Name: In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji in utero do badania łączności strukturalnej i pobudliwości neuronów korowych. Technika ta umożliwia analizę pojedynczych komórek nerwowych w neurobiologii rozwojowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni R. Gutiérrezowi i A. Moralesowi za doskonałą pomoc techniczną oraz L. A. Weissowi za redakcję. C.G.B. jest finansowany przez hiszpańskie Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Praca ta została sfinansowana z grantu Fundacji BBVA i SAF2014-58598-JIN (MINECO) dla M. Navarrete oraz z grantu Fundacji Ramón Areces i grantów SAF2014-52119-R i BFU2014-55738-REDT (z MINECO) dla M. Nieto.

<ol><li>Dehorter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+fast-spiking+interneuron+properties+by+an+activity-dependent+transcriptional+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch.</a> Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).</li>
<li>Rodriguez-Tornos, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cux1+Enables+Interhemispheric+Connections+of+Layer+II%2FIII+Neurons+by+Regulating+Kv1-Dependent+Firing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing.</a> Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+postnatal+electroporation+and+time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+mouse+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices.</a> J Vis Exp. (81), (2013).</li>
<li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortex-%2C+Hippocampus-%2C+Thalamus-%2C+Hypothalamus-%2CLateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+Utero+Electroporation+in+the+C57BL%2F6+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> J Vis Exp. (107), (2016).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (31), (2009).</li>
<li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Woodworth, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip1+Regulates+the+Balance+between+Specification+of+Distinct+Projection+Neuron+Subtypes+in+Deep+Cortical+Layers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers.</a> Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).</li>
<li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transportable%2C+inexpensive+electroporator+for+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation.</a> Dev Growth Differ. , (2015).</li>
<li>Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+I.+A+quantitative+study+of+Golgi-impregnated+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons.</a> J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).</li>
<li>Miller, M., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+II.+A+combined+Golgi-electron+microscope+study+of+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).</li>
<li>Cubelos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cux-2+controls+the+proliferation+of+neuronal+intermediate+precursors+of+the+cortical+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone.</a> Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).</li>
<li>Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Control+of+a+Neuronal+Protein+Using+a+Genetically+Encoded+Unnatural+Amino+Acid+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intrinsic+properties+and+excitability+of+layer+2%2F3+pyramidal+neurons+during+a+critical+period+for+sensory+maps+in+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex.</a> J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół ten szczegółowo opisuje, jak oznaczać neurony kory somatosensorycznej myszy C75BL / 6 w celu analizy ich połączeń i pobudliwości. W odniesieniu do istniejących metod, wizualizuje rozróżniające aspekty łączności, takie jak liczba gałęzi aksonalnych na neuron, ich dokładna topografia i lokalizacja anatomiczna. Zmieniając położenie elektrod, możliwe jest celowanie w inne populacje neuronów, takie jak kora obręczy (zachowaj ten sam kąt między elektrodami a mózgiem, ale zmień orientację biegunów) lub hipokamp<sup cla...

Rozwój struktur dendrytycznych i aksonalnych jest ważnym aspektem regulacji obwodów w układzie nerwowym, w tym w korze mózgowej. Odgrywa kluczową rolę podczas selektywnego okablowania różnych subpopulacji neuronów. Szereg ostatnich doniesień wykazało, że oprócz łączności, różnorodność molekularna neuronów znajduje odzwierciedlenie w nabywaniu wysoce specyficznych sposobów odpalania. Jednak mechanizmy decydujące o pobudliwości i łączności różnych podtypów neuronów podczas rozwoju, a także o stopniu ich koordynacji, są nadal słabo poznane1,2.
Analizy in vivo utraty i wzmocnienia funkcji pozwalają na badanie związku między poziomem ekspresji określonych genów a ich wpływem na rozwój obwodu. Elektroporacja in utero (IUE) jest techniką szeroko stosowaną do badania funkcji genu będącego przedmiotem zainteresowania w określonych populacjach neuronów oraz do badania ogólnych wzorców ich połączeń. Jednak, aby określić cechy morfologiczne aksonów i dendrytów w warstwach korowych u żywych myszy, konieczne jest rzadkie oznaczanie neuronów. System rekombinacji Cre w połączeniu z IUE może być używany do oznaczania rzadkiej populacji neuronów o wystarczająco niskiej gęstości, aby rozdzielić projekcje emitowane przez poszczególne komórki zidentyfikowanych blaszek korowych. Metoda ta oznacza wystarczającą liczbę neuronów na korę, aby uzyskać dane ilościowe po analizie rozsądnej liczby mózgów poddanych elektroporacji (ryc. 1). Niniejszy manuskrypt przedstawia metodę takiej dokładnej analizy łączności. Przedstawiono również podobną strategię analizy, w oddzielnych eksperymentach, właściwości elektrycznych neuronów poprzez wykonywanie zapisów cęgów prądowych na komórkach elektroporowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) z ostrych wycinków kory mózgowej. Protokoły te są wszechstronne i mogą być stosowane do badania pobudliwości i połączeń neuronów WT i zwierząt transgenicznych, a także neuronów, w których straty i zyski funkcji są wprowadzane przez dodatkowe plazmidy podczas IUE.
Chociaż ten protokół opisuje elektroporację myszy w dniu embrionalnym (E)15.5, ta technika może być wykonywana w każdym wieku między E9.53 a dniem po urodzeniu (P)24. Podczas gdy elektroporacja we wczesnych stadiach jest ukierunkowana na neurony i prekursory wzgórza oraz głębokich warstw kory mózgowej, elektroporacja na późniejszym etapie oznacza bardziej powierzchowne warstwy (np. E15.5 IUE celuje w neurony warstwy II-III). Podsumowując, połączenie IUE z analizą morfologiczną pojedynczych komórek i elektrofizjologią jest użytecznym narzędziem do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw ogromnej różnorodności strukturalnej i funkcjonalnej neuronów w układzie nerwowym.

<table><tbody><tr><td>pCAG-Cre</td><td>Addgene</td><td>13775</td><td></td></tr><tr><td>pCALNL-GFP</td><td>Addgene</td><td>13770</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-DsRed2</td><td>Addgene</td><td>15777</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Carl Roth</td><td>301.1</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Karprofen (Rimadyl)</td><td>Pfizer GmbH</td><td>1615 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran (IsoFlo)</td><td>Abbott (Esteve)</td><td>1385 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Imalgen)</td><td>Merial</td><td>2528-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna (Xilagesic)</td><td>Calier</td><td>0682-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Powidon Jod</td><td>Meda</td><td>694109.6</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu (Lipolac)</td><td>Angelini</td><td>65.277</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela # 3 - 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela # 10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Adson ząbkowane - proste 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>Hartowane drobne nożyczki - proste 11 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Mezenbaum-Nelson zakrzywione L=14,5 cm</td><td>Teleflex</td><td>PO143281</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie zakrzywione końcówki - Styl 7 Dumoxel</td><td>Dumont</td><td>0303-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę Mathieu - ząbkowany</td><td>drobno Narzędzia naukowe</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>Aplikacja AutoClip</td><td>Braintree scientific, Inc</td><td>ACS&nbsp; APL</td><td></td></tr><tr><td>9 mm AutoClips</td><td>MikRon Precision, Inc.</td><td></td><td></td>205016</tr><tr><td>Szwy - Maszynka do golenia Polysorb 6-0</td><td>Covidien</td><td>UL-101</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Kapilary ze</td> szkła borokrzemianowego <td>Panasonic ER 240</td><td></td></tr><tr><td>(100 mm, 1,0/0,58 średnica zewnętrzna/wewnętrzna)</td><td>World Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Zespoły probówek aspiracyjnych do kalibrowanych pipet mikrokapilarnych</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Gaza (Aposan)</td><td>Laboratorios Indas, S.A.U.</td><td>CN 482232.8</td><td></td></tr><tr><td>Waciki bawełniane (Star Cott)</td><td></td><td>Albasa-igła</td><td></td></tr> <tr><td>25 g (BD Microlance 3)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Związek OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 100 x 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag Przeciwciało poliklonalne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11122</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne, koniugat Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator ECM 830&nbsp;</td><td>Aparat BTX Harvard</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody platynowe 650P 7 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P7</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop&nbsp; do obrazowania fluorescencyjnego - MZ10F</td><td>Parownik</td> izofluorowy <td>Leica-VIP</td><td></td></tr> <tr><td>3000</td> System skanowania laserowego Matrx-TCS-SP5 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td> Leica-Axiovert <td></td></tr><tr><td>200</td><td>Zeiss-Cryostat</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- CM 1950</td><td></td> Leica-P-97 <td></td><td></td></tr><tr><td>Micropette Puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy zacisków krosowych (p-Clamp Clampfit 10.3)</td><td></td>Oprogramowanie do akwizycji <td>urządzeń</td><td></td> molekularnych</tr> <tr><td>(wzmacniacz MultiClamp 700B)</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>DD1440A</td><td></td></tr><tr><td>zmotoryzowany mikromanipulator + obrotowa podstawa&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Stół powietrzny</td><td>Newport-Miniaturowe</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>pompy perystaltyczne</td><td>WPI-</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in utero (w macicy) podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

Układ nerwowy składa się z ogromnej liczby różnych typów neuronów. Te subpopulacje neuronalne charakteryzują się, między innymi, odrębną morfologią dendrytyczną, specyficznymi wzorcami połączeń aksonalnych i selektywnymi reakcjami na odpalanie. Mechanizmy molekularne i komórkowe odpowiedzialne za te aspekty różnicowania podczas rozwoju są nadal słabo poznane.
Tutaj opisujemy połączone protokoły do oznaczania i charakteryzowania strukturalnej łączności i pobudliwości neuronów korowych. Modyfikacja protokołu elektroporacji in utero (IUE) umożliwia znakowanie rzadkiej populacji neuronów. To z kolei umożliwia identyfikację i śledzenie dendrytów i aksonów poszczególnych neuronów, precyzyjną charakterystykę laminarnego położenia projekcji aksonalnych oraz analizę morfometryczną. IUE może być również używany do badania zmian w pobudliwości neuronów typu dzikiego (WT) lub genetycznie modyfikowanych poprzez połączenie go z zapisem całych komórek z ostrych wycinków mózgów poddanych elektropostacji. Te dwie techniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia sprzężenia połączeń strukturalnych i funkcjonalnych oraz mechanizmów molekularnych kontrolujących różnorodność neuronów podczas rozwoju. Te procesy rozwojowe mają ważne implikacje dla okablowania aksonów, funkcjonalnej różnorodności neuronów i biologii zaburzeń poznawczych.

Aby szczegółowo scharakteryzować zmiany morfologiczne neuronów w trakcie rozwoju, niezbędne jest rzadkie znakowanie neuronów. System z rozcieńczoną rekombinazą Cre umożliwia ekspresję interesującego genu w rzadkiej populacji neuronów, tak że tylko te neurony, które włączą ten enzym, wykazują ekspresję GFP (Rysunek 1A). Stosując tę strategię, warstwa II-III jest ukierunkowana i znakowana za pomocą IUE w dniu E15.5. CAG-DsRed2 w stężeniu 1 µg/µL jest ko-elektroporowany jako...

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Ogólnym celem tego podejścia z wykorzystaniem elektroporacji in utero jest charakterystyka łączności strukturalnej i pobudliwości neuronów korowych w warunkach prawidłowych oraz eksperymentalnych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii rozwojowej, takie jak analiza struktury i łączności funkcjonalnej mózgu oraz biologia zaburzeń poznawczych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na znakowanie rzadkiej populacji neuronów oraz umożliwia obrazowanie dendrytów i dostęp do poszczególnych neuronów, co prowadzi do bardziej efektywnej i wierniejszej analizy ilościowej.Przed iniekcją należy przygotować dziesięć mikrolitrów mieszaniny DNA na każdy zabieg, zarówno w przypadku znakowania pojedynczych komórek, jak i standardowych badań metodą patch clamp. Następnie, delikatnie manipulując zarodkami za pomocą pęsety, należy zlokalizować telencefalon. W kolejnym kroku przygotowaną kapilarę borokrzemianową należy umieścić w pipecie ustnej.Przesuń końcówkę igły przez macicę, unikając naczyń krwionośnych, aż dotrze ona do komory bocznej. Następnie powoli wstrzyknij około 1 µL roztworu DNA z barwnikiem Fast Green, aż pojawi się duża niebieska plama. Krytycznym etapem tej procedury jest wstrzyknięcie DNA.Czynność tę należy wykonywać jak najdelikatniej. Następnie należy umieścić siedmiomilimetrowe elektrody platynowe bocznie na głowie zarodka i przyłożyć napięcie za pomocą elektrod platynowych. W tej procedurze należy przeprowadzić krioprotekcję utrwalonych mózgów w 10 mL 30% sacharozy w PBS w temperaturze 4 °C przez jeden do dwóch dni, aż opadną na dno.Następnie przygotować sześciany z folii aluminiowej o boku jednego centymetra i wypełnić je w 2/3 objętości OCT. Po tym czasie umieścić mózgi w sześcianach i zamrozić je na suchym lodzie. Następnie zamrożone mózgi przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza.Aby wykonać seryjne cięcia mózgu w kriotomie, nanieść kroplę OCT na powierzchnię tarczy do preparatów. Zdjąć folię aluminiową z bloku histologicznego i ustawić blok w pożądanej orientacji na powierzchni płynnego OCT. Mocno docisnąć, aż blok histologiczny zostanie utrwalony.Następnie włóż dysk z preparatem do głowicy kriostatu i zorientuj go pod kątem cięcia. Następnie wykonaj przekroje o grubości 50-100 µm i przenieś pływające skrawki mrożone do PBS za pomocą cienkiego pędzla. Następnie inkubuj skrawki w celu blokowania przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w 5% fetal bovine serum w PBS zawierającym 0,5% Triton X-100.Następnie inkubuj je przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałem pierwszorzędowym w rozcieńczeniu 1:500 w roztworze blokującym. Następnego dnia przemyj preparaty trzykrotnie w PBS. Dodaj przeciwciało wtórne w rozcieńczeniu 1:500 w roztworze blokującym i inkubuj preparaty przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie przemyć preparaty trzy razy w PBS. Po tym czasie przeprowadź barwienie kontrastowe preparatów za pomocą dapE w PBS zawierającym 0,5% Triton X-100 przez dziesięć minut. Przepłucz preparaty w PBS i zamknij je w medium montażowym.Aby zrekonstruować neurony, należy pozyskać obrazy przekrojów mózgu z dużym powiększeniem i wysoką rozdzielczością. Następnie w oprogramowaniu do akwizycji należy wybrać funkcję Tile Scan, aby objąć obszar zainteresowania, obejmujący wszystkie dendryty i wypustki aksonalne. Należy zebrać wystarczającą liczbę stosów w osi Z, aby uniknąć utraty informacji.Następnie otwórz obraz i wybierz z menu opcję linii segmentowanej. Narysuj linię wzdłuż struktury neuronu. Następnie przejdź do Analyze, Tools, a następnie ROI manager i wybierz Add, aby zapisać linię.Powtórz ten proces dla każdego aksonu lub dendrytu analizowanego neuronu. W menu ROI Manager kliknij Measure, aby uzyskać długość. Wyeksportuj pomiary do pliku tekstowego lub arkusza kalkulacyjnego w celu przeprowadzenia analizy.Aby przeprowadzić rejestrację neuronu wykazującego ekspresję GFP z myszy poddanej elektroporacji GFP, należy umieścić mózg w schłodzonej szalce hodowlanej. Odciąć móżdżek za pomocą małych nożyczek. Następnie podnieść mózg szpatułką i osuszyć go za pomocą ręcznika papierowego.Przykleić brzuszną płaszczyznę ogonową mózgu do uchwytu wibratomu. Umieścić uchwyt w wibratomie wypełnionym lodowatym ACSF i zapewnić ciągłą karbogenyzację komory wibratomu. Następnie uzyskać ostre skrawki, wykonując przekroje wieńcowe o grubości 300 micrometer w ciągu 15 minut.Następnie inkubuj świeże skrawki w temperaturze 25 °C przez co najmniej 60 minut w ACSF, napowietrzając roztwór karbogenem. Po 60 minutach przenieś skrawek do komory rejestracyjnej za pomocą pipety Pasteura lub małego pędzla. Unieruchom skrawek za pomocą harfy i perfunduj go ACSF z przepływem 2 mL/min.Aby wykonać patch-clamp neuronu wykazującego ekspresję GFP, zlokalizuj obszar zainteresowania za pomocą mikroskopu przy powiększeniu 10x. Następnie odszukaj komórkę GFP-dodatnią, używając obiektywu 60x. W kolejnym kroku napełnij elektrodę rejestrującą roztworem wewnątrzkomórkowym.Następnie umieść szklaną pipetę w uchwycie do pipet. Potem wprowadź końcówkę pipety do kąpieli i ustaw ostrość na końcówce. Gdy pipeta znajdzie się w kąpieli, przyłóż dodatnie ciśnienie za pomocą systemu kontroli przeciwciśnienia.Zbliż się do wybranej komórki pod kontrolą wizualną, utrzymując ciśnienie wsteczne w pipecie. Po pojawieniu się niewielkiego wgłębienia na powierzchni komórki, zwolnij nacisk. W tym momencie może zostać utworzone szczelne połączenie (seal) o rezystancji przekraczającej jeden gigaom.W przeciwnym razie należy zastosować lekkie podciśnienie, aby ułatwić ten proces. Podczas tworzenia się uszczelnienia, należy ustawić potencjał utrzymujący (holding voltage clamp) na 60 millivolts. Po uzyskaniu uszczelnienia gigaomowego należy zastosować impuls ssania, aby przerwać błonę komórkową i przejść w tryb całej komórki (whole cell mode).Po przejściu w tryb whole-cell, przełącz z trybu clampy napięciowej na tryb clampy prądowej i rozpocznij rejestrację. Przedstawione obrazy pokazują dostarczenie wektorów do neuronów warstwy 2/3 za pomocą elektroporacji in utero w 15,5 dniu embrionalnym; przekroje czołowe przygotowano w 16 dniu postnatalnym. Jako kontrolę zastosowano kotransfekcję wektorem CAG DsRed2.GFP jest ekspresyjne tylko w tych neuronach, które włączyły również cre, co umożliwia rekombinację miejsc LoxP w wektorze CALNL GFP. Poniżej znajduje się obraz konfokalny przy dużym powiększeniu przedstawiający drzewa dendrytyczne innego, rzadko znakowanego neuronu GFP. Jest to neuron piramidalny elektroporowany GFP, obserwowany w warunkach jasnego pola oraz fluorescencji zielonej.Oto typowa, regularna odpowiedź impulsowa neuronu kontrolnego w warstwie 2/3, poddanego elektroporacji CAG-GFP. Po opanowaniu techniki, w przypadku elektroporacji in utero, procedura ta może zająć 30 minut, a rejestracja patch-clamp pół dnia, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przeprowadzeniu operacji tak szybko, jak to możliwe, aby zredukować stres matki i zwiększyć szanse przetrwania młodych.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza ekspresji, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące związku między ekspresją specyficznych genów a ich wpływem na rozwój substytutu. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu neuronauki rozwojowej do badania łączności i morfologii neuronów u myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania operacji in utero do opisu struktury i łączności neuronów na poziomie pojedynczych komórek oraz pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie.

in-utero-electroporation-approaches-to-study-excitability-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Kontrola ekspansji somatycznych komórek macierzystych jest głównym czynnikiem utrudniającym ich badanie oraz zastosowanie w terapii. W niniejszym opracowaniu opisujemy system czasowej kontroli ekspansji neuronalnych komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym, który może zostać wykorzystany do zwiększenia liczby neuronów generowanych w mózgu myszy.

Ekspansja embrionalnych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego poprzez elektroporację in utero lub stereotaksycyjne wstrzyknięcie wirusowe

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół elektroporacji in utero kory mózgowia oraz hipokampa u myszy w stadium E14.5. Wykazujemy również, że jest to cenna metoda badania dendrytów i kolców dendrytycznych w tych dwóch obszarach mózgu.

Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgu i hipokampie myszy z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Film demonstruje metodę badania pobudliwości komórek neuronalnych wyrażających białko fluorescencyjne za pomocą cęgów prądowych dla całych komórek. W trybie cęgowym generowane są potencjały czynnościowe wskazujące na pobudliwość neuronów.

Badanie pobudliwości neuronów fluorescencyjnych za pomocą klamry krosowej dla całych komórek

Ten protokół opisuje ulepszoną procedurę eksplantacji, która obejmuje elektroporację ex utero, sekcję i hodowlę całych półkul mózgowych od embrionalnej myszy. Preparat ułatwia badania farmakologiczne i testy funkcji genów we wczesnym okresie rozwoju kory mózgowej.

Ex utero Elektroporacja i eksplantaty całej półkuli: prosta metoda eksperymentalna do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej

Ta procedura pokazuje, jak celować w interneurony w rozwijającym się przodomózgowiu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Technika ta okazała się szczególnie skuteczna w osiąganiu selektywnej ekspresji genów w podtypach interneuronów przeznaczonych do powierzchownych warstw kory mózgowej.

Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Poznaj metodę elektroporacji in utero do badania łączności strukturalnej i pobudliwości neuronów korowych. Technika ta umożliwia analizę pojedynczych komórek nerwowych w neurobiologii rozwojowej.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Przeglądaj więcej filmów