Produkcja i podawanie terapeutycznych sferoid mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) przygotowanych w hodowlach 3D w warunkach wolnych od ksenotypów

Ogólnym celem tych eksperymentów jest efektywne generowanie i wstrzykiwanie terapeutycznych agregatów sferycznych, czyli sferoidów, mezenchymalnych komórek macierzystych/stromalnych (MSCs), przygotowanych w warunkach wolnych od składników pochodzenia zwierzęcego (xeno-free) do zastosowań eksperymentalnych i klinicznych. Metody te mogą pomóc w przełamaniu głównych barier w dziedzinie terapii opartych na MSCs, takich jak słaba retencja, przeżywalność i funkcjonalność komórek. Zjawiska te są często obserwowane po transplantacji rozproszonych komórek oraz w odpowiedzi na niekorzystne warunki powszechnie związane z uszkodzeniem tkanek.

Główną zaletą tych procedur jest możliwość przygotowania, aktywacji i wstrzyknięcia sferoidów MSC bez użycia immunogennych produktów pochodzenia zwierzęcego, takich jak FBS, co obecnie ogranicza niektóre zastosowania kliniczne tych komórek i może również utrudniać interpretację niektórych danych przedklinicznych. Chociaż mechanizm ten jest potencjalnie bardzo korzystny w pośredniczeniu skuteczności opartej na MSC, może on również służyć do zrozumienia naprawy tkanek pośredniczonej przez MSC, a także tego, jak inne formulacje pożywek mogą zmienić efekt terapeutyczny. Procedury te zaprezentują Josh Beaver i Bret Clough, dwaj technicy z mojego laboratorium.

Po wysianiu i inkubacji mezenchymalnych komórek macierzystych, zgodnie z protokołem tekstowym, należy zebrać komórki przy użyciu trypsyny i EDTA, a następnie poddać je wirowaniu przy 450 ×g. Wszystkie zebrane komórki należy połączyć w jednej probówce stożkowej z odpowiednim medium. Komórki należy odwirować, a osad resuspender w niewielkiej objętości medium. Następnie, po policzeniu komórek, aby uzyskać sferoidy składające się z około 25 000 komórek, należy rozcieńczyć zebrane MSC w jednym z poniższych mediów do stężenia 714 komórek na µL.

Następnie nanieś pipetą krople komórek o objętości 35 µL na wewnętrzną stronę pokrywki odwróconej szalki hodowlanej o średnicy 150 mm. Przenieś 20 ml PBS o temperaturze pokojowej do podstawy szalki i jednym płynnym, jednostajnym ruchem odwróć pokrywkę z kroplami tak, aby wierzchołki kropel były skierowane w dół. Następnie ostrożnie nałóż pokrywkę na podstawę szalki hodowlanej.

Przenieś płytkę do inkubatora na trzy dni, nie zakłócając jej, aby umożliwić prawidłowe formowanie się sferoidów. Po inkubacji rozpocznij zbiór sferoidów, ostrożnie zdejmując pokrywkę i odwracając ją tak, aby krople ponownie znajdowały się od góry. Następnie przechyl pokrywkę pod kątem około 10 do 20 stopni i za pomocą podkładki do przenoszenia komórek przesuń krople zawierające sferoidy do krawędzi płytki.

Za pomocą pipety o objętości 1 ml przenieś medium z końcowego etapu hodowli sferoidów do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, a następnie użyj PBS o temperaturze pokojowej i tej samej końcówki pipety, aby wypłukać płytkę, zapewniając maksymalny odzysk sferoidów. W przypadku analiz real-time PCR odwiruj zawiesinę sferoidów z prędkością 450 ×g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie odessij supernatant.

Za pomocą PBS przemyć sferoidy i powtórzyć kroki wirowania oraz aspiracji. W przypadku podania zwierzętom pozwolić sferom osiąść na dnie probówki bez wirowania. Aby zebrać pożywkę warunkującą (CM) do analiz potencjału immunomodulacyjnego i przeciwnowotworowego, wykorzystując podnośnik do komórek i pipetę w sposób zaprezentowany przed chwilą, przenieść sferoidy oraz pożywkę CM do 15 mililitrowej probówki stożkowej.

Należy jednak nie płukać pokrywek buforem PBS. Po wirowaniu przy 450 ×g przez 5 do 10 minut przenieść nadsącz do probówek o pojemności 1,5 ml. Odwirować nadsącz przy 10 000 ×g w temperaturze pokojowej przez 5 do 10 minut.

Następnie za pomocą pipety ostrożnie przenieś oczyszczone CM do nowych probówek o pojemności 1,5 mililitra w celu przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po przygotowaniu sferoidów zgodnie z instrukcją przedstawioną w tym filmie i odczekaniu od trzech do czterech minut, aż opadną one na dno probówki, odessij nadsącz i przemyj sferoidy, dodając HBSS uzupełniony o 0,2 do 0,5% HSA, aby zachować warunki xeno-free. Następnie odessij nadsącz.

Przykryj sferoidy od 100 do 200 µL sterylnego HBSS/HSA i umieść probówki w lodzie. Po znieczuleniu myszy zgodnie z protokołem tekstowym, umieść zwierzę w komorze BSL-2 grzbietem do dołu i użyj 70% etanolu do dezynfekcji dolnej części brzucha myszy. Zdejmij nasadkę cewnika dożylnego 20G i trzymając skórę myszy jedną ręką, zlokalizuj środek linii hipotetycznej łączącej zgięty staw kolanowy i obszar genitalny, a następnie, kierując końcówką igły zestawu cewnika w stronę linii środkowej, wykonaj drugą ręką wstrzyknięcie doszpiesznowe.

Ostrożnie wyjmij metalowy stilet z zestawu kaniuli z stylistem. Sprawdź, czy na stylistem nie ma krwi, moczu lub kału, a następnie go wyrzuć. Potwierdź prawidłowe umieszczenie plastikowej kaniuli, wkładając końcówkę pipety o pojemności 100-200 µL zawierającą 100 µL sterylnego HBSS/HSA do adaptera strzykawki kaniuli, tworząc szczelne połączenie.

Następnie powoli wstrzyknij płyn do jamy otrzewnowej. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 100 do 200 µl pobierz sferoidy MSA oraz HBSS/HSA i przenieś całą objętość do jamy otrzewnowej przez cewnik, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Następnie, za pomocą 100 µl HBSS/HSA, wypłucz probówkę zawierającą sfery i przenieś całą objętość sfer do jamy otrzewnowej.

Umieść nasączony antyseptykiem gazik nad cewnikiem, a następnie powoli wyjmij cewnik z jamy otrzewnej i go utylizuj. Sprawdź, czy w cewniku nie pozostały żadne sferoidy. Następnie delikatnie masuj jamę otrzewną palcami, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie sferoidów.

Bezpośrednio po podaniu sferoidów myszom, należy ocenić poziom aktywacji sferoidów przygotowanych do iniekcji, przenosząc od 40 do 120 sfer do katetera, a następnie do płytki 12- lub 6-dołkowej zawierającej od jednego do dwóch mililitrów pożywki Alpha MEM uzupełnionej o 2%FBS oraz 1X penicylinę i streptomycynę. Po sześciu godzinach należy przenieść medium z dołków do probówek 1,5 lub 15 mililitrowych i odwirować probówki przy 450 ×g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Na koniec należy przenieść oczyszczony CM do nowych probówek 1,5 mililitrowych i wykorzystać komercyjny zestaw ELISA zgodnie z protokołem tekstowym w celu oznaczenia stężenia PGE-2.

Jak widać tutaj, gdy około 25 000 MSC zawiesza się w kroplach 35 µL CCM, komórki początkowo tworzą małe agregaty, ale ostatecznie łączą się, tworząc pojedynczą zwartą sferę po 72 godzinach w wierzchołku kropli. Rysunek ten pokazuje, że formowanie pojedynczych zwartych sfer oraz XFM-1 wymaga suplementacji HSA w stężeniu 13 mg/mL, co odzwierciedla szacowaną całkowitą zawartość białka w CCM. Podczas tworzenia sfer fenotyp MSC ulega radykalnej zmianie, a w odpowiednio zdefiniowanym chemicznie medium wolnym od komponentów pochodzenia zwierzęcego następuje upregulacja ekspresji licznych czynników przeciwzapalnych, w tym PGE2 i TSG6.

Jednakże produkcja TSG6 i PGE2 nie jest wyraźnie zwiększona w MSCs hodowanych jako sfery w XFM-2 lub XFM-1 bez HSA. Wreszcie, podobnie jak w efektach in vitro, sfery XFM-1 HSA wstrzyknięte do jamy otrzewnowej myszy bezpośrednio po wywołaniu zapalenia systemowego poprzez dożylną administrację LPS, zwiększyły poziomy PGE2 i IL-10 w otrzewnej, zmniejszając jednocześnie prozapalny TNF alpha. Po opanowaniu techniki, każda płytka z kroplami wiszącymi może zostać przygotowana w ciągu jednej do dwóch minut.

Przy prawidłowym wykonaniu, dostarczenie nienaruszonych sferoid drogą dosytnieniową może zająć od 5 do 10 minut na zwierzę. Podczas wytwarzania sferoid MSC metodą wiszącej kropli należy pamiętać, że różne formulacje mediów wolnych od składników pochodzenia zwierzęcego różnią się pod względem wydajności tworzenia sfer oraz wzmacniania ekspresji genów terapeutycznych. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna, aby zrozumieć organizację MSC w sferoidach, a także zidentyfikować dodatkowe szlaki sygnalizacyjne, które mogą zostać aktywowane w MSC w różnych częściach sferoidy.

Po tym opracowaniu metoda ta pozwoliła naukowcom zajmującym się MSC na zbadanie innych warunków hodowli 3D oraz ich wpływu na primowanie MSC i ekspresję genów terapeutycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić primowanie MSC w formie sferoidów z wykorzystaniem techniki wiszącej kropli, jak ocenić ich skuteczność terapeutyczną in vitro oraz jak efektywnie wprowadzać nienaruszone sferoidy do organizmów myszy w celu testowania skuteczności in vivo. Należy pamiętać, że praca z dorosłymi ludzkimi komórkami macierzystymi wymaga specjalistycznego sprzętu oraz szkolenia i może być niebezpieczna, jeśli komórki nie są odpowiednio obsługiwane.

Podczas pracy z dorosłymi ludzkimi komórkami macierzystymi należy przez cały czas stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).