PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem bezpośrednim jako wysoce czuła metoda wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości

Blokowanie PCR typu dzikiego, a następnie sekwencjonowanie bezpośrednie, oferuje bardzo czułą metodę wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości w różnych typach próbek.

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości w różnych typach próbek. Metodologia ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w testowaniu mutacji somatycznych, ułatwiając wykrywanie mutacji o bardzo niskiej częstotliwości. Tutaj będziemy szukać mutacji w genie myd88 w próbkach szpiku kostnego.

Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza bardzo dokładnych i czułych informacji o obecności mutacji somatycznych, nawet przy bardzo małej liczbie komórek nowotworowych. Ten test sekwencjonowania PCR oparty na blokowaniu typu dzikiego został opracowany w celu amplifikacji części eksonu piątego w genie myd88, zapewniając pokrycie hotspotu L265. Startery do przodu i do tyłu zostały zaprojektowane z pięcioma sekwencjami głównymi M13, aby umożliwić klęczenie uzupełniających starterów sekwencjonowania.

Zaprojektuj oligonukleotyd blokujący tak, aby miał około 10 do 15 zasad długości i był komplementarny do szablonu typu dzikiego, w którym pożądane jest wzbogacenie mutantów. Krótszy oligo poprawi dyskryminację w niedopasowaniu. Aby osiągnąć wysoką swoistość docelową, ważne jest, aby nie używać zbyt dużej ilości nukleotydów blokujących, ponieważ spowoduje to powstanie bardzo lepkich oligonukleotydów.

Aby zaprojektować oligonukleotyd blokujący, zacznij od przejścia do strony internetowej Oligo Tools. Wybierz narzędzie do przewidywania Oligo TM. Otworzy się nowe okno.

Wklej sekwencję szablonu typu wild, który ma zostać zablokowany, do pola sekwencji oligo. Dodaj znak plus przed podstawami blokującymi, aby je oznaczyć. Kliknij przycisk obliczania, aby określić przybliżoną TM hybrydy blokującej DNA.

Obliczone temperatury topnienia pojawią się w poniższych polach. Zaprojektuj oligo blokującego tak, aby miał temperaturę topnienia od 10 do 15 stopni Celsjusza wyższą od temperatury rozciągania podczas termocyklingu. Tutaj temperatura przedłużenia wynosi 72 stopnie Celsjusza.

Aby dostosować temperaturę topnienia, dodaj, usuń lub zastąp zasady blokujące. Unikaj długich odcinków od trzech do czterech blokujących podstawy C lub G. Następnie, aby uniknąć tworzenia się struktury drugorzędowej lub samorozmycia, wróć do ekranu głównego witryny Oligo Tools i wybierz narzędzie Oligo Optimizer.

Otworzy się nowe okno. Wklej sekwencję szablonu typu wild, który ma zostać zablokowany, w polu. Dodaj znak plus, aby wskazać bazy blokujące.

Zaznacz dwa pola dla struktury drugorzędowej i tylko dla siebie, a następnie naciśnij przycisk analizy, aby zobaczyć wyniki hybrydyzacji i struktury drugorzędowej. Wyniki te reprezentują bardzo przybliżone szacunki temperatur topnienia odpowiednio dimerów własnych i struktur drugorzędowych. Niższe wyniki są optymalne i można je osiągnąć, ograniczając parowanie blokerów.

Usuń lub zmień położenie nukleotydów blokujących, aby osiągnąć niższe wyniki. Pokazany tutaj zoptymalizowany blokujący oligonukleotyd dla myd88 zapewnia równowagę między temperaturą topnienia hybrydowego blokera DNA a wystarczająco niskimi wynikami hybrydyzacji i struktury drugorzędowej. Został zaprojektowany, aby objąć aminokwasy od Q262 do I266 i zawiera trzy pierwsze odwrócone DT, które hamują zarówno wydłużanie przez polimerazę DNA, jak i degradację przez trzy pierwsze egzonukleazy.

Po zaprojektowaniu starterów należy skonfigurować PCR blokujący typ dziki i przeprowadzić termocykling, jak opisano w dołączonym dokumencie. Wyjmij kulki magnetyczne z miejsca przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza i doprowadź je do temperatury pokojowej. Przenieś 10 mikrolitrów produktu PCR na nową płytkę PCR.

Energicznie wiruj kulki magnetyczne, aby całkowicie zawiesić cząstki magnetyczne, a następnie dodaj 18 mikrolitrów kulek magnetycznych do każdej studzienki na nowej płytce. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Po inkubacji umieścić płytkę PCR na bocznej płytce magnetycznej na dwie minuty, aby oddzielić kulki od roztworu. Użyj pipety wielokanałowej, aby zassać supernatant. Uważaj, aby uniknąć granulki kulek.

Następnie dozuj 150 mikrolitrów 70% etanolu do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 sekund. Następnie odessać etanol za pomocą pipety wielokanałowej i wyrzucić końcówki. Powtórz tę procedurę prania jeszcze raz.

Za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 20 mikrolitrów odessaj pozostały etanol z każdej studzienki i wyrzuć końcówki. Po odczekaniu około 10 minut, aż dołki płytki wyschną, wyjmij ją z magnesu i dodaj 40 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do każdej studzienki. Pipetować w górę i w dół 15 razy, aby wymieszać.

Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Po inkubacji umieść płytkę PCR z powrotem na płytce magnetycznej na jedną minutę, aby oddzielić kulki od roztworu. Przenieść 35 mikrolitrów oczyszczonego produktu na nową płytkę PCR i przeprowadzić sekwencjonowanie dwukierunkowe zgodnie z opisem w dokumencie towarzyszącym.

Po przeprowadzeniu sekwencjonowania dwukierunkowego w celu oczyszczenia produktów sekwencjonowania należy przygotować świeży roztwór w 25 roztworze trójmolowego octanu sodu o pH 5,2 i 100% etanolu. Przygotuj również świeży roztwór 70% etanolu. Do każdej studzienki zarówno płytki sekwencjonowania do przodu, jak i do tyłu, dodaj 30 mikrolitrów octanu sodu w 100% etanolu i pipetuj w górę iw dół pięć razy, aby wymieszać.

Następnie ponownie zamknij płytkę i inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po upływie 20 minut odwirować płytkę w temperaturze 2 250 razy G przez 15 minut. Po odwirowaniu wyjmij uszczelniacz do płytek i odwróć płytkę raz nad pojemnikiem na odpady.

Jeśli talerz zostanie wielokrotnie odwrócony, granulki mogą poluzować się z dna studzienki. Umieść odwróconą płytkę na czystym ręczniku papierowym i odwiruj przy 150 razy G przez jedną minutę. Następnie dodaj 150 mikrolitrów 70% etanolu do każdej studzienki i ponownie zamknij płytkę.

Wirować 2 razy 250 razy G przez pięć minut. Następnie powtórz proces wyjmowania uszczelniacza do płyt i odwracania płytki. Jeśli studzienki nie są całkowicie suche, pozwól im wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej.

Upewnij się, że próbki są chronione przed światłem. Gdy studzienki całkowicie wyschną, dodaj 10 mikrolitrów formamidu do każdej studzienki i pipetuj w górę iw dół 10 razy, aby wymieszać. Ponownie uszczelnij płytkę.

Denaturacja za pomocą termocyklera w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez trzy minuty, a następnie cztery stopnie Celsjusza przez pięć minut. Po denaturacji należy wymienić uszczelniacz płytek na przegrodę i ułożyć na platformie sekwencjonującej zgodnie z instrukcjami producenta. Korzystając z oprogramowania do analizy sekwencji, wizualizuj ślady i dopasuj sekwencje do odpowiednich sekwencji referencyjnych.

Dopasuj myd88 do sekwencji referencyjnej NCBI NM002468. Genomowe DNA od pacjentów z mutacjami i bez mutacji poddano działaniu PCR blokującym zarówno konwencjonalnie, jak i metodą dzikią, a następnie zsekwencjonowano powstałe produkty PCR. Jak widać tutaj, zmutowany allel został wzbogacony, gdy przeprowadzono PCR blokujący typ dziki, a wyników fałszywie dodatnich nie zaobserwowano w DNA typu dzikiego.

Charakterystyczny spadek intensywności sygnału, jak pokazano tutaj, jest często obserwowany, jeśli stosuje się zbyt wysokie stężenie blokera lub jeśli oczyszczanie po PCR nie usunęło blokera przed sekwencjonowaniem dwukierunkowym. Dzieje się tak, gdy oczyszczanie enzymatyczne jest wykonywane zamiast oczyszczania kulek magnetycznych. Każdy test oparty na PCR, który wzbogaca o zmutowane allele, wykryje artefakty o niskiej częstotliwości.

Ślady te wskazują na wzrost artefaktów sekwencjonowania CG w stosunku do artefaktów TA w tkance FFPE, gdy cytozyna lub metylowana cytozyna są deaminowane przez formalne ufiksowanie odpowiednio do uracylu lub tiaminy. Glikozylaza DNA uracylu lub UDG może wycinać uracyl przed PCR blokującym typ dziki, pomagając zmniejszyć artefakty sekwencjonowania. Jednak tiamina pochodząca ze zdeaminowanej pięciu cytozyny metylowej, która często występuje na wyspach CPG, nie może być wycinana przez UDG.

Zmniejszenie stężenia blokera stosowanego w PCR blokującym typu dzikiego może pomóc w ograniczeniu występowania artefaktów sekwencjonowania, którym nie zaradzi leczenie UDG. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak testować mutacje somatyczne z dużą dokładnością i czułością, używając techniki blokowania typu dzikiego. Zasada działania tej technologii może być stosowana do wykrywania mutacji w małych subpopulacjach komórek.

Dlatego ma zastosowanie w wykrywaniu minimalnej choroby resztkowej, monitorowaniu pacjentów i przewidywaniu wczesnego nawrotu u pacjentów z różnymi nowotworami.