Name: Wykrywanie zmian numeru kopii za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę sekwencjonowania pojedynczych komórek do wykrywania megabazowych zmian liczby kopii DNA. Protokół zwiększa czułość i swoistość analizy genomowej w porównaniu z tradycyjnymi podejściami cytologicznymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Stuartowi Levine'owi za komentarze do tego manuskryptu. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health Grant GM056800 oraz Kathy and Curt Marble Cancer Research Fund dla Angeliki Amon, a częściowo przez Koch Institute Support Grant P30-CA14051. Angelika Amon jest również badaczką w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa i Fundacji Glenna na rzecz Badań Biomedycznych. K.A.K. jest wspierany przez NIGMS Training Grant T32GM007753.

1. Izolowanie pojedynczych komórek
<ol>
	<li>Przygotuj mikroaspirator
	<ol>
		<li>Zdejmij przezroczystą plastikową końcówkę z zespołu rurki aspiratora i włóż wąski koniec do jednego końca rurki PVC o długości 1 stopy i średnicy wewnętrznej 3/16".</li>
		<li>Włóż wylot filtra strzykawkowego 0.2 μm do drugiego końca rurki PVC o długości 1 stopy i średnicy wewnętrznej 3/6".</li>
		<li>Włóż wlot filtra strzykawkowego 0.2 μm do jednego końca rurki PVC o długości 6 cali i średnicy wewnętrznej 5/16".</li>
		<li>Opcjonalnie: Przetnij rurkę PVC o długości 6 cali i średnicy wewnętrznej 5/16" na pół i włóż syfon w linii między dwie połówki.</li>
		<li>Rozbij plastikową pipetę serologiczną o pojemności 5 ml z podziałką 1 ml i włóż złamany koniec do otwartego końca rurki PVC o średnicy wewnętrznej 5/16".</li>
		<li>Włożyć wylot plastikowej pipety serologicznej o pojemności 5 ml do elastycznego końca zespołu probówki aspiratora (w miejscu, z którego usunięto przezroczystą plastikową końcówkę).</li>
		<li>Do przechowywania przykryj czerwony ustnik zespołu rurki aspiratora sterylną plastikową rurką.</li>
		<li>Wyciągnij szklaną rurkę kapilarną do średnicy wewnętrznej 10-30 μm, zbliżając środek rurki do płomienia palnika Bunsena i wywierając napięcie na obu końcach rurki. Przerwij narysowaną rurkę na środku, aby utworzyć dwie potencjalne igły aspiratora. Powtórz ten krok z kilkoma probówkami, ponieważ tylko niektóre rurki będą miały średnicę wewnętrzną, która jest odpowiednia do wybierania pojedynczych komórek.</li>
		<li>Do przechowywania umieść dwa paski plasteliny na 15-centymetrowej szalce Petriego i przymocuj igły aspiratora w poprzek pasków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wskaż komórki
	<ol>
		<li>Przygotować zawiesinę z pojedynczą komórką, odpowiednią dla typu komórki i eksperymentu. Na przykład, aby przygotować przylegające komórki, takie jak ludzkie linie komórkowe fibroblastów, należy zebrać komórki przez trypsynizację i przenieść komórki do stożkowej rurki zawierającej odpowiednią pożywkę.</li>
		<li>Przed, w trakcie lub po przygotowaniu zawiesiny pojedynczej komórki (w zależności od czasu potrzebnego na przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki) ustaw kaptur do amplifikacji całego genomu.
		<ol>
			<li>Spryskaj powierzchnię kaptura, pudełka na końcówki do pipet i końcówki do pipet 10% wybielaczem i wytrzyj ręcznikiem papierowym. Powtórz ten krok z 70% etanolem.</li>
			<li>Dodaj 8 μl wody z zestawu do amplifikacji całego genomu (WGA) do pojedynczych dołków 96-dołkowej płytki PCR, po jednym dołku na każdą komórkę, która ma być sekwencjonowana. Przykryj 96-dołkową płytkę do PCR pokrywką z 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i umieść na lodzie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać 1000 komórek do 10 ml pożywki lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na 15-centymetrowej szalce Petriego i umieścić naczynie na lodzie, aby zapobiec przywieraniu komórek do naczynia.</li>
		<li>Przynieś komórki na szalce Petriego i 96-dołkową płytkę do PCR z pokrywką na lodzie do mikroskopu świetlnego z obiektywem 10X.</li>
		<li>Zwiększ otwór igły aspiratora, delikatnie stukając wyciągniętym końcem igły aspiratora o twardą powierzchnię, tak aby końcówka się oderwała. Włóż szeroki koniec igły aspiratora do przezroczystego końca mikroaspiratora.</li>
		<li>Umieścić szalkę Petriego zawierającą komórki na stoliku mikroskopu. Umieść czerwony ustnik aspiratora w ustach. Jedną ręką przesuwaj igłę aspiratora, a drugą ręką przesuwaj szalkę Petriego zawierającą komórki. Zidentyfikuj pojedyncze komórki, które mają zostać zsekwencjonowane.</li>
		<li>Za pomocą odsysania przez usta wciągnij pojedynczą komórkę do igły aspiratora wraz z ~1-2 μL pożywki lub PBS. Przenieś komórkę do 8 μl wody wewnątrz pojedynczego dołka 96-dołkowej płytki PCR. Unikaj wprowadzania pęcherzyków podczas przenoszenia komórki.</li>
		<li>Powtarzaj krok 1.2.7, aż żądana liczba komórek zostanie odizolowana. Trzymaj płytkę PCR na lodzie i przykryj pokrywką między komórkami do pobrania. Zaznacz studzienki, w których otrzymały się komórki.
