Porządkowanie czasowe danych wyrażeń dynamicznych na podstawie szczegółowych map wyrażeń przestrzennych

Ogólnym celem tej procedury eksperymentalnej jest mapowanie czasoprzestrzennej dynamiki ekspresji genów w zegarze segmentacji kręgowców przy użyciu stałego pobierania próbek tkanek. Metoda ta pozwala na bezstronną ocenę dynamiki genów oscylacyjnych w mezodermie presocytowej, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów molekularnych rządzących somatogenezą kręgowców. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiele próbek może być generowanych i przetwarzanych jednocześnie, co pozwala na wysoką trzyczęściową analizę dynamiki ekspresji genów w tkance stałej.

Procedurę zademonstruje dr Charlotte Bailey, która jest byłym post-docem w moim laboratorium. Po uzyskaniu rogu macicy myszy zgodnie z protokołem tekstowym, pod mikroskopem stereoskopowym użyto zakrzywionych nożyczek, aby przeciąć grubą błonę mięśniową rogu macicy i ostrożnie wydobyć każdy zarodek. Za pomocą zakrzywionych nożyczek i cienkich kleszczy wypreparuj worek owodniowy z każdego zarodka.

Następnie za pomocą igły chirurgicznej lub zakrzywionych nożyczek zbierz tkankę ogona z każdego zarodka, przecinając zarodek przed zawiązkami kończyn tylnych. Zrównoważ tkankę ogona brzuszną stroną do dołu. Następnie wygeneruj pary eksplantatów PSM, preparując tkankę ogona na dwie połówki wzdłuż linii środkowej, wykonując delikatny ruch kołyszący igłą.

Upewnij się, że cewa nerwowa, struna grzbietowa i tkanka PSM są równo podzielone między dwa eksplantaty. Następnie odpipetuj każdy kontralateralny eksplant PSM na spodniej stronie plastikowej pokrywki naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm w małej objętości wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej. Umieść naczynie na górze pokrywki i szybko je odwróć, tak aby tkanka PSM była zawieszona na pokrywce w wiszącej kropli pożywki.

Następnie hoduj PSM eksplantaty w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin. Przenieś pary eksplantatów PSM do poszczególnych dołków 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Następnie dodaj 4% paraformaldehydu z PBS do próbek i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez godzinę lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza na bujanej platformie przez noc.

Po inkubacji należy użyć PBS do umycia studzienek na próbki w temperaturze pokojowej na platformie bujanej. Za pomocą cienkiej plastikowej pipety Pasteura wymień roztwór PBS na próbki trzy do czterech razy. Aby przeprowadzić immunohistochemię, dodaj 2% Triton X-100 w PBS do jednego eksplantatu PSM z każdej pary zarodkowej i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej przez godzinę, aby je umyć.

Użyć PBS do krótkiego przepłukania próbek. Następnie zastąp PBS roztworem blokującym i inkubuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na kołyszącej się platformie przez noc. Używając buforu roboczego, rozcieńczyć pożądane przeciwciała pierwszorzędowe.

W tym przykładzie przeciwciała przeciwko Delta-like 1 i Notch1 są używane w rozcieńczeniu 1:25. Dodaj przeciwciała do eksplantatów i inkubuj próbki na platformie kołyszącej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy do pięciu dni. Po inkubacji należy użyć PBS do przemycia próbek dwa razy przez pięć do dziesięciu minut każda.

Następnie wykonaj trzy prania w 0,3%Triton X-100 w PBS w temperaturze pokojowej na bujanej platformie. Po rozcieńczeniu przeciwciał drugorzędowych w buforze roboczym dodać 250-500 mikrolitrów roztworu przeciwciała do każdej studzienki próbki, uważając, aby nie użyć ostatnich kilku mikrolitrów roztworu, który może zawierać agregaty przeciwciał. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj próbki w roztworze przeciwciał drugorzędowych w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy do pięciu dni.

Po inkubacji należy użyć PBST do przemycia próbek dwukrotnie przez dziesięć minut każda. Następnie użyj PBS, aby umyć chusteczkę raz w temperaturze pokojowej na bujanej platformie przez pięć minut. Postępując zgodnie z protokołem tekstowym, odwodnić i ponownie uwodnić pozostałe przeciwległe eksplantaty PSM za pomocą serii rozcieńczeń PBST etanolu.

Dodaj dziesięć mikrogramów na mililitr proteinazy K w 0,1% PBST do eksplantatów i inkubuj tkankę bez mieszania przez pięć minut. Następnie szybko usuń roztwór proteinazy K i użyj PBST, aby krótko przepłukać próbki. Dodać 4% formaldehydu i 0,1% aldehydu glutarowego w PBST do eksplantatów PSM w celu ich postfiksu i inkubacji próbek przez 30 minut.

Następnie, po użyciu PBST do dwukrotnego przemycia próbek przez dziesięć minut każda, dodaj 50% mieszankę hybrydyzacyjną do tkanki i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza bez mieszania przez dziesięć minut. Po inkubacji próbek i mieszaniu hybrydyzacji zgodnie z protokołem tekstowym, usuń roztwór i dodaj 0,25 do 0,5 mililitra wstępnie podgrzanej mieszanki hybrydyzacyjnej zawierającej antysensowną sondę RNA znakowaną digoksygeniną przeciwko znanemu składnikowi zegara segmentacji. Użyj taśmy klejącej, aby uszczelnić płytkę i inkubować próbki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dwie noce.

