Rekonstrukcje na dużą skalę i niezależne, bezstronne grupowanie oparte na wskaźnikach morfologicznych w celu klasyfikacji neuronów w selektywnych populacjach

Ten protokół opisuje zakrojone na szeroką skalę rekonstrukcje selektywnych populacji neuronów, oznaczonych po wstecznym zakażeniu zmodyfikowanym wirusem wścieklizny wyrażającym markery fluorescencyjne, oraz niezależne, bezstronne analizy klastrów, które umożliwiają kompleksową charakterystykę wskaźników morfologicznych wśród różnych podklas neuronów.

Celem tego protokołu jest opisanie kroków mających na celu rekonstrukcję morfologii neuronów znakowanych wirusem oraz przeprowadzenie niezależnych, bezstronnych analiz klastrów na populacjach znakowanych neuronów, aby umożliwić kompleksową charakterystykę wskaźników morfologicznych wzdłuż różnych podklas neuronów. Przedstawiamy nowatorskie podejście do zbierania i analizowania danych neuroanatomicznych, aby ułatwić bardziej kompleksowe pobieranie próbek i bezstronną klasyfikację morfologicznie unikalnych typów neuronów w selektywnej populacji neuronów. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia analizę morfologii neuronów na dużą skalę i wykorzystuje bezstronne metody do klasyfikowania odrębnych podklas neuronów.

Najtrudniejszymi aspektami rekonstrukcji morfologicznych są wybór dobrze izolowanych neuronów do rekonstrukcji, przypisanie odpowiedniej głębokości z i wyrównanie altan w celu kontynuowania rekonstrukcji w sąsiednich odcinkach tkanek. Rozpocznij rekonstrukcję od wybrania szkiełka zawierającego barwiony 50-mikronowy wycinek tkanki mózgowej od naczelnego, któremu stereotaktycznie wstrzyknięto zmodyfikowany wirus wścieklizny wykazujący ekspresję EGFP. Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka mikroskopowego i skup się na pojedynczej sekcji zainteresowania za pomocą obiektywu o małym powiększeniu.

Upewnij się, że obraz z kamery jest widoczny na obrazie na żywo, prawidłowo ustawiając migawkę kamery. Wybierz rozsądnie wyizolowany, oznakowany neuron w interesującej nas strukturze mózgu, aby umożliwić jednoznaczną rekonstrukcję arboryzacji dendrytycznej. Przełącz się na 10-krotne powiększenie i ustaw ostrość obszaru.

Preferencyjnie wybieraj neurony, jeśli ciało komórki znajduje się w całości w jednej sekcji, aby dokładnie oszacować jej obszar i okrągłość. Po wybraniu dobrze wybarwionego, dobrze wyizolowanego neuronu, kliknij przycisk nowej sekcji w oprogramowaniu, aby dodać sekcję domową zawierającą ciało komórki do menedżera sekcji. Wprowadź liczbę przekrojów, które mają zostać uwzględnione w przebudowie.

Na początek zaleca się wstawienie dwóch do trzech sekcji. Przypisz grubość przekroju 50 mikronów. Wybierz dwa obiektywy x, a następnie kliknij przycisk konturu na górnym pasku narzędzi i wybierz typ konturu z menu rozwijanego.

Obrysuj kontur struktury docelowej, klikając za pomocą myszy punkty wzdłuż konturu. Po zakończeniu obrysowywania konturu kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz z menu opcję Zamknij kontur, aby zamknąć kontur. Następnie, gdy widok nadal znajduje się na dwóch x, kliknij żądany symbol znacznika na lewym pasku narzędzi.

Następnie kliknij środek struktury docelowej, aby umieścić znacznik. Po zakończeniu konturów wybierz obiektyw 40x lub 60x, aby obrysować kontur korpusu komórki. Następnie wybierz przycisk śledzenia neuronów na górnym pasku narzędzi i wybierz strukturę neuronu do śledzenia, w tym przypadku ciało komórki, z menu rozwijanego.

