Kwantyfikacja autofosforylacji bakteryjnej kinazy histydynowej przy użyciu testu wiązania nitrocelulozy

Ogólnym celem tego protokołu jest ilościowe określenie autofosforylacji oczyszczonych bakteryjnych kinaz histydynowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji dwuskładnikowej. Takich jak wpływ bodźców pokrewnych w interakcjach białko-białko na autofosforylację kinaz histydynowych.

Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest to metoda wysokoprzepustowa, którą można wykorzystać do dokładnego wykrywania powstałych pikomoli fosfohistadyny i uzyskiwania parametrów kinetycznych dla kinaz histydynowych. Jako adiunkt stosuję filtrację na membranach nitrocelulozowych do ilościowego oznaczania radioaktywnych ligandów związanych z białkami. W związku z tym sensowne było opracowanie podobnej techniki ilościowego określania fosforylacji histydyny w bakteryjnych kinazach histydynowych.

Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania odczynników i materiałów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby ustawić aparat z 96 dołkami z wykresem punktowym, wytnij kawałek membrany nitrocelulozowej o wymiarach 8 na 12 centymetrów. Umieścić nitrocelulozę w aparacie z wykresem punktowym.

Upewnij się, że membrana jest dopasowana w taki sposób, że urządzenie jest uszczelnione, a wszystkie studzienki są całkowicie pokryte membraną. W celu zebrania filtratu należy podłączyć aparat do dodatkowej kolby bocznej. Od trzpienia zaworu podłączyć odpowiednie rurki, aby umożliwić wygodne użytkowanie aparatu bez przechylania kolby wtórnej.

Następnie podłącz wtórną kolbę boczną do źródła podciśnienia aspiratora. Sprawdź, czy urządzenie jest całkowicie szczelne, stosując próżnię do aparatu. Jeśli aparat zostanie prawidłowo zmontowany, we wszystkich studzienkach będzie panować silne podciśnienie.

Wszystkie połączenia rur mogą być owinięte folią Parafilm lub Saran, aby zapewnić szczelne uszczelnienie. Przed rozpoczęciem należy przygotować wszystkie cztery składniki reakcji jako cztery roztwory podstawowe X, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wymieszać równe objętości buforu reakcyjnego, kinazy histydynowej i podwójnie destylowanej wody.

Pozwól, aby te składniki reakcji zrównoważyły się w temperaturze pokojowej przez krótki czas. Aby zainicjować reakcję, dodaj jedną objętość roztworu gamma-32 P ATP i mieszaj, pipetując w górę iw dół. Śledź czas, który upłynął za pomocą timera i pozwól, aby reakcja postępowała przez żądany czas.

Ugasić reakcję. Dodać podwielokrotność reakcji do 325 milimolowego kwasu fosforowego. Natychmiast umieść stłumione reakcje na lodzie, aż wszystkie reakcje zostaną zakończone.

Umieścić wstępnie zmontowaną 96-dołkową aparaturę do wykresów punktowych w pojemniku wtórnym. Pojemnik ten powinien być wystarczająco duży, aby aparat można było łatwo zdemontować, ponieważ aparat i membrana będą radioaktywne po użyciu. Zastosuj próżnię do 96-dołkowego aparatu z wykresem punktowym.

Gdy aparat znajdzie się pod próżnią, ostrożnie pipetować wygaszoną reakcję bezpośrednio na membranę nitrocelulozową w każdym dołku. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie reakcje zostaną załadowane na membranę. Ponieważ zdolność wiązania nitrocelulozy jest większa niż ilość kinazy histydynowej plamistej, można założyć, że prawie cała kinaza wiąże się z błoną, gdy jest prawidłowo załadowana.

W zależności od używanej aparatury należy uważać, aby nie przebić nitrocelulozy. Zauważ, że cała reakcja miała kontakt z nitrocelulozą. Niektóre reakcje łatwo przyklejają się do ścian studni.

Umyj studzienki 100 mikrolitrami lodowatego 25-milimolowego kwasu fosforowego. Pozwoli to na dotarcie do membrany dowolnej objętości reakcji, która mogła zostać uwięziona w studni, zapewniając pełne obciążenie wszystkich reakcji. Pozwól, aby cała objętość przepłynęła przez membranę.

Ostrożnie zdemontuj urządzenie przed wyłączeniem odkurzacza. Należy pamiętać, że zarówno aparatura, jak i membrana nitrocelulozowa są w tym czasie radioaktywne. Nie wyjmuj żadnych elementów urządzenia z pojemnika wtórnego.

Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś membranę nitrocelulozową z aparatu do pojemnika zawierającego około 200 mililitrów 25-milimolowego lodowatego kwasu fosforowego. Umieść pokrywkę na tym pojemniku, ponieważ pranie będzie radioaktywne. W tym momencie próżnia może zostać wyłączona.

Umieść pojemnik z membraną myjącą na bujaku. Pozwól membranie delikatnie się kołysać przez 20 minut. Po 20 minutach ostrożnie przelej zużyty roztwór myjący do dużego wiadra, które będzie używane do tymczasowego przechowywania odpadów.

Dodaj 200 mililitrów lodowatego 25-milimolowego kwasu fosforowego do membrany. Umyj membranę w ten sposób co najmniej trzy razy, aby usunąć sygnał tła gamma-32 P ATP z membrany. Po trzecim płukaniu przetestuj zużyty roztwór płuczący pod kątem promieniowania za pomocą licznika Geigera.

Kontynuuj mycie membrany, aż w roztworze myjącym nie będzie żadnego sygnału. Po wystarczającym umyciu membrany pozostaw ją do krótkiego wyschnięcia na powietrzu, co zwykle trwa pięć minut lub krócej. Po wystawieniu nitrocelulozy na działanie zieleni fosforowej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przygotować się do barwienia i odbarwiania Pąskiem S.

Na krótko zanurz membranę nitrocelulozową w roztworze barwiącym Ponceau S na jedną do dwóch minut. Zwilż całą membranę plamą przed odbarwieniem. Następnie zdekantować nadmiar Ponceau S z membrany.

Przepłukać membranę podwójnie destylowaną wodą, aż zabarwią się tylko plamy z kinazy histydyny. Należy pamiętać, że ta procedura zadziała tylko wtedy, gdy wszystkie plamki zawierają wykrywalne ilości białka. Za pomocą nożyczek wytnij każde miejsce na membranie nitrocelulozowej.

Nie jest konieczne idealne cięcie wzdłuż krawędzi poplamionego miejsca. Jeśli membrana została wystarczająco umyta, tło ze względu na różną wielkość wyciętych miejsc jest znikome. Ważne jest tylko, aby wyciąć całe miejsce dla każdej reakcji.

Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś każde miejsce do fiolek scyntylacyjnych. Nie jest konieczny koktajl scyntylacyjny, ponieważ fosfor 32 jest łatwo wykrywalny przez promieniowanie Czerenkowa. Następnie narysuj kilka rozcieńczeń roztworu gamma-32 P ATP na jednym centymetrze kwadratowym nitrocelulozy.

Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś każdy kwadrat do fiolek scyntylacyjnych bez koktajlu scyntylacyjnego. Próbki te zostaną wykorzystane do wygenerowania krzywej wzorcowej w celu wyznaczenia liczby na minutę na pikomol roztworu ATP. Barwienie pąskiem membrany nitrocelulozowej pokazano tutaj.

Barwienie jest jednolite we wszystkich próbkach, co wskazuje, że wszystkie próbki są równomiernie obciążone. Wyniki fluorografii błony nitrocelulozowej pokazują względny poziom znakowanej radioaktywnie fosfohistydyny w każdym miejscu. Czwarty i ósmy rząd to kontrole ujemne wykazujące, że nadmiar ATP jest wypłukiwany z membrany nitrocelulozowej.

Przedstawiono reprezentatywne wyniki kwantyfikacji autofosforylacji kinazy histydynowej tutaj. Dane te są generowane na podstawie zliczania scyntylacyjnego każdego punktu wyciętego z membrany. Przedstawiona tutaj standardowa krzywa zliczeń na minutę na pikosol ATP jest również generowana na podstawie zliczania scyntylacyjnego i służy do obliczania pikoboli fosfohistydyny obecnej w każdej próbce.

Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak wprowadzenie pokrewnych bodźców lub białek, co do których przypuszczalnie modulują aktywność kinazy, można dodać do eksperymentu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wpływ tych dodatków na aktywność kinazy. Nie zapominaj, że praca z promieniotwórczością może być niezwykle niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak odpowiednie szkolenie w zakresie bezpieczeństwa radiacyjnego oraz stosowanie środków ochrony osobistej i osłon.