Name: Rekonstrukcje na dużą skalę i niezależne, bezstronne grupowanie oparte na wskaźnikach morfologicznych w celu klasyfikacji neuronów w selektywnych populacjach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Poznaj metodę rekonstrukcji morfologii neuronów zakażonych wirusem wścieklizny oraz bezstronne grupowanie w celu klasyfikacji podklas neuronowych w badaniach neuroanatomicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować doktorom Edowi Callawayowi i Marty'emu Usreyowi za umożliwienie nam wykorzystania tkanki przygotowanej w ramach wcześniejszego badania oraz Libby Fairless i Shiyuan Liu za pomoc w rekonstrukcji neuronów. Praca ta została sfinansowana przez NIH (NEI: EY018683) i Fundację Whitehall.

<ol><li>Cajal, S. R. y <a target="_blank" href="https://archive.org/details/b2129592x_0001">Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres</a>. , Maloine. (1911).</li>
<li>Seung, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+functional+connectomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Toward functional connectomics.</a> Nature. 471, 170-172 (2011).</li>
<li>Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+circuit+tracing+with+neurotropic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).</li>
<li>Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+neuronal+tracing+with+a+deletion-mutant+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus.</a> Nature Methods. 4, 47-49 (2007).</li>
<li>Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+substrates+for+parallel+streams+of+corticogeniculate+feedback+originating+in+both+V1+and+V2+of+the+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey.</a> Neuron. 90, 388-399 (2016).</li>
<li>Cauli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+fusiform+neocortical+interneurons+based+on+unsupervised+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering.</a> PNAS. 97, 6144-6149 (2000).</li>
<li>Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+visual+sector+thalamic+reticular+neurons+in+the+macaque+monkey+sugests+retinotopically-specialized%2C+parallel+stream-mixed+input+to+the+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus.</a> J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/neuron/abstract/S0896-6273(11)00600-3">New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits.</a> Neuron. 71, 617-631 (2011).</li>
<li>Callaway, E. M., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+with+glycoprotein-deleted+rabies+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses.</a> Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).</li>
<li>Nhan, H. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+superior+colliculus-+and+middle+temporal+area-projecting+neurons+in+primate+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex.</a> J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).</li>
<li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thalamic+reticular+nucleus%3A+structure%2C+function+and+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept.</a> Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 65, e3564(2012).</li>
<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Research. 171, 11-28 (1979).</li>
<li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+neuroanatomical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Basic neuroanatomical methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1(2003).</li>
<li>Thorndike, R. L. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/summary?doi=10.1.1.177.7605">Who belongs in the family?</a> Psychometrika. 18, 267-276 (1953).</li>
<li>Talebi, V., Baker, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Categorically+distinct+types+of+receptive+fields+in+early+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).</li>
<li>Helmstaedter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connectomic+reconstruction+of+the+inner+plexiform+layer+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina.</a> Nature. 500, 168-174 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badania neuroanatomiczne pozostały filarem neurobiologii, a niedawne zainteresowanie konektomomiką i relacjami struktura-funkcja odnowiło entuzjazm dla szczegółowej charakterystyki morfologicznej selektywnych populacji neuronów. Tradycyjnie, badania neuroanatomiczne opierały się na jakościowych klasyfikacjach neuronów w morfologicznie odrębne klasy neuronów zdefiniowane przez ekspertów neuroanatomów. Dzięki postępom w technikach rekonstrukcji neuronów i ekstrakcji danych morfologicznych, możliwe jest obecnie wykorzystani...

