In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

Ogólnym celem tego podejścia do elektroporacji in utero jest scharakteryzowanie połączeń strukturalnych i pobudliwości neuronów korowych w warunkach normalnych i eksperymentalnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurobiologii rozwojowej, takie jak analiza struktury i funkcjonalnej łączności mózgu oraz biologii zaburzeń poznawczych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na oznaczenie rzadkiej populacji neuronów i pozwala na ubieranie dendrytów i dostęp do poszczególnych neuronów, co prowadzi do bardziej wydajnej, bardziej fimetycznej analizy ilościowej.

Przed wstrzyknięciem należy przygotować dziesięć mikrolitrów mieszaniny DNA na operację do znakowania pojedynczych komórek lub standardowego badania z użyciem klamry. Następnie delikatnie manipuluj zarodkami palcami, aby zlokalizować kresomózgowie. Następnie umieść przygotowaną kapilę borokrzemianową w pipecie do ust.

Przełóż końcówkę igły przez macicę, omijając naczynia krwionośne, aż dotrze do komory bocznej. Następnie powoli wstrzyknij około jednego mikrolitra roztworu DNA w kolorze Fast Green, aż do zaobserwowania dużej niebieskiej plamki. Krytycznym krokiem w tej procedurze jest wstrzyknięcie DNA.

Należy to zrobić tak delikatnie, jak to możliwe. Teraz umieść siedmiomilimetrowe platynowe elektrody bocznie na głowie zarodka i przyłóż napięcie do platynowych elektrod. W tej procedurze krioprotekcjonij unieruchomione mózgi w dziesięciu mililitrach 30% sacharozy w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni, aż opadną.

Następnie przygotuj jednocentymetrową kostkę z folii aluminiowej i wypełnij kostkę w 2/3 lub w ten sposób OCT. Następnie włóż mózgi do kostki i zamroź je na suchym lodzie. Następnie przechowuj zamrożone mózgi w temperaturze 80 stopni Celsjusza.

Aby podzielić mózgi na sekcje w kriostacie, umieść kroplę OCT na powierzchni krążka próbki. Oderwij folię aluminiową od bloku histologicznego i umieść blok w pożądanej orientacji na wierzchu płynnego OCT. Zastosuj mocny nacisk, aż blok histologiczny zostanie utrwalony.

Następnie włóż krążek próbki do głowicy próbki kriostatu i ustaw próbkę do podziału. Następnie pokrój skrawki o grubości 50-100 mikrometrów i przenieś pływające kriosekcje do PBS za pomocą cienkiej szczotki. Następnie zablokuj skrawki na godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą 5% płodowej surowicy bydlęcej w PBS, zawierającej 0,5% Triton X-100.

Następnie inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z przeciwciałem pierwszorzędowym w stosunku 1:500 rozcieńczonym w roztworze blokującym. Następnego dnia umyj skrawki trzy razy w PBS. Dodać przeciwciało drugorzędowe w stosunku 1:500 rozcieńczone w roztworze blokującym i inkubować skrawki przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie umyj sekcje trzy razy w PBS. Następnie przebarwić skrawki dapE w PBS zawierającym 0,5% Triton X-100 przez dziesięć minut. Przepłucz sekcje PBS i zamontuj je za pomocą medium montażowego.

Aby zrekonstruować neurony, uzyskaj obrazy sekcji mózgu w dużym powiększeniu i wysokiej rozdzielczości. Następnie wybierz Tile Scan w oprogramowaniu do akwizycji, aby pokryć obszar zainteresowania, obejmujący wszystkie dendryty i procesy aksonalne. Zdobądź wystarczającą liczbę stosów na osi Z, aby uniknąć utraty informacji.

Następnie otwórz obraz i wybierz z menu opcję linii segmentowanej. Narysuj linię podążającą za strukturą neuronu. Następnie przejdź do Analizuj, Narzędzia, następnie Menedżer ROI, a następnie Dodaj, aby zapisać linię.

Powtórz ten proces dla każdego aksonu lub dendrytu analizowanego neuronu. W menu Menedżer zwrotu z inwestycji naciśnij Zmierz, aby uzyskać długość. Eksportuj pomiary do pliku tekstowego lub arkusza kalkulacyjnego w celu analizy.

Aby wykonać zapis neuronu wyrażającego GFP od myszy poddanej elektropostacji GFP, umieść mózg w schłodzonym naczyniu hodowlanym. Odetnij móżdżek małymi nożyczkami. Następnie podnieś mózg szpatułką i osusz go na ręczniku papierowym.

Przyklej brzuszną płaszczyznę ogonową mózgu do uchwytu Vibratome. Umieść uchwyt na Vibratome wypełnionym lodowatym ACSF i upewnij się, że komora Vibratome ma ciągłą karbonizację. Następnie uzyskaj ostre plastry, wycinając 300 mikrometrowych odcinków koronalnych w ciągu 15 minut.

Następnie inkubuj ostre plastry w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez co najmniej 60 minut w ACSF, bulgocząc karbogenem. Po 60 minutach przenieś plasterek do komory zapisu za pomocą pipety Pasteura lub małego pędzelka. Przytrzymaj plasterek harfą i obficie go ACSF w ilości dwóch mililitrów na minutę.

Aby załatać neuron GFP, zlokalizuj obszar zainteresowania przez mikroskop pod kątem 10x. Następnie znajdź komórkę z dodatnim wynikiem GFP za pomocą obiektywu 60x. Następnie napełnij elektrodę rejestrującą roztworem wewnątrzkomórkowym.

Następnie umieść szklaną pipetę w uchwycie na pipety. Następnie umieść końcówkę pipety w wannie i skup się na końcówce. Gdy pipeta znajdzie się w kąpieli, należy zastosować nadciśnienie przez system kontroli ciśnienia wstecznego.

Zbliżyć się do celi zainteresowania pod kierunkiem wizualnym, utrzymując ciśnienie wsteczne w pipecie. Po pojawieniu się małego wgłębienia na powierzchni komórki zwolnij ciśnienie. W tym momencie może powstać szczelne uszczelnienie o rezystancji większej niż jeden gigaom.

W przeciwnym razie zastosuj lekkie podciśnienie, aby to ułatwić. Podczas formowania uszczelki doprowadzić zacisk napięcia podtrzymującego do 60 miliwoltów. Po uformowaniu uszczelki giga-omowej zastosuj impuls ssania, aby rozerwać błonę komórkową i włamać się w tryb całej komórki.

Gdy znajdzie się w trybie całego ogniwa, przełącz się z trybu cęgów napięciowych na tryb cęgów prądowych i rozpocznij nagrywanie. Obrazy te pokazują dostarczanie wektorów do neuronów warstwy 2/3 przez elektroporację in utero w 15,5 dniu embrionalnym, a skrawki koronalne zostały przygotowane w 16 dniu po urodzeniu. Wektor CAG DsRed2 był kotransfekowany jako kontrola.

GFP ulega ekspresji tylko w tych neuronach, które również zawierają cre, umożliwiając rekombinację miejsc LoxP w wektorze CALNL GFP. Oto konfokalny obraz w dużym powiększeniu dendrytycznych altan innego słabo znakowanego neuronu GFP. Jest to neuron piramidowy elektroporowany GFP, który obserwowano w jasnym polu i warunkach zielonej fluorescencji.

Oto typowa, regularna reakcja impulsowa elektroporowanego neuronu kontrolnego CAG-GFP w warstwie 2/3. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w 30 minut w przypadku elektroporacji in utero i pół dnia w przypadku nagrania zacisku krosowego, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o jak najszybszym wykonaniu operacji, aby zmniejszyć stres matki i zwiększyć szanse na przeżycie szczeniąt.

Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak ekspresja, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak związek między ekspresją określonych genów a ich wpływem na rozwój surogatki. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neuronauką rozwojową do zbadania połączeń i morfologii neuronów u myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać operacji in utero do opisania struktury i połączeń neuronów na poziomie pojedynczej komórki oraz pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie.