe, główna metoda izolacji wykorzystuje niezwykłą właściwość MSC, polegającą na ścisłym przyleganiu do plastiku hodowli tkankowej w obecności płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Chociaż ta tradycyjna technika izolacji pozwala na łatwą i szybką ekspansję MSCs w kulturze dwuwymiarowej (2D), jest ona również bardzo sztuczna i ignoruje znaczenie natywnego środowiska trójwymiarowego (3D), prowadząc do potencjalnej utraty ważnych cech komórkowych4,5,6. W związku z tym rozpoczęto badania nad MSCs w kulturach 3D, które są bardziej fizjologiczne niż tradycyjne kultury 2D, w poszukiwaniu "utraconych/osłabionych" cech MSC. Co więcej, wzrosło duże zainteresowanie identyfikacją chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli i aktywacji MSC, wolnych od ksenotypów (XF), a tym samym uczynieniem komórek bardziej podatnymi na zastosowania kliniczne.
Opublikowano wiele badań demonstrujących hodowlę 3D MSCs zarówno w biomateriałach, jak i jako sferyczne agregaty lub sferoidy. MSCs w biomateriałach zostały początkowo zaprojektowane z myślą o podejściach inżynierii tkankowej w celu zastąpienia uszkodzonych tkanek rusztowaniami wysiewanymi przez komórki, podczas gdy sferoidalne hodowle MSCs były postrzegane jako sposób na zrozumienie zachowania MSC in vivo po podaniu komórek do terapii w badaniach przedklinicznych lub klinicznych4,5,7. Co ciekawe, MSC tworzą sferoidy spontanicznie, gdy przyleganie do plastiku hodowli tkankowej jest niedozwolone8,9,10. Tradycyjnie, agregacja komórek była ułatwiona za pomocą metod kolb wirujących lub technik nakładania cieczy, metod stosowanych początkowo w biologii nowotworów w celu naśladowania mikrośrodowiska guza. Niedawno pojawiły się dodatkowe metody, które pokazują agregację komórek w szalkach hodowlanych wstępnie pokrytych określonymi substancjami chemicznymi, aby zapobiec przyleganiu komórek do plastiku4,5,6. Jedną z najprostszych i najbardziej ekonomicznych metod generowania sferoid MSC jest hodowla ich w wiszących kroplach, technika, która była często stosowana do produkcji ciał embrionalnych z embrionalnych komórek macierzystych. Dzięki technice hodowli wiszącej zapobiega się przyleganiu komórek do plastiku hodowli tkankowej poprzez zawieszenie komórek w kropli pożywki na spodniej stronie pokrywy naczynia do hodowli tkankowej i umożliwienie grawitacji ułatwienia agregacji komórek w wierzchołku kropli. Wielkością sferoidy można łatwo manipulować, zmieniając stężenie komórek lub objętość kropli, dzięki czemu wiszące kultury kropelkowe są szczególnie łatwe do kontrolowania.
Wczesne badania nad hodowlą 3D MSCs wykazały radykalne różnice w charakterystyce komórek w 3D w porównaniu do ich odpowiedników 2D6,8,9. Jednocześnie raporty wykazały, że korzystne działanie MSCs in vivo zależy od ich zdolności do aktywacji przez sygnały mikrośrodowiskowe i w odpowiedzi do wytwarzania czynników przeciwzapalnych i immunomodulujących11. Co ciekawe, wiele z tych czynników, takich jak prostaglandyna E2 (PGE2), gen 6 stymulowany czynnikiem martwicy nowotworów (TSG6) i czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) było wytwarzanych w znacznie większych ilościach przez sferoidy MSC niż tradycyjne MSC 2D, torując drogę do pomysłu wykorzystania kultur 3D do aktywacji komórek8,12,13. Co więcej, aktywacja genów w hodowlach 3D wydaje się podsumowywać mechanizmy, przynajmniej częściowe, aktywacji komórek po wstrzyknięciu myszom12. Poprzez aktywację MSCs przed ich użyciem w eksperymentach, efekty działania komórek mogą być przedłużone i bardziej widoczne, ponieważ tradycyjny efekt MSC in vivo jest często opóźniony i przemijający i można go opisać jako "uderzenie i ucieczka". W ciągu ostatnich kilku lat ważne badania funkcjonalne z wykorzystaniem sferoid MSC wykazały, że mogą one tłumić reakcje zapalne i modulować odporność in vivo poprzez wpływ na komórki efektorowe, takie jak makrofagi, komórki dendrytyczne, neutrofile i limfocyty T, dzięki czemu sferoidy są atrakcyjną formą zagruntowanych MSCs2,3. Ponadto produkcja cząsteczek przeciwnowotworowych, takich jak interleukina-24 (IL-24) i ligand indukujący apoptozę związaną z czynnikiem martwicy nowotworu (TRAIL), jest zwiększona w hodowlach 3D MSC w porównaniu z jednowarstwowymi MSC, zjawisko, które można wykorzystać w celowanych terapiach przeciwnowotworowych8,10,14.
Ponieważ tradycyjna hodowla MSC wymagała nie tylko użycia plastiku do hodowli tkankowych, ale także FBS, trzeba było pokonać kolejną przeszkodę, aby sferoidy MSC stały się bardziej podatne na zastosowanie kliniczne. Aby poradzić sobie z tą przeszkodą, niedawno wykazaliśmy tworzenie się sferoid MSC w określonych, chemicznie zdefiniowanych warunkach XF i ustaliliśmy, że powstałe sferoidy MSC zostały aktywowane w celu wytworzenia tych samych cząsteczek przeciwzapalnych i przeciwnowotworowych, co sferoidy generowane w warunkach z FBS14. W tym miejscu wyniki te zostały przedstawione w kilku szczegółowych protokołach, które demonstrują generowanie wstępnie aktywowanych MSC w kulturach 3D przy użyciu pożywek XF. Ponadto przedstawiono protokoły, które opisują skuteczne sposoby oceny poziomów aktywacji MSCs w odniesieniu do ich działania przeciwzapalnego, immunomodulującego i przeciwnowotworowego, wraz z praktyczną metodą dostarczania nienaruszonych sferoid myszom.

<table><tbody><tr><td>MEM-&alpha; (minimalny niezbędny średni alfa)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>12561049; 12561056; 12561072</td><td>minimalna niezbędna pożywka do przygotowania pożywki wzrostowej MSC (CCM)</td></tr><tr><td>FBS (płodowej surowicy bydlęcej), premium select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11595; S11510; S11550; S11595-24</td><td>składnik kompletnych pożywek hodowlanych dla wszystkich typów komórek</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>25030081; 25030149; 25030164</td><td>składnik kompletnych pożywek hodowlanych dla wszystkich typów komórek</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>15070063</td><td>składnik kompletnych pożywek hodowlanych dla wszystkich typów komórek</td></tr><tr><td>Jednostki filtrujące do sterylizacji, 0,22 i mikro; m Membrana PES</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; Naczynie do</td> hodowli komórkowych 150 mm <td>z pożywką</td>SCGPU11RE</tr><tr><td></td><td>Nunc</td><td>D8554&nbsp; Hodowla</td><td>komórkowa</td>SIGMA</tr><tr><td>Termo Forma z płaszczem wodnym Inkubator nawilżany CO2</td><td>Thermo Fisher</td><td>Model 3110</td><td>inkubacja hodowanych komórek</td></tr><tr><td>Wczesne pasaż</td><td>MCS Centrum Przygotowania i Dystrybucji Dorosłych Komórek Macierzystych w Texas A& M Health Science Center College of Medicine Instytut Medycyny Regeneracyjnej w Scott & Biały</td><td>NA</td><td>przygotowanie kultur 2D i 3D w kąpieli</td></tr><tr><td>wodnej</td> MSC <td>VWR</td><td>89501-468</td><td>podłoże podgrzewające do 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Eppendorf</td><td>492000904</td><td>ręczna obsługa cieczy</td></tr><tr><td>Pipete-Aid</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>4-000-300</td><td>obsługa pipet sereologicznych</td></tr><tr><td>Sterylna pipeta serologiczna Costar (5, 10, 25 i 50 ml)</td><td>Corning</td><td>4487; 4101; 4251; 4490</td><td>obsługa cieczy</td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), pH 7,4</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>10010023; 10010072; 10010031; 10010049</td><td>przetwarzanie kultur komórkowych</td></tr><tr><td>0,25% roztwór trypsyny/EDTA</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>25200056; 25200072; 25200114</td><td>podnoszenie przylegających komórek i dyspergowanie agregatów komórkowych Rurka</td></tr><tr><td>stożkowa 15 ml Wirowanie</td> komórek <td>Corning/BD Falcon</td><td>352097</td><td>50</td></tr><tr><td>ml Rurka stożkowa</td><td>Corning/BD Falcon</td><td>352098</td><td>Wirówka</td></tr> z <tr><td>chłodzeniem Eppendor</td> Hemocytometr <td>wirowania komórek</td> <td>Eppendorf/Fisher Scientific</td><td>Model 5810R</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>26716</td><td></td></tr><tr><td>trypan niebieski</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Wykluczenie martwych komórek SIGMA podczas zliczania komórek w hemacytometrze</td></tr><tr><td>Zdefiniowany ksenowolny MSC medium-1 (XFM-1)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>A1067501</td><td>Pożywka wolna od kseno-ksenozy opracowana specjalnie do wzrostu i ekspansji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych</td></tr><tr><td>Zdefiniowano ksenowolne MSC pożywka-2 (XFM-2)</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>5420</td><td>Zdefiniowana, wolna od ksenozy pożywka dla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych</td></tr><tr><td>HSA (albumina surowicy ludzkiej)</td><td>Gemini</td><td>800-120</td><td>Składnik pożywki MSC wolnej od ksenozy</td></tr><tr><td>rHSA (rekombinowana albumina surowicy ludzkiej)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9731&nbsp; SIGMA</td><td>Składnik pożywek MSC wolnych od ksenoza</td></tr><tr><td>Całkowita izolacja RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Ekstrakcja całkowitego RNA</td></tr><tr><td>Qiashredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>Homogenizacja próbki przed ekstrakcją całkowitego</td></tr><tr><td>RNA Zestaw DNaz wolnych od RNAz&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>Eliminacja DNA na kolumnie podczas całkowitej ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250&nbsp; Hamowanie ALDRICH</td><td>RNAZ w buforze RLT</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td>mieszanie próbki</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Biorad</td><td>NA</td><td>Stężenie i jakość RNA</td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td>transkrypcji całkowitego RNA do cDNA</td></tr><tr><td>Testy ekspresji genów</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td></td><td>Zmienna kombinacja startera/sondy do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Szybka uniwersalna mieszanka wzorcowa do PCR</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>4352042; 4364103; 4366073; 4367846</td><td>do reakcji PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)</td><td>ABI Prizm</td><td>NA</td><td>real-time PCR</td></tr><tr><td>1,5 ml probówka wirówkowa</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>Wirowanie komórek, pobieranie i przechowywanie próbek</td></tr> <tr><td>(-80 & deg; C) zamrażarka</td><td>Thermo Fisher</td><td>Model Thermo Forma 8695</td><td>do przechowywania próbek</td></tr><tr><td>PGE2 (prostaglandyna E2) Zestaw ELISA R</td><td>& Systemy D</td><td>KGE004B</td><td>szacowanie stężenia cytokin w próbce</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s zmodyfikowany Eagle średni)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>10566-016; 10566-024; 10566-032</td><td>pożywka do hodowli makrofagów</td></tr><tr><td>J774 makrofagi myszy</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>mysia linia komórkowa makrofagów</td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3513</td><td>in vitro stymulacja makrofagów</td></tr><tr><td>LPS (lipopolisacharyd)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>L4130</td><td>in vitro stymulacja makrofagów</td></tr><tr><td>Mysz TNF-a zestaw ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>MTA00B</td><td>oszacowanie stężenia cytokin w próbce</td></tr><tr><td>Mysz IL-10 (interleukina 10) zestaw ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>M1000B</td><td>oszacowanie stężenia cytokin w próbce</td></tr><tr><td>Pożywka RPMI-1640 Pożywka</td> do <td>hodowli splenocytów</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>11875-085</td></tr><tr><td>Myszy BALB/c</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>651</td><td>in vivo dostarczanie sferoidów; preparat splenocytu</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD3e Klasa funkcjonalna Oczyszczona</td><td>eBioscience</td><td>145-2C11</td><td>in vitro stymulacja splenocytów</td></tr><tr><td>70 &mu; m sitko&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Preparat splenocytów</td></tr><tr><td>Roztwór do lizy czerwonych krwinek (1x)</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>00-4333</td><td>usuwanie czerwonych krwinek podczas izolacji splenocytów</td></tr><tr><td>Mysz IFN-&#947; (interferon gamma) Zestaw ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>MIF 00</td><td>ocena stężenia cytokin w próbce</td></tr><tr><td>LNCaP komórek raka prostaty&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1740</td><td>badanie wpływu MSCs 3D na linie komórek nowotworowych in vitro</td></tr><tr><td>DNA Zestaw do oznaczania proliferacji komórek na podstawie</td> DNA <td>ThermoFisher</td><td>C7026</td> pomiar <td>liczby komórek na podstawie zawartości DNA</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>składnik odczynnika do lizy</td></tr><tr><td>EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)</td><td>ThermoFisher</td><td>FERR1021</td><td>chelator wapnia, składnik odczynnika do lizy</td></tr><tr><td>Rnaza A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>Degradacja RNA do pomiaru DNA</td></tr><tr><td>Wielomodowy czytnik mikropłytek oparty na filtrze</td><td>Technologia BMG</td><td>NA</td><td>Testy mikropłytek (ELISA, kwantyfikacja komórek, etc.)</td></tr><tr><td>HBSS (zrównoważony roztwór soli Hanksa), bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>14175079</td><td>Resuspekcja sferoid MSC przed wstrzyknięciami in vivo</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>MWI Vet Supply</td><td>502017</td><td>znieczulenia do wstrzyknięć in vivo</td></tr><tr><td>Tlen, sprężony gaz</td><td>Praxair</td><td>NA</td><td>Do stosowania z izofluranem</td></tr><tr><td>Thermo Forma BSL-2</td><td>szafka Thermo Fisher</td><td>Model 1385</td><td>Sterylna hodowla komórek</td></tr><tr><td>Bezpieczeństwo Cewnik dożylny/szpilka igłowa, 20 G, 1 cal</td><td>Terumo</td><td>SR*FNP2025</td><td>Dostarczanie shperoidów do jamy otrzewnej</td></tr><tr><td>Sterylne końcówki do mikropipet</td><td>Eppendorf</td><td>zmienia</td><td>sposób obchodzenia się z cieczami/komórkami</td></tr></tbody></table>

produkcja i podawanie terapeutycznych sferoid mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (msc) przygotowanych w hodowlach 3d w warunkach wolnych od ksenotypów

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Mezenchymalne komórki macierzyste/zrębowe (MSC) są bardzo obiecujące w bioinżynierii i medycynie regeneracyjnej. MSCs mogą być izolowane z wielu dorosłych tkanek dzięki ich silnemu przyleganiu do plastiku hodowlanego tkankowego, a następnie dalej namnażane in vitro, najczęściej przy użyciu płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Ponieważ FBS może powodować, że MSCs stają się immunogenne, jego obecność w hodowlach MSC ogranicza zarówno kliniczne, jak i eksperymentalne zastosowania komórek. Dlatego niezwykle cenne są badania z wykorzystaniem chemicznie zdefiniowanych pożywek wolnych od kseno-wirusów (XF) w hodowlach MSC. Wiele korzystnych efektów MSCs przypisuje się ich zdolności do regulacji stanu zapalnego i odporności, głównie poprzez wydzielanie czynników immunomodulujących, takich jak gen 6 stymulowany czynnikiem martwicy nowotworu (TSG6) i prostaglandyna E2 (PGE2). Jednak MSCs wymagają aktywacji do wytworzenia tych czynników, a ponieważ efekt MSCs jest często przejściowy, pojawiło się duże zainteresowanie odkryciem sposobów wstępnej aktywacji komórek przed ich użyciem, eliminując w ten sposób czas opóźnienia aktywacji in vivo. W tym miejscu przedstawiamy protokoły skutecznej aktywacji lub przygotowania MSCs w trójwymiarowych (3D) kulturach w chemicznie zdefiniowanych warunkach XF oraz podawania tych wstępnie aktywowanych MSCs in vivo. W szczególności najpierw opisujemy metody generowania sferycznych mikrotkanek MSC lub "sferoid" w wiszących kroplach przy użyciu pożywki XF i pokazujemy, w jaki sposób kulki i kondycjonowane podłoże (CM) mogą być zbierane do różnych zastosowań. Po drugie, opisujemy badania przesiewowe ekspresji genów i testy funkcjonalne in vitro, aby szybko ocenić poziom aktywacji MSC w sferoidach, podkreślając potencjał przeciwzapalny i przeciwnowotworowy komórek. Po trzecie, opisujemy nowatorską metodę wstrzykiwania nienaruszonych sferoid MSC do jamy otrzewnowej myszy w celu przeprowadzenia testów skuteczności in vivo. Ogólnie rzecz biorąc, zawarte w niniejszym dokumencie protokoły przezwyciężają główne wyzwania związane z otrzymywaniem wstępnie aktywowanych MSC w chemicznie zdefiniowanych warunkach XF i zapewniają elastyczny system podawania sferoid MSC do terapii.

W niniejszej pracy wykorzystano hodowle w kroplach wiszących do generowania zwartych, sferycznych mikro-tkanek lub „sferoidów” aktywowanych MSC w warunkach XF. Plan badawczy przedstawiony na Rysunku 1 obrazuje, że MSC ulegają samoorganizacji w sferoidy podczas zawieszenia w kroplach wiszących przez 72 hr, po czym sferoidy lub CM wzbogacona o pochodzące ze sferoidów czynniki terapeutyczne mogą zostać zebrane i potencjalnie wykorzystane zarówno w badaniach, jak i w zastosow...

Potencjał terapeutyczny mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) jest dobrze udokumentowany, jednak najlepsza metoda przygotowania komórek dla pacjentów pozostaje kontrowersyjna. W tym artykule przekazujemy protokoły umożliwiające efektywne generowanie i podawanie terapeutycznych agregatów sferycznych lub "sferoid" MSCs przygotowanych w warunkach wolnych od ksenotypów do zastosowań eksperymentalnych i klinicznych.

Produkcja i podawanie terapeutycznych sferoid mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) przygotowanych w hodowlach 3D w warunkach wolnych od ksenotypów

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Ogólnym celem tych eksperymentów jest efektywne generowanie i wstrzykiwanie terapeutycznych agregatów sferycznych, czyli sferoidów, mezenchymalnych komórek macierzystych/stromalnych (MSCs), przygotowanych w warunkach wolnych od składników pochodzenia zwierzęcego (xeno-free) do zastosowań eksperymentalnych i klinicznych. Metody te mogą pomóc w przełamaniu głównych barier w dziedzinie terapii opartych na MSCs, takich jak słaba retencja, przeżywalność i funkcjonalność komórek. Zjawiska te są często obserwowane po transplantacji rozproszonych komórek oraz w odpowiedzi na niekorzystne warunki powszechnie związane z uszkodzeniem tkanek.Główną zaletą tych procedur jest możliwość przygotowania, aktywacji i wstrzyknięcia sferoidów MSC bez użycia immunogennych produktów pochodzenia zwierzęcego, takich jak FBS, co obecnie ogranicza niektóre zastosowania kliniczne tych komórek i może również utrudniać interpretację niektórych danych przedklinicznych. Chociaż mechanizm ten jest potencjalnie bardzo korzystny w pośredniczeniu skuteczności opartej na MSC, może on również służyć do zrozumienia naprawy tkanek pośredniczonej przez MSC, a także tego, jak inne formulacje pożywek mogą zmienić efekt tera

production-administration-therapeutic-mesenchymal-stemstromal-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje izolację i następującą ekspansję mezenchymalnych komórek macierzystych oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie bez użycia surowicy zwierzęcej, w celu wygenerowania autologicznych par do celów eksperymentalnej transplantacji.

Izolacja i ekspansja w warunkach wolnych od surowicy zwierzęcej mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) oraz endotelialnych komórek progenitorowych tworzących kolonie (ECFC) pochodzących z ludzkiej pępowiny

Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych (hMSC) za pomocą autologicznej surowicy, zmniejsza ryzyko odrzucenia przez materiał ksenogeniczny i inne negatywne skutki. Pozwala również na odzyskanie podzbioru mezodermalnych komórek progenitorowych, które mogą dostarczać świeże hMSC. Osadzenie hMSC w autologicznym skrzepie fibrynowym umożliwia łatwą obsługę i skuteczną implantację chirurgiczną.