Neuroanatomia jest jednym z fundamentów neuronauki1, a niedawne zainteresowanie "konektomiczną" odnowiło entuzjazm do zrozumienia morfologicznej różnorodności populacji neuronów i połączeń między określonymi neuronami2. Metody znakowania i rekonstrukcji neuronów znacznie się poprawiły dzięki najnowszym innowacjom, w tym genetycznym i wirusowym metodom śledzenia obwodów3,4, umożliwiając bardziej kompleksowe badania morfologiczne populacji neuronów5. Oprócz ulepszeń w oznaczaniu poszczególnych neuronów, pojawiły się również techniki ilościowej analizy danych, które umożliwiają niezależną i bezstronną klasyfikację neuronów do odrębnych subpopulacji na podstawie danych morfologicznych5,6. Te bezstronne techniki stanowią ulepszenie bardziej tradycyjnych metod klasyfikacji jakościowej, które są standardem w tej dziedzinie od ponad wieku. Celem tego badania jest nakreślenie, krok po kroku, kombinacji znakowania neuronów za pośrednictwem wirusa w selektywnej populacji, wielkoskalowych rekonstrukcji kompleksowej próbki tych neuronów oraz ilościowej analizy danych opartej na niezależnym grupowaniu z oceną statystyczną. Łącząc te metody, nakreślamy nowatorskie podejście do gromadzenia i analizy danych neuroanatomicznych, aby ułatwić kompleksowe pobieranie próbek i bezstronną klasyfikację morfologicznie unikalnych typów neuronów w selektywnej populacji neuronów.
Jako przykład tych metod opisujemy naszą analizę dużej populacji neuronów w obrębie jednego sektora jądra siatkowatego wzgórza (TRN) makaka. Te dane pochodzą z wcześniejszego badania7. Przedstawiono metody selektywnego znakowania neuronów TRN rzutujących do grzbietowego bocznego jądra kolankowatego wzgórza (dLGN) przy użyciu chirurgicznego wstrzykiwania zmodyfikowanego wirusa wścieklizny kodującego EGFP4,8 (patrz Tabela Specyficznych Materiałów/Sprzętu, wiersz 2). Ten zmodyfikowany wirus wścieklizny nie ma genu kodującego niezbędne białko płaszcza, eliminując transsynaptyczny ruch wirusa. Gdy wirus dostanie się do końców aksonów w miejscu wstrzyknięcia, działa jak tradycyjny znacznik wsteczny, z ważną korzyścią polegającą na napędzaniu ekspresji EGFP podczas pełnej arboryzacji dendrytycznej zainfekowanych neuronów5,9,10. W związku z tym ten wirus wścieklizny z delecją G może być wykorzystany do selektywnego infekowania i znakowania dowolnej populacji neuronów po wstrzyknięciu i transporcie wstecznym.
Aby przeprowadzić kompleksową analizę określonej populacji neuronów, ważne jest pobranie próbki z szerokiego rozmieszczenia neuronów w populacji. Ponieważ technika znakowania za pośrednictwem wirusa wytwarza kompletne, wewnątrzkomórkowe, "podobne do Golgiego" wypełnienia wielu neuronów aksonami w miejscu wstrzyknięcia wirusa, możliwe jest zrekonstruowanie bardzo dużej próbki neuronów w pełnym zakresie struktury mózgu. Dodatkowo, ponieważ zmodyfikowany wirus wścieklizny jest tak skuteczny w infekowaniu i znakowaniu dużej liczby neuronów, możliwe jest zrekonstruowanie setek neuronów na zwierzę. Przedstawiono procedury pobierania próbek od 160 neuronów w całym sektorze wzrokowym TRN11 w celu wygenerowania kompleksowej próbki neuronów TRN projekcyjnych z dLGN. Opisano proces rekonstrukcji poszczególnych neuronów za pomocą systemu rekonstrukcji neuronów obejmującego mikroskop, kamerę i oprogramowanie do rekonstrukcji. Opisano również metody określania położenia poszczególnych neuronów w strukturze mózgu (w tym przypadku w obrębie TRN) oraz weryfikacji objętości i lokalizacji miejsca iniekcji wirusa w strukturze (w tym przypadku w obrębie dLGN) za pomocą wolumetrycznych rekonstrukcji konturu. Przedstawiono kroki, które należy wykonać, aby wyeksportować dane morfologiczne i przeprowadzić niezależne analizy skupień na podstawie wskaźników morfologicznych zmierzonych dla każdego neuronu. Istnieją ograniczenia dotyczące metod grupowania, a także dostępnych jest wiele różnych algorytmów grupowania. W związku z tym opisano te opcje i korzyści płynące z niektórych z częściej używanych algorytmów. Analiza skupień nie zapewnia statystycznej weryfikacji unikalności klastrów. W związku z tym przedstawiono dodatkowe kroki w celu zweryfikowania optymalnego grupowania, a także relacji między danymi morfologicznymi w obrębie klastrów i między nimi. Opisano statystyczne metody oceny klastrów dla zestawu danych TRN w celu potwierdzenia, że neurony TRN są pogrupowane w trzy unikalne klastry na podstawie 10 niezależnych wskaźników morfologicznych.
Tak więc, opisując kroki selektywnego oznaczania, rekonstrukcji i analizy danych morfologicznych z określonej populacji neuronów, opisujemy metody ilościowego określania różnic morfologicznych między neuronami w populacji. Wcześniejsze odkrycia dotyczące różnych typów neuronów w sektorze wzrokowym makaka TRN zostały potwierdzone za pomocą oddzielnych metod oceny statystycznej. Mamy nadzieję, że techniki te będą miały szerokie zastosowanie w zestawach danych neuroanatomicznych i pomogą w ustaleniu ilościowej klasyfikacji różnorodności populacji neuronów w mózgu.

<table><tbody><tr><td>SAD&Delta; G-EGFP</td><td>E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute</td><td></td><td>przygotowane przez Dr. F. Osakada. Wirus wścieklizny z delecją G dostępny za pośrednictwem Instytutu Salka Wirusowy rdzeń</td></tr><tr><td>Elektroda rejestrująca: platyna/iryd lub wolfram</td><td>FHC</td><td>UEPSGGSE1N2M</td><td>Odwiedź stronę internetową (www.fh-co.com), aby zapoznać się z alternatywnymi specyfikacjami zamówienia</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummod Scientific</td><td>3-000-204, 110V</td><td>Alternatywy: picospritzer, strzykawka Hamilton</td></tr><tr><td>Mikrotom do zamrażania</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5905-50TAB</td><td>Tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny, tabletka, podłoże 10 mg w tabletce. Uwaga: czynnik rakotwórczy - musi być wybielony przed wyrzuceniem</td></tr><tr><td>Cytochrom C</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2037-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma-Aldich</td><td>C9322-5G</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-GFP</td><td>Life Technologies/Thermo Fisher</td><td>#A-11122&nbsp;</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Biotynylowane kozy anty-króliki</td><td>Vector Laboratories</td><td>#BA-1000</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Neurolucida System&nbsp;</td><td>Oprogramowanie MicroBrightField</td><td></td><td>do śledzenia i analizy neuronów. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida</td></tr><tr><td>Neurolucida Explorer</td><td>Oprogramowanie do eksportu danych</td><td>MicroBrightField</td><td></td></tr><tr><td>Kamera Microfire&nbsp;</td><td>Optoelektroniczna kamera mikroskopowa</td><td>o rozdzielczości 2 megapikseli</td><td></td>. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf</tr><tr><td>Mikroskop Nikon E800</td><td>firmy Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>Biologiczny mikroskop badawczy. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Oprogramowanie do matematyki obliczeniowej oparte na macierzy. http://www.mathworks.com</td></tr><tr>Program<td>Microsoft Office</td><td>Excel Arkusz kalkulacyjny</td> <td>Microsoft</td><td></td></tr></tbody></table>

rekonstrukcje na dużą skalę i niezależne, bezstronne grupowanie oparte na wskaźnikach morfologicznych w celu klasyfikacji neuronów w selektywnych populacjach

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

Ten protokół przedstawia rekonstrukcje neuronów na dużą skalę w połączeniu z wykorzystaniem niezależnych i bezstronnych analiz grupowania w celu stworzenia kompleksowego przeglądu cech morfologicznych obserwowanych wśród selektywnej populacji neuronów. Połączenie tych technik stanowi nowatorskie podejście do gromadzenia i analizy danych neuroanatomicznych. Łącznie techniki te umożliwiają pobieranie próbek na dużą skalę, a tym samym są bardziej kompleksowe, selektywnych populacji neuronów i ustanawiają bezstronne metody ilościowe do opisywania morfologicznie unikalnych klas neuronów w populacji.
Protokół opisuje użycie zmodyfikowanego wirusa wścieklizny do selektywnego oznaczania neuronów. Wirus wścieklizny z delecją G działa jak znacznik wsteczny po stereotaktycznym wstrzyknięciu do docelowej struktury mózgu i służy jako nośnik dostarczania i ekspresji EGFP w neuronach. Duża liczba neuronów jest infekowana przy użyciu tej techniki i wyraża GFP w swoich dendrytach, wytwarzając "podobne do Golgiego" pełne wypełnienia poszczególnych neuronów. W związku z tym metoda śledzenia wstecznego za pośrednictwem wirusa ulepsza tradycyjne techniki śledzenia wstecznego oparte na barwniku, wytwarzając pełne wypełnienia wewnątrzkomórkowe.
Pojedyncze, dobrze izolowane neurony, obejmujące wszystkie obszary badanego obszaru mózgu, są wybierane do rekonstrukcji w celu uzyskania reprezentatywnej próbki neuronów. Protokół określa procedury rekonstrukcji ciał komórkowych i kompletnych wzorców arboryzacji dendrytycznej znakowanych neuronów obejmujących wiele sekcji tkanki. Dane morfologiczne, w tym pozycje każdego neuronu w strukturze mózgu, są wyodrębniane w celu dalszej analizy. Standardowe funkcje programowania wykorzystano do przeprowadzenia niezależnych analiz skupień i ocen skupień w oparciu o metryki morfologiczne. Aby zweryfikować przydatność tych analiz, dokonano oceny statystycznej analizy skupień przeprowadzonej na 160 neuronach zrekonstruowanych w siatkowatym jądrze wzgórza wzgórza (TRN) makaka. Zarówno oryginalna analiza skupień, jak i przeprowadzone tutaj oceny statystyczne wskazują, że neurony TRN są podzielone na trzy subpopulacje, z których każda ma unikalne cechy morfologiczne.

Wcześniej wykazaliśmy, że wielkoskalowe rekonstrukcje neuronów w obrębie wyselekcjonowanej populacji są możliwe po wstrzyknięciu zmodyfikowanego wirusa wścieklizny do dLGN5. Niedawno ta sama tkanka została wykorzystana do rekonstrukcji 160 neuronów w sektorze wzrokowym TRN (Bragg et al., w recenzji; Rysunek 2A-B) zgodnie ze szczegółowymi krokami metodologicznymi opisanymi powyżej. W badaniu TRN zidentyfikowano trzy unikalne klastry neuronów TRN na pods...

Ten protokół opisuje zakrojone na szeroką skalę rekonstrukcje selektywnych populacji neuronów, oznaczonych po wstecznym zakażeniu zmodyfikowanym wirusem wścieklizny wyrażającym markery fluorescencyjne, oraz niezależne, bezstronne analizy klastrów, które umożliwiają kompleksową charakterystykę wskaźników morfologicznych wśród różnych podklas neuronów.

Rekonstrukcje na dużą skalę i niezależne, bezstronne grupowanie oparte na wskaźnikach morfologicznych w celu klasyfikacji neuronów w selektywnych populacjach

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

Celem niniejszego protokołu jest opisanie kroków niezbędnych do rekonstrukcji morfologii neuronów znakowanych wirusem oraz przeprowadzenie niezależnych i obiektywnych analiz klastrowych populacji znakowanych neuronów, aby umożliwić kompleksową charakterystykę parametrów morfologicznych w obrębie poszczególnych podklas neuronów. Przedstawiamy nowatorskie podejście do gromadzenia i analizy danych neuroanatomicznych, które ułatwia bardziej wszechstronne próbkowanie i obiektywną klasyfikację morfologicznie unikalnych typów neuronów w obrębie wyselekcjonowanej populacji neuronalnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wielkoskalową analizę morfologii neuronów i wykorzystuje obiektywne metody klasyfikacji odrębnych podklas neuronów.Najtrudniejszymi aspektami rekonstrukcji morfologicznych są wybór odpowiednio odizolowanych neuronów do rekonstrukcji, przypisanie właściwej głębokości z oraz dopasowanie drzewek w celu kontynuowania rekonstrukcji w sąsiednich przekrojach tkanki. Rekonstrukcję należy rozpocząć od wybrania preparatu zawierającego barwiony przekrój tkanki mózgu naczelnego o grubości 50 micron, w który stereotaktycznie wstrzyknięto zmodyfikowany wirus wścieklizny wykazujący ekspresję EGFP. Preparat należy umieścić w uchwycie do szkiełek przedmiotowych i ustawić ostrość na pojedynczym, wybranym przekroju, korzystając z obiektywu o niskim powiększeniu.Upewnij się, że obraz z kamery jest widoczny w podglądzie na żywo, odpowiednio ustawiając migawkę kamery. Wybierz odpowiednio odizolowany, znakowany neuron w interesującej strukturze mózgu, aby umożliwić jednoznaczną rekonstrukcję arboryzacji dendrytycznej. Przełącz powiększenie na 10x i ustaw ostrość w wybranym obszarze.Wybieraj preferencyjnie neurony, których ciało komórki znajduje się w całości w obrębie jednego przekroju, aby dokładnie oszacować jego powierzchnię i stopień okrągłości. Po wybraniu dobrze zabarwionego i dobrze odizolowanego neuronu, kliknij w oprogramowaniu przycisk nowej sekcji, aby dodać przekrój bazowy zawierający ciało komórki do menedżera przekrojów. Wprowadź liczbę przekrojów, które mają zostać uwzględnione w rekonstrukcji.Zaleca się rozpoczęcie od wstawienia od dwóch do trzech przekrojów. Ustaw grubość przekroju na 50 micronów. Wybierz obiektyw 2x, a następnie kliknij przycisk konturu na górnym pasku narzędzi i wybierz typ konturu z menu rozwijanego.Obrysuj kontur docelowej struktury, klikając myszą w punktach wzdłuż konturu. Po zakończeniu obrysowywania kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz z menu opcję close contour, aby zamknąć kontur. Następnie, zachowując dwukrotne powiększenie widoku, kliknij wybrany symbol znacznika na lewym pasku narzędzi.Następnie kliknij w centrum docelowej struktury, aby umieścić marker. Po zakończeniu obrysowywania konturów wybierz obiektyw 40x lub 60x, aby odrysować zarys ciała komórki. Następnie wybierz przycisk śledzenia neuronów na górnym pasku narzędzi i z menu rozwijanego wybierz strukturę neuronu do odrysowania, w tym przypadku ciało komórki.Obrysuj ciało komórki, klikając w punktach wokół jej największego zasięgu i dostosowując głębokość z w razie potrzeby, aby ustawić ciało komórki w ostrości. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć konturowanie ciała komórki. Następnie umieść znacznik o innym stylu w centrum konturu ciała komórki, upewniając się, że znacznik znajduje się mniej więcej w centrum pod względem głębokości z.Przed rozpoczęciem każdego śledzenia kluczowe jest ustalenie prawidłowej głębokości z w sekcji domyślnej, a także w sekcjach sąsiednich, aby wartości osi z były dokładne. Aby rozpocząć śledzenie drzewek dendrytycznych, należy wybrać dendrite z górnego menu rozwijanego.Następnie należy prześledzić każde dendryty, zaczynając od ciała komórki. W miejscu rozgałęzienia dendryty należy kliknąć prawym przyciskiem myszy i wybrać węzeł bifurkacyjny lub węzeł trifurkacyjny, aby umieścić węzeł w punkcie rozgałęzienia. Należy pamiętać o regulacji głębokości z podczas śledzenia, aby precyzyjnie uchwycić kąt i kierunek dendryty.Na końcu dendrytu w tej sekcji kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję „ending” z menu rozwijanego. Po prześledzeniu wszystkich drzew dendrytycznych w sekcji głównej, zidentyfikuj te zakończenia dendrytyczne, które prawdopodobnie będą kontynuowane w sąsiedniej sekcji. Następnie ustaw je w ostrości na odpowiedniej głębokości z w obrazie mikroskopowym przy powiększeniu 20x.Na obrazie mikroskopowym uwzględnij główne punkty orientacyjne w pobliżu, takie jak naczynia krwionośne lub łatwo rozpoznawalne wzory bądź pęczki dendrytów. Następnie wykonaj zdjęcie obrazu na żywo, używając cyfrowego aparatu fotograficznego trzymanego w ręku przed ekranem komputera. Potem zmień obiektyw mikroskopu na 2x i przejdź do sąsiedniego przekroju na preparacie.Następnie dopasuj kontury wcześniej obrysowanego przekroju w widoku oprogramowania do granic LGN i TRN w nowym przekroju. Powróć do powiększenia 20x i wyrównaj obraz, korzystając z punktów orientacyjnych. Następnie, pomagając sobie zdjęciem zakończeń dendrytów z poprzednio obrysowanego przekroju, przesuń obrys w celu wyrównania dendrytów, używając najpierw narzędzia strzałki do zaznaczenia rekonstrukcji.Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, wybierz opcję „move” (przesuń) z menu rozwijanego i odpowiednio przesuń zapis. Aby obrócić zapis, kliknij prawym przyciskiem myszy, wybierz opcję „rotate” (obróć) z menu rozwijanego i odpowiednio obróć zapis. Alternatywnie, wybierz narzędzie „match” (dopasuj) z górnego menu narzędzi i określ liczbę punktów do dopasowania.Następnie kliknij zakończenie w rekonstrukcji oraz odpowiadający mu punkt kontynuacji na obrazie rzeczywistym, aby dopasować zakończenia dendrytów do ich początków. Gdy ślad z poprzednej sekcji zostanie wyrównany z dendrytami w nowej sekcji, dodaj nową sekcję do menedżera sekcji w ten sam sposób co wcześniej. Alternatywnie można po prostu wybrać sąsiednią sekcję utworzoną wcześniej i w ten sam sposób dostosować głębokość z.Upewnij się, że w menedżerze sekcji wybrano odpowiednią nową sekcję, klikając w bieżącą sekcję. Następnie, po zwiększeniu powiększenia do 40x lub 60x, zaznacz dendryt za pomocą strzałki. Kliknij prawym przyciskiem myszy na koniec dendrytu z poprzedniej sekcji i wybierz opcję „add to ending” z menu rozwijanego.Pojawi się monit z pytaniem, czy kontynuacja znajduje się w nowej sekcji. Kliknij tak. Następnie obrysuj kontynuację dendrytu, używając myszy jako narzędzia do rysowania.Wykonaj zdjęcia zakończeń w celu przygotowania do dopasowania do kolejnego przekroju. Następnie dodawaj kontynuacje do śladów dendrytów, aż zostaną obrysowane co najmniej trzy przekroje dla danego neuronu lub do momentu, gdy dendryty nie będą już możliwe do śledzenia bądź odnalezienia. Używając programu ekstrakcyjnego powiązanego z systemem rekonstrukcji neuronów, otwórz ukończony plik rekonstrukcji.Z rozwijanego menu Edycja wybierz opcję Zaznacz wszystkie obiekty. Z górnego paska narzędzi analizy wybierz Analiza struktury gałęzi, a następnie kliknij każdą zakładkę i wybierz pożądane opcje analizy w każdej z nich. Wyodrębnij wszystkie potrzebne dane, klikając przycisk OK w oknie analizy, a następnie zapisz je w formacie arkusza kalkulacyjnego, klikając prawym przyciskiem myszy w oknach wyjściowych i wybierając Eksportuj do Excel w celu przeprowadzenia dalszej analizy.Na tej fotografii przedstawiono pojedynczy przekrój wieńcowy przez grzbietową część LGN u jednego zwierzęcia. Barwienie na cytochrom oksydazę służy do wizualizacji warstw LGN, a barwienie GFP oznacza miejsce wstrzyknięcia wirusa.Strzałka wskazuje obszary gęsto rozmieszczonych, znakowanych retrogradnie neuronów jądra siatkowatego wzgórza. Orientacja przekroju jest zgodna z przedstawionym schematem kierunków grzbietowo-brzusznych i przyśrodkowo-bocznych. Pasek skali znajduje się w lewym dolnym rogu.Na tym obrazie przedstawiono kontury LGN zaznaczone na czerwono oraz TRN na bordowo dla wszystkich przekrojów zawierających wstrzyknięty wirus, co wskazują czarne kontury. Żółte gwiazdki oznaczają środki miejsc wstrzyknięcia. Obraz przedstawia rendering 3D konturów oraz miejsca wstrzyknięcia.Jest to mapa lokalizacji zrekonstruowanych neuronów TRN, zakodowanych kolorystycznie zgodnie z przypisaniem do klastra w obrębie pojedynczego zagregowanego konturu TRN przedstawionego w kolorze bordowym. Pasek skali reprezentuje 500 mikronów. Obraz ten przedstawia zagregowane kontury TRN w kolorze czarnym oraz LGN w kolorze szarym, z pięcioma zrekonstruowanymi neuronami TRN o barwach od ciepłych do zimnych, zależnie od ich położenia w osi przyśrodkowej i bocznej w obrębie TRN.Pasek skali reprezentuje 500 mikronów. Fotografie te przedstawiają szczegóły tych samych pięciu neuronów TRN z dopasowanymi kolorystycznie paskami skali reprezentującymi 100 mikronów. To hierarchiczne drzewo dendrogramu ilustruje odległości powiązań między 160 zrekonstruowanymi neuronami TRN w oparciu o 10 niezależnych metryk morfologicznych i przedstawia ogólne wyniki analizy skupień.Trzy odrębne skupiska neuronów TRN przedstawiono w kolorze niebieskim, zielonym i czerwonym. Po opanowaniu tych technik rekonstrukcji neuronalnej pojedynczy neuron można całkowicie zrekonstruować w ciągu jednej do dwóch godzin. Podczas rekonstrukcji neuronów ważne jest stałe monitorowanie i korygowanie głębokości z (z-depth).Protokół opisany w niniejszym opracowaniu stanowi udoskonalenie tradycyjnych, bardziej subiektywnych metod analizy neuroanatomicznej i umożliwia badaczom poszukiwanie nowych podklas neuronów w oparciu o wielkoskalowe dane morfologiczne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak rekonstruować neurony poprzez analizę sąsiadujących przekrojów tkanki oraz jak ekstrahować dane morfologiczne do dalszej analizy.

large-scale-reconstructions-independent-unbiased-clustering-based-on

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opracowaliśmy program komputerowy do analizy morfologii neuronów. W połączeniu z dwoma istniejącymi narzędziami analitycznymi o otwartym kodzie źródłowym, nasz program przeprowadza analizę Sholla oraz określa liczbę neurytów, punktów rozgałęzień i zakończeń neurytów. Analizy są wykonywane w taki sposób, aby można było obserwować lokalne zmiany w morfologii neurytów.

Zautomatyzowana analiza Sholla zdigitalizowanej morfologii neuronów w wielu skalach

Tutaj pokazujemy, jak analizować dendrytyczne kierowanie neuronów rdzenia Drosophila w kolumnach i warstwach. Przepływ pracy obejmuje technikę obrazowania w podwójnym widoku w celu poprawy jakości obrazu oraz narzędzia obliczeniowe do śledzenia, rejestrowania trzpieni dendrytycznych do układu kolumn referencyjnych oraz do analizy struktur dendrytycznych w przestrzeni 3D.

Analiza morfologii dendrytycznej w kolumnach i warstwach

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Tutaj udostępniamy przepływ pracy, który pozwala na identyfikację zdrowych i patologicznych komórek na podstawie ich 3-wymiarowego kształtu. Opisujemy proces wykorzystania konturów projekcji 2D opartych na powierzchniach 3D do trenowania Mapy Samoorganizującej się, która zapewni obiektywne grupowanie badanych populacji komórek.

Oparte na morfologii rozróżnienie między zdrowymi i patologicznymi komórkami z wykorzystaniem transformaty Fouriera i samoorganizujących się map

Opisany tutaj protokół opisuje analizę immunofluorescencyjną, odzyskiwanie biocytyny i wysokiej jakości rekonstrukcje interneuronów CA2 w hipokampie po wewnątrzkomórkowych zapisach elektrofizjologicznych in vitro, co pozwala na badanie charakterystyki neuronów i ostatecznie anatomii neuronalnej.

Odzyskiwanie biocytyny i rekonstrukcje 3D wypełnionych interneuronów CA2 w hipokampie

Opisany potok jest przeznaczony do segmentacji zestawów danych mikroskopii elektronowej większych niż gigabajty, w celu wyodrębnienia morfologii całych komórek. Po zrekonstruowaniu komórek w 3D, dostosowane do indywidualnych potrzeb oprogramowanie może być wykorzystane do przeprowadzenia analizy jakościowej i ilościowej bezpośrednio w 3D, wykorzystując również rzeczywistość wirtualną do pokonania okluzji widoku.

Metoda rekonstrukcji 3D i analizy w wirtualnej rzeczywistości komórek glejowych i neuronalnych

Presented to narzędzie obliczeniowe, które umożliwia prosty i bezpośredni automatyczny pomiar orientacji gałęzi dendrytycznych neuronów na podstawie obrazów fluorescencyjnych 2D.

Automatyczna identyfikacja gałęzi dendrytycznych i ich orientacji

Protokół dostarcza szczegółową metodę obrazowania neuronów w wycinku mózgu za pomocą metody oczyszczania tkanki, ScaleSF. Protokół obejmuje przygotowanie tkanki mózgowej, klarowanie tkanek, postępowanie z oczyszczonymi wycinkami oraz konfokalne obrazowanie struktur neuronalnych za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej od poziomu mezoskopowego do mikroskopowego.

Metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych

Ten protokół opisuje metody przeprowadzania rezonansu magnetycznego, oczyszczania i znakowania immunologicznego nienaruszonych mózgów myszy za pomocą iDISCO+, a następnie szczegółowy opis obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej i dalszych analiz za pomocą NuMorph.

Obrazowanie i analiza pojedynczych komórek całego mózgu nienaruszonych mózgów noworodków myszy za pomocą rezonansu magnetycznego, oczyszczania tkanek i mikroskopii świetlnej

Testy wzrostu neurytów dostarczają ilościowej wartości na temat regeneracyjnych procesów neuronalnych. Zaletą tego półautomatycznego oprogramowania jest to, że segmentuje ciała komórek i neuryty oddzielnie, tworząc maskę i mierzy różne parametry, takie jak długość neurytów, liczba punktów rozgałęzień, obszar klastra komórka-ciało i liczba klastrów komórek.

Standaryzacja nowatorskiego półautomatycznego oprogramowania do pomiaru przyrostu neurytów

Poznaj metodę rekonstrukcji morfologii neuronów zakażonych wirusem wścieklizny oraz bezstronne grupowanie w celu klasyfikacji podklas neuronowych w badaniach neuroanatomicznych.

Rekonstrukcje na dużą skalę i niezależne, bezstronne grupowanie oparte na wskaźnikach morfologicznych w celu klasyfikacji neuronów w selektywnych populacjach (Wideo) | JoVE Journal

Rekonstrukcje na dużą skalę i niezależne, bezstronne grupowanie oparte na wskaźnikach morfologicznych w celu klasyfikacji neuronów w selektywnych populacjach

Przeglądaj więcej filmów