Kwantyfikacja autofosforylacji bakteryjnej kinazy histydynowej przy użyciu testu wiązania nitrocelulozy

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest ilościowe określenie autofosforylacji oczyszczonych bakteryjnych kinaz histydynowych. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu sygnalizacji dwuskładnikowej, takie jak wpływ cognatywnych bodźców w oddziaływaniach białko-białko na autofosforylację kinaz histydynowych.

Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest to metoda o wysokiej przepustowości, która umożliwia dokładne wykrywanie pikomoli powstałej fosfohistydyny oraz wyznaczanie parametrów kinetycznych dla kinaz histydynowych. Jako stażysta podoktorski wykorzystuję filtrację na membranach nitrocelulozowych do ilościowego oznaczania związanych z białkami ligandów radioaktywnych. W związku z tym zasadne było opracowanie podobnej techniki do ilościowego oznaczania fosforylacji histydyny w bakteryjnych kinazach histydynowych.

Rozpocznij tę procedurę od przygotowania odczynników i materiałów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować aparat do dot-blotu z 96 dołkami, wytnij fragment membrany nitrocelulozowej o wymiarach 8 cm na 12 cm. Umieść membranę nitrocelulozową w aparacie do dot-blotu.

Należy upewnić się, że membrana przylega w taki sposób, aby aparat był szczelny, a wszystkie otwory były całkowicie nią przykryte. W celu zebrania filtratu należy połączyć aparat z wtórną kolbą z bocznym wylotem. Do trzpienia zaworu należy podłączyć odpowiednią rurkę, aby umożliwić wygodne korzystanie z aparatu bez ryzyka przewrócenia wtórnej kolby.

Następnie podłącz kolbę z bocznym ramieniem wtórnym do aspiratora próżniowego. Sprawdź, czy aparat jest całkowicie szczelny, wytwarzając w nim podciśnienie. Jeśli aparat został prawidłowo złożony, w każdym z otworów powstanie silna próżnia.

Wszystkie połączenia rurek można owinąć folią Parafilm lub folią spożywczą, aby zapewnić szczelność. Przed rozpoczęciem przygotuj wszystkie cztery komponenty reakcji jako roztwory stokowe 4X, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wymieszaj równe objętości buforu reakcyjnego, histydynowej kinazy oraz wody podwójnie destylowanej.

Pozostaw składniki reakcji w temperaturze pokojowej przez krótką chwilę w celu ich wyrównania termicznego. Aby zainicjować reakcję, dodaj jedną objętość roztworu ATP z gamma-32 P i wymieszaj, pipetując ciecz w górę i w dół. Odmierz czas trwania reakcji za pomocą stopera i pozwól reakcji przebiegać przez wymagany czas.

Przerwij reakcję. Dodaj alikwot reakcji do kwasu fosforowego o stężeniu 325 millimolar. Bezzwłocznie umieść przerwane reakcje na lodzie, aż wszystkie reakcje zostaną zakończone.

Umieść wcześniej zmontowany aparat do dot-plotu z 96 dołkami w pojemniku zewnętrznym. Pojemnik ten powinien być wystarczająco duży, aby można było w nim łatwo rozmontować aparat, ponieważ aparat i membrana będą radioaktywne po użyciu. Zastosuj podciśnienie do aparatu do dot-plotu z 96 dołkami.

Po wytworzeniu próżni w aparaturze należy ostrożnie nanieść pipetą zatrzymaną reakcję bezpośrednio na membranę nitrocelulozową w każdym dołku. Powtarzać tę czynność do czasu naniesienia wszystkich reakcji na membranę. Ponieważ pojemność wiązania nitrocelulozy jest większa niż ilość naniesionej histydynowej kinazy, można przyjąć, że przy prawidłowym naniesieniu prawie cała kinaza wiąże się z membraną.

W zależności od użytego urządzenia należy uważać, aby nie przebić nitrocelulozy. Należy upewnić się, że cała mieszanina reakcyjna miała kontakt z nitrocelulozą. Część odczynników może łatwo przykleić się do ścianek dołka.

Przemyj dołki 100 µL lodowatego 25 mM kwasu fosforowego. Pozwoli to na dotarcie do membrany wszelkiej objętości reakcyjnej, która mogła zostać uwięziona w dołku, zapewniając całkowite naniesienie wszystkich reakcji. Pozostaw całą objętość do przepłynięcia przez membranę.

Przed wyłączeniem pompy próżniowej należy ostrożnie rozmontować aparat. Należy pamiętać, że w tym momencie zarówno aparat, jak i membrana nitrocelulozowa są radioaktywne. Nie wolno wyjmować żadnych elementów aparatury z pojemnika zewnętrznego.

Za pomocą pęsety ostrożnie przenieś membranę nitrocelulozową z aparatu do naczynia zawierającego około 200 ml lodowatego 25 mM kwasu fosforowego. Przykryj naczynie pokrywką, ponieważ roztwór do płukania będzie radioaktywny. W tym momencie można wyłączyć pompę próżniową.

Umieść pojemnik z membraną do płukania na shakerze oscylacyjnym. Pozostaw membranę do delikatnego kołysania przez 20 minut. Po 20 minutach ostrożnie odlej zużyty roztwór piorący do dużego wiadra przeznaczonego do tymczasowego przechowywania odpadów.

Do membrany należy dodać 200 mililitrów lodowatego 25 milimolowego kwasu fosforowego. Membranę należy w ten sposób przemyć co najmniej trzy razy, aby usunąć z niej tło sygnału gamma-32 P ATP. Po trzecim przemyciu należy sprawdzić zużyty roztwór płuczący pod kątem promieniowania za pomocą licznika Geigera.

Kontynuuj płukanie membrany, aż w roztworze płuczącym nie będzie obecny żaden sygnał. Po odpowiednim wypłukaniu membrany pozwól jej krótko wyschnąć na powietrzu, co zazwyczaj trwa pięć minut lub krócej. Po naświetleniu nitrocelulozy barwnikiem phosphorus green, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przygotuj się do barwienia i odbarwiania Ponceau S.

Krótko zanurz membranę nitrocelulozową w roztworze barwiącym Ponceau S na jedną do dwóch minut. Przed odbarwianiem należy zwilżyć całą membranę barwnikiem. Następnie zlej nadmiar Ponceau S z membrany.

Płucz membranę wodą dwukrotnie destylowaną do momentu, aż zabarwione pozostaną jedynie plamki odpowiadające kinazie histydynowej. Należy pamiętać, że procedura ta zadziała tylko wtedy, gdy wszystkie plamki zawierają wykrywalne ilości białka. Za pomocą nożyczek wytnij każdą plamkę z membrany nitrocelulozowej.

Nie jest konieczne wycinanie idealnie wzdłuż krawędzi zabarwionej plamki. Jeśli membrana została dostatecznie wypłukana, tło wynikające z różnej wielkości wyciętych plamek jest pomijalne. Ważne jest jedynie, aby dla każdej reakcji wyciąć całą plamkę.

Za pomocą pęsety ostrożnie przenieś każdą plamkę do fiolek scyntylacyjnych. Stosowanie koktajlu scyntylacyjnego nie jest konieczne, ponieważ fosfor 32 jest łatwo wykrywalny za pomocą promieniowania Czerenkowa. Następnie nanieś kilka rozcieńczeń roztworu ATP znakowanego gamma-32 P na kwadraty z nitrocelulozy o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr.

Używając pincety, ostrożnie przenieś każdy kwadrat do fiolek scyntylacyjnych bez dodatku koktajlu scyntylacyjnego. Próbki te zostaną wykorzystane do wygenerowania krzywej wzorcowej w celu określenia liczby zliczeń na minutę na pikomol roztworu ATP. Tutaj przedstawiono barwienie membrany nitrocelulozowej barwnikiem Ponceau.

Barwienie jest jednorodne we wszystkich próbkach, co wskazuje na równomierne nałożenie materiału. Wyniki fluorografii membrany nitrocelulozowej pokazują względny poziom radioznakowanej fosfohistydyny w każdej plamce. Czwarta i ósma rzędy stanowią kontrole negatywne, wykazujące, że nadmiar ATP został wypłukany z membrany nitrocelulozowej.

Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki ilościowego oznaczania autofosforylacji kinazy histydynowej. Dane te uzyskano w drodze zliczania scyntylacyjnego każdego wyciętego z membrany punktu. Przedstawiona tutaj krzywa wzorcowa liczby zliczeń na minutę na pikomol ATP została również wyznaczona metodą zliczania scyntylacyjnego i służy do obliczenia liczby pikomoli fosfohistydyny obecnych w każdej próbce.

Po przeprowadzeniu tej procedury do eksperymentu można dodać inne metody, takie jak wprowadzenie pokrewnych bodźców lub białek, które według hipotezy modulują aktywność kinazy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące wpływu tych dodatków na aktywność kinazy. Należy pamiętać, że praca z materiałami radioaktywnymi może być niezwykle niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak odpowiednie szkolenie z zakresu ochrony radiologicznej oraz stosowanie środków ochrony indywidualnej i osłon.