Porządkowanie czasowe danych wyrażeń dynamicznych na podstawie szczegółowych map wyrażeń przestrzennych

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest mapowanie czasowo-przestrzennej dynamiki ekspresji genów zegara segmentacyjnego kręgowców z wykorzystaniem pobierania próbek utrwalonej tkanki. Metoda ta pozwala na obiektywną ocenę oscylacyjnej dynamiki genów w mezodermie presomitycznej, co jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów molekularnych sterujących somatogenezą kręgowców. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jednoczesnego generowania i przetwarzania wielu próbek, co umożliwia wysokiej rozdzielczości analizę dynamiki ekspresji genów w utrwalonej tkance.

Procedurę zaprezentuje dr Charlotte Bailey, była stażystka podoktorska w moim laboratorium. Po pobraniu rogu macicy myszy zgodnie z protokołem tekstowym, pod mikroskopem stereoskopowym należy użyć zakrzywionych nożyczek, aby przeciąć grubą błonę mięśniową rogu macicy i ostrożnie wyekstrahować każdy zarodek. Za pomocą zakrzywionych nożyczek i precyzyjnych pincet należy oddzielić pęcherzyk owodniowy od każdego zarodka.

Następnie, używając igły chirurgicznej lub zakrzywionych nożyczek, pobierz tkankę ogona z każdego zarodka, przecinając go przed tylnymi pąkami kończyn. Ułóż tkankę ogona stroną brzuszną do dołu. Następnie przygotuj pary eksplantatów PSM, dzieląc tkankę ogona na dwie połowy wzdłuż linii środkowej, wykonując delikatne ruchy kołyszące igłą.

Należy upewnić się, że rurka neuralna, struna grzbietowa i tkanka PSM są równomiernie podzielone między oba eksplanty. Następnie każdy przeciwległy eksplant PSM należy nanieść pipetą na spód pokrywki plastikowej szalki hodowlanej o średnicy 35 mm w niewielkiej objętości uprzednio ogrzanej pożywki hodowlanej. Szalkę należy położyć na pokrywce i szybko ją odwrócić, tak aby tkanka PSM zawisła z pokrywki w formie wiszącej kropli pożywki.

Następnie hoduj eksplanty PSM w komorze nawilżanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin. Przenieś pary eksplantów PSM do poszczególnych dołków 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Następnie dodaj do próbek 4%paraformaldehyd w PBS i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza na platformie kołyszącej przez noc.

Po inkubacji należy przemyć studzienki z próbkami za pomocą PBS w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej. Za pomocą precyzyjnej plastikowej pipety Pasteura należy trzykrotnie lub czterokrotnie wymienić roztwór PBS w próbkach. Aby przeprowadzić immunohistochemię, do jednego eksplantu PSM z każdej embrionalnej pary należy dodać 2% Triton X-100 w PBS i inkubować próbki w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej przez jedną godzinę w celu ich przemycia.

Próbki należy krótko przepłukać roztworem PBS. Następnie PBS należy zastąpić roztworem blokującym i inkubować próbki w temperaturze czterech stopni Celsius w temperaturze 4°C na platformie kołyszącej przez noc. Pożądane przeciwciała pierwszorzędowe należy rozcieńczyć w buforze roboczym.

W tym przykładzie przeciwciała przeciwko Delta-like 1 i Notch1 są stosowane w rozcieńczeniu 1:25. Należy dodać przeciwciała do eksplantów i inkubować próbki na platformie kołyszącej w temperaturze czterech stopni Celsiusiusza przez trzy do pięciu dni. Po inkubacji próbki należy dwukrotnie przemyć buforem PBS przez pięć do dziesięciu minut każdorazowo.

Następnie przeprowadź trzy płukania w 0.3% Triton X-100 w PBS w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej. Po rozcieńczeniu przeciwciał wtórnych w buforze roboczym, dodaj 250-500 µL roztworu przeciwciał do każdego dołka z próbką, dbając o to, aby nie używać ostatnich kilku mikrolitrów roztworu, które mogą zawierać agregaty przeciwciał. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj próbki w roztworze przeciwciał wtórnych w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres od trzech do pięciu dni.

Po inkubacji próbki należy dwukrotnie przemyć roztworem PBST przez dziesięć minut każdorazowo. Następnie tkankę należy raz przemyć roztworem PBS w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej przez pięć minut. Zgodnie z protokołem tekstowym, pozostałe przeciwległe eksplanty PSM należy odwodnić i ponownie nawodnić, stosując serię rozcieńczeń etanolu w PBST.

Do eksplantów należy dodać Proteinazę K w stężeniu 10 µg/mL w 0,1% PBST i inkubować tkankę bez mieszania przez pięć minut. Następnie szybko usunąć roztwór Proteinazy K i krótko wypłukać próbki za pomocą PBST. Do eksplantów PSM dodać 4% formaldehyd i 0,1% glutaraldehyd w PBST w celu ich dofixowania, a następnie inkubować próbki przez 30 minut.

Następnie, po dwukrotnym przemyciu próbek w PBST przez dziesięć minut za każdym razem, należy dodać do tkanki 50% mieszaniny hybrydyzacyjnej i inkubować w temperaturze 65 °C bez mieszania przez dziesięć minut. Po inkubacji próbek z mieszaniną hybrydyzacyjną zgodnie z protokołem tekstowym, należy usunąć roztwór i dodać od 0,25 do 0,5 ml podgrzanej mieszaniny hybrydyzacyjnej zawierającej sondę antysensowną RNA znakowaną digoksigeniną przeciwko znanemu komponentowi zegara segmentacyjnego. Płytkę należy uszczelnić taśmą klejącą i inkubować próbki w temperaturze 65 °C przez dwie noce.

Po inkubacji należy przemyć próbki przez 15 minut, używając wstępnie ogrzanej 50% mieszaniny hybrydyzacyjnej w TBST. Następnie próbki należy dwukrotnie opłukać w TBST, a potem inkubować tkankę w TBST w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej przez 30 minut. W kolejnym kroku eksplanty należy poddać preinkubacji w roztworze blokującym przez co najmniej dwie godziny.

Następnie zastąp roztwór świeżym roztworem blokującym, zawierającym przeciwciało anty-digoksigenin sprzężone z HRB w rozcieńczeniu 1:200. Inkubuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia wypłucz próbki trzy razy roztworem TBST w temperaturze pokojowej i przenieś je do oddzielnych studzienek nowej 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.

Następnie, używając TBST, przemyj eksplanty trzykrotnie, przez jedną godzinę każdego mycia. Przed przygotowaniem próbek do obrazowania, zastosuj zestaw do wzmacniania sygnału tyramidowego w celu wizualizacji wykrytego mRNA. Przygotuj jedno naładowane szkiełko do adhezji dla każdej pary eksplantów, usuwając folię ochronną z dystansera do obrazowania o grubości 0,12 mm i przyklejając go do szkiełka przedmiotowego.

Po umieszczeniu pary eksplantatów na szkiełku zgodnie z protokołem tekstowym, należy odczekać od 45 do 60 sekund, aż próbki przylgną do szkiełka, a tkanka zacznie wydawać się lepka i półprzezroczysta, nie wysychając całkowicie. W tym czasie za pomocą pęsety należy usunąć pozostałą folię ochronną z dystansera i nanieść dużą kroplę dwufunkcyjnego medium montażowego i roztworu przejrzystiającego na próbki znajdujące się w centrum dystansera. Następnie należy nałożyć okrągłe szkiełko nakrywkowe na próbki, upewniając się, że medium montażowe jest równomiernie rozprowadzone, a wszystkie krawędzie stykają się z dystanserem.

Następnie należy położyć szkiełko z nakryweką odwrócone do góry dnem na papierze beztkaninowym. Mocno docisnąć, aby upewnić się, że nakrywka w pełni przylega do dystansu, a nadmiar medium montującego został usunięty. Powtarzać ten proces do momentu, aż medium montujące przestanie przebijać na papier.

Oczyść i opisz szkiełko, a następnie przechowuj je w ciemności do momentu obrazowania. Następnie przeprowadź obrazowanie i analizę zgodnie z protokołem tekstowym. W tym eksperymencie wykazano, że ekspresja białek Delta-Like 1 i Notch1 oscyluje niesynchronicznie poprzez tymczasowe uporządkowanie embrionów według nowo powstającej transkrypcji genu zegara segmentacyjnego regulowanego przez Notch, intronic lunatic fringe, wykrytej w jednej połowie każdej pary eksplantatów.

Panele są ułożone zgodnie z fazą pierwszą, drugą i trzecią cyklu zegara segmentacyjnego. Zakresy domen ekspresji dla Delta-Like 1, Notch1 oraz intronowego lunatic fringe wzdłuż osi przednio-tylnej PSM są wyznaczone za pomocą kolorowych pasków. Jak pokazano tutaj, generowany jest wykres w celu ilościowego określenia intensywności sygnału Delta-Like 1, Notch1 oraz intronowego lunatic fringe w odniesieniu do osi przednio-tylnej PSM, co ilustruje zmienność osiową i intensywność sygnału w obrębie PSM w trakcie całego cyklu zegara.

Kymografy wizualizują rozkład przestrzenny Delta-Like 1, Notch1 oraz intronowego lunatic fringe w wielu PSM. Każdy wiersz kymografu reprezentuje natężenie sygnału z pojedynczego eksplantu PSM. Kwantyfikacja natężenia sygnału Delta-Like 1, Notch1 oraz intronowego lunatic fringe w odniesieniu do osi przednio-tylnej PSM ujawnia wyraźną oscylacyjną dynamikę ekspresji tych celów.

Na koniec, kymografy te przedstawiają rozkład przestrzenny odszczepionej i aktywnej formy receptora Notch (NICD), Delta-Like 1, intronic lunatic fringe oraz Notch1 w wielu PSM. Technika ta pomogła badaczom w dziedzinie mitogenezy kręgowców lepiej zrozumieć dynamikę oscylacji genów segmentacji w mezodermie presomitycznej kurczaka i myszy. Po opanowaniu metoda ta może być stosowana w przypadku dużej liczby próbek, co pozwala na jednoczesną analizę profili ekspresji kilku wybranych mRNA i białek.

Po zastosowaniu tej procedury dodatkowa kwantyfikacja danych obrazowych może pozwolić na zrozumienie opóźnień czasowych w ekspresji genów, a także subkomórkowej lokalizacji sygnałów RNA i białek będących przedmiotem zainteresowania badacza. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak mapować czasowo-przestrzenną dynamikę ekspresji genów zegara segmentacyjnego kręgowców z wykorzystaniem pobierania grubych próbek tkankowych. Może to zostać uzupełnione automatyczną analizą obrazu, zgodnie ze szczegółami zawartymi w protokole tekstowym.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zapewnienie równomiernego rozkładu PSM, notochordu i rurki neuralnej pomiędzy eksplantami PSM oraz staranne zoptymalizowanie rozcieńczeń przeciwciał przed rozpoczęciem pracy. Należy pamiętać, że praca z formamidem, paraformaldehydem i glutaraldehydem może być niezwykle niebezpieczna. Należy zadbać o stosowanie środków ochrony osobistej i pracę w dygestorium, jeżeli jest to wymagane.