Mezenchymalna hodowla komórek zrębowych i dostarczanie w warunkach autologicznych: inteligentne podejście do zastosowań ortopedycznych

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli sferoidów komórek ludzkiego więzadła przyzębia (PDL) za pomocą filmów chitozanowych. Hodowla trójwymiarowych (3D) sferoid komórkowych stanowi alternatywę dla konwencjonalnego systemu hodowli polistyrenowych do hodowli tkankowych (TCPS).

Tworzenie sferoid ludzkich komórek więzadeł przyzębia na błonach chitozanu

Tutaj prezentujemy protokół produkcji dużej liczby egzosomów klasy GMP z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą bioreaktora 3D.

Przygotowanie na dużą skalę egzosomów pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą hodowli bioreaktora 3D

Tutaj opisujemy produkcję na dużą skalę sferoidów zrębu/komórek macierzystych (ASC) pochodzących z tkanki tłuszczowej przy użyciu automatycznego systemu pipetowania do zasiewania zawiesiny komórkowej, zapewniając w ten sposób jednorodność wielkości i kształtu sferoidy. Te sferoidy ASC mogą być używane jako elementy budulcowe dla podejść do biodruku 3D.

Wielkoskalowa, zautomatyzowana produkcja sferoid komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do biodruku 3D

Tutaj prezentujemy protokół pobierania przylegających komórek z wielowarstwowych kolb w zamknięty półautomatyczny sposób za pomocą systemu wirowania przeciwprądowego. Protokół ten może być stosowany do zbierania zarówno komórek przylegających, jak i zawiesinowych z innych platform do rozbudowy komórek z niewielkimi modyfikacjami istniejących etapów.

Przetwarzanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do zastosowań klinicznych przy użyciu zamkniętego, półautomatycznego przepływu pracy

Produkty ksenogeniczne (chemiczne lub pochodzenia zwierzęcego) wprowadzone do etapów przygotowania/manipulacji terapii komórkowej są związane ze zwiększonym ryzykiem reaktywności immunologicznej i transmisji patogennej u pacjentów gospodarza. W tym artykule opisano całkowicie wolną od ksenogenów metodę izolacji i ekspansji in vitro ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej.

Izolacja i hodowla ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej za pomocą innowacyjnej metody wolnej od ksenogenu w terapii u ludzi

Opisano protokół produkcji komórek zależnych od kotwiczenia mikronośnikowo-mikrobioreaktorowymi jako potencjalne terapie oparte na komórkach. Ukierunkowane na ostry zespół niedociągania oddechowego ilustruje porównywalną wydajność komórek i korzystną ekspresję genów w porównaniu do warunków procesów opartych na kolbach. Protokół ten jest rozszerzalny na inne komórki zależne od kotwiczenia oraz wskazania celowe.

Produkcja komórek stromalnych zależnych od kotwiczenia mezenchymalnych opartych na mikrobioreaktorze, przygotowanych do ostrego zespołu niedociągania oddechowego

Tutaj opisujemy metody preparowania tkanek płodowych i matczynych z ludzkiego łożyska, a następnie izolacji i ekspansji mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) z tych tkanek.

Izolacja i ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych pochodzących z ludzkiej tkanki łożyska

Przedstawiono metodę hodowli Drosophila melanogaster w warunkach aksonicznych i gnotobiotycznych. Zarodki much są dechorionowane w podchlorynie sodu, przenoszone aseptycznie do jałowej diety i hodowane w zamkniętych pojemnikach. Zaszczepianie diety i zarodków bakteriami prowadzi do asocjacji gnotobiotycznych, a obecność bakterii potwierdza się poprzez posiew homogenatów Drosophila na całe ciało.

Hodowla muszki owocowej Drosophila melanogaster w warunkach aksenicznych i gnotobiotycznych

Poznaj metodę produkcji sferoid MSC w warunkach wolnych od ksenotypów, która poprawia przeżywalność i funkcjonalność komórek po transplantacji. Technika ta eliminuje immunogenne produkty zwierzęce, zwiększając kliniczną przydatność terapii komórkowych.

Produkcja i podawanie terapeutycznych sferoid mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) przygotowanych w hodowlach 3D w warunkach wolnych od ksenotypów (Wideo) | JoVE Journal

Produkcja i podawanie terapeutycznych sferoid mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) przygotowanych w hodowlach 3D w warunkach wolnych od ksenotypów

Przeglądaj więcej filmów