Po inkubacji użyj wstępnie podgrzanej 50% mieszanki hybrydyzacyjnej w TBST, aby umyć próbki przez 15 minut. Następnie użyj TBST do dwukrotnego przepłukania próbek przed inkubacją tkanki w TBST w temperaturze pokojowej na platformie bujanej przez 30 minut. Następnie wstępnie inkubuj eksplantaty w roztworze blokującym przez co najmniej dwie godziny.

Następnie zastąp roztwór świeżym roztworem blokującym, zawierającym rozcieńczone w stosunku 1:200 przeciwciało anty-digoksygeniny HRB. Próbki należy inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia za pomocą TBST przepłukać próbki trzykrotnie w temperaturze pokojowej i przenieść je do indywidualnych dołków nowej 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.

Następnie za pomocą TBST umyj eksplantaty trzy razy przez godzinę każdy. Użyj zestawu do wzmacniania sygnału tyramidowego, aby zobrazować wykryte mRNA przed przygotowaniem próbek do obrazowania. Przygotuj jedno naładowane szkiełko adhezyjne dla każdej pary eksplantatów, usuwając wkładkę samoprzylepną z przekładki obrazowej o grubości 0,12 mm i przyklejając ją do szkiełka podstawowego.

Po umieszczeniu pary lub eksplantatów na szkiełku zgodnie z protokołem tekstowym, pozwól próbkom przylegać do szkiełka przez 45-60 sekund, aż tkanka zacznie wydawać się lepka i przezroczysta, nie wysychając całkowicie. W międzyczasie użyj kleszczyków, aby usunąć pozostałą warstwę samoprzylepną z przekładki i dodaj dużą kroplę dwufunkcyjnego medium montażowego i roztworu czyszczącego do próbek pośrodku przekładki. Nałożyć okrągłe szkiełko nakrywkowe na próbki, upewniając się, że podłoże mocujące jest równomiernie rozprowadzone i że wszystkie krawędzie stykają się z przekładką.

Następnie umieść szkiełko nakrywkowe do góry nogami na papierze o niskiej zawartości kłaczków. Dociśnij mocno, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe całkowicie przylega do przekładki i że nadmiar środka montażowego został usunięty. Powtarzaj ten proces, aż nośnik montażowy przestanie plamić papier.

Wyczyść i oznacz szkiełko i przechowuj je w ciemności do czasu obrazowania. Następnie przeprowadź obrazowanie i analizę zgodnie z protokołem tekstowym. W tym eksperymencie wykazano, że ekspresja białek Delta-Like 1 i Notch1 oscyluje poza synchronizacją poprzez tymczasowe ułożenie zarodków zgodnie z powstającą transkrypcją genu zegara segmentacyjnego regulowanego przez Notch, intronicznego obrzeża obłąkanego wykrytego w połowie każdej pary eksplantatów.

Panele są ułożone zgodnie z pierwszą, drugą i trzecią fazą cyklu zegara segmentacji. Zakres domen ekspresji dla Delta-Like 1, Notch1 i intronicznej obrzeża obłąkanego wzdłuż przednio-tylnej osi PSM jest wyznaczony przez paski oznaczone kolorami. Jak pokazano tutaj, wykres jest generowany w celu ilościowego określenia intensywności sygnału obrzeży obłąkanych typu Delta-Like 1, Notch1 i intronicznej obrzeża w odniesieniu do przednio-tylnej osi PSM i ilustruje zmienność osiową i intensywność sygnału w całym cyklu zegara.

Kimografy wizualizują przestrzenny rozkład Delta-Like 1, Notch1 i intronicznego obrzeża obłąkanego w licznych PSM. Każdy wiersz kimografu reprezentuje intensywność sygnału pojedynczego eksplantatu PSM. Kwantyfikacja intensywności sygnału Delta-Like 1, Notch1 i intronicznej obrzeża obłąkanego w odniesieniu do przednio-tylnej osi PSM ujawnia wyraźną dynamikę oscylacyjnej ekspresji dla tych celów.

Wreszcie, kimografy te pokazują przestrzenny rozkład rozszczepionej i aktywowanej formy receptora Notch NICD, Delta-Like 1, intronicznej obrzeża obłąkanego i Notch1 w licznych PSM. Technika ta pomogła naukowcom zajmującym się mitogenezą kręgowców w lepszym zrozumieniu dynamiki oscylacji genów segmentacji w mezodermie presomitycznej piskląt i myszy. Po opanowaniu technika ta może być wykonywana na dużej liczbie próbek, co pozwala na jednoczesną analizę profili ekspresji kilku interesujących mRNA i białek.

Po tej procedurze, dodatkowa kwantyfikacja danych obrazowych może zapewnić zrozumienie czasowych opóźnień w ekspresji genów, a także subkomórkowej lokalizacji zarówno RNA, jak i sygnałów białkowych, które są interesujące dla badacza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mapować przestrzenno-czasową dynamikę ekspresji genów w zegarze segmentacji kręgowców za pomocą grubego próbkowania tkanek. Następnie można przeprowadzić automatyczną analizę obrazu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Podczas próby tej procedury ważne jest, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie PSM, struny grzbietowej i cewy nerwowej między eksplantatami PSM oraz starannie zoptymalizować rozcieńczenia przeciwciał przed rozpoczęciem. Pamiętaj, że praca z formamidem, paraformaldehydem i aldehydem glutarowym może być niezwykle niebezpieczna. Należy pamiętać o noszeniu środków ochrony osobistej i w razie potrzeby pracować pod wyciągiem.