PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem bezpośrednim jako wysoce czuła metoda wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości
29 marca 2017
Blokowanie PCR typu dzikiego, a następnie sekwencjonowanie bezpośrednie, oferuje bardzo czułą metodę wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości w różnych typach próbek.
Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości w różnych typach próbek. Metodologia ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w testowaniu mutacji somatycznych, ułatwiając wykrywanie mutacji o bardzo niskiej częstotliwości. Tutaj będziemy szukać mutacji w genie myd88 w próbkach szpiku kostnego.
Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza bardzo dokładnych i czułych informacji o obecności mutacji somatycznych, nawet przy bardzo małej liczbie komórek nowotworowych. Ten test sekwencjonowania PCR oparty na blokowaniu typu dzikiego został opracowany w celu amplifikacji części eksonu piątego w genie myd88, zapewniając pokrycie hotspotu L265. Startery do przodu i do tyłu zostały zaprojektowane z pięcioma sekwencjami głównymi M13, aby umożliwić klęczenie uzupełniających starterów sekwencjonowania.
Zaprojektuj oligonukleotyd blokujący tak, aby miał około 10 do 15 zasad długości i był komplementarny do szablonu typu dzikiego, w którym pożądane jest wzbogacenie mutantów. Krótszy oligo poprawi dyskryminację w niedopasowaniu. Aby osiągnąć wysoką swoistość docelową, ważne jest, aby nie używać zbyt dużej ilości nukleotydów blokujących, ponieważ spowoduje to powstanie bardzo lepkich oligonukleotydów.
Aby zaprojektować oligonukleotyd blokujący, zacznij od przejścia do strony internetowej Oligo Tools. Wybierz narzędzie do przewidywania Oligo TM. Otworzy się nowe okno.
Wklej sekwencję szablonu typu wild, który ma zostać zablokowany, do pola sekwencji oligo. Dodaj znak plus przed podstawami blokującymi, aby je oznaczyć. Kliknij przycisk obliczania, aby określić przybliżoną TM hybrydy blokującej DNA.
Obliczone temperatury topnienia pojawią się w poniższych polach. Zaprojektuj oligo blokującego tak, aby miał temperaturę topnienia od 10 do 15 stopni Celsjusza wyższą od temperatury rozciągania podczas termocyklingu. Tutaj temperatura przedłużenia wynosi 72 stopnie Celsjusza.
Aby dostosować temperaturę topnienia, dodaj, usuń lub zastąp zasady blokujące. Unikaj długich odcinków od trzech do czterech blokujących podstawy C lub G. Następnie, aby uniknąć tworzenia się struktury drugorzędowej lub samorozmycia, wróć do ekranu głównego witryny Oligo Tools i wybierz narzędzie Oligo Optimizer.
Otworzy się nowe okno. Wklej sekwencję szablonu typu wild, który ma zostać zablokowany, w polu. Dodaj znak plus, aby wskazać bazy blokujące.
Zaznacz dwa pola dla struktury drugorzędowej i tylko dla siebie, a następnie naciśnij przycisk analizy, aby zobaczyć wyniki hybrydyzacji i struktury drugorzędowej. Wyniki te reprezentują bardzo przybliżone szacunki temperatur topnienia odpowiednio dimerów własnych i struktur drugorzędowych. Niższe wyniki są optymalne i można je osiągnąć, ograniczając parowanie blokerów.
Usuń lub zmień położenie nukleotydów blokujących, aby osiągnąć niższe wyniki. Pokazany tutaj zoptymalizowany blokujący oligonukleotyd dla myd88 zapewnia równowagę między temperaturą topnienia hybrydowego blokera DNA a wystarczająco niskimi wynikami hybrydyzacji i struktury drugorzędowej. Został zaprojektowany, aby objąć aminokwasy od Q262 do I266 i zawiera trzy pierwsze odwrócone DT, które hamują zarówno wydłużanie przez polimerazę DNA, jak i degradację przez trzy pierwsze egzonukleazy.
Po zaprojektowaniu starterów należy skonfigurować PCR blokujący typ dziki i przeprowadzić termocykling, jak opisano w dołączonym dokumencie. Wyjmij kulki magnetyczne z miejsca przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza i doprowadź je do temperatury pokojowej. Przenieś 10 mikrolitrów produktu PCR na nową płytkę PCR.
Energicznie wiruj kulki magnetyczne, aby całkowicie zawiesić cząstki magnetyczne, a następnie dodaj 18 mikrolitrów kulek magnetycznych do każdej studzienki na nowej płytce. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Po inkubacji umieścić płytkę PCR na bocznej płytce magnetycznej na dwie minuty, aby oddzielić kulki od roztworu. Użyj pipety wielokanałowej, aby zassać supernatant. Uważaj, aby uniknąć granulki kulek.
Następnie dozuj 150 mikrolitrów 70% etanolu do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 sekund. Następnie odessać etanol za pomocą pipety wielokanałowej i wyrzucić końcówki. Powtórz tę procedurę prania jeszcze raz.
Za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 20 mikrolitrów odessaj pozostały etanol z każdej studzienki i wyrzuć końcówki. Po odczekaniu około 10 minut, aż dołki płytki wyschną, wyjmij ją z magnesu i dodaj 40 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do każdej studzienki. Pipetować w górę i w dół 15 razy, aby wymieszać.
Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Po inkubacji umieść płytkę PCR z powrotem na płytce magnetycznej na jedną minutę, aby oddzielić kulki od roztworu. Przenieść 35 mikrolitrów oczyszczonego produktu na nową płytkę PCR i przeprowadzić sekwencjonowanie dwukierunkowe zgodnie z opisem w dokumencie towarzyszącym.
Po przeprowadzeniu sekwencjonowania dwukierunkowego w celu oczyszczenia produktów sekwencjonowania należy przygotować świeży roztwór w 25 roztworze trójmolowego octanu sodu o pH 5,2 i 100% etanolu. Przygotuj również świeży roztwór 70% etanolu. Do każdej studzienki zarówno płytki sekwencjonowania do przodu, jak i do tyłu, dodaj 30 mikrolitrów octanu sodu w 100% etanolu i pipetuj w górę iw dół pięć razy, aby wymieszać.
Następnie ponownie zamknij płytkę i inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po upływie 20 minut odwirować płytkę w temperaturze 2 250 razy G przez 15 minut. Po odwirowaniu wyjmij uszczelniacz do płytek i odwróć płytkę raz nad pojemnikiem na odpady.
Jeśli talerz zostanie wielokrotnie odwrócony, granulki mogą poluzować się z dna studzienki. Umieść odwróconą płytkę na czystym ręczniku papierowym i odwiruj przy 150 razy G przez jedną minutę. Następnie dodaj 150 mikrolitrów 70% etanolu do każdej studzienki i ponownie zamknij płytkę.
Wirować 2 razy 250 razy G przez pięć minut. Następnie powtórz proces wyjmowania uszczelniacza do płyt i odwracania płytki. Jeśli studzienki nie są całkowicie suche, pozwól im wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej.
Upewnij się, że próbki są chronione przed światłem. Gdy studzienki całkowicie wyschną, dodaj 10 mikrolitrów formamidu do każdej studzienki i pipetuj w górę iw dół 10 razy, aby wymieszać. Ponownie uszczelnij płytkę.
Denaturacja za pomocą termocyklera w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez trzy minuty, a następnie cztery stopnie Celsjusza przez pięć minut. Po denaturacji należy wymienić uszczelniacz płytek na przegrodę i ułożyć na platformie sekwencjonującej zgodnie z instrukcjami producenta. Korzystając z oprogramowania do analizy sekwencji, wizualizuj ślady i dopasuj sekwencje do odpowiednich sekwencji referencyjnych.
Dopasuj myd88 do sekwencji referencyjnej NCBI NM002468. Genomowe DNA od pacjentów z mutacjami i bez mutacji poddano działaniu PCR blokującym zarówno konwencjonalnie, jak i metodą dzikią, a następnie zsekwencjonowano powstałe produkty PCR. Jak widać tutaj, zmutowany allel został wzbogacony, gdy przeprowadzono PCR blokujący typ dziki, a wyników fałszywie dodatnich nie zaobserwowano w DNA typu dzikiego.
Charakterystyczny spadek intensywności sygnału, jak pokazano tutaj, jest często obserwowany, jeśli stosuje się zbyt wysokie stężenie blokera lub jeśli oczyszczanie po PCR nie usunęło blokera przed sekwencjonowaniem dwukierunkowym. Dzieje się tak, gdy oczyszczanie enzymatyczne jest wykonywane zamiast oczyszczania kulek magnetycznych. Każdy test oparty na PCR, który wzbogaca o zmutowane allele, wykryje artefakty o niskiej częstotliwości.
Ślady te wskazują na wzrost artefaktów sekwencjonowania CG w stosunku do artefaktów TA w tkance FFPE, gdy cytozyna lub metylowana cytozyna są deaminowane przez formalne ufiksowanie odpowiednio do uracylu lub tiaminy. Glikozylaza DNA uracylu lub UDG może wycinać uracyl przed PCR blokującym typ dziki, pomagając zmniejszyć artefakty sekwencjonowania. Jednak tiamina pochodząca ze zdeaminowanej pięciu cytozyny metylowej, która często występuje na wyspach CPG, nie może być wycinana przez UDG.
Zmniejszenie stężenia blokera stosowanego w PCR blokującym typu dzikiego może pomóc w ograniczeniu występowania artefaktów sekwencjonowania, którym nie zaradzi leczenie UDG. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak testować mutacje somatyczne z dużą dokładnością i czułością, używając techniki blokowania typu dzikiego. Zasada działania tej technologii może być stosowana do wykrywania mutacji w małych subpopulacjach komórek.
Dlatego ma zastosowanie w wykrywaniu minimalnej choroby resztkowej, monitorowaniu pacjentów i przewidywaniu wczesnego nawrotu u pacjentów z różnymi nowotworami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia metodę wykrywania somatycznych mutacji o niskiej częstotliwości z wykorzystaniem PCR z blokowaniem typu dzikiego, a następnie bezpośredniego sekwencjonowania. Technika ta jest szczególnie skuteczna w analizie próbek szpiku kostnego pod kątem mutacji w genie myd88.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Onkologia
- Biologia molekularna
Wstęp
- Mutacje somatyczne mogą występować z niską częstotliwością w różnych tkankach.
- Wykrywanie tych mutacji jest kluczowe dla zrozumienia biologii nowotworów.
- Tradycyjne metody mogą nie posiadać czułości niezbędnej do wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.
- PCR z blokowaniem typu dzikiego oferuje nowatorskie podejście w celu zwiększenia możliwości detekcji.
Cel badania
- W celu poprawy wykrywalności somatycznych mutacji o niskiej częstotliwości.
- W celu specyficznego ukierunkowania na mutacje w genie myd88.
- W celu walidacji skuteczności metody PCR z blokowaniem typu dzikiego.
Zastosowane metody
- Zastosowano blokującą PCR typu dzikiego w celu amplifikacji specyficznych regionów genów.
- Przeprowadzono bezpośrednie sekwencjonowanie w celu identyfikacji mutacji.
- Próbki szpiku kostnego przeanalizowano pod kątem obecności mutacji.
- Zaprojektowano primery, aby zapewnić pokrycie punktu zapalnego L265 w eksonie pięć.
Główne wyniki
- Metoda ta z powodzeniem wykryła mutacje o niskiej częstotliwości w próbkach szpiku kostnego.
- Osiągnięto wysoką czułość i dokładność w identyfikacji mutacji somatycznych.
- Wyniki potwierdziły obecność mutacji w genie myd88.
- Technika ta wykazała potencjał do szerszego zastosowania w testach na obecność mutacji.
Wnioski
- PCR z blokowaniem typu dzikiego jest cennym narzędziem do wykrywania somatycznych mutacji o niskiej częstotliwości.
- Metoda ta może zwiększyć naszą wiedzę na temat zmian genetycznych w nowotworach.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć jej zastosowanie w warunkach klinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wykrywanie somatycznych mutacji o niskiej częstotliwości jest kluczowe dla monitorowania minimalnej choroby resztkowej, identyfikacji pojawiającej się oporności oraz kierowania decyzjami terapeutycznymi w procesie opracowywania leków onkologicznych. Metoda PCR z blokowaniem alleli typu dzikiego zwiększa czułość do poziomu około 1 allelu zmutowanego na 1 000 alleli typu dzikiego, co umożliwia wczesne wykrywanie ewolucji nowotworu. Zdolność ta zwiększa pewność prognostyczną w badaniach przedklinicznych i translacyjnych, umożliwiając wiarygodną ocenę heterogeniczności genetycznej przy ograniczonej ilości materiału wejściowego, takiego jak krążące komórki nowotworowe lub aspiraty z szpiku kostnego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutyków
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wykrywanie rzadkich alleli mutantowych w próbkach heterogenicznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez precyzyjne ilościowe określenie obciążenia mutacjami w modelach przedklinicznych.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność badań nad modulacją celu poprzez zmniejszenie odsetka wyników fałszywie ujemnych w detekcji mutacji.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych wyników sekwencjonowania, które odróżniają rzeczywiste mutacje o niskiej częstotliwości od szumu tła.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wytwarzanie standaryzowanych, powtarzalnych amplikonów wzbogaconych o mutanty, odpowiednich do dalszych etapów procesów sekwencjonowania.
- Użyteczność platformy: Ułatwia skalowalność testu i jego ponowne zastosowanie dla wielu genów docelowych dzięki adaptacyjnemu projektowaniu blokujących oligonukleotydów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia ciągłość translacyjną poprzez wykrywanie mutacji w systemach istotnych dla przebiegu choroby, takich jak próbki szpiku kostnego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia monitorowanie podłużne częstości występowania alleli mutantowych w celu oceny odpowiedzi terapeutycznej oraz pojawiania się oporności.
- Łagodzenie ryzyka: Wspiera przedkliniczne decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając mierzalnych progów ewolucji klonalnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu, przez optymalizację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności, szczególnie w przypadkach, gdy monitorowanie zmian genetycznych determinuje wybór związku.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez umożliwienie wykrywania mutacji somatycznych w wybranych szlakach genowych.
- Przesiewanie: Dostarcza oczyszczone produkty PCR gotowe do analizy, z ograniczoną interferencją typu dzikiego, co zapewnia wiarygodną identyfikację wariantów.
- Analityka: Zapewnia dwukierunkowe odczyty sekwencjonowania, które umożliwiają wizualizację i kwantyfikację specyficzną dla alleli.
- Badania translacyjne: Pozwala na dopasowanie biomarkerów poprzez śledzenie mutacji w klinicznie istotnych typach próbek.
- Zastosowania wielokrotne: Służy jako modułowa platforma detekcyjna, którą można zastosować do wielu onkogenów poza MYD88.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Poprawia pewność predykcyjną w wykrywaniu mutacji i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad opornością.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność analiz dzięki oczyszczaniu na koralikach oraz kontrolowanemu projektowaniu oligonukleotydów blokujących.
- Wartość strategiczna: Pozwala na podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go dzięki możliwości wczesnego wykrywania mutacji odpowiedzialnych za oporność.
- Wpływ na portfolio: Wspiera rozwój dostosowany do ryzyka poprzez identyfikację niskoczęstotliwościowych klonów opornych przed ich ekspansją.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w projektowaniu oligonukleotydów oraz optymalizacji temperatury topnienia w celu skutecznego blokowania typu dzikiego.
- Zależy od dostępu do termocyklerów, systemów oczyszczania koralikami magnetycznymi oraz platform do sekwencjonowania dwukierunkowego.
- Wymaga standaryzacji stężenia blokującego oligonukleotydu w celu zminimalizowania artefaktów sekwencjonowania.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy zastosowaniu do różnych typów próbek, takich jak tkanki FFPE lub biopsje płynne.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, w tym potencjalne pozostałości artefaktów sekwencjonowania wynikających z procesów deaminacji, które nie zostały w pełni usunięte przez uracylową glikozylazę DNA.