Śledź ciało komórki, klikając punkty wokół największego obszaru ciała komórki, dostosowując głębokość z w razie potrzeby, aby ustawić ostrość ciała komórki. I klikając prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć kontur ciała komórki. Następnie umieść inny znacznik stylu na środku konturu ciała komórki, upewniając się, że znacznik znajduje się mniej więcej w środku na głębokości z.

Bardzo ważne jest, aby ustalić prawidłową głębokość z w sekcji głównej, a także w sąsiednich sekcjach, przed rozpoczęciem każdego śledzenia, aby wartości osi Z były dokładne. Aby rozpocząć śledzenie altan dendrytycznych, wybierz dendryt z górnego menu rozwijanego.

Następnie śledź każdy dendryt, zaczynając od ciała komórki. Gdy dendryt rozgałęzia się, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz węzeł rozwidlający lub węzeł trifurkacyjny, aby umieścić węzeł w tym punkcie rozgałęzienia. Pamiętaj, aby dostosować głębokość z w całym śledzeniu, aby dokładnie uchwycić kąt i kierunek dendrytu.

Na końcu dendrytu w tej sekcji kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz zakończenie z menu rozwijanego. Po prześledzeniu wszystkich altan dendrytycznych w sekcji domowej zidentyfikuj te zakończenia dendrytyczne, które prawdopodobnie będą kontynuowane w sąsiedniej sekcji. I ustaw je na odpowiedniej głębokości z na obrazie mikroskopowym z 20-krotnie.

Uwzględnij główne punkty orientacyjne w pobliżu, takie jak naczynia krwionośne lub łatwo rozpoznawalne wzory lub wiązki dendrytów na obrazie mikroskopowym. Następnie zrób zdjęcie obrazu na żywo za pomocą aparatu cyfrowego przyłożonego do ekranu komputera. Następnie ustaw obiektyw mikroskopu na dwa x i przejdź do sąsiedniej sekcji na szkiełku.

Następnie wyrównaj kontury poprzednio obrysowanego odcinka w widoku oprogramowania z granicami LGN i TRN w nowej sekcji. Wróć do 20x i wyrównaj za pomocą punktów orientacyjnych. Następnie, za pomocą zdjęcia zakończeń dendrytów z wcześniej narysowanego odcinka, przesuń obrys, aby wyrównać dendryty, najpierw używając narzędzia strzałki, aby wybrać rekonstrukcję.

Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz przenieś z menu rozwijanego i odpowiednio przesuń śledzenie. Aby obrócić obrys, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Obróć z menu rozwijanego, a następnie odpowiednio obróć obrys. Alternatywnie wybierz narzędzie do dopasowywania z listy rozwijanej górnych narzędzi i wybierz liczbę punktów do dopasowania.

Następnie kliknij na zakończenie w rekonstrukcji i odpowiadający mu punkt kontynuacji na obrazie na żywo, aby dopasować zakończenia dendrytyczne do początków. Gdy śledzenie z poprzedniej sekcji zostanie wyrównane z dendrytami w nowej sekcji, dodaj nową sekcję do menedżera sekcji, tak jak poprzednio. Alternatywnie, po prostu wybierz sąsiedni przekrój, który został utworzony wcześniej, i dostosuj głębokość z w ten sam sposób.

Upewnij się, że odpowiednia nowa sekcja jest wybrana w menedżerze sekcji, klikając bieżącą sekcję. Następnie, po zwiększeniu powiększenia do 40x lub 60x, należy wybrać dendryt za pomocą strzałki. Kliknij prawym przyciskiem myszy na końcu dendrytu z poprzedniej sekcji i wybierz dodaj do zakończenia z menu rozwijanego.

Pojawi się monit z pytaniem, czy kontynuacja znajduje się w nowej sekcji. Kliknij przycisk Tak. Następnie prześledź kontynuację dendrytu, używając myszy jako narzędzia do rysowania.

Zrób zdjęcia zakończeń, przygotowując się do wyrównania do następnej sekcji. Następnie dodaj kontynuacje do śledzenia dendrytycznego, aż co najmniej trzy sekcje zostaną prześledzone dla neuronu lub do momentu, gdy dendryty nie będą już mogły być śledzone lub znajdowane. Korzystając z programu do ekstrakcji powiązanego z systemem rekonstrukcji neuronów, otwórz ukończony plik rekonstrukcji.

Z menu rozwijanego edycji wybierz opcję wybierz wszystkie obiekty. Z górnego paska narzędzi analizy wybierz analizę struktury gałęzi, a następnie kliknij każdą zakładkę i wybierz żądane opcje analizy w każdej zakładce. Wyodrębnij wszystkie żądane dane, klikając przycisk OK w oknie analizy i zapisz w formacie arkusza kalkulacyjnego, klikając prawym przyciskiem myszy okna wyjściowe i wybierając eksport do Excela w celu dalszej analizy.

Fotografia ta pokazuje pojedynczy przekrój koronalny przez grzbietowy LGN jednego zwierzęcia. Barwienie oksydazą cytochromową służy do wizualizacji warstw LGN. A barwienie GFP oznacza miejsce wstrzyknięcia wirusa.

Strzałka wskazuje obszary gęstych, wstecznie oznaczonych, siatkowatych neuronów jądra wzgórzowego. Orientacja przekroju jest zgodna z pokazanym grzbietowym brzusznym przyśrodkowym bocznym kompasem. Pasek skali jest zilustrowany w lewym dolnym rogu.

Na tym zdjęciu przedstawiono kontury LGN w kolorze czerwonym i TRN w kolorze bordowym dla wszystkich odcinków zawierających wstrzyknięcie wirusa, jak wskazano czarnymi konturami. Żółte gwiazdki oznaczają środki miejsc wstrzyknięcia. Ten obraz przedstawia renderowanie 3D konturów i miejsca iniekcji.

Jest to mapa lokalizacji zrekonstruowanych neuronów TRN oznaczona kolorami zgodnie z przyporządkowaniem klastrów w obrębie pojedynczego zagregowanego konturu TRN pokazanego w kolorze bordowym. Pasek skali reprezentuje 500 mikronów. Obraz ten pokazuje zagregowane kontury TRN w kolorze czarnym i LGN w kolorze szarym z pięcioma zrekonstruowanymi neuronami TRN w kolorze ciepłym do chłodnego zgodnie z ich przyśrodkowym położeniem bocznym w TRN.

Pasek skali reprezentuje 500 mikronów. Fotografie te pokazują szczegóły tych samych pięciu neuronów TRN z dopasowanymi kolorystycznie paskami skali reprezentującymi 100 mikronów. To hierarchiczne drzewo dendrogramu ilustruje odległości połączeń między 160 zrekonstruowanymi neuronami TRN w oparciu o 10 niezależnych wskaźników morfologicznych i pokazuje ogólne wyniki analizy skupień.

Trzy odrębne klastry neuronów TRN są zilustrowane na niebiesko, zielono i czerwono. Po opanowaniu tych technik rekonstrukcji neuronów, pojedynczy neuron może zostać całkowicie zrekonstruowany w ciągu jednej do dwóch godzin. Ważne jest, aby stale monitorować i dostosowywać głębokość z podczas rekonstrukcji neuronów.

Przedstawiony tutaj protokół stanowi ulepszenie tradycyjnych, bardziej stronniczych metod analizy neuroanatomicznej i umożliwia naukowcom badanie nowych podklas neuronów w oparciu o dane morfologiczne na dużą skalę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rekonstruować neurony za pomocą sąsiednich odcinków tkanek i wyodrębniać dane morfologiczne do dalszej analizy.