Rekonstrukcje na dużą skalę i niezależne, bezstronne grupowanie oparte na wskaźnikach morfologicznych w celu klasyfikacji neuronów w selektywnych populacjach
15 lutego 2017
Ten protokół opisuje zakrojone na szeroką skalę rekonstrukcje selektywnych populacji neuronów, oznaczonych po wstecznym zakażeniu zmodyfikowanym wirusem wścieklizny wyrażającym markery fluorescencyjne, oraz niezależne, bezstronne analizy klastrów, które umożliwiają kompleksową charakterystykę wskaźników morfologicznych wśród różnych podklas neuronów.
Celem niniejszego protokołu jest opisanie kroków niezbędnych do rekonstrukcji morfologii neuronów znakowanych wirusem oraz przeprowadzenie niezależnych i obiektywnych analiz klastrowych populacji znakowanych neuronów, aby umożliwić kompleksową charakterystykę parametrów morfologicznych w obrębie poszczególnych podklas neuronów. Przedstawiamy nowatorskie podejście do gromadzenia i analizy danych neuroanatomicznych, które ułatwia bardziej wszechstronne próbkowanie i obiektywną klasyfikację morfologicznie unikalnych typów neuronów w obrębie wyselekcjonowanej populacji neuronalnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wielkoskalową analizę morfologii neuronów i wykorzystuje obiektywne metody klasyfikacji odrębnych podklas neuronów.
Najtrudniejszymi aspektami rekonstrukcji morfologicznych są wybór odpowiednio odizolowanych neuronów do rekonstrukcji, przypisanie właściwej głębokości z oraz dopasowanie drzewek w celu kontynuowania rekonstrukcji w sąsiednich przekrojach tkanki. Rekonstrukcję należy rozpocząć od wybrania preparatu zawierającego barwiony przekrój tkanki mózgu naczelnego o grubości 50 micron, w który stereotaktycznie wstrzyknięto zmodyfikowany wirus wścieklizny wykazujący ekspresję EGFP. Preparat należy umieścić w uchwycie do szkiełek przedmiotowych i ustawić ostrość na pojedynczym, wybranym przekroju, korzystając z obiektywu o niskim powiększeniu.
Upewnij się, że obraz z kamery jest widoczny w podglądzie na żywo, odpowiednio ustawiając migawkę kamery. Wybierz odpowiednio odizolowany, znakowany neuron w interesującej strukturze mózgu, aby umożliwić jednoznaczną rekonstrukcję arboryzacji dendrytycznej. Przełącz powiększenie na 10x i ustaw ostrość w wybranym obszarze.
Wybieraj preferencyjnie neurony, których ciało komórki znajduje się w całości w obrębie jednego przekroju, aby dokładnie oszacować jego powierzchnię i stopień okrągłości. Po wybraniu dobrze zabarwionego i dobrze odizolowanego neuronu, kliknij w oprogramowaniu przycisk nowej sekcji, aby dodać przekrój bazowy zawierający ciało komórki do menedżera przekrojów. Wprowadź liczbę przekrojów, które mają zostać uwzględnione w rekonstrukcji.
Zaleca się rozpoczęcie od wstawienia od dwóch do trzech przekrojów. Ustaw grubość przekroju na 50 micronów. Wybierz obiektyw 2x, a następnie kliknij przycisk konturu na górnym pasku narzędzi i wybierz typ konturu z menu rozwijanego.
Obrysuj kontur docelowej struktury, klikając myszą w punktach wzdłuż konturu. Po zakończeniu obrysowywania kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz z menu opcję close contour, aby zamknąć kontur. Następnie, zachowując dwukrotne powiększenie widoku, kliknij wybrany symbol znacznika na lewym pasku narzędzi.
Następnie kliknij w centrum docelowej struktury, aby umieścić marker. Po zakończeniu obrysowywania konturów wybierz obiektyw 40x lub 60x, aby odrysować zarys ciała komórki. Następnie wybierz przycisk śledzenia neuronów na górnym pasku narzędzi i z menu rozwijanego wybierz strukturę neuronu do odrysowania, w tym przypadku ciało komórki.
Obrysuj ciało komórki, klikając w punktach wokół jej największego zasięgu i dostosowując głębokość z w razie potrzeby, aby ustawić ciało komórki w ostrości. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć konturowanie ciała komórki. Następnie umieść znacznik o innym stylu w centrum konturu ciała komórki, upewniając się, że znacznik znajduje się mniej więcej w centrum pod względem głębokości z.
Przed rozpoczęciem każdego śledzenia kluczowe jest ustalenie prawidłowej głębokości z w sekcji domyślnej, a także w sekcjach sąsiednich, aby wartości osi z były dokładne. Aby rozpocząć śledzenie drzewek dendrytycznych, należy wybrać dendrite z górnego menu rozwijanego.
Następnie należy prześledzić każde dendryty, zaczynając od ciała komórki. W miejscu rozgałęzienia dendryty należy kliknąć prawym przyciskiem myszy i wybrać węzeł bifurkacyjny lub węzeł trifurkacyjny, aby umieścić węzeł w punkcie rozgałęzienia. Należy pamiętać o regulacji głębokości z podczas śledzenia, aby precyzyjnie uchwycić kąt i kierunek dendryty.
Na końcu dendrytu w tej sekcji kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję „ending” z menu rozwijanego. Po prześledzeniu wszystkich drzew dendrytycznych w sekcji głównej, zidentyfikuj te zakończenia dendrytyczne, które prawdopodobnie będą kontynuowane w sąsiedniej sekcji. Następnie ustaw je w ostrości na odpowiedniej głębokości z w obrazie mikroskopowym przy powiększeniu 20x.
Na obrazie mikroskopowym uwzględnij główne punkty orientacyjne w pobliżu, takie jak naczynia krwionośne lub łatwo rozpoznawalne wzory bądź pęczki dendrytów. Następnie wykonaj zdjęcie obrazu na żywo, używając cyfrowego aparatu fotograficznego trzymanego w ręku przed ekranem komputera. Potem zmień obiektyw mikroskopu na 2x i przejdź do sąsiedniego przekroju na preparacie.
Następnie dopasuj kontury wcześniej obrysowanego przekroju w widoku oprogramowania do granic LGN i TRN w nowym przekroju. Powróć do powiększenia 20x i wyrównaj obraz, korzystając z punktów orientacyjnych. Następnie, pomagając sobie zdjęciem zakończeń dendrytów z poprzednio obrysowanego przekroju, przesuń obrys w celu wyrównania dendrytów, używając najpierw narzędzia strzałki do zaznaczenia rekonstrukcji.
Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, wybierz opcję „move” (przesuń) z menu rozwijanego i odpowiednio przesuń zapis. Aby obrócić zapis, kliknij prawym przyciskiem myszy, wybierz opcję „rotate” (obróć) z menu rozwijanego i odpowiednio obróć zapis. Alternatywnie, wybierz narzędzie „match” (dopasuj) z górnego menu narzędzi i określ liczbę punktów do dopasowania.
Następnie kliknij zakończenie w rekonstrukcji oraz odpowiadający mu punkt kontynuacji na obrazie rzeczywistym, aby dopasować zakończenia dendrytów do ich początków. Gdy ślad z poprzednej sekcji zostanie wyrównany z dendrytami w nowej sekcji, dodaj nową sekcję do menedżera sekcji w ten sam sposób co wcześniej. Alternatywnie można po prostu wybrać sąsiednią sekcję utworzoną wcześniej i w ten sam sposób dostosować głębokość z.
Upewnij się, że w menedżerze sekcji wybrano odpowiednią nową sekcję, klikając w bieżącą sekcję. Następnie, po zwiększeniu powiększenia do 40x lub 60x, zaznacz dendryt za pomocą strzałki. Kliknij prawym przyciskiem myszy na koniec dendrytu z poprzedniej sekcji i wybierz opcję „add to ending” z menu rozwijanego.
Pojawi się monit z pytaniem, czy kontynuacja znajduje się w nowej sekcji. Kliknij tak. Następnie obrysuj kontynuację dendrytu, używając myszy jako narzędzia do rysowania.
Wykonaj zdjęcia zakończeń w celu przygotowania do dopasowania do kolejnego przekroju. Następnie dodawaj kontynuacje do śladów dendrytów, aż zostaną obrysowane co najmniej trzy przekroje dla danego neuronu lub do momentu, gdy dendryty nie będą już możliwe do śledzenia bądź odnalezienia. Używając programu ekstrakcyjnego powiązanego z systemem rekonstrukcji neuronów, otwórz ukończony plik rekonstrukcji.
Z rozwijanego menu Edycja wybierz opcję Zaznacz wszystkie obiekty. Z górnego paska narzędzi analizy wybierz Analiza struktury gałęzi, a następnie kliknij każdą zakładkę i wybierz pożądane opcje analizy w każdej z nich. Wyodrębnij wszystkie potrzebne dane, klikając przycisk OK w oknie analizy, a następnie zapisz je w formacie arkusza kalkulacyjnego, klikając prawym przyciskiem myszy w oknach wyjściowych i wybierając Eksportuj do Excel w celu przeprowadzenia dalszej analizy.
Na tej fotografii przedstawiono pojedynczy przekrój wieńcowy przez grzbietową część LGN u jednego zwierzęcia. Barwienie na cytochrom oksydazę służy do wizualizacji warstw LGN, a barwienie GFP oznacza miejsce wstrzyknięcia wirusa.
Strzałka wskazuje obszary gęsto rozmieszczonych, znakowanych retrogradnie neuronów jądra siatkowatego wzgórza. Orientacja przekroju jest zgodna z przedstawionym schematem kierunków grzbietowo-brzusznych i przyśrodkowo-bocznych. Pasek skali znajduje się w lewym dolnym rogu.
Na tym obrazie przedstawiono kontury LGN zaznaczone na czerwono oraz TRN na bordowo dla wszystkich przekrojów zawierających wstrzyknięty wirus, co wskazują czarne kontury. Żółte gwiazdki oznaczają środki miejsc wstrzyknięcia. Obraz przedstawia rendering 3D konturów oraz miejsca wstrzyknięcia.
Jest to mapa lokalizacji zrekonstruowanych neuronów TRN, zakodowanych kolorystycznie zgodnie z przypisaniem do klastra w obrębie pojedynczego zagregowanego konturu TRN przedstawionego w kolorze bordowym. Pasek skali reprezentuje 500 mikronów. Obraz ten przedstawia zagregowane kontury TRN w kolorze czarnym oraz LGN w kolorze szarym, z pięcioma zrekonstruowanymi neuronami TRN o barwach od ciepłych do zimnych, zależnie od ich położenia w osi przyśrodkowej i bocznej w obrębie TRN.
Pasek skali reprezentuje 500 mikronów. Fotografie te przedstawiają szczegóły tych samych pięciu neuronów TRN z dopasowanymi kolorystycznie paskami skali reprezentującymi 100 mikronów. To hierarchiczne drzewo dendrogramu ilustruje odległości powiązań między 160 zrekonstruowanymi neuronami TRN w oparciu o 10 niezależnych metryk morfologicznych i przedstawia ogólne wyniki analizy skupień.
Trzy odrębne skupiska neuronów TRN przedstawiono w kolorze niebieskim, zielonym i czerwonym. Po opanowaniu tych technik rekonstrukcji neuronalnej pojedynczy neuron można całkowicie zrekonstruować w ciągu jednej do dwóch godzin. Podczas rekonstrukcji neuronów ważne jest stałe monitorowanie i korygowanie głębokości z (z-depth).
Protokół opisany w niniejszym opracowaniu stanowi udoskonalenie tradycyjnych, bardziej subiektywnych metod analizy neuroanatomicznej i umożliwia badaczom poszukiwanie nowych podklas neuronów w oparciu o wielkoskalowe dane morfologiczne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak rekonstruować neurony poprzez analizę sąsiadujących przekrojów tkanki oraz jak ekstrahować dane morfologiczne do dalszej analizy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę rekonstrukcji morfologii neuronów oznakowanych za pomocą infekcji wstecznej zmodyfikowanym wirusem wścieklizny. Kładzie on nacisk na bezstronne analizy klastrów w celu scharakteryzowania odrębnych podklas neuronalnych na podstawie wskaźników morfologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- neuroanatomia
- biologia komórki
Wstęp
- Zrozumienie morfologii neuronów jest kluczowe dla klasyfikacji typów neuronów.
- Tradycyjne metody mogą wprowadzać błąd systematyczny w analizie morfologicznej.
- Zmodyfikowany wirus wścieklizny może skutecznie znakować specyficzne populacje neuronów.
- Obiektywne analizy skupień usprawniają charakterystykę podklas neuronów.
Cel badania
- W celu rekonstrukcji morfologii neuronów znakowanych wirusem.
- W celu przeprowadzenia obiektywnych analiz klastrowych populacji znakowanych neuronów.
- W celu ułatwienia kompleksowej charakterystyki odrębnych podklas neuronów.
Zastosowane metody
- Wybór dobrze odizolowanych neuronów do rekonstrukcji.
- Przypisanie odpowiedniej głębokości z dla dokładnej reprezentacji morfologicznej.
- Dopasowanie rozgałęzień w sąsiednich przekrojach tkanki.
- Użycie mikroskopu do ustawienia ostrości na barwionych przekrojach tkanki mózgowej.
Główne wyniki
- Skuteczna analiza morfologii neuronów na dużą skalę.
- Identyfikacja morfologicznie unikalnych typów neuronów.
- Obiektywna klasyfikacja odrębnych podklas neuronów.
- Pogłębione zrozumienie gromadzenia i analizy danych neuroanatomicznych.
Wnioski
- Protokół zapewnia solidne ramy dla rekonstrukcji morfologii neuronów.
- Obiektywne metody poprawiają dokładność klasyfikacji podklas neuronów.
- Podejście to może ułatwić przyszłe badania neuroanatomiczne.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Niniejszy protokół umożliwia wielkoskalową, bezstronną klasyfikację morfologiczną populacji neuronów, wspierając walidację celów w procesie odkrywania leków w neuronaukach poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w identyfikacji podtypów neuronów. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, dostarczając ilościowych i powtarzalnych wskaźników służących do minimalizacji ryzyka w odniesieniu do hipotez dotyczących celów związanych z funkcją obwodów neuronalnych. Pozycjonuje to fenotypowanie morfologiczne jako skalowalne narzędzie na etapie odkrywania, służące do priorytetyzacji celów o wysokiej ciągłości translacyjnej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez obiektywną klasyfikację podtypów neuronów w oparciu o parametry morfologiczne.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez ustanowienie kryteriów ilościowych pozwalających na rozróżnienie funkcjonalnie odmiennych populacji neuronów.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wyboru celu terapeutycznego poprzez powiązanie unikalności morfologicznej z potencjalną różnicą w odpowiedzi na leki w selektywnych populacjach neuronów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy neuronalne do dalszego opracowywania testów poprzez zdefiniowanie morfologicznie odrębnych podklas w celu uzyskania spójnych modeli komórkowych.
- Wartość operacyjna: Rozwiązuje problemy standaryzacji i powtarzalności testów poprzez ekstrakcję ilościowych danych morfologicznych odpowiednich dla platform wysokoprzepustowego screeningu obrazowego (high-content screening).
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w różnych populacjach neuronów poprzez ustanowienie transferowalnego przepływu pracy dla wielkoskalowej rekonstrukcji i klastrowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wspiera modelowanie układów istotnych dla chorób, umożliwiając klasyfikację typów neuronów w obszarach mózgu naczelnych, które są istotne dla celów terapeutycznych w zaburzeniach neuropsychiatrycznych.
- Zgodność przedkliniczna: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, dostarczając biomarkerów morfologicznych korelujących z aktywacją ścieżek specyficznych dla podtypów neuronów.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach badań poprzez walidację selektywności celu za pomocą kompleksowego profilowania morfologicznego populacji neuronów poza celem.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesów odkrywczych, od wczesnego testowania hipotez dotyczących punktów uchwytu po identyfikację związków wiodących, gdzie klasyfikacja morfologiczna dostarcza informacji dla screeningu związków w neuronalnych systemach modelujących chorobę.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie bezstronnej identyfikacji podklas neuronów, które mogą w różny sposób modulować obwody istotne dla przebiegu choroby.
- Screening: Zwiększa gotowość testów, dostarczając ilościowych wyników morfologicznych, które zapewniają spójność modeli neuronalnych wykorzystywanych do oceny związków.
- Analityka: Dostarcza statystyczną analizę klastrów i metryki morfologiczne, które umożliwiają porównanie populacji neuronów w różnych warunkach doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez profilowanie morfologiczne w neuronalnych systemach naczelnych o znaczeniu dla ludzkich celów terapeutycznych w mózgu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość ponownego wykorzystania profilowania neuroanatomicznego, które można zastosować w wielu populacjach neuronów i obszarach mózgu w celu walidacji celów w całym portfolio.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w walidacji celów terapeutycznych poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w klasyfikacji podtypów neuronów.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, odtwarzalność i skalowalność generowania danych morfologicznych pomiędzy różnymi laboratoriami i badaniami.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji go/no-go dzięki możliwości wczesnego ograniczania ryzyka związanego z celami terapeutycznymi w oparciu o specyficzność podklas neuronów, co redukuje ryzyko biologicznej porażki na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja decyzji o dalszym rozwoju projektów z uwzględnieniem ryzyka poprzez obiektywną klasyfikację morfologiczną populacji neuronów w modelach przedklinicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie neuroanatomicznego śledzenia (tracingu), mikroskopii konfokalnej oraz obsługi oprogramowania do rekonstrukcji 3D w celu dokładnego odwzorowania morfologii neuronów.
- Zależne od infrastruktury mikroskopowej umożliwiającej sekcjonowanie w osi z oraz obrazowanie fluorescencyjne grubych skrawków tkanki, a także narzędzi obliczeniowych do ekstrakcji morfologicznej i analizy skupień.
- Wymaga standaryzacji protokołów śledzenia oraz definicji parametrów morfologicznych między zespołami, aby zapewnić powtarzalność wyników w różnych ośrodkach i u różnych operatorów.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji przy stosowaniu metody w odniesieniu do różnych populacji neuronów, obszarów mózgu lub gatunków, ze względu na różnice w morfologii i wydajności znakowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują czasochłonny charakter ręcznego śledzenia oraz zależność od wysokiej jakości znakowania wirusowego i konserwacji tkanki w celu uzyskania wiarygodnych rekonstrukcji.
