Name: PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem bezpośrednim jako wysoce czuła metoda wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Poznaj metodę PCR blokującego typu dzikiego z sekwencjonowaniem bezpośrednim do wykrywania somatycznych mutacji o niskiej częstotliwości w genie myd88 w próbkach szpiku kostnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie testy próbek ludzkich zostały przeprowadzone po uzyskaniu zgody Institutional Review Board (IRB).
1. Ekstrakcja DNA z tkanki FFPE, krwi obwodowej i aspiratu szpiku kostnego
<ol>
	<li>Do tkanki FFPE szpiku kostnego z zestawem do ekstrakcji DNA FFPE
	<ol>
		<li>Zacznij od tkanki FFPE z niebarwionych szkiełek (5 - 10 odcinków o grubości 5 - 10 μm). 
		UWAGA: Jeśli zaczynasz od wiórów tkankowych, użyj 3 - 6 odcinków o grubości 5 - 10 μm i przejdź do kroku 1.1.6.</li>
		<li>Umieść szkiełka w koszu na szkiełka i przygotuj cztery zbiorniki do mycia (dwa na ksylen i dwa na 100% alkohol). Dodać minimalną objętość 600 ml roztworu do każdego koszyka.</li>
		<li>Odparafinować szkiełka, wykonując 5-minutowe mycie ksylenem w pierwszej tacy. Przenieś szkiełka do drugiego zbiornika do mycia ksylenem na dodatkowe 5 minut.</li>
		<li>Po odparafinowaniu myć szkiełka 100% alkoholem przez 5 min. Przenieść szkiełka do drugiego zbiornika do mycia alkoholem na dodatkowe 5 minut.</li>
		<li>Pozostaw szkiełka do całkowitego wyschnięcia pod maską, a następnie zeskrob je żyletką do probówki do mikrowirówki. 
		UWAGA: Jeśli dostępny jest szkiełko H&E ze wskazanym regionem guza, wyrównaj szkiełka i zeskrob tylko obszar guza.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w ulotce producenta dołączonej do zestawu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do aspiratu BM i krwi obwodowej
	<ol>
		<li>Wyodrębnij zgodnie z instrukcjami producenta, ulotką z tymi specyfikacjami. 
		UWAGA: Istnieje wiele dostępnych na rynku zestawów i metod ekstrakcji DNA z tkanek i komórek FFPE. Praktycznie wszystkie mogą być używane. Użyj metody, która została ustalona w laboratorium.
		<ol>
			<li>Użyj 200 μl krwi obwodowej (PB) lub 100 μl BM + 100 μL PBS.</li>
			<li>Użyj 4 μl RNazy A roztworu podstawowego.</li>
			<li>Eluować za pomocą 100 μl buforu elucyjnego.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja DNA
	<ol>
		<li>Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru, zapewniając stosunek 260 nm do 280 nm wynoszący około 1,8 (dla czystego DNA). Jeśli stosunek ten jest znacznie niższy, może to wskazywać na obecność białka, fenolu lub innych zanieczyszczeń, które mogą zakłócać dalsze zastosowania.</li>
		<li>Dostosuj stężenia DNA do około 50 - 100 ng/μl za pomocą odpowiedniego buforu elucyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. PCR blokujący typu dzikiego
<ol>
	<li>Projekt podkładu
	<ol>
		<li>Zaprojektuj i uzyskaj startery dla interesujących genów zgodnie z wcześniej opisanymi ogólnymi wytycznymi projektowania starterów PCR13. Dołącz uniwersalne startery sekwencjonowania M13 do przodu i do tyłu we starterach PCR. 
		UWAGA: Test MYD88 został opracowany w celu amplifikacji eksonu 5 MYD88 (G259 - N291) i 110 nukleotydów znajdujących się w regionie intronowym 5' w celu pokrycia miejsca splicingu i części intronu 4. Startery do przodu i do tyłu zostały zaprojektowane z sekwencją 5'-M13 (M13-forward: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-reverse: cag gaa aca gct atg acc), aby umożliwić wyżarzanie komplementarnych starterów sekwencjonujących (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konstrukcja z zablokowanym oligonukleotydem kwasu nukleinowego
	<ol>
		<li>Zaprojektuj oligonukleotyd blokujący tak, aby miał około 10 - 15 zasad długości i był komplementarny z matrycą WT, w której pożądane jest wzbogacenie mutantów. 
		UWAGA: Krótszy oligo poprawi dyskryminację niedopasowania. Aby osiągnąć wysoką swoistość docelową, ważne jest, aby nie używać zbyt dużej ilości nukleotydów blokujących, ponieważ może to spowodować bardzo "lepki" oligonukleotyd. Zawartość i długość oraz nukleotyd blokujący powinny być zoptymalizowane w zależności od konkretnego nukleotydu, który należy zablokować. Ważne jest, aby osiągnąć wysoką specyficzność wiązania bez naruszania struktury drugorzędowej i ryzyka samokomplementarności.</li>
		<li>Zaprojektuj oligo blokującego tak, aby jego temperatura wynosiła 10–15 °C powyżej temperatury rozciągania podczas termocyklingu. DostosujTM, dodając lub usuwając zasady blokujące lub zastępując zasady blokujące DNA, unikając długich odcinków (3 - 4 zasady) blokowania zasad G lub C.
		<ol>
			<li>Przejdź do strony internetowej oligo tools (patrz Spis materiałów) i wybierz narzędzie "blocking Oligo Tm Prediction".</li>
			<li>Wklej sekwencję szablonu WT, która ma zostać zablokowana, w polu "Sekwencja oligo". Dodaj znak "+" przed podstawami, aby wskazać podstawy blokujące.</li>
			<li>Wybierz przycisk "Oblicz", aby określić przybliżoną Tm hybrydy DNA-Blocker.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zaprojektuj oligo blokującego, aby uniknąć tworzenia się struktur drugorzędowych lub samo-dimerów.
		<ol>
			<li>Wejdź na stronę oligo tools (patrz Spis materiałów) i wybierz narzędzie "blokowanie Oligo Optimizer".</li>
			<li>Wklej sekwencję szablonu WT, która ma zostać zablokowana, do pola. Dodaj znak "+" przed podstawami, aby wskazać podstawy blokujące.</li>
			<li>Zaznacz dwa pola "Struktura drugorzędna" i "Tylko własna". Naciśnij przycisk Analizuj, aby przejrzeć oligo pod kątem potencjalnie kłopotliwych struktur drugorzędowych lub samo-dimerów. 
			UWAGA: Wyniki reprezentują bardzo przybliżone szacunkiTM struktur drugorzędowych i samo-dimerów. Niższe wyniki są zatem optymalne i można je osiągnąć, ograniczając parowanie bloker-bloker. Oligonukleotyd blokujący dla MYD88 [MYD88blocker (TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/)] został zaprojektowany tak, aby pokrywać aminokwasy Q262-I266 i zawiera odwrócony przez 3' dT, który hamuje zarówno wydłużanie przez polimerazę DNA, jak i degradację przez 3'-egzonukleazę. Ten specyficzny oligo blokujący to 17mer z 10 zasadami blokującymi, które są oznaczone jako "+N". Pozostałe 7 zasad to zwykłe nukleotydy DNA.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja WTB-PCR i termocykl
	<ol>
		<li>Przygotuj główną mieszankę WTB-PCR (MMX) przy użyciu 2,5 μl buforu reakcyjnego PCR 10x z 20 mM MgCl2, 250 μM dNTP, 0,2 μM startera do przodu i do tyłu, 1,2 μM MYD88bloker i DNAzy, wolnego od RNAse, ultraczystegoH2O, aby uzyskać końcową objętość roztworu 21,75 μl na reakcję. 
		UWAGA: Stężenia robocze dotyczą końcowej objętości reakcji wynoszącej 25 μl (po dodaniu matrycy DNA i polimerazy). Konwencjonalny PCR MMX przygotowuje się po prostu pomijając dodanie blokera. Wszystkie kroki protokołu pozostają identyczne zarówno dla WTB, jak i konwencjonalnego PCR. Można to wykorzystać do walidacji i określenia wzbogacenia osiągniętego przez dodanie blokera.
		<ol>
			<li>Obliczając ilość MMX do przygotowania, należy wziąć pod uwagę 3 dodatkowe reakcje (kontrole dodatnie i ujemne oraz kontrolę bez matrycy w celu sprawdzenia zanieczyszczenia) i co najmniej 1 dodatkową reakcję w przypadku błędu pipetowania.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dokładnie przekręć MMX. MMX może być przechowywany w temperaturze -80 °C przez okres do roku.</li>
		<li>Dodać 0,25 μl polimerazy DNA Taq na reakcję do MMX i odwrócić do mieszania. Po dodaniu polimerazy do MMX trzymaj ją na lodzie.</li>
		<li>Umieść nową 96-dołkową płytkę do PCR na zimnej płytce i odpipetuj 22 μl MMX z polimerazą do każdej studzienki reakcyjnej.</li>
		<li>Dodać 3 μl genomowego DNA (50 - 100 ng/μl do każdej z studzienek zawierających MMX z polimerazą.</li>
		<li>Uszczelnij płytkę i odwiruj na krótko, aby upewnić się, że roztwór dotrze do dna każdej studzienki.</li>
		<li>Załaduj płytkę PCR do termocyklera.
		<ol>
			<li>Ustawić warunki termocyklingu dla reakcji WTB-PCR w następujący sposób: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 6 minut; 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 30 s, wyżarzanie startera w temperaturze 56 °C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 min 20 s; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min. 
			UWAGA: Najlepsza praktyka polega na wykonaniu pozostałej części protokołu w fizycznie oddzielonym obszarze, aby uniknąć zanieczyszczenia amplikonem w przyszłych konfiguracjach.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj elektroforezę żelową zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami14 w celu ustalenia, czy WTB-PCR się powiódł i potwierdzenia braku amplifikacji w kontroli bez matrycy.</li>
	<li>Oczyszczanie produktu PCR za pomocą kulek magnetycznych
	<ol>
		<li>Usunąć kulki magnetyczne z 4 °C i doprowadzić do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Przenieś 10 μl produktu PCR na nową płytkę PCR.</li>
		<li>Energicznie wiruj kulki magnetyczne, aby w pełni zawiesić cząstki magnetyczne.</li>
		<li>Dodaj 18 μl kulek magnetycznych do każdego dołka na nowej płytce. Odpipetować 10 razy.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Umieść płytkę PCR na bocznej płytce magnetycznej na 2 minuty, aby oddzielić kulki od roztworu.</li>
		<li>Odessać supernatant za pomocą pipety wielokanałowej, unikając osadu kulkowego.</li>
		<li>Dozować 150 μl 70% etanolu do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 sekund. Odessać etanol za pomocą pipety wielokanałowej i wyrzucić końcówki. Powtórz tę procedurę prania jeszcze raz.</li>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 20 μl odessać pozostały etanol z każdej studzienki i wyrzucić końcówki.</li>
		<li>Po wyschnięciu studzienek (~ 10 min) zdejmij z płytki magnetycznej i dodaj 40 μl wody wolnej od nukleaz do każdej studzienki i pipetuj 15 razy lub delikatnie przemieszaj.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.</li>
		<li>Umieść płytkę PCR na płytce magnetycznej na 1 minutę, aby oddzielić kulki od roztworu.</li>
		<li>Przenieść 35 μl oczyszczonego produktu na nową płytkę PCR. Jest to oczyszczony produkt PCR, który jest teraz gotowy do przeprowadzenia sekwencjonowania dwukierunkowego lub może być przechowywany w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny. 
		UWAGA: Podczas opracowywania nowego testu może być wymagane określenie ilościowe oczyszczonego produktu PCR. Amplikon DNA o stężeniu 1 - 3 ng/μl jest optymalny do sekwencjonowania dwukierunkowego. Jeśli stężenie jest stale niskie, proporcjonalnie zwiększ produkt PCR i kulki magnetyczne (1:1,8). Jeśli stężenie jest stale wysokie, eluuj większą ilością wody.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Sekwencjonowanie produktu WTB-PCR
<ol>
	<li>Sekwencjonowanie dwukierunkowe 
	UWAGA: Poniższy protokół jest zmodyfikowaną formą instrukcji producenta, która została zoptymalizowana pod kątem użycia mniejszej liczby odczynników.
	<ol>
		<li>Przygotuj mieszaniny reakcyjne do sekwencjonowania do przodu i do tyłu z 0,25 μl gotowej mieszanki reakcyjnej, 1,88 μl buforu do sekwencjonowania, 1,78 μM starterów sekwencjonowania M13-F lub M13-R i dodaj i DNAzę, bezlitosną RNAse, ultraczysty H2O, aby uzyskać końcową objętość roztworu 9 μl na reakcję. Ta mieszanina reakcji sekwencjonowania może być przechowywana w temperaturze -20 °C przez okres do roku.</li>
		<li>Odpipetować 9 μl reakcji sekwencjonowania do przodu, wymieszać do każdej studzienki nowej 96-dołkowej płytki PCR w celu przeprowadzenia reakcji sekwencjonowania do przodu. Powtórzyć na oddzielnej płytce dla reakcji odwrotnego sekwencjonowania.</li>
		<li>Dodaj 1 μl oczyszczonego produktu WTB-PCR do każdego dołka zarówno na płytce przedniej, jak i odwrotnej.</li>
		<li>Uszczelnij płytkę i odwiruj na krótko, aby upewnić się, że roztwór dotrze do dna każdej studzienki.</li>
		<li>Załaduj płytkę PCR do termocyklera.
		<ol>
			<li>Ustawić warunki termocyklingu dla reakcji sekwencjonowania w następujący sposób: 96 °C przez 1 minutę; 30 cykli po 96 °C przez 10 s, 50 °C przez 5 s, 60 °C przez 4 minuty; Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu uzyskania gotowości do oczyszczania.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie produktów do sekwencjonowania
	<ol>
		<li>Przygotować świeży roztwór 3 M octanu sodu (pH 5,2) i 100% etanolu w stosunku 1:25.</li>
		<li>Przygotuj świeży 70% roztwór etanolu.</li>
		<li>Dodać 30 μl octanu sodu/100% roztworu etanolu do każdej studzienki zarówno na płytce sekwencjonowania do przodu, jak i do tyłu, a następnie wymieszać pipetami 5 razy.</li>
		<li>Ponownie zamknąć płytkę i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
		<li>Odwirować płytkę o masie 2 250 x g przez 15 minut.</li>
		<li>Wyjmij uszczelniacz do płyt i odwróć pojemnik na odpady. 
		UWAGA: Odwróć tylko raz, w przeciwnym razie pelety mogą poluzować się z dna studzienki.</li>
		<li>Umieść odwróconą płytkę na czystym ręczniku papierowym i odwiruj przy 150 x g przez 1 min.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodać 150 μl 70% etanolu.</li>
		<li>Ponownie zamknąć płytkę i wirować z prędkością 2 250 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.2.6 i 3.2.7.</li>
		<li>Jeśli studzienki nie są całkowicie suche, pozwól im wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że próbki są chronione przed światłem podczas suszenia.</li>
		<li>Dodać 10 μl formamidu do każdego dołka i wymieszać pipetą 10 razy. Ponownie uszczelnij płytkę.</li>
		<li>Denaturacja na termocyklerze w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie 4 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Po denaturacji należy wymienić uszczelniacz płytek na przegrodę i ułożyć na platformie sekwencjonowania zgodnie z instrukcjami producenta15.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza wyników sekwencjonowania
<ol>
	<li>Wizualizuj ślady sekwencjonowania za pomocą oprogramowania do analizy danych sekwencjonowania zgodnie z instrukcjami producenta16 i wyrównaj do odpowiednich sekwencji referencyjnych. Dopasuj MYD88 do sekwencji referencyjnej NCBI "NM_002468".</li>
</ol>

<ol><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/96/16/9236.abstract">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+methods+for+the+enrichment+of+minority+alleles+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations.</a> Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).</li>
<li>Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+and+high+sensitivity+test+for+MYD88+mutations+using+locked+nucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Lab+Hematol%22%5BJournal%5D)">Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid.</a> Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).</li>
<li>Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+blocking+polymerase+chain+reaction+for+detection+of+single+nucleotide+minority+mutations+from+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens.</a> Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).</li>
<li>Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+All+Next+Generation+Sequencing+Diagnostics+are+Created+Equal%3A+Understanding+the+Nuances+of+Solid+Tumor+Assay+Design+for+Somatic+Mutation+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection.</a> Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).</li>
<li>Smith, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+estimates+of+clonal+evolution+and+subclonal+heterogeneity+can+arise+from+PCR+duplicates+in+deep+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments.</a> Genome Biol. 15 (8), 420(2014).</li>
<li>Varettoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+clinical+significance+of+the+MYD88+%28L265P%29+somatic+mutation+in+Waldenstr%C3%B6m%27s+macroglobulinemia+and+related+lymphoid+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms.</a> Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYD88+L265P+in+Waldenstr%C3%B6m+macroglobulinemia%2C+immunoglobulin+M+monoclonal+gammopathy%2C+and+other+B-cell+lymphoproliferative+disorders+using+conventional+and+quantitative+allele-specific+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction.</a> Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).</li>
<li>Gertz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waldenstr%C3%B6m+macroglobulinemia%3A+2012+update+on+diagnosis%2C+risk+stratification%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Amer+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management.</a> Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).</li>
<li>Salar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.bloodjournal.org/content/124/21/1690">MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL).</a> Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).</li>
<li>Ngo, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenically+active+MYD88+mutations+in+human+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma.</a> Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).</li>
<li>Pasqualucci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+coding+genome+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma.</a> Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).</li>
<li>Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Applied Biosystems. <a target="_blank" href="http://imbi.bio.indiana.edu/includes/content/documents/3730%20Usage/ABI%203730%20User%20guide.pdf">User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer</a>. , (2014).</li>
<li>Applied Biosystems. <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/4474242A.pdf">User Guide for SeqScape Software 3</a>. , (2012).</li>
<li>Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+locked+nucleic+acid+%28LNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA).</a> Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).</li>
<li>Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+mutation+artifacts+after+formalin+fixation+and+error+prone+translesion+synthesis+during+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR.</a> BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).</li>
<li>Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+and+K-ras+mutation+analysis+in+non-small+cell+lung+cancer%3A+comparison+of+paraffin+embedded+versus+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Cell+Pathol%22%5BJournal%5D)">EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens.</a> Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).</li>
<li>Solassol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+mutation+detection+in+paired+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+colorectal+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues.</a> Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).</li>
<li>Yost, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+high-confidence+somatic+mutations+in+whole+genome+sequence+of+formalin-fixed+breast+cancer+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens.</a> Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).</li>
<li>Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+sequence+artifacts+in+amplicon-based+massively+parallel+sequencing+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+DNA+by+enzymatic+depletion+of+uracil-containing+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates.</a> Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).</li>
<li>Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+amplification+of+rare+mutations+using+locked+nucleic+acid+oligonucleotides+that+competitively+inhibit+primer+binding+to+wild-type+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA.</a> J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).</li>
<li>Mancini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+novel+methods+for+rapid+detection+and+quantification+of+DNMT3A+R882+mutations+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia.</a> J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).</li>
<li>Parsons, B. L., Heflich, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+selection+methods+for+the+direct+analysis+of+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Muta+Res%22%5BJournal%5D)">Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations.</a> Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).</li>
<li>Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncated+amplification%3A+a+method+for+high-fidelity+template-driven+nucleic+acid+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification.</a> BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).</li>
<li>Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+of+a+primer+at+a+mutation%3A+a+method+to+detect+low+level+mutations+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA.</a> Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).</li>
<li>Albitar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.bloodjournal.org/content/126/23/716">High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients.</a> Blood. 126 (23), 716(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj test WTB-PCR wykorzystuje ogólny zestaw starterów z oligo blokującym zaprojektowanym do blokowania amplifikacji DNA WT podczas wydłużania (Figura 1). Produkt WTB-PCR jest następnie sekwencjonowany do analizy mutacyjnej. Użyteczność WTB-PCR/Sanger polega na jego prostocie, wysokiej czułości i wysokiej przepustowości. Korzystając z opisanych tutaj wytycznych, większość istniejących testów opartych na metodzie Sangera można po prostu zmodyfikować poprzez dodanie oligonukleotydu blokującego, ab...

Sekwencjonowanie Sangera tradycyjnie było złotym standardem w testowaniu zarówno znanych, jak i nieznanych mutacji somatycznych. Jednym z ograniczeń sekwencjonowania Sangera jest jego granica wykrywalności (~ 10 - 20% zmutowanego allelu na tle WT)1. Ten poziom czułości jest nieodpowiedni do wykrywania mutacji somatycznych o niskim poziomie, które mogą być obecne w próbkach z tkanek przednowotworowych lub u pacjentów z niewielką liczbą krążących komórek nowotworowych lub gdy szpik kostny (BM) jest niejednolity. Sprawia to również, że ocena choroby resztkowej po terapii lub wykrywanie pojawiających się mutacji oporności podczas terapii jest trudne za pomocą samego konwencjonalnego sekwencjonowania2. Zastępując konwencjonalny PCR PCR blokowaniem typu dzikiego za pośrednictwem zablokowanych kwasów nukleinowych (LNA) w sekwencjonowaniu Sangera, można osiągnąć czułość do 0,1% zmutowanego allelu w tle WT2,3,4. W WTB-PCR wzbogacenie o zmutowane allele uzyskuje się poprzez dodanie krótkiego (~ 10 - 14 NT) blokującego (LNA) oligonukleotydu, który wiąże się preferencyjnie z DNA WT, zapobiegając w ten sposób amplifikacji DNA WT. Zmutowany produkt WTB-PCR może być następnie sekwencjonowany. Blokując DNA WT, a nie selekcjonując pod kątem określonych mutacji, WTB-PCR pozwala na wzbogacenie zarówno znanych, jak i nieznanych mutacji obecnych w maleńkich frakcjach komórek.
Obecnie stosuje się wiele metod wykrywania mutacji we frakcjach małych komórek. Obejmuje to PCR specyficzny dla alleli, system mutacji opornych na amplifikację (ARMS), denaturującą wysokosprawną chromatografię cieczową (DHPLC), kulki, emulsje, amplifikację i magnetykę (BEAMing), uwalnianie i pomiar wywołany polem elektrycznym (EFIRM), temperaturę topnienia o wysokiej rozdzielczości i inne. Jednak większość z tych metod jest ograniczona przez wyniki fałszywie dodatnie i możliwość wykrycia tylko jednej mutacji, dla której test został zaprojektowany4. WTB-PCR pozwala jednak użytkownikowi na wizualizację śladów sekwencjonowania, co umożliwia wykrywanie wielu typów mutacji i może pomóc w wykluczeniu wyników fałszywie dodatnich spowodowanych artefaktami lub zdarzeniami deaminacji. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) może stanowić odpowiednią alternatywę dla konwencjonalnego sekwencjonowania, jednak znacznie większe koszty, złożoność i dłuższy czas oznaczania sprawiają, że jest to niepotrzebna opcja dla wielu typów chorób z kilkoma odrębnymi markerami molekularnymi lub do monitorowania pacjentów poddawanych terapii pod kątem pojawiających się mutacji oporności. Co więcej, wysoki odsetek wyników fałszywie dodatnich podczas wykrywania wariantów z częstością występowania zmutowanych alleli mniejszą niż 5% może stanowić problem dla NGS5,6.
Tutaj pokazujemy wzrost czułości osiągnięty przez WTB-PCR w badaniach przesiewowych pod kątem mutacji w genie czynnika różnicowania szpiku 88, jak opisali Albitar i wsp. 3 Mutacje MYD88 są ważnymi czynnikami diagnostycznymi i prognostycznymi w makroglobulinemii Waldenströma (WM), gammapatii monoklonalnej IgM o nieznanym znaczeniu (IgM-MGUS), chłoniaku strefy brzeżnej śledziony (SMZL) i chłoniaku rozlanym z dużych komórek B (DLBCL). Mutacje MYD88 występują w prawie wszystkich przypadkach WM i około 50% pacjentów z MGUS wydzielającym immunoglobulinę M (IgM). Natomiast mutacje MYD88 występują tylko u 0-6% pacjentów z SMZL i nie występują w szpiczaku mnogim7,8. Ponieważ nakładające się cechy morfologiczne, immunofenotypowe, cytogenetyczne i kliniczne między WM i SMZL lub IgM-szpiczakiem mnogim mogą często komplikować diagnostykę różnicową, obecność mutacji MYD88 może służyć jako użyteczny czynnik identyfikujący9. Mutacje MYD88 są również związane z większym obciążeniem chorobą u pacjentów z DLBCL i słabym całkowitym przeżyciem po terapii7,10. Dodatkowo, ponieważ mutacje MYD88 są częściej spotykane w aktywowanym DLBCL podobnym do komórek B (ABC) niż w DLBCL podobnym do komórek B w centrum zarodkowym (GCB) lub pierwotnym chłoniaku z komórek B śródpiersia (PMBL), status mutacji MYD88 może służyć jako marker zastępczy dla podtypu ABC<klasa sup = "xref">11,12.
Szczegółowy protokół tutaj dostarczony służy jako szablon, na podstawie którego można opracować nowe testy, a większość istniejących testów sekwencjonowania można łatwo dostosować do dokładnego wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w różnych typach próbek. Podejście to może być również wykorzystywane do monitorowania i wykrywania opornych mutacji, które mogą rozwinąć się w nowotworach, a nawet bakterii, które mogą rozwinąć się podczas leczenia pacjentów terapią celowaną lub antybiotykami. Ponadto rozwiązuje i rozwiązuje wiele problemów związanych ze wzbogacaniem mutacji, szczególnie w tkance zatopionej w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE).

<table><tbody><tr><td>Probówki wirówkowe Safe-Lock o pojemności 1,5 lub 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>100% alkoholu</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td>Klasa histologiczna; 91,5% etanol, 5% alkohol izopropylowy, 4,5% alkohol metylowy</td></tr><tr><td>3730XL sekwencer</td><td>ABI</td><td></td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Do oczyszczania PCR z kulkami magnetycznymi</td></tr><tr><td>Aluminium folie uszczelniające</td><td>GeneMate</td><td>T-2451-1</td><td>Do PCR i przechowywania w chłodni</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Zestaw do sekwencjonowania cyklu</td><td>Life Technologies</td><td>4337455</td><td>Do sekwencjonowania dwukierunkowego. Z 5x wirówką buforową do sekwencjonowania</td></tr> serii <tr><td>5804</td><td>Rotor Eppendorf</td><td></td><td>A-2-DWP (do płytki PCR)</td></tr><tr><td>Zimna płytka do płytek 96-dołkowych</td><td>Eppendorf</td><td>Z606634</td><td></td></tr><tr><td>DNAse, wolne od RNAse, ultra-czystej wody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP (100 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>10297-117</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 Magnes boczny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>Do stosowania w oczyszczaniu PCR.</td></tr><tr><td>Absolutny poziom etanolu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>200 proof, dla biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Strona internetowa Exiqon Oligo Tools</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.exiqon.com/oligo-tools">www.exiqon.com/oligo-tools</a></td></tr><tr><td>FastStart Polimeraza DNA Taq (5 U/&micro; L)</td> <td>Roche</td><td>12032937001</td><td>Z10x skoncentrowany bufor reakcyjny PCR, z 20 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Aparat do elektroforezy</td><td></td><td></td> żelowej <td>2% żel agarozowy</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji GeneRead DNA FFPE&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>180134</td><td>Zawiera glikozylazę DNA uracylu niezbędną do redukcji artefaktów sekwencjonowania</td></tr><tr><td>Hi-Di Formamid</td><td>ABI</td><td>4311320</td><td>Do sekwencjonowania.</td></tr><tr><td>Oligonukleotyd LNA</td><td>Exiqon</td><td>500100</td><td>5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = zasady LNA)</td></tr><tr><td>M13-F Starter sekwencjonowania</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT</td></tr><tr><td>M13-R Podkład sekwencjonujący</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg</td></tr><tr><td>acc Mastercycler Pro S Termocykler</td><td>Eppendorf</td><td>E950030020</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka model 5430</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>FA-45-30-11 rotor (do probówek mikrowirówek 1,5/2 ml)</td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR starter forward IDT</td><td></td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG</td></tr><tr><td>PCR reverse primer</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGG TGT AGT AGT CGC AGA CA</td></tr><tr><td>PCR płytki</td><td>GeneMate</td><td>T-3107-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td></td><td></td><td>20, 200, 1 000 i mikro; L</td></tr><tr><td>Przegroda płytkowa, 96 dołków</td><td>ABI</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>Do aspiratu BM i krwi obwodowej</td></tr><tr><td>SeqScape Sortware v3.0</td><td>ABI</td><td>4474978</td><td>Do analizy sekwencjonowania</td></tr><tr><td>Kosz</td><td></td><td></td><td></td>na suwak</tr><tr><td>Octan sodu (3 M, pH 5,2)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne końcówki</td><td></td><td></td> do pipet z filtrem <td>20, 200, 1,000 i mikro; L</td></tr><tr><td>Termomikser C&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Vortex genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik</td><td></td><td></td> do mycia <td>~ 1,000 ml</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td>Klasa histologiczna</td></tr></tbody></table>

pcr blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem bezpośrednim jako wysoce czuła metoda wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Dokładne wykrywanie i identyfikacja mutacji o niskiej częstotliwości może być problematyczne podczas oceny pozostałości choroby po terapii, badań przesiewowych pod kątem pojawiających się mutacji oporności podczas terapii lub gdy pacjenci mają niewiele krążących komórek nowotworowych. PCR blokujący typu dzikiego, po którym następuje analiza sekwencjonowania, oferuje wysoką czułość, elastyczność i prostotę jako metodologia wykrywania tych mutacji o niskiej częstotliwości. Dodając specjalnie zaprojektowany oligonukleotyd zablokowanego kwasu nukleinowego do nowego lub wcześniej ustalonego konwencjonalnego testu sekwencjonowania opartego na PCR, można osiągnąć czułość około 1 zmutowanego allelu na tle 1,000 alleli WT (1:1,000). Artefakty sekwencjonowania związane ze zdarzeniami deaminacji powszechnie występującymi w tkankach zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie można częściowo zaradzić poprzez zastosowanie glikozylazy DNA uracylu podczas etapów ekstrakcji. Zoptymalizowany protokół jest specyficzny dla wykrywania mutacji MYD88, ale może służyć jako szablon do projektowania dowolnego testu WTB-PCR. Zalety testu WTB-PCR w porównaniu z innymi powszechnie stosowanymi testami do wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości, w tym PCR specyficznego dla alleli i ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, obejmują mniejszą liczbę przypadków wyników fałszywie dodatnich, większą elastyczność i łatwość wdrożenia oraz możliwość wykrywania zarówno znanych, jak i nieznanych mutacji.

Koncepcyjny przegląd procesu WTB-PCR podczas elongacji przedstawiono na Rysunku 1. Ponieważ pojedyncza niedopasowana nukleotyd w hybrydzie blokera z DNA znacznie obniża jej temperaturę topnienia (ΔTm=20 - 30 °C), amplifikacja allelu WT jest blokowana, podczas gdy matrycowe DNA mutanty może swobodnie przejść pełną elongację17. W ten sposób DNA mutanty ulega amplifikacji wykładniczej, natomiast DNA WT ulega amplifikacji liniowej.
<p cl...

Blokowanie PCR typu dzikiego, a następnie sekwencjonowanie bezpośrednie, oferuje bardzo czułą metodę wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości w różnych typach próbek.

PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem bezpośrednim jako wysoce czuła metoda wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrywanie rzadkich mutacji somatycznych w różnych typach próbek. Metodologia ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach mutacji somatycznych poprzez ułatwienie wykrywania mutacji o bardzo niskiej częstotliwości. W niniejszym protokole będziemy poszukiwać mutacji w genie myd88 w próbkach szpiku kostnego.Główną zaletą tej techniki jest dostarczanie bardzo dokładnych i czułych informacji o obecności mutacji somatycznych, nawet przy bardzo niewielkiej liczbie komórek nowotworowych. Ten test sekwencjonowania oparty na PCR z blokowaniem typu dzikiego został opracowany w celu amplifikacji fragmentu eksonu pięć w genie myd88, zapewniając pokrycie punktu zapalnego L265. Primery forward i reverse zostały zaprojektowane z sekwencją M13 na końcu 5', aby umożliwić przyłączenie komplementarnych primerów sekwencjonujących.Zaprojektuj blokujący oligonukleotyd o długości około 10 do 15 zasad, komplementarny do matrycy typu dzikiego w miejscu, w którym pożądane jest wzbogacenie mutantów. Krótszy oligonukleotyd poprawi dyskryminację niedopasowań. Aby uzyskać wysoką swoistość wobec celu, ważne jest, aby nie używać zbyt wielu nukleotydów blokujących, ponieważ doprowadzi to do powstania zbyt silnie wiążących się oligonukleotydów.Aby zaprojektować blokujący oligonukleotyd, należy przejść do strony internetowej Oligo Tools. Wybierz narzędzie Oligo TM prediction. Otworzy się nowe okno.Wklej sekwencję matrycy typu dzikiego, która ma zostać zablokowana, do pola sekwencji oligonu. Przed zasadami blokującymi dodaj znak plus, aby je oznaczyć. Kliknij przycisk oblicz, aby wyznaczyć przybliżoną TM hybrydy DNA z blokerem.Obliczone temperatury topnienia zostaną wyświetlone w poniższych polach. Zaprojektuj blokujący oligonukleotyd tak, aby jego temperatura topnienia była o 10 do 15 stopni Celsjusza wyższa od temperatury elongacji stosowanej podczas cyklicznego ogrzewania i chłodzenia. W tym przypadku temperatura elongacji wynosi 72 stopnie Celsjusza.Aby dostosować temperaturę topnienia, należy dodać, usunąć lub zastąpić zasady blokujące. Należy unikać długich ciągów trzech do czterech blokujących zasad C lub G. Następnie, aby zapobiec tworzeniu się struktur drugorzędowych lub samodimeryzacji, należy wrócić do strony głównej witryny Oligo Tools i wybrać narzędzie Oligo Optimizer.Otworzy się nowe okno. W odpowiednim polu należy wkleić sekwencję matrycy typu dzikiego, która ma zostać zablokowana. Aby wskazać zasady blokujące, należy dodać znak plus.Zaznacz dwa pola dla struktury drugorzędowej oraz samo-dimerów i naciśnij przycisk analizy, aby wyświetlić wyniki dla hybrydyzacji i struktury drugorzędowej. Wyniki te stanowią bardzo przybliżone szacunki temperatur topnienia odpowiednio dla samo-dimerów i struktur drugorzędowych. Niższe wartości są optymalne i można je osiągnąć poprzez ograniczenie parowania blokera z blokerem.Usuń lub zmień położenie nukleotydów blokujących, aby uzyskać niższe wyniki. Zoptymalizowany blokujący oligonukleotyd dla myd88 przedstawiony tutaj zachowuje równowagę między temperaturą topnienia hybrydy blokera DNA a wystarczająco niskimi wynikami hybrydyzacji i struktury drugorzędowej. Został on zaprojektowany tak, aby pokrywał aminokwasy Q262 do I266 i posiada trzyprimerowy odwrócony DT w celu zahamowania zarówno elongacji przez polimerazę DNA, jak i degradacji przez egzonukleazę 3'.Po zaprojektowaniu starterów należy przygotować blokującą reakcję PCR dla typu dzikiego i przeprowadzić cykling termiczny zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie. Wyjąć kulki magnetyczne z przechowywania w temperaturze 4°C i doprowadzić je do temperatury pokojowej. Przenieść 10 µl produktu PCR do nowej płytki PCR.Mocno wymieszaj kulki magnetyczne w wirówce typu vortex, aby całkowicie je resuspenderować, a następnie dodaj 18 µL kulek magnetycznych do każdego dołka na nowej płytce. Pipetuj 10 razy w górę i w dół, aby wymieszać zawiesinę. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Po inkubacji należy umieścić płytkę PCR na magnesie do płytek z bocznymi ramkami na dwie minuty, aby oddzielić kuleczki od roztworu. Za pomocą pipety wielokanałowej należy odessać nadsącz. Należy uważać, aby nie pobrać osadu z kuleczek.Następnie do każdego dołka nanieś 150 µL 70% etanolu i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 sekund. Następnie odessij etanol za pomocą pipety wielokanałowej i wyrzuć końcówki. Powtórz tę procedurę płukania jeszcze raz.Za pomocą wielokanałowej pipety o objętości 20 µL odessać pozostały etanol z każdego dołka i wyrzucić końcówki. Po odczekaniu około 10 minut do wyschnięcia dołków na płytce, zdjąć ją z magnesu i dodać 40 µL wody wolnej od nukleaz do każdego dołka. Pomieszać zawartość, pipetując w górę i w dół 15 razy.Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Po inkubacji umieścić płytkę PCR z powrotem na płytce magnetycznej na jedną minutę, aby oddzielić kuleczki od roztworu. Przenieść 35 µL oczyszczonego produktu do nowej płytki PCR i przeprowadzić sekwencjonowanie dwukierunkowe zgodnie z opisem w dołączonym dokumencie.Po przeprowadzeniu sekwencjonowania dwukierunkowego w celu oczyszczenia produktów sekwencjonowania, należy przygotować świeży roztwór octanu sodu o stężeniu 3 M przy pH 5,2 w 100% etanolu. Należy również przygotować świeży roztwór 70% etanolu. Do każdego dołka na płytkach z sekwencjonowaniem w kierunku w przód i w tył należy dodać 30 µL octanu sodu w 100% etanolu, a następnie pięciokrotnie pipetować roztwór w górę i w dół w celu wymieszania.Następnie ponownie szczelnie zamknąć płytkę i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po upływie 20 minut odwirować płytkę z prędkością 2 250 ×g przez 15 minut. Po wirowaniu usunąć folię uszczelniającą i raz odwrócić płytkę nad pojemnikiem na odpady.Jeśli płytka zostanie odwrócona wielokrotnie, osady mogą oddzielić się od dna dołków. Należy położyć odwróconą płytkę na czystym ręczniku papierowym i wirować przy 150 ×g przez jedną minutę. Następnie do każdego dołka należy dodać 150 µL 70% etanolu i ponownie uszczelnić płytkę.Wiruj z prędkością 2 250 ×g przez pięć minut. Następnie powtórz proces usuwania uszczelki płytki i odwrócenia płytki. Jeśli dołki nie są całkowicie suche, pozostaw je do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.Należy upewnić się, że próbki są chronione przed światłem. Po całkowitym wyschnięciu studzienek należy dodać do każdej z nich 10 µL formamidu i pipetować roztwór w górę i w dół 10 razy w celu wymieszania. Następnie należy ponownie zamknąć płytkę.Przeprowadź denaturację w termocyklerze w temperaturze 95 °C przez trzy minuty, a następnie w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Po denaturacji zastąp uszczelkę płytek septą i przeprowadź sekwencjonowanie na platformie sekwencjonującej zgodnie z instrukcjami producenta. Używając oprogramowania do analizy sekwencji, zwizualizuj ślady i dopasuj sekwencje do odpowiednich sekwencji referencyjnych.Wyrównano sekwencję myd88 do sekwencji referencyjnej NCBI NM002468. DNA genomiczne pobrane od pacjentów z mutacjami oraz bez mutacji poddano zarówno konwencjonalnej, jak i blokującej PCR dla typu dzikiego, a otrzymane produkty PCR następnie zsekwencjonowano. Jak widać tutaj, allel zmutowany uległ wzbogaceniu podczas przeprowadzenia blokującej PCR dla typu dzikiego, a w DNA typu dzikiego nie zaobserwowano wyników fałszywie dodatnich.Charakterystyczny spadek intensywności sygnału, przedstawiony tutaj, jest często obserwowany w przypadku zastosowania zbyt wysokiego stężenia blokera lub gdy oczyszczanie po PCR nie usunęło blokera przed sekwencjonowaniem dwukierunkowym. Dzieje się tak, gdy zamiast oczyszczania za pomocą kulek magnetycznych zastosowano oczyszczanie enzymatyczne. Każdy test oparty na metodzie PCR, który wzbogaca allele mutantowe, wykryje artefakty o niskiej częstotliwości.Ślady te wykazują wzrost artefaktów sekwencjonowania CG w stosunku do artefaktów TA w tkance FFPE, gdy cytozyna lub zmetylowana cytozyna ulegają deaminacji w wyniku utrwalania formaldehydem odpowiednio do uracylu lub tyminy. Deoksyurydynoglikozylaza (UDG) może wycinać uracyl przed blokującą PCR typu dzikiego, co pomaga zredukować artefakty sekwencjonowania. Jednakże tymina powstała w wyniku deaminacji 5-metylocytozyny, która często występuje w wyspach CpG, nie może zostać wycięta przez UDG.Zmniejszenie stężenia blokera stosowanego w PCR z blokowaniem typu dzikiego może pomóc w ograniczeniu występowania artefaktów sekwencjonowania, których nie eliminuje traktowanie enzymem UDG. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak badać mutacje somatyczne z wysokim stopniem dokładności i czułości, wykorzystując technikę blokowania typu dzikiego. Zasadę tej technologii można zastosować do wykrywania mutacji w niewielkich subpopulacjach komórek.W związku z tym znajduje ono zastosowanie w wykrywaniu minimalnej choroby resztkowej, monitorowaniu pacjentów oraz przewidywaniu wczesnego nawrotu u osób z różnymi nowotworami.

wild-type-blocking-pcr-combined-with-direct-sequencing-as-highly

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film opisuje reakcję łańcuchową polimerazy blokującej typu dzikiego, czyli WTB-PCR, która wykrywa mutacje somatyczne. Technika oparta na PCR wykorzystuje zablokowany kwas nukleinowy lub LNA, oligonukleotyd, który wiąże się ze swoim komplementarnym allelem typu dzikiego i blokuje jego wydłużenie. Blokowanie selektywnie umożliwia amplifikację zmutowanych alleli niskiego poziomu w stosunku do ich wariantów typu dzikiego w próbce.

Blokowanie PCR typu dzikiego w celu wykrycia mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości

Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie

Ten manuskrypt opisuje protokoły kliniczne dla dwóch paneli sekwencjonowania nowej generacji. Jeden panel bada nowotwory hematologiczne, podczas gdy drugi panel koncentruje się na genach powszechnie zmutowanych w guzach litych. Klasyfikacja molekularna mutacji powodujących nowotwory złośliwe u ludzi dostarcza cennych informacji prognostykujących i predykcyjnych.

Sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych

Celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić automatyczną ekstrakcję DNA z referencyjnych linii komórkowych z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie (FFPE) oraz cyfrową analizę PCR kropelkowego (ddPCR) w celu wykrycia rzadkich mutacji w warunkach klinicznych. Wykrywanie mutacji w próbkach FFPE pokazuje kliniczną przydatność ddPCR w próbkach FFPE.

Wykorzystanie cyfrowej reakcji kropelkowej PCR do wykrywania mutacji BRAF V600E w standardowych referencyjnych liniach komórkowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

W artykule opisano metodę identyfikacji zmian klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od danego pacjenta. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na określonym typie nowotworu, podejście to ma szerokie zastosowanie do innych guzów litych.

Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania

Ten artykuł przedstawia zastosowanie metody wykrywania niskiej częstotliwości opartej na sekwencjonowaniu Sangera w chłoniaku angioimmunoblastycznym. Zapewnij podstawę do zastosowania tej metody do innych chorób.

PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem Sangera w celu wykrycia mutacji somatycznej o niskiej częstotliwości

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek jest coraz bardziej popularnym i dostępnym narzędziem do rozwiązywania problemów związanych ze zmianami genomowymi w wysokiej rozdzielczości. Udostępniamy protokół, który wykorzystuje sekwencjonowanie pojedynczych komórek do identyfikacji zmian liczby kopii w pojedynczych komórkach.

Wykrywanie zmian numeru kopii za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek

Poznaj metodę PCR blokującego typu dzikiego z sekwencjonowaniem bezpośrednim do wykrywania somatycznych mutacji o niskiej częstotliwości w genie myd88 w próbkach szpiku kostnego.

PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem bezpośrednim jako wysoce czuła metoda wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości (Wideo) | JoVE Journal

PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem bezpośrednim jako wysoce czuła metoda wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości

Przeglądaj więcej filmów