		<ol>
			<li>Podczas wybierania pojedynczych komórek rozmrozić 10-krotny bufor do lizy i fragmentacji pojedynczych komórek z całego zestawu do amplifikacji genomu. Po wybraniu żądanej liczby komórek należy natychmiast przystąpić do amplifikacji całego genomu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Amplifikacja całego genomu
<ol>
	<li>Aby zapobiec zanieczyszczeniu podczas amplifikacji całego genomu, dodaj wszystkie odczynniki do okapu do hodowli tkankowej, użyj końcówek do pipet z filtrami i zmień końcówkę pipety między studzienkami.</li>
	<li>Przygotuj działający roztwór buforowy do lizy i fragmentacji z zestawu do amplifikacji całego genomu (WGA). Dla każdego zestawu do 32 komórek połącz 32 μl 10x buforu do lizy i fragmentacji pojedynczych komórek oraz 2 μl roztworu proteinazy K w probówce do mikrowirówki. Wiruj rurkę, aby wymieszać roztwory.</li>
	<li>Dodać 1 μl roboczego roztworu buforowego do lizy i fragmentacji do każdej studzienki i pipetować w górę iw dół, aby wymieszać.</li>
	<li>Przykryj płytkę i uszczelnij wszystkie studzienki folią z tworzywa sztucznego. Krótko odwirować płytkę w mini wirówce do płytek.</li>
	<li>Następujący cykl termiczny: 50 °C, 1 h i 99 °C, 4 min.</li>
	<li>Ostudzić płytkę na lodzie i krótko odwirować płytkę w mini wirówce do talerzy.</li>
	<li>Przygotuj działający roztwór buforowy do przygotowania biblioteki z całego zestawu do amplifikacji genomu. Dla każdej komórki połącz 2 μl 1x buforu do przygotowania biblioteki pojedynczej komórki i 1 μl roztworu stabilizującego bibliotekę w probówce mikrowirówkowej. Przygotuj roztwór roboczy dla kilku komórek w tej samej probówce do mikrowirówki.</li>
	<li>Usuń folię z tworzywa sztucznego i dodaj 3 μl roztworu buforowego do przygotowania biblioteki roboczej do każdego dołka. Odpipetować zawartość studzienki w górę i w dół, aby wymieszać. Wymień plastikową folię. 
	UWAGA: Folia z tworzywa sztucznego może być ponownie wykorzystana w całym procesie amplifikacji genomu, dopóki studzienki nie zaczną wiercić otworów w folii. W takim przypadku zmień folię na nową z tworzywa sztucznego.</li>
	<li>Krótko odwirować płytkę w mini wirówce do płytek i inkubować w temperaturze 95 °C przez 2 minuty.</li>
	<li>Ostudzić płytkę na lodzie i krótko odwirować płytkę w mini wirówce do talerzy.</li>
	<li>Usuń folię z tworzywa sztucznego, dodaj 1 μl enzymu do przygotowania biblioteki do każdego dołka i pipetuj zawartość studzienki w górę iw dół, aby wymieszać. Na tym etapie należy przechowywać enzym przygotowawczy w bibliotece na lodzie lub w zimnym bloku. Wymień plastikową folię.</li>
	<li>Krótko odwirować płytkę w mini wirówce płytkowej i cyklu termicznym w następujący sposób: 16 °C, 20 min, 24 °C, 20 min, 37 °C, 20 min, 75 °C, 5 min i utrzymywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostudzić płytkę na lodzie i krótko odwirować płytkę w mini wirówce do talerzy.</li>
	<li>Przygotuj działającą mieszankę amplifikacyjną z całego zestawu do amplifikacji genomu. Dla każdej komórki połącz 48,5 μl wody, 7,5 μl 10-krotnej amplifikacji głównej mieszanki i 5 μl polimerazy DNA WGA w probówce do mikrowirówki. Przygotuj mieszaninę roboczą dla kilku komórek w tej samej probówce do mikrowirówki. Utrzymuj mieszankę roboczą na lodzie.</li>
	<li>Usuń folię z tworzywa sztucznego, dodaj 61 μl roboczej mieszanki amplifikacyjnej do każdego dołka i pipetuj zawartość studzienki w górę iw dół, aby wymieszać. Na tym etapie utrzymuj działającą mieszankę wzmacniającą na lodzie lub w zimnym bloku. Wymień plastikową folię.</li>
	<li>Krótko odwirować płytkę w mini wirówce do płytek i cyklu termicznego w następujący sposób: 95 °C, 3 min, 25 cykli 94 °C, 30 sekund i 65 °C, 5 minut i utrzymywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść 60 μl każdej próbki do oddzielnej probówki do mikrowirówki i przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w kroku 3.</li>
	<li>Dodać barwnik ładujący DNA do pozostałej objętości każdej próbki (tj. 3 μl 6-krotnego barwnika obciążającego DNA na 15 μl próbki) i przeprowadzić 5 μl z każdej reakcji na 1% żelu agarozowym. 
	UWAGA: Komórki, które pomyślnie uległy amplifikacji, pojawią się jako rozmaz od 250 do 1,000 pz. Jest mało prawdopodobne, aby próbki, które nie wykazały rozmazu lub wykazywały tylko słaby rozmaz, dostarczyły użytecznych danych sekwencjonowania.</li>
</ol>
3. Sekwencjonowanie
<ol>
	<li>Oczyść próbki za pomocą kulek paramagnetycznych.
	<ol>
		<li>Rozmrozić próbki DNA na lodzie. Wirować kulki paramagnetyczne, aż roztwór będzie jednorodny i inkubować kulki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut.</li>
		<li>Przenieść 20 μl każdej próbki DNA do czystej probówki do mikrowirówki. Pozostałą część próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Dodaj 30 μl (1,5x) kulek paramagnetycznych do każdej próbki DNA i wymieszaj. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Pozostawić roztwór podstawowy kulek w temperaturze pokojowej do użycia w kroku 3.4.</li>
		<li>Umieść probówki na magnetycznym pasku probówki na 2 minuty lub do momentu, gdy kulki utworzą osad, a supernatant będzie klarowny.</li>
		<li>Za pomocą pipety P200 usuń jak najwięcej supernatantu, nie naruszając kulek.</li>
		<li>Dodać 180 μl 80% etanolu do mieszaniny DNA-kulki. Obróć rurki kilka razy względem magnesu, aby "przepłukać" kulki przez roztwór etanolu.</li>
		<li>Za pomocą pipety P200 usuń jak najwięcej płynu z etanolu, nie naruszając kulek.</li>
		<li>Powtórzyć czynności 3.1.6 i 3.1.7.</li>
		<li>Suszyć kulki na powietrzu przez około 10 minut lub do momentu, gdy nie będzie już widać etanolu. Przejdź do następnego kroku, gdy koraliki wydają się pęknięte lub spadają ze ścianki rurki.</li>
		<li>Usuń próbki z paska magnetycznego. Dodaj 40 μl 10 mM Tris pH 8,0, aby wymyć DNA z kulek i zwirować próbki, aby ponownie zawiesić kulki. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Krótko odwirować próbki, aby zebrać ciecz na dnie probówki i umieścić probówki na pasku probówki magnetycznej na co najmniej dwie minuty. Przenieść eluent do czystych probówek do mikrowirówek, nie naruszając kulek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Normalizacja próbki
	<ol>
		<li>Określić ilościowo stężenie każdej próbki za pomocą spektrofotometru. Stężenia powinny wynosić od 10 do 30 ng/μl.</li>
		<li>Rozcieńczyć każdą próbkę do 0,2 ng/μl za pomocą 10 mM Tris pH 8,0. Poniższe kroki będą wymagały minimalnego dopływu 5 μl z tego rozcieńczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie biblioteki
	<ol>
		<li>Przygotuj biblioteki sekwencjonowania, postępując zgodnie z instrukcjami zestawu do przygotowywania biblioteki13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Końcowe sprzątanie
	<ol>
		<li>Oczyść próbki zgodnie z krokiem 3.1. W przypadku długości odczytu 50 pz, 75 pz lub 150 pz należy użyć stosunku ściegu do objętości próbki wynoszącego odpowiednio 1,5x, 1x lub 0,6x. Eluować za pomocą 15 μl 10 mM Tris pH 8,0.</li>
		<li>Uruchom próbki w analizatorze fragmentów, aby sprawdzić rozkład rozmiaru biblioteki14. Rozkład wielkości powinien być równomiernie rozłożony od 150 do 900 pz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie ilościowe próbek za pomocą qPCR
	<ol>
		<li>Korzystając z bibliotecznego zestawu do kwantyfikacji, skonfiguruj reakcję qPCR zgodnie z instrukcjami zestawu15. Pozostaw pustą kolumnę, aby dodać wzorce dodatnie (wzorce DNA z zestawu) i normy ujemne (woda lub inny roztwór ślepej próby).</li>
		<li>Cykl termiczny w następujący sposób: 95 °C, 5 min (szybkość narastania 4,8 °C/s) i 35 cykli 95 °C, 30 sekund (szybkość narastania 4,8 °C/s) i 60 °C, 45 sekund (szybkość narastania 2,5 °C/s).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Buforowanie
	<ol>
		<li>Określ, ile pasów w komorze przepływowej jest potrzebnych i podziel próbki na grupy, po jednej grupie na tor.</li>
		<li>Dla każdej grupy próbek należy wybrać próbkę o najniższym stężeniu na podstawie danych qPCR z kroku 3.5.2 i znormalizować wszystkie próbki w tej grupie do tego stężenia przy użyciu 10 mM Tris pH 8,0.</li>
		<li>Zbierz próbki w każdej grupie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekwencjonowanie
	<ol>
		<li>Załaduj pule na maszynę sekwencjonującą nowej generacji zgodnie ze standardowymi procedurami16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
UWAGA: Środowisko oparte na Uniksie jest wymagane do uruchamiania programów i skryptów w tej sekcji. Zainstaluj oprogramowanie wymienione w protokole, postępując zgodnie z instrukcjami instalacji. Wszystkie skrypty można znaleźć na stronie https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/.
<ol>
	<li>Przytnij odczyty do 40-nt za pomocą fastx_trimmer z FASTX-Toolkit w wersji 0.0.1317. 
	fastx_trimmer -Q33 -i przyklad.fastq -l 40 -o przyklad.przytnij.fastq</li>
	<li>Dopasuj odczyty do odpowiedniego genomu referencyjnego (mm9 dla myszy, hg19 dla człowieka) przy użyciu BWA w wersji 0.6.1 z opcjami domyślnymi18. 
	bwa aln mm9.fa example.trim.fastq >example.sai 
	bwa samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq >example.sam</li>
	<li>Usuń dopasowania do chrM i losowych chromosomów, a następnie posortuj i zindeksuj wynikowy plik BAM za pomocą SAMTools w wersji 0.1.1919. 
	grep -v -w chrM przyklad.sam |grep -v losowy >przyklad.filtrowany.sam 
	samtools view -uSh przyklad.filtrowany.sam | Samtools sort - example.filtered 
	samtools index example.filtered.bam</li>
	<li>Uruchom HMMcopy, aby wykryć CNVs20
	<ol>
		<li>Użyj gcCounter w HMMcopy, aby wygenerować plik referencyjny procentu GC dla genomu. Użyj opcji "-w 500000", aby określić rozmiar okna. Użyj tej samej wersji pliku referencyjnego fasta, która została użyta w kroku 4.2, ale upewnij się, że chrM i losowe chromosomy zostały usunięte z pliku fasta. 
		gcCounter -w 500000 mm9.fa >mm9_gc.wig</li>
		<li>Użyj generateMap.pl w HMMcopy, aby wygenerować plik wiggle w celu mapowania. Użyj opcji "-w 40", aby określić długość odczytu. Użyj tego samego pliku referencyjnego fasta, który został użyty w kroku 4.4.1. 
		generateMap.pl -b mm9.fa 
		generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig</li>
		<li>Użyj mapCounter w HMMcopy, aby wygenerować plik referencyjny mapokowalności dla genomu. Użyj opcji "-w 500000", aby określić rozmiar okna. 
		mapCounter -w 500000 mm9.bigwig >mm9_map.wig</li>
		<li>Użyj readCounter w HMMcopy, aby wygenerować plik wiggle dla każdego pliku BAM. 
		readCounter -w 500000 example.filtered.bam >input.wig</li>
		<li>Zmodyfikuj ścieżki do plików referencyjnych w skryptach R (run_hmmcopy.mm9.r lub run_hmmcopy.hg19.r), użyj plików wygenerowanych powyżej w 4.4.1 (np. mm9_gc.wig) i 4.4.3 (np. mm9_map.wig) dla zmiennych gfile i mfile, które odnoszą się odpowiednio do pliku referencyjnego GC percentage i pliku referencyjnego mappability. Następnie uruchom dostarczony skrypt języka R "run_hmmcopy.mm9.r" lub "run_hmmcopy.hg19.r". 
		R CMD WSAD run_hmmcopy.mm9.r 
		lub 
		R WSAD CMD run_hmmcopy.hg19.r</li>
		<li>W przypadku przetwarzania wsadowego zestawu plików BAM umieść pliki BAM w jednym folderze i uruchom dostarczony skrypt "HMMpipe.pl" w pakiecie, aby wywołać segmenty i obliczyć wyniki zmienności (VS). Postępuj zgodnie z formatem: 
		perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles mm9</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom DNAcopy, aby wykryć CNVs21.
	<ol>
		<li>Użyj SAMtools w wersji 0.1.19, aby wyodrębnić unikatowo zmapowane odczyty z każdego pliku BAM. 
		samtools view -h -F 0x0004 przykład.filtrowany.bam | egrep -i "^@|XT:A:U" |samtools view -Shu - >example.mapped.bam</li>
		<li>Użyj MarkDuplicates w Picard w wersji 1.94, aby oznaczyć duplikaty PCR w pliku BAM22. 
		java -jar MarkDuplicates.jar INPUT=example.mapped.bam OUTPUT=example.nondup.bam METRICS_FILE=example.dup REMOVE_DUPLICATES=true</li>
		<li>Użyj coveragebed w bedtools w wersji 2.17.0, aby policzyć zmapowane odczyty w każdym z predefiniowanych dynamicznych 500kb mapowalnych okien w dostarczonym pliku BED "mm9.500k.dynamic.win.bed" lub "hg19.500k.dynamic.win.bed"23. 
		coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | sortowanie -k1,1 -k2,2n >przyklad.nondup.counts</li>
		<li>Użyj dostarczonego skryptu Perla "normalizeGC.pl", aby znormalizować liczniki odczytów na podstawie dostarczonego pliku referencyjnego zawartości GC "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" lub "hg19.500k.dynamic.win.fa.gc.txt". 
		Perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts >example.bam.norm.counts</li>
		<li>Użyj dostarczonego skryptu języka R "dnacopy.r", aby wywołać segments. 
		R CMD BATCH dnacopy.r</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikowanie CNV
	<ol>
		<li>Wyklucz komórki, dla których VS obliczony w 4.4.6 przekracza 0,26.</li>
		<li>Przefiltruj segmenty wywołane przez HMMcopy w 4.4.6, aby uwzględnić tylko te, dla których mediana współczynnika logarytmu2 jest większa niż 0,4 (przypuszczalny zysk) lub mniejsza niż -0,35 (przypuszczalna strata).</li>
		<li>Przefiltrować segmenty wywołane przez DNAcopy w ppkt 4.5.5 tak, aby obejmowały tylko te, dla których średnia segmentu jest większa niż 1,32 lub mniejsza niż 0,6.</li>
		<li>Nakładaj na siebie segmenty z 4.6.2 i 4.6.3, wywołując CNV tylko w regionach, w których zarówno HMMcopy, jak i DNAcopy identyfikują przypuszczalny zysk lub przypuszczalną stratę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kahlem, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+Level+Alterations+Reflect+Gene+Dosage+Effects+Across+Multiple+Tissues+in+a+Mouse+Model+of+Down+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Transcript Level Alterations Reflect Gene Dosage Effects Across Multiple Tissues in a Mouse Model of Down Syndrome.</a> Genome Res. 14 (7), 1258-1267 (2004).</li>
<li>Torres, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Aneuploidy+on+Cellular+Physiology+and+Cell+Division+in+Haploid+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast.</a> Science. 317 (5840), 916-924 (2007).</li>
<li>Itsara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+Analysis+of+Large+Copy+Number+Variants+and+Hotspots+of+Human+Genetic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Human+Gen%22%5BJournal%5D)">Population Analysis of Large Copy Number Variants and Hotspots of Human Genetic Disease.</a> Am. J. Human Gen. 84 (2), 148-161 (2009).</li>
<li>Sudmant, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+diversity%2C+population+stratification%2C+and+selection+of+human+copy-number+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global diversity, population stratification, and selection of human copy-number variation.</a> Science. 349 (6253), aab3761(2015).</li>
<li>Navin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+tumor+progression+from+genomic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Inferring tumor progression from genomic heterogeneity.</a> Genome Res. 20 (1), 68-80 (2010).</li>
<li>Torres, L., Ribeiro, F. R., Pandis, N., Andersen, J. A., Heim, S., Teixeira, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+genomic+heterogeneity+in+breast+cancer+with+clonal+divergence+between+primary+carcinomas+and+lymph+node+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+cancer+res+and+treat%22%5BJournal%5D)">Intratumor genomic heterogeneity in breast cancer with clonal divergence between primary carcinomas and lymph node metastases.</a> Breast cancer res and treat. 102 (2), 143-155 (2007).</li>
<li>Yates, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclonal+diversification+of+primary+breast+cancer+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing.</a> Nat. Med. 21 (7), 751-759 (2015).</li>
<li>Forsberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+somatic+structural+changes+in+the+nuclear+genome+of+human+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Human+Gen%22%5BJournal%5D)">Age-related somatic structural changes in the nuclear genome of human blood cells.</a> Am. J. Human Gen. 90 (2), 217-228 (2012).</li>
<li>Laurie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detectable+clonal+mosaicism+from+birth+to+old+age+and+its+relationship+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Gen%22%5BJournal%5D)">Detectable clonal mosaicism from birth to old age and its relationship to cancer.</a> Nat. Gen. 44 (6), 642-650 (2012).</li>
<li>Jacobs, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detectable+clonal+mosaicism+and+its+relationship+to+aging+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Gen%22%5BJournal%5D)">Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer.</a> Nat. Gen. 44 (6), 651-658 (2012).</li>
<li>Knouse, K. A., Wu, J., Whittaker, C. A., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+low+levels+of+aneuploidy+across+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals low levels of aneuploidy across mammalian tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (37), 13409-13414 (2014).</li>
<li>Knouse, K. A., Wu, J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+megabase-scale+somatic+copy+number+variation+using+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of megabase-scale somatic copy number variation using single-cell sequencing.</a> Genome Res. 26 (3), 376-384 (2016).</li>
<li>Nextera XT DNA Library Preparation Kit. at. , at: 
 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html</a> (2016).</li>
<li>Advanced Analytical Fragment Analyzer. , at: 
 <a target="_blank" href="http://aati-us.com/product/fragment-analyzer">http://aati-us.com/product/fragment-analyzer</a> (2016).</li>
<li>KAPA Library Quantification Kit. , at: 
 <a target="_blank" href="https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/">https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/</a> (2016).</li>
<li>Illumina HiSeq 2000. , at: 
 <a target="_blank" href="http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_instruments/hiseq_2000.html">http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_instruments/hiseq_2000.html</a> (2016).</li>
<li>FASTX-Toolkit. , at: 
 <a target="_blank" href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> (2016).</li>
<li>Burrows-Wheeler Aligner. , at: 
 <a target="_blank" href="http://bio-bwa.sourceforge.net/">http://bio-bwa.sourceforge.net/</a> (2016).</li>
<li>SAMTools. , at: 
 <a target="_blank" href="http://samtools.sourceforge.net/">http://samtools.sourceforge.net/</a> (2016).</li>
<li>HMMcopy. , at: 
 <a target="_blank" href="http://compbio.bccrc.ca/software/hmmcopy/">http://compbio.bccrc.ca/software/hmmcopy/</a> (2016).</li>
<li>DNAcopy. , at: 
 <a target="_blank" href="https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html">https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html</a> (2016).</li>
<li>Picard. , at: 
 <a target="_blank" href="http://broadinstitute.github.io/picard/">http://broadinstitute.github.io/picard/</a> (2016).</li>
<li>bedtools. , at: 
 <a target="_blank" href="http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/">http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/</a> (2016).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).</li>
<li>Navin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li>
<li>Szulwach, K. E., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Genetic+Analysis+Using+Automated+Microfluidics+to+Resolve+Somatic+Mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Genetic Analysis Using Automated Microfluidics to Resolve Somatic Mosaicism.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135007(2015).</li>
<li>Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Detection+of+Single-Nucleotide+and+Copy-Number+Variations+of+a+Single+Human+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell.</a> Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+breast+cancer+revealed+by+single+nucleus+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing.</a> Nature. 512 (7513), 155-160 (2014).</li>
<li>Zhang, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromothripsis+from+DNA+damage+in+micronuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromothripsis from DNA damage in micronuclei.</a> Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).</li>
<li>Macaulay, I. C., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Genomics%3A+Advances+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives.</a> PLoS Genetics. 10 (1), e1004126(2014).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing%3A+current+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gen%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nat. Rev. Gen. , 1-14 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tradycyjnie, identyfikacja CNV i aneuploidii na poziomie pojedynczych komórek wymagała metod cytologicznych, takich jak FISH i SKY. Teraz sekwencjonowanie pojedynczych komórek pojawiło się jako alternatywne podejście do takich pytań. Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ma przewagę nad FISH i SKY, ponieważ obejmuje zarówno cały genom, jak i ma wysoką rozdzielczość. Ponadto, gdy stosowane są odpowiednie metody kontroli jakości, sekwencjonowanie pojedynczych komórek może zapewnić bardziej wiarygodną ocenę CNV i aneuploidii, ponieważ nie jest podatne na hybrydyzację i rozprzestrzenianie się artefaktów charakterystycznych dla FISH i SKY. Jednak wiele z niedawnych zastosowań sekwencjonowania pojedynczych komórek nie zostało popartych dogłębną oceną czułości i swoistości metod i analiz. Rzeczywiście, niektóre z podejść analitycznych stosowanych w innych badaniach są związane z wysoką częstotliwością (>50%) fałszywie dodatnich połączeń CNV12. Opisywane przez nas podejście zostało rygorystycznie przetestowane przy użyciu komórek o znanym obciążeniu CNV w celu określenia wskaźników prawdziwych i fałszywych wykryć oraz optymalizacji czułości i swoistości wykrywania CNV12. Korzystając z metod kontroli jakości i analiz opisanych w tym protokole, można wykryć około 20% z 5 Mb zysków, 75% z 5 Mb strat i wszystkie CNV przekraczające 10 Mb. Chociaż określenie wskaźnika fałszywych odkryć sekwencjonowania pojedynczych komórek jest trudne, oszacowaliśmy, że wynosi on mniej niż 25%. Protokół ten może być stosowany do komórek z różnych źródeł, skrypty mogą być modyfikowane w celu dostosowania rozdzielczości wykrywania CNV, a protokół może być dostosowany do identyfikacji innych typów zmian genomowych.
Istnieje wiele sposobów dysocjacji świeżych tkanek na pojedyncze komórki, a wiele publikacji opisuje procedury zoptymalizowane dla określonych tkanek, takich jak skóra24 i mózg25. Preferujemy izolację pojedynczych komórek metodą mikroaspiracji, ponieważ pozwala to na wizualną ocenę każdej komórki, która ma być zsekwencjonowana. Możliwe jest jednak również izolowanie pojedynczych komórek za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)26 i urządzeń mikroprzepływowych27. Jeśli izolacja pojedynczej komórki i amplifikacja całego genomu jest wykonywana ręcznie, rozsądne jest wyizolowanie i amplifikacja do czterdziestu komórek za jednym razem. Aby uzyskać wysokiej jakości dane dotyczące sekwencjonowania pojedynczych komórek, kluczowe jest, aby amplifikacja genomów pojedynczych komórek była jednolita i kompletna. Stwierdzamy, że jakość izolowanych pojedynczych komórek, a także skuteczność lizy i amplifikacji ma znaczący wpływ na jakość danych sekwencjonowania. W związku z tym komórki powinny zostać pobrane z ich rodzimego środowiska tuż przed izolacją, a amplifikacja całego genomu powinna rozpocząć się natychmiast po wyizolowaniu komórek. Ponadto etap lizy i fragmentacji powinien być postępowany dokładnie tak, jak opisano w krokach 2.3-2.6.
Algorytmy można dostosować w celu zmiany rozdzielczości wykrywania CNV, co ma przeciwstawny wpływ na czułość i swoistość12. Możliwe jest również dostosowanie progów w celu wykrycia aneuploidii całego chromosomu w ustawieniu tetraploidii11. Okazuje się jednak, że nasze podejście ogranicza się do wykrywania CNV większych niż 5 Mb, ponieważ szum wprowadzany podczas amplifikacji całego genomu komplikuje wykrywanie mniejszych wariantów12. Przyszłe ulepszenia w podejściach do amplifikacji całego genomu powinny ostatecznie zwiększyć rozdzielczość wykrywania CNV przy użyciu sekwencjonowania pojedynczych komórek.
Sekwencjonowanie pojedynczych komórek pozwala na badanie nie tylko zmian liczby kopii, ale także wariacji pojedynczych nukleotydów28,29 i zmienności strukturalnej30. Nasz protokół izolacji pojedynczych komórek może być zastosowany, aby odpowiedzieć na te inne pytania. Jednak wybór metody amplifikacji całego genomu zależy od konkretnego zastosowania. Metoda opisana w tym protokole, która opiera się na reakcji łańcuchowej polimerazy, najlepiej nadaje się do wykrywania zmian liczby kopii, ponieważ wiąże się z niższymi poziomami odchylenia amplifikacji32. Uważa się, że do badania innych typów zmian genomowych, takich jak polimorfizmy pojedynczych nukleotydów, bardziej odpowiednie są inne metody amplifikacji całego genomu31,32.

Zmiany w liczbie kopii DNA mogą wahać się od kilku par zasad (warianty liczby kopii) (CNV) do całych chromosomów (aneuploidia). Zmiany liczby kopii wpływające na duże obszary genomu mogą mieć znaczące konsekwencje fenotypowe poprzez zmianę ekspresji nawet tysięcy genów1,2. CNV, które są obecne we wszystkich komórkach populacji, mogą być wykrywane za pomocą sekwencjonowania zbiorczego lub metod opartych na mikromacierzach3,4. Jednak populacje mogą być również genetycznie heterogeniczne, przy czym CNV istnieją w podzbiorze populacji lub nawet w pojedynczych komórkach. Heterogeniczność genetyczna jest powszechna w nowotworach, napędzając ewolucję guza, a także występuje w normalnych tkankach, z nieznanymi konsekwencjami5,6,7,8,9,10.
Tradycyjnie, heterogeniczność genetyczna była oceniana albo za pomocą metod cytologicznych, albo sekwencjonowania zbiorczego. Podejścia cytologiczne, takie jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), rozprzestrzenianie chromosomów i kariotypowanie spektralne (SKY), mają tę zaletę, że identyfikują zmiany obecne w poszczególnych komórkach, ale mają wysokie wskaźniki błędów ze względu na artefakty hybrydyzacji i rozprzestrzeniania się11. Podejścia te są również ograniczone pod względem rozdzielczości - ujawniają tylko zmiany liczby kopii obejmujące kilka megabaz. Sekwencjonowanie lub mikromacierze masowego DNA, choć mają wyższą dokładność i rozdzielczość, są mniej czułe. Aby wykryć heterogeniczność genetyczną za pomocą podejść populacyjnych, warianty muszą być obecne w znacznej części komórek w populacji. Pojawienie się metod amplifikacji genomowego DNA z pojedynczych komórek umożliwiło sekwencjonowanie genomu pojedynczych komórek. Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ma zalety wysokiej rozdzielczości, wysokiej czułości i, gdy stosowane są odpowiednie metody kontroli jakości, wysokiej dokładności12.
Tutaj opisujemy metodę wykrywania zmian liczby kopii w skali megabazowej w pojedynczych komórkach. Izolujemy pojedyncze komórki za pomocą mikroaspiracji, amplifikujemy genomowe DNA za pomocą PCR łącznika-adaptera, przygotowujemy biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji i wykrywamy warianty liczby kopii zarówno za pomocą ukrytego modelu Markowa, jak i kołowej segmentacji binarnej.

<table><tbody><tr><td>Zespoły probówek aspiratora do kalibrowanych pipet mikrokapilarnych</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Rurka PVC (ID 3/16", OD 5/16", ~1 stopa)</td><td>VWR</td><td>89068-500</td><td></td></tr><tr><td>Rurka PVC (ID 5/16", OD 7/16", ~6 cali)</td><td>VWR</td><td>89068-508</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc Filtr strzykawkowy z membraną HT Tuffryn (średnica 25 mm, wielkość porów 0,2 i mikro; m)</td><td>Pipeta</td> serologiczna VWR <td>28144-040</td><td></td></tr><tr><td>(5 ml)</td><td>BioExpress</td><td>P-2837-5</td><td>Każda plastikowa pipeta o pojemności 5 ml powinna wystarczyć</td></tr><tr><td>Syfon liniowy do tlenu</td><td>Amazon.com</td><td>700220210813</td><td></td></tr><tr><td>Kapilarne rurki do pomiaru temperatury topnienia (ID 0,8-1,1 mm, długość 100 mm)</td><td>VWR</td><td>34502-99</td><td></td></tr><tr><td>Plastelina</td><td>VWR</td><td>470156-850</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego (średnica 150 mm)</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>Powierzchnia powinna być nieprzylegająca, aby ułatwić aspirację pojedynczych komórek</td></tr><tr><td>Twarda skorupa&nbsp; 96-dołkowy półlistwę przypodłogową PCR o pełnej wysokości&nbsp; Płytki</td><td>Bio-Rad</td><td>HSS9601</td><td>Każda 96-dołkowa płytka do PCR powinna wystarczyć</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>VWR</td><td>62406-081</td><td>Każda 96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej powinna wystarczyć</td></tr><tr><td>GenomePlex Zestaw do amplifikacji pojedynczej komórki całego genomu</td><td>Sigma</td><td>WGA4</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'A' Film</td><td>Bio-Rad</td><td>MSA5001</td><td></td></tr><tr><td>Mini wirówka do płytek</td><td>Thomas Scientific</td><td>1225Z37</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096&nbsp;</td><td>Każdy termocykler powinien wystarczyć, o ile może pomieścić 96-dołkową płytkę PCR</td></tr><tr><td>Koraliki Agencourt Ampure</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Magnes Dynamag-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Każdy podobny pasek rurki magnetycznej powinien wystarczyć</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki DNA Nextera XT</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw indeksowy Nextera XT</td><td>Kompletny zestaw Illumina</td><td>FC-121-1012</td><td></td></tr><tr><td>(zoptymalizowany dla Roche LightCycler 480)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4845&nbsp;</td><td>Ten zestaw jest zoptymalizowany pod kątem maszyny do PCR w czasie rzeczywistym Roche LightCycler 480. Jeśli używasz innej maszyny, zastąp ją zestawem zoptymalizowanym dla Twojej maszyny.</td></tr></tbody></table>

wykrywanie zmian numeru kopii za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Wykrywanie zmian genomowych w rozdzielczości pojedynczej komórki jest ważne dla scharakteryzowania genetycznej heterogeniczności i ewolucji w normalnych tkankach, nowotworach i populacjach mikroorganizmów. Tradycyjne metody oceny heterogeniczności genetycznej były ograniczone przez niską rozdzielczość, niską czułość i/lub niską swoistość. Sekwencjonowanie pojedynczych komórek stało się potężnym narzędziem do wykrywania heterogeniczności genetycznej z wysoką rozdzielczością, wysoką czułością i, po odpowiedniej analizie, wysoką swoistością. Tutaj przedstawiamy protokół izolacji, amplifikacji całego genomu, sekwencjonowania i analizy pojedynczych komórek. Nasze podejście pozwala na wiarygodną identyfikację wariantów liczby kopii w skali megabazowej w pojedynczych komórkach. Jednak aspekty tego protokołu mogą być również stosowane do badania innych rodzajów zmian genetycznych w pojedynczych komórkach.

Zmontowany aspirator powinien wyglądać podobnie do urządzenia przedstawionego na Rysunku 1A. Igła powinna być zaciągnięta tak, aby była wystarczająco szeroka, by pomieścić pojedynczą komórkę, ale nie tak szeroka, aby wraz z pojedynczą komórką zaciągać dużą objętość cieczy. Aspiracja pojedynczych komórek jest najłatwiejsza, gdy w polu widzenia 10X znajduje się od jednej do pięciu komórek (Rysunek 1B).
Jeśli amplifikacja całego genomu przebiegła pomyślnie, próbka będzie widoczna jako smug na żelu agarozowym (Rysunek 2, ścieżki 1, 2, 4, 5, 6 i 7). Słaba lub nieobecna smuga wskazuje na nieudaną reakcję amplifikacji i taka próbka nie powinna być sekwencjonowana (Rysunek 2, ścieżki 3 i 8).
Po przygotowaniu biblioteki należy ocenić rozkład wielkości fragmentów próbek za pomocą elektroforezy kapilarnej na analizatorze fragmentów. Prawidłowo przygotowane biblioteki będą charakteryzować się dość równomiernym rozkładem wielkości fragmentów w zakresie od 150 do 900 bp (Rysunek 3, A,B). Nieudane przygotowanie biblioteki spowoduje uzyskanie asymetrycznego rozkładu wielkości fragmentów; takich bibliotek nie należy sekwencjonować (Rysunek 3C).
Przetwarzanie danych sekwencjonowania za pomocą ukrytego modelu Markowa (HMMcopy) oraz kolistej segmentacji binarnej (DNAcopy) pozwoli na podział genomu każdej komórki na segmenty o oszacowanej liczbie kopii. Segmenty te mogą następnie zostać przefiltrowane w celu zidentyfikowania tych, których szacowana liczba kopii jest zgodna z przyrostem lub utratą w pojedynczej komórce (Tabela 1). Następnie należy nałożyć na siebie te przefiltrowane segmenty z HMMcopy i DNAcopy, aby zidentyfikować CNV o wysokim stopniu pewności.
<img alt="Układ cewnika i analiza mikroskopowa próbki; strzałki wskazują zaobserwowane punkty, skala 100 μm." src="/files/ftp_upload/55143/55143fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Izolacja pojedynczych komórek. (A) Zmontowany mikroaspirator. (B) Pole widzenia przy powiększeniu 10X ukazujące zdysocjowane komórki (strzałki) oraz igłę mikroaspiratora (prawy dolny róg). Aspiracja pojedynczych komórek jest najłatwiejsza, gdy w polu widzenia 10X znajduje się od jednej do pięciu komórek. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej w agarozie, ścieżki rozdziału DNA; masy cząsteczkowe w kilobazach (kb)." src="/files/ftp_upload/55143/55143fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Amplifikacja całego genomu. Elektroforeza żelowa w agarozie 5 µl produktów amplifikacji całego genomu. Próbki, które uległy skutecznej amplifikacji, będą widoczne jako jasne smugi w zakresie od 100 bp do 1 kb (ścieżki 1, 2, 4, 5, 6 i 7) i mogą zostać poddane sekwencjonowaniu. Próbki, które nie uległy skutecznej amplifikacji, wykażą słabe smugi lub ich brak (ścieżki 3 i 8) i nie powinny być sekwencjonowane. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Elektroforegram biblioteki DNA; markery wielkości, piki starterów, możliwe dimery; wyniki analizy żelowej." src="/files/ftp_upload/55143/55143fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Przygotowanie biblioteki. Reprezentatywne wyniki z analizatora fragmentów. Wykresy przedstawiają wielkość fragmentów (w bp) na osi X oraz względne jednostki fluorescencji (RFU) na osi Y. Po prawej stronie każdego wykresu znajduje się symulowana ścieżka żelowa. (A) Wyniki dla próbki idealnej, z równomiernym rozkładem między 150 a 900 bp, bez ostrych pików lub przesunięcia w jedną stronę. Taka próbka nadaje się do sekwencjonowania. (B) Wyniki dla próbki dopuszczalnej, z rozkładem wielkości przesuniętym w stronę mniejszych fragmentów. Mimo że nie jest to wynik optymalny, próbka nadal może zostać zsekwencjonowana. (C) Wyniki dla próbki nieudanej, z przewagą fragmentów o małej wielkości. Jest to prawdopodobnie spowodowane zbyt długą inkubacją podczas etapu tagmentacji przy przygotowywaniu biblioteki. Takiej próbki nie należy sekwencjonować. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="7">HMMcopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Próbka</td>
			<td>Segment</td>
			<td>Chr</td>
			<td>Start</td>
			<td>Koniec</td>
			<td>Stan</td>
			<td>Mediana</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D15-4998</td>
			<td>23</td>
			<td>chr8</td>
			<td>144,500,001</td>
			<td>146,500,000</td>
			<td>6</td>
			<td>0.5008794</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D15-4998</td>
			<td>29</td>
			<td>chr10</td>
			<td>67,000,001</td>
			<td>134,500,000</td>
			<td>6</td>
			<td>0.4031945</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D15-4998</td>
			<td>52</td>
			<td>chr19</td>
			<td>1</td>
			<td>20,000,000</td>
			<td>6</td>
			<td>0.4616884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D15-4998</td>
			<td>57</td>
			<td>chrY</td>
			<td>1</td>
			<td>59,500,000</td>
			<td>2</td>
			<td>-1.506532</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="8">kopia DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Próbka</td>
			<td>Chrom</td>
			<td>Rozpocznij binowanie</td>
			<td>Koniec pojemnika</td>
			<td>Start</td>
			<td>Koniec</td>
			<td>średnia wartość segmentu</td>
			<td>Medycyna regeneracyjna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D15-4998</td>
			<td>chr10</td>
			<td>88</td>
			<td>197</td>
			<td>62,612,945</td>
			<td>129,971,511</td>
			<td>1.4688</td>
			<td>0.157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D15-4998</td>
			<td>chr19</td>
			<td>0</td>
			<td>31</td>
			<td>0</td>
			<td>28,416,392</td>
			<td>1.4141</td>
			<td>0.1674</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D15-4998</td>
			<td>chromosom X</td>
			<td>77</td>
			<td>126</td>
			<td>51,659,160</td>
			<td>95,343,369</td>
			<td>1.3548</td>
			<td>0.1874</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D15-4998</td>
			<td>chrY</td>
			<td>0</td>
			<td>14</td>
			<td>0</td>
			<td>23,805,358</td>
			<td>-2.7004</td>
			<td>0.3591</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Analiza danych. Filtrowane segmenty wygenerowane przez HMMcopy i DNAcopy z jednej komórki. Nałożenie tych dwóch wyników ujawnia przyrost na chromosomie 10 od 67 do 130 Mb oraz przyrost na chromosomie 19 od 0 do 20 Mb. Stwierdziliśmy, że przyrosty w proksymalnej części chromosomu 19 są artefaktem sekwencjonowania pojedynczych komórek 12.

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek jest coraz bardziej popularnym i dostępnym narzędziem do rozwiązywania problemów związanych ze zmianami genomowymi w wysokiej rozdzielczości. Udostępniamy protokół, który wykorzystuje sekwencjonowanie pojedynczych komórek do identyfikacji zmian liczby kopii w pojedynczych komórkach.

Wykrywanie zmian numeru kopii za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja zmian liczby kopii DNA w skali megabaz w pojedynczych komórkach. Aby skategoryzować heterogeniczność genomiczną w populacjach komórek, konieczne jest zidentyfikowanie zmian genomicznych z rozdzielczością pojedynczej komórki. Tradycyjnie osiągano to za pomocą metod cytologicznych, jednak metody te charakteryzowały się ograniczoną czułością i swoistością.Sekwencjonowanie pojedynczych komórek pozwala na wykrycie różnorodnych zmian genomicznych z większą czułością i swoistością niż w przypadku wcześniejszych metod, jednak wymaga to niezwykle precyzyjnej realizacji. W niniejszym materiale opisujemy, jak wykorzystać sekwencjonowanie pojedynczych komórek do niezawodnego wykrywania zmian liczby kopii o skali megabaz w pojedynczych komórkach. Aby złożyć mikroaspirator, należy rozpocząć od usunięcia przezroczystego plastikowego zakończenia z zestawu rurek aspiratora, a następnie włożyć wąski koniec do jednego końca PVC tubing o długości jednej stopy i średnicy wewnętrznej 3/16 cala.Wprowadź wylot filtra strzykawkowego o wielkości porów 0,2 µm do drugiego końca PVC rurki o długości 1 stopy i średnicy wewnętrznej 3/16 cala. Następnie wprowadź wlot filtra strzykawkowego 0,2 µm do jednego końca PVC rurki o długości 6 cali i średnicy wewnętrznej 5/16 cala. Przełam plastikową pipetę serologiczną o pojemności 5 ml na wysokości podziałki 1 ml i wprowadź przełamany koniec do otwartego końca PVC rurki o średnicy wewnętrznej 5/16 cala.Następnie wsuń wylot plastikowej pipety serologicznej o pojemności 5 ml do elastycznego końca zestawu rurki aspiracyjnej, a następnie użyj sterylnej plastikowej probówki, aby zakryć czerwony ustnik zestawu rurki w celu przechowywania. Wytnij szklaną rurkę kapilarną o średnicy wewnętrznej 10-30 µm, umieszczając środkową część rurki w pobliżu płomienia i wywierając napięcie na obu jej końcach. Przełam wyciągniętą rurkę na dwie części, aby stworzyć dwie potencjalne igły aspiracyjne.Powtórz ten krok z kilkoma probówkami, aby upewnić się, że przygotowano wystarczającą liczbę igieł o odpowiedniej średnicy wewnętrznej do pobierania pojedynczych komórek. Aby przygotować komórki adherentne, takie jak linie komórkowe ludzkich fibroblastów, zbierz komórki poprzez trypsynizację i przenieś je do probówki stożkowej zawierającej odpowiednie pożywkę. Przygotuj dygestorium do amplifikacji całego genomu, spryskując powierzchnię dygestorium, pudełka z końcówkami do pipet oraz same końcówki 10% roztworem wybielacza.Następnie należy wytrzeć je wszystkie ręcