Name: Kwantyfikacja autofosforylacji bakteryjnej kinazy histydynowej przy użyciu testu wiązania nitrocelulozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Naucz się kwantyfikować autofosforylację bakteryjnych kinaz histydynowych za pomocą testu wiązania nitrocelulozy. Ta metoda umożliwia wykrywanie pikomoli fosfohistydyny i określanie parametrów kinetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Departament Edukacji poprzez program Graduate Assistance in Areas of National Need (P200A100044).

Uwaga: Protokół ten wymaga odpowiedniego przeszkolenia w zakresie stosowania i obchodzenia się z materiałami promieniotwórczymi. Podczas wykonywania tego testu należy używać wymaganego wyposażenia ochrony osobistej, w tym osłony przed promieniowaniem beta. Z odpadami promieniotwórczymi należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ podczas fazy mycia eksperymentu powstają duże ilości odpadów. Upewnij się, że odpady są przechowywane w pionowym pojemniku, takim jak duże wiadro lub butelka, które nie zostaną łatwo przewrócone lub rozlane. Po zakończeniu eksperymentu należy ostrożnie przenieść wszystkie odpady płynne do odpowiednio oznaczonych pojemników na odpady radioaktywne. Ze wszystkimi materiałami należy obchodzić się ostrożnie i trzymać w pobliżu licznik Geigera, aby monitorować miejsce pracy pod kątem zanieczyszczeń.
UWAGA: Ten protokół jest poprawioną wersją wcześniej zgłoszonego testu z naszej grupy. 15 Przed zastosowaniem tej metody należy zbadać stabilność fosfohistydyny wH3PO4 dla każdej niescharakteryzowanej kinazy histydynowej. Test stabilności fosfohistydyny został opisany wcześniej. 15 Należy uwzględnić kontrolę ujemną, która nie zawiera kinazy. Jest to konieczne, aby odjąć sygnał tła od każdej próbki i zapewnić, że [γ-32P]-ATP jest wystarczająco wypłukany z membrany.
1. Przygotowanie odczynników i materiałów
<ol>
	<li>Oczyść kinazy histydynowe z kultury bakteryjnej przed użyciem tego testu.
	<ol>
		<li>Oczyść kinazę histydynową (identyfikator genu 1189383) z Vibrio parahaemolyticus (EB101, ATCC 17802) w celu opracowania tego testu. Sklonuj kinazę do wektora ekspresyjnego pET-23aHis-TEV przy użyciu miejsc restrykcyjnych NdeI i XhoI i przeprowadź mutagenezę ukierunkowaną na miejsce, aby uzyskać zmutowany konstrukt Vp1876 D499A.</li>
		<li>Przekształć plazmid w E. coli BL21 (DE3) pLysS i hoduj komórki w pożywce gruźliczej w temperaturze 37 °C. Uzupełnij kultury ampicyliną (100 μg/ml) i chloramfenikolem (34 μg/ml) i rozmnażaj z mieszaniem (250 obr./min) do OD600 0,6.</li>
		<li>Indukuj ekspresję białka za pomocą IPTG do końcowego stężenia 25 μM i hoduj kultury przez noc w temperaturze 16 °C. Zbieraj komórki przez wirowanie (5 000 x g), lizuj przez sonikację i odwiruj w celu usunięcia resztek komórkowych (18 000 x g).</li>
		<li>Oczyść kinazę znakowaną przez Hisa za pomocą agarozy Ni-NTA. Potwierdź czystość za pomocą SDS-PAGE. Zoptymalizuj oczyszczanie dla każdego białka i potwierdź czystość przed użyciem tego testu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór do płukania 25 mM H3PO4. Do 1 l destylowanej wody dejonizowanej dodaćH3PO4 do końcowego stężenia 25 mM. pH tego roztworu wynosi około 2,0. Umieść 25 mM H3PO4 na lodzie.</li>
	<li>Przygotować 13-krotny roztwór podstawowy 325 mM H3PO4, który ma być użyty do wygaszenia reakcji kinazy. pH tego roztworu wynosi około 1,5. Umieść 325 mM H3PO4 na lodzie. 
	UWAGA:H3PO4 w końcowym stężeniu 25 mM wystarczająco wygasza reakcję, a także pomaga blokować znakowany radioaktywnie fosforan, który nie jest związany z histydyną, przed wiązaniem się z błoną nitrocelulozową.</li>
	<li>Przygotować 4x buforowy roztwór reakcyjny zawierający 160 mM Tris-HCl pH 8,0, 600 mM KCl, 16 mM MgCl2 i 40% glicerolu.</li>
	<li>Określ ilościowo stężenie kinazy histydynowej za pomocą ustalonych metod koncentracji białek (Bradford, UV-Vis itp.). 16,17 Przygotować roztwór kinazy histydynowej o stężeniu 4 razy większym od pożądanego stężenia końcowego. Aby uzyskać odpowiedni sygnał, końcowe stężenie białka w reakcji powinno wynosić co najmniej 5 μM.</li>
	<li>Przygotuj 4x znakowany radioaktywnie roztwór [γ-32P]-ATP o odpowiednim 4-krotnym stężeniu nieznakowanego ATP i znakowanym stosunku do nieznakowanego stosunku do nieznakowanego do eksperymentu. 
	UWAGA: Ilość [γ-32P]-ATP, która powinna znaleźć się w tej mieszance, zależy od tego, ile [γ-32P]-ATP zostanie ostatecznie wykryte dla każdej reakcji. Uzyskano odpowiedni sygnał o końcowych stężeniach w zakresie 0,1 - 5 μCi na reakcję. Ważne jest, aby stosunek ATP znakowany do nieznakowanego był stały dla wszystkich reakcji w danym eksperymencie. Seryjne rozcieńczenia powinny być wykonywane, gdy pożądanych jest wiele stężeń ATP, ponieważ pozwala to utrzymać stały stosunek ATP oznakowany do nieznakowanego we wszystkich stężeniach. Końcowe stężenia ATP zwykle wahają się od 10 μM do co najmniej 1 mM, a każde stężenie powinno być oznaczane w trzech egzemplarzach w celu uzyskania wiarygodnych danych kinetycznych.</li>
	<li>96-dołkowy aparat do igłów punktowych
	<ol>
		<li>Wytnij kawałek membrany nitrocelulozowej o wymiarach 8 cm x 12 cm (wielkość porów 0,2 μm).</li>
		<li>Umieść nitrocelulozę w aparacie do plam punktowych, upewniając się, że membrana jest dopasowana w taki sposób, że aparat jest uszczelniony, a wszystkie studzienki są całkowicie pokryte membraną. Przy prawidłowym montażu nie powinno być wycieków powietrza po zastosowaniu próżni.</li>
		<li>W celu zebrania filtratu należy podłączyć aparat do wtórnej kolby bocznej. Od trzpienia zaworu podłączyć odpowiednie przewody, tak aby urządzenie mogło być wygodnie używane bez przechylania kolby wtórnej.</li>
		<li>Podłączyć wtórną kolbę ramienia bocznego do aspiratora/źródła podciśnienia.</li>
		<li>Sprawdź, czy urządzenie jest całkowicie szczelne, przykładając próżnię do aparatu. Jeśli aparat zostanie prawidłowo zmontowany, we wszystkich studzienkach będzie panować silne podciśnienie. Wszystkie połączenia rurek mogą być owinięte folią Parafilm lub saran, aby zapewnić szczelne uszczelnienie.</li>
		<li>Opcjonalnie, aby przetestować próżnię, odpipetuj 100 μl buforu reakcyjnego do jednego dołka. Próżnia powinna być wystarczająco silna, aby wciągnąć całą ciecz przez studnię i na membranę.</li>
		<li>Wyłącz próżnię, aż wszystkie próbki będą gotowe do wykrycia na membranie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Inicjacja i wygaszanie reakcji
<ol>
	<li>Mieszanie składników reakcji
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem należy przygotować wszystkie cztery składniki reakcji jako 4x roztwory podstawowe: bufor reakcyjny (patrz punkt 1.4), kinazę histydynową (1.5), [γ-32P]-ATP (1.6) i ddH2O.</li>
		<li>Wymieszać równe objętości buforu reakcyjnego, kinazy histydynowej i ddH2O. Pozostawić te składniki reakcji do zrównoważenia w temperaturze pokojowej przez krótki czas (10 min). 
		UWAGA: Ostateczna objętość reakcji zależy od tego, czy eksperyment jest zależny od czasu, enzymu czy substratu. Reakcje zależne od czasu muszą być większe, ponieważ z tej samej reakcji pobiera się wiele podwielokrotności i hartuje w żądanym punkcie czasowym. Objętość reakcji będzie zależeć od liczby pożądanych punktów czasowych. Test jest zoptymalizowany dla każdego miejsca na membranie nitrocelulozowej, aby zawierał 30 μl reakcji. W związku z tym, jeśli wymagane jest 10 punktów czasowych, objętość reakcji musi wynosić co najmniej 300 μl (w przypadku jakichkolwiek błędów pipetowania preferowana byłaby większa objętość, np. 330 μl). Eksperymenty zależne od enzymów i substratów wymagają mniejszych objętości reakcji. Objętość reakcji w tych eksperymentach może wynosić nawet 30 μl, ponieważ jest to końcowa objętość, która zostanie zauważona na membranie nitrocelulozowej.</li>
		<li>Aby rozpocząć reakcję, dodać jedną objętość roztworu [γ-32P]-ATP do reakcji i mieszać, pipetując w górę i w dół. Śledź czas, który upłynął za pomocą timera i pozwól, aby reakcja postępowała przez żądany czas.</li>
		<li>Aby wygasić reakcję, dodać do reakcji 1/13 całkowitej objętości reakcji lodowatego 325 mM H3PO4 i wymieszać, pipetując w górę i w dół. Alternatywnie, dodać podwielokrotność reakcji do 325 mM H3PO4. 
		UWAGA: Końcowe stężenieH3PO4 powinno wynosić 25 mM, aby wystarczająco wygasić reakcję. Na przykład dodaj 2,5 μL 325 mM H3PO4 do 30 μL reakcji lub dodaj 30 μL reakcji do 2,5 μL 325 mM H3PO4. Końcowe pH reakcji wynosi około 4,0. To stężenieH3PO4 zostało przetestowane i potwierdzone w celu wygaszenia reakcji kinazy w tym buforze bez degradacji fosfohistydyny.
		<ol>
			<li>Na przykład zmieszaj 7,5 μl 4x buforu reakcyjnego, 7,5 μl 4x kinazy histydynowej i 7,5 μl ddH2O. Rozpocznij reakcję z 7,5 μl [γ-32P]-ATP. Ugasić reakcję za pomocą 2,5 μL 325 mM H3PO4.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Natychmiast umieść stłumione reakcje na lodzie, aż wszystkie reakcje zostaną zakończone. 
		UWAGA: Aby zmaksymalizować wydajność, zaleca się inicjowanie jednej reakcji co 15 lub 20 s, aż wszystkie reakcje zostaną zainicjowane, a po upływie pożądanego czasu reakcji wygaszać jedną reakcję co 15 lub 20 s, aż wszystkie zostaną wygaszone. Dla tych, którzy używają testu po raz pierwszy, dłuższy odstęp może być łatwiejszy do opanowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Plamienie wygaszonych reakcji na nitrocelulozie
<ol>
	<li>Rozpocznij odkurzanie w 96-dołkowym aparacie do igłowania plam
	<ol>
		<li>Umieścić wstępnie zmontowany 96-dołkowy aparat do pomiaru plam punktowych (sekcja 1.7) w pojemniku wtórnym. Pojemnik ten powinien być wystarczająco duży, aby aparat można było łatwo zdemontować, ponieważ aparat i membrana będą radioaktywne po użyciu.</li>
		<li>Zastosuj próżnię do 96-dołkowego aparatu do igłówek.</li>
		<li>Gdy aparat znajdzie się pod próżnią, ostrożnie odpipetować wygaszoną reakcję bezpośrednio na membranę nitrocelulozową w każdym dołku. Powtarzaj, aż wszystkie reakcje zostaną załadowane na membranę. Ponieważ zdolność wiązania nitrocelulozy (75 - 110 μg/cm2) jest większa niż ilość kinazy histydynowej, która jest wykrywana, można założyć, że prawie cała kinaza wiąże się z błoną, gdy jest prawidłowo załadowana. 
		UWAGA: W zależności od używanej aparatury należy uważać, aby nie przebić nitrocelulozy. Zauważ, że cała reakcja miała kontakt z nitrocelulozą. Łatwo jest, aby część lub całość reakcji przykleiła się do ścian studni i nie dotarła do nitrocelulozy.</li>
		<li>Umyć studzienki 100 μl lodowatego roztworu o natężeniu 25 mM H3PO4. Pozwoli to na dotarcie do membrany dowolnej objętości reakcji, która mogła zostać uwięziona w studni, zapewniając pełne obciążenie wszystkich reakcji. Pozwól, aby cała objętość przepłynęła przez membranę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Demontaż aparatury i transfer membrany nitrocelulozowej
	<ol>
		<li>Ostrożnie zdemontuj urządzenie przed wyłączeniem odkurzacza. Należy pamiętać, że zarówno aparatura, jak i membrana nitrocelulozowa są w tym czasie radioaktywne. W tym czasie nie wyjmuj żadnych elementów urządzenia z pojemnika wtórnego.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieść membranę nitrocelulozową z aparatu do pojemnika o pojemności około 200 ml 25 mM lodowategoH3PO4. Umieść pokrywkę na tym pojemniku, ponieważ pranie będzie radioaktywne. W tym momencie próżnia może zostać wyłączona.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przetwarzanie nitrocelulozy
<ol>
	<li>Mycie nitrocelulozy
	<ol>
		<li>Umieść pojemnik z membraną myjącą na bujaku. Pozwól membranie delikatnie się kołysać przez 20 minut.</li>
		<li>Po 20 minutach ostrożnie zdekantować zużyty roztwór myjący do dużego wiadra, które będzie używane do tymczasowego przechowywania odpadów. Dodać 200 ml lodowatego 25 mM H3PO4 do membrany i powtórzyć. 
		UWAGA: Konieczne są co najmniej trzy 20-minutowe płukania, aby usunąć sygnał tła [γ-32P]-ATP z membrany. Po trzecim płukaniu przetestuj zużyty roztwór płuczący pod kątem promieniowania za pomocą licznika Geigera. Kontynuuj mycie membrany zgodnie z powyższym opisem, aż w roztworze myjącym nie będzie żadnego sygnału.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Suszenie nitrocelulozy
	<ol>
		<li>Po wystarczającym umyciu membrany pozostaw ją do krótkiego wyschnięcia na powietrzu. Zwykle trwa to 5 minut lub mniej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Narażenie na ekran fosforowy do przechowywania
Uwaga: Ta sekcja jest opcjonalna. Wystawienie membrany na działanie ekranu luminoforowego jest korzystne, ponieważ pozwala na wizualizację intensywności kinazy znakowanej radioaktywnie w każdym miejscu na membranie. Względna intensywność tych plam jest wprost proporcjonalna do ilości fosforylowanej kinazy histydynowej w każdym punkcie. Intensywność można określić ilościowo za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu, a wyniki te można porównać z wynikami wygenerowanymi w sekcji 7. Ponadto ten krok pozwala na kontrolę jakości. Nieprawidłowości widoczne w tym skanie mogą wyjaśniać nieregularne wyniki uzyskane z liczenia scyntylacyjnego.
<ol>
	<li>Przygotowanie sita fosforowego
	<ol>
		<li>Przed wystawieniem membrany na działanie ekranu fosforowego do przechowywania, należy wystawić ekran luminoforowy na działanie białego światła przez co najmniej 5 minut. Gwarantuje to, że wszelkie szczątkowe obrazy, które mogą być przechowywane na ekranie, zostaną usunięte.</li>
		<li>Upewnij się, że ekran jest czysty i suchy. W razie potrzeby delikatnie wyczyść ekran roztworem do czyszczenia ekranu fosforowego zatwierdzonym przez producenta ekranu i wytrzyj do sucha.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie membrany nitrocelulozowej
	<ol>
		<li>Ostrożnie owiń suchą membranę nitrocelulozową cienką folią, aby zapobiec uszkodzeniu ekranu fosforowego przez resztki wilgoci. Upewnij się, że nie ma zmarszczek ani pęcherzyków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Narażenie na ekran luminoforowy
	<ol>
		<li>Umieść owiniętą membranę nitrocelulozową w kasecie z ekranem fosforowym do przechowywania, umieść ekran ekranem do dołu na membranie i zamknij kasetę. Nie otwieraj kasety ani nie przesuwaj membrany, dopóki nie nadejdzie czas na zeskanowanie ekranu luminoforowego, ponieważ przesunięcie membrany podczas ekspozycji spowoduje uchwycenie podwójnego lub rozmazanego obrazu.</li>
		<li>Eksponuj przez co najmniej 4 godziny lub tak długo, jak sugeruje producent ekranu fosforowego.</li>
		<li>Po zakończeniu naświetlania zeskanuj ekran luminoforowy i uchwyć obraz za pomocą skanera luminoforowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Przygotowanie membrany nitrocelulozowej do zliczania scyntylacyjnego
<ol>
	<li>Barwienie i odbarwianie Pąsek S
	<ol>
		<li>Membranę nitrocelulozową na krótko zanurzyć w roztworze barwiącym Ponceau S (0,1% Ponceau S (w/v) w 5% kwasie octowym) na 1 - 2 minuty. Przed odbarwieniem zwilż całą membranę barwnikiem.</li>
		<li>Zdekantować nadmiar Ponceau S z membrany.</li>
		<li>Przepłukać membranę ddH2O, aż tylko plamki z kinazy histydynowej zostaną zabarwione. Należy pamiętać, że ta procedura zadziała tylko wtedy, gdy wszystkie plamki zawierają wykrywalne ilości białka. 
		UWAGA: Ten krok jest konieczny, aby potwierdzić, że kinaza jest związana z nitrocelulozą i że obciążenie białkami jest równomierne we wszystkich miejscach. Pozwala również na łatwe odcięcie kinazy plamistej od błony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wycinanie plam
	<ol>
		<li>Za pomocą nożyczek wytnij każde miejsce na membranie nitrocelulozowej. Nie jest konieczne idealne cięcie wzdłuż krawędzi poplamionego miejsca; Jeśli membrana została wystarczająco umyta, tło ze względu na różną wielkość wyciętych miejsc będzie znikome. Ważne jest tylko, aby wyciąć całe miejsce dla każdej reakcji.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś każde miejsce do fiolek scyntylacyjnych. Nie jest konieczny koktajl scyntylacyjny, ponieważ 32P jest łatwo wykrywalny przez promieniowanie Czerenkowa. 
		UWAGA: Alternatywnie miejsce można wyciąć za pomocą zaostrzonego świdra korkowego. Usuń każde miejsce z nitrocelulozy za pomocą świdra korkowego i wepchnij je do fiolki scyntylacyjnej za pomocą szpilki. Dzięki tej metodzie membrany nie trzeba dotykać, co dodatkowo minimalizuje narażenie na promieniowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie CPM/pmol roztworu [γ-32P]-ATP
	<ol>
		<li>Umieścić kilka rozcieńczeń roztworu [γ-32P]-ATP (sekcja 1.5) na kwadratach nitrocelulozy o wymiarach 1 cm x 1 cm. Krótko wysuszyć na powietrzu.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś każdy kwadrat do fiolek scyntylacyjnych. Nie jest konieczny koktajl scyntylacyjny. Próbki te zostaną wykorzystane do wygenerowania krzywej standardowej w celu określenia CPM/pmol roztworu ATP.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Zliczanie scyntylacyjne
<ol>
	<li>Załaduj wszystkie fiolki scyntylacyjne do kaset licznika scyntylacyjnego. Załaduj kasety do licznika scyntylacyjnego.</li>
	<li>Wykonaj program zliczania scyntylacyjnego, aby zmierzyć CPM dla każdej fiolki. Dane te, wraz z CPM/pmol znakowanej radioizotopowo mieszaniny ATP (z sekcji 6.3), mogą być wykorzystane do obliczenia ilości fosforylowanej kinazy histydynowej obecnej w każdym punkcie, a tym samym szybkości autofosforylacji. Rozdział 18,19</li>
</ol>

<ol><li>Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-component+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Two-component signal transduction.</a> Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).</li>
<li>Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histidine+kinases+and+response+regulators+in+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Histidine kinases and response regulators in networks.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15 (2), 118-124 (2012).</li>
<li>Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+modules+in+bacterial+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Communication modules in bacterial signaling proteins.</a> Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).</li>
<li>Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphotransfer+profiling%3A+systematic+mapping+of+two-component+signal+transduction+pathways+and+phosphorelays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays.</a> Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).</li>
<li>Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+domains+in+bacterial+regulatory+proteins+that+respond+to+environmental+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli.</a> Cell. 49 (5), 579-581 (1987).</li>
<li>Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+sensor+histidine+kinase+controlled+by+transmembrane+helix+interactions+with+its+auxiliary+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (15), 5891-5896 (2008).</li>
<li>Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shewanella+oneidensis+MR-1+H-NOX+regulation+of+a+histidine+kinase+by+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide.</a> Biochemistry. 46 (48), 13677-13683 (2007).</li>
<li>Zhulin, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+superfamily+of+chemotaxis+transducers%3A+from+physiology+to+genomics+and+back%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Microb.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back.</a> Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).</li>
<li>Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+two+components%3A+a+novel+kinase+and+a+regulatory+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch.</a> Nature Struct. Biol. 7 (8), 626-633 (2000).</li>
<li>Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus+on+phosphohistidine%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+acids%22%5BJournal%5D)">Focus on phosphohistidine.</a> Amino acids. 32 (1), 145-156 (2007).</li>
<li>Kee, J. -M., Muir, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chasing+phosphohistidine%2C+an+elusive+sibling+in+the+phosphoamino+acid+family%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family.</a> ACS Chem. Biol. 7 (1), 44-51 (2012).</li>
<li>Tawa, P., Stewart, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+CheA+Autophosphorylation+and+Dephosphorylation+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions.</a> Biochemistry. 33 (25), 7917-7924 (1994).</li>
<li>Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+mutational+analysis+of+the+PhoQ+histidine+kinase+catalytic+domain.+Insight+into+the+reaction+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism.</a> J. Biol. Chem. 276 (44), 41182-41190 (2001).</li>
<li>Fuhs, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+1-+and+3-Phosphohistidine+Antibodies%3A+New+Tools+to+Study+Histidine+Phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation.</a> Cell. 162 (1), 198-210 (2015).</li>
<li>Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+assay+for+the+quantification+of+histidine+kinase+autophosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 465 (3), 331-337 (2015).</li>
<li>Bradford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 7 (72), 248-254 (1976).</li>
<li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein.</a> Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li>
<li>Funt, B. L., Hetherington, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scintillation+counting+of+beta+activity+on+filter+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Scintillation counting of beta activity on filter paper.</a> Science. 131 (3413), 1608-1609 (1960).</li>
<li>Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+phosphorus-32+and+calcium-45+in+biological+samples+by+%C4%8Cerenkov+and+liquid+scintillation+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Appl.+Radiat.+Isot%22%5BJournal%5D)">Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting.</a> Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31 (6), 371-374 (1980).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany przez nas test wiązania nitrocelulozy ma wiele zalet w porównaniu z dotychczas stosowanymi metodami charakteryzowania kinaz histydynowych. W porównaniu z tradycyjną autoradiografią opartą na SDS/PAGE, nasza metoda jest bardziej przepustowa i mniej czasochłonna. Membrana nitrocelulozowa jest łatwiejsza w obsłudze niż żele SDS i nie wymaga mocowania. Pąsowanie nitrocelulozy pozwala na uwidocznienie plam białkowych. Zapewnia to łatwy sposób na wycięcie każdego miejsca do zliczania scyntylacyjnego i określenie, czy o...

Odpowiedź adaptacyjna jest kluczowa dla przetrwania bakterii. Aby wykryć zmiany środowiskowe i zareagować na nie, bakterie wykorzystują system bodziec-odpowiedź znany jako sygnalizacja dwuskładnikowa. 1,2 W typowym układzie dwuskładnikowym kinaza histydynowa wykrywa bodziec pokrewny, autofosforyluje swoją konserwatywną resztę histydyny, a następnie przenosi fosforan do konserwatywnej reszty asparaginianowej w domenie odbiorczej białka regulatora odpowiedzi. 3 Zdarzenie to wywołuje zmianę w aktywności regulatora odpowiedzi, co stymuluje efekt następczy. 4,5 W ten sposób bakterie są w stanie wyczuwać i przystosowywać się do zmian w lokalnym środowisku. Niektóre dwuskładnikowe systemy sygnalizacji odbiegają od tego archetypu. W niektórych przypadkach domena czuciowa kinazy histydynowej jest samodzielnym białkiem, które bezpośrednio wykrywa bodźce sensoryczne i modyfikuje aktywność kinazy poprzez interakcję białko-białko. 6-8 Podstawowy proces i ogólna rola systemu pozostają jednak takie same. Sygnalizacja dwuskładnikowa to wszechobecny system bodziec-odpowiedź, który jest niezbędny do przetrwania bakterii, a kinazy histydynowe odgrywają kluczową rolę w transdukcji sygnału. 9
Pomimo znaczenia kinaz histydynowych dla biologii bakteryjnej, pozostają one słabo scharakteryzowane. Wynika to z nieodłącznej niestabilności fosfohistydyny i braku praktycznej metody pomiaru autofosforylacji. Fosfohistydyna jest bardziej labilna niż fosfoseryna, fosfotreonina i fosfotyrozyna. 10 W związku z tym techniki, które są powszechnie stosowane do analizy kinaz Ser/Thr/Tyr, nie mają zastosowania do kinaz histydynowych. 11 Testy in vitro mające na celu badanie kinaz histydynowych były w dużej mierze ograniczone do autoradiografii SDS-PAGE. 12,13 W tej metodzie [γ-32P]-ATP inkubuje się z kinazą, a fosforylację kinazy analizuje się za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE), a następnie autoradiografii żelu. Metoda ta może być stosowana do monitorowania autofosforylacji kinazy, a także fosfotransferu z kinazy do regulatora odpowiedzi. Jednak ta metoda ma znaczące wady. Testy oparte na PAGE są niskoprzepustowe i czasochłonne. Takie ograniczenia nie sprzyjają charakterystyce białka i ustaleniu jego parametrów kinetycznych. Alternatywna metoda badania kinaz histydynowych, która została niedawno opublikowana, wykorzystuje przeciwciała fosfohistydyny do wykrywania autofosforylacji. 14 Chociaż zaletą tej metody jest rozróżnienie między 1-fosfohistydyną a 3-fosfohistydyną, w zależności od oprzyrządowania użytego do wykrywania, metoda ta może nie oferować dużego zakresu dynamiki ani wysokiej górnej granicy wykrywalności. W związku z tym istnieje potrzeba szybszego, mniej pracochłonnego i bardziej czułego testu, który można wykorzystać do badania tych ważnych białek.
Tutaj opisujemy i demonstrujemy starannie opracowany test wiązania nitrocelulozy, który może być użyty do ilościowego określenia autofosforylacji oczyszczonych bakteryjnych kinaz histydynowych in vitro. Ten test jest bardziej przepustowy i mniej czasochłonny niż testy oparte na PAGE. Metoda wykorzystuje również promieniowanie Czerenkowa do ilościowego oznaczania fosfohistydyny, co zapewnia wysoką górną granicę wykrywalności i duży zakres dynamiki. Test może być wykorzystany do określenia parametrów kinetycznych dla kinaz histydynowych.

<table><tbody><tr><td>Kwas fosforowy</td><td>VWR</td><td>AAAA18067-AP</td><td>Do reakcji hartowania i płukania nitrocelulozy</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>RPI</td><td>T60040-5000.0</td><td>Tris-HCl pH 8,0, do buforu reakcji kinazy</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>RPI</td><td>P41000-2500.0</td><td>Do buforu reakcyjnego kinazy</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>RPI</td><td>M24000-500.0</td><td>Do buforu reakcyjnego</td></tr> <tr><td>kinazyGlicerol</td><td>RPI</td><td>G22020-4000.0</td><td>Do buforu reakcji kinazy</td></tr><tr><td>5'-ATP</td><td>Promega</td><td>E6011</td><td>Podłoże kinazy</td></tr><tr><td>[&gamma;-32P]-5'-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002Z250UC&nbsp;</td><td>6 000 Ci/mmol</td></tr><tr><td>96-dołkowy aparat do igłowania plam</td><td>Bio-rad</td><td>1706545</td><td>Do reakcji plamienia</td></tr><tr><td>Nitroceluloza</td><td>Whatman</td><td>32-10401396-PK</td><td>Do reakcji plamienia</td></tr><tr><td>Pąsik S</td><td>Sigma aldrich</td><td>P3504-50G</td><td>Do barwienia nitrocelulozy</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja autofosforylacji bakteryjnej kinazy histydynowej przy użyciu testu wiązania nitrocelulozy

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Pokazujemy użyteczną metodę ilościowego określania autofosforylacji oczyszczonych bakteryjnych kinaz histydynowych. Kinazy histydynowe są znane ze swojego udziału w dwuskładnikowej transdukcji sygnału, wszechobecnym systemie, za pomocą którego bakterie wyczuwają i reagują na bodźce środowiskowe. Sygnalizacja dwuskładnikowa charakteryzuje się autofosforylacją kinazy histydyny, po której następuje fosfotransfer do domeny odbiorczej białka regulatora odpowiedzi, co ostatecznie prowadzi do odpowiedzi wyjściowej. Autofosforylacja kinazy histydynowej reaguje na obecność pokrewnego bodźca środowiskowego, dając w ten sposób bakteriom środki do wykrywania i reagowania na zmiany w środowisku. Pomimo ich znaczenia w biologii bakteryjnej, kinazy histydynowe pozostają słabo poznane ze względu na wrodzoną labilność fosfohistydyny. Konwencjonalne metody badania tych białek, takie jak autoradiografia SDS-PAGE, mają istotne wady. Opracowaliśmy test wiązania nitrocelulozy, który można wykorzystać do scharakteryzowania kinaz histydynowych. Protokół tego testu jest prosty i łatwy do wykonania. Nasza metoda jest bardziej przepustowa, mniej czasochłonna i oferuje większy zakres dynamiczny niż autoradiografia SDS-PAGE.

Wygenerowano reprezentatywny zestaw danych obejmujący obraz zarejestrowany za pomocą obrazownika fosforowego (Rycina 1), barwienie membrany nitrocelulozowej Ponceau S (Rycina 2) oraz dane z licznika scyntylacyjnego (Rycina 3). Rycina 3A przedstawia stałe kinetyczne enzymu na wykresie Lineweavera-Burka. Wyniki te uzyskano z wykorzystaniem oczyszczonej histydynowej kinazy z gram-ujemnego gatunku Vibrio parahaemolyticus ...

Przedstawiamy i demonstrujemy zoptymalizowany test wiązania nitrocelulozy, który może być użyty do ilościowego określenia autofosforylacji oczyszczonych bakteryjnych kinaz histydynowych. Nasza metoda ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi technikami opartymi na SDS-PAGE, stanowiąc cenną alternatywę dla charakterystyki tych ważnych białek.

Kwantyfikacja autofosforylacji bakteryjnej kinazy histydynowej przy użyciu testu wiązania nitrocelulozy

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest ilościowe określenie autofosforylacji oczyszczonych bakteryjnych kinaz histydynowych. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu sygnalizacji dwuskładnikowej, takie jak wpływ cognatywnych bodźców w oddziaływaniach białko-białko na autofosforylację kinaz histydynowych.Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest to metoda o wysokiej przepustowości, która umożliwia dokładne wykrywanie pikomoli powstałej fosfohistydyny oraz wyznaczanie parametrów kinetycznych dla kinaz histydynowych. Jako stażysta podoktorski wykorzystuję filtrację na membranach nitrocelulozowych do ilościowego oznaczania związanych z białkami ligandów radioaktywnych. W związku z tym zasadne było opracowanie podobnej techniki do ilościowego oznaczania fosforylacji histydyny w bakteryjnych kinazach histydynowych.Rozpocznij tę procedurę od przygotowania odczynników i materiałów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować aparat do dot-blotu z 96 dołkami, wytnij fragment membrany nitrocelulozowej o wymiarach 8 cm na 12 cm. Umieść membranę nitrocelulozową w aparacie do dot-blotu.Należy upewnić się, że membrana przylega w taki sposób,

quantification-bacterial-histidine-kinase-autophosphorylation-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje czułą technikę fosforylacji białek za pomocą testu ściągania pojedynczej cząsteczki. Funkcjonalizacja glikolu polietylenowego-biotyny i zastosowanie znakowanych przeciwciał zwiększa wykrywalność fosforylowanej tyrozyny ze swoistością.

Test jednocząsteczkowy pull-down do analizy fosforylacji białek: wysokoprzepustowa technika ilościowego określania fosforylacji białek w lizacie komórkowym

Ten film demonstruje różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego - techniki systematycznego, wysokoprzepustowego badania przesiewowego białek wiążących drugi przekaźnik nukleotydów wewnątrzkomórkowych. Technika ta pozwala na bezpośrednie wiązanie przekaźników z nadekspresyjnym białkiem docelowym w lizacie komórkowym - z pominięciem konieczności oczyszczania białka.

Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego: wysokoprzepustowa technika identyfikacji wewnątrzkomórkowych białek wiążących drugi przekaźnik nukleotydu bakteryjnego

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Protokół tutaj opisuje interakcje oczyszczonego białka kanału jonowego hEAG1 z małocząsteczkowym ligandem lipidowym fosfatydyloinozytolem 4,5-bisfosforanem (2). Pomiar pokazuje, że BLI może być potencjalną metodą badań przesiewowych ligandów kanałów jonowych małych cząsteczek.

Uchwycenie kinetyki oddziaływania białka kanału jonowego z małymi cząsteczkami za pomocą testu interferometrii biowarstwowej

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest aktywowana w fazie G2 cyklu komórkowego i reguluje wiele szlaków komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu kinazy in vitro z Cdk1, który umożliwia identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w celu ustalenia celów komórkowych tej ważnej kinazy.

Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną i wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej radioznakowanych substratów i produktów do badania aktywności enzymatycznej in vitro. Test aktywności enzymatycznej ma szerokie zastosowanie do dowolnej kinazy, cyklazy nukleotydowej lub reakcji przenoszenia fosforu, której mechanizm obejmuje hydrolizę trifosforanu nukleotydów.

Test oczyszczania i aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile

Deacetylazy histonowe klasy 1 (HDAC), takie jak RpdA, zyskały na znaczeniu jako potencjalne cele w leczeniu infekcji grzybiczych. W tym miejscu przedstawiamy protokół specyficznego wzbogacania RpdA znakowanego TAP w połączeniu z testem aktywności HDAC, który umożliwia badanie skuteczności in vitro inhibitorów deacetylazy histonowej.

Jednoetapowe wzbogacanie deacetylazy histonowej znakowanej TAP grzyba nitkowatego Aspergillus nidulans do oznaczania aktywności enzymatycznej

Scharakteryzowaliśmy nowe białko kinazy za pomocą solidnych podejść biochemicznych: analiza Western Blot z dedykowanym specyficznym przeciwciałem na różnych liniach komórkowych i tkankach, interakcje za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją, aktywność kinazy wykryta przez Western Blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosfy oraz znakowanie γ[32P] ATP.

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Ten protokół opisuje nieradioaktywny test do pomiaru aktywności kinaz polinukleotydowych (PNK) na małych substratach DNA i RNA.

Test nieradioaktywny do pomiaru fosforylacji polinukleotydów małych substratów nukleotydowych

Obecny protokół opisuje przygotowanie próbki i analizę danych w celu ilościowego określenia fosforylacji białek za pomocą ulepszonego testu ściągania pojedynczych cząsteczek (SiMPull).

Zoptymalizowany test typu pull-down dla pojedynczych cząsteczek do ilościowego oznaczania fosforylacji białek

Szybkie i dokładne testy chemiczne do badań przesiewowych pod kątem określonych inhibitorów są ważnym narzędziem w arsenale rozwoju leków. Tutaj przedstawiamy skalowalny test chemiczny acetylu do pomiaru hamowania aktywności acetylacji HAT1.

Test chemiczny Acetyl-Click do pomiaru acetylacji acetylotransferazy histonowej 1

Naucz się kwantyfikować autofosforylację bakteryjnych kinaz histydynowych za pomocą testu wiązania nitrocelulozy. Ta metoda umożliwia wykrywanie pikomoli fosfohistydyny i określanie parametrów kinetycznych.

Kwantyfikacja autofosforylacji bakteryjnej kinazy histydynowej przy użyciu testu wiązania nitrocelulozy

Przeglądaj więcej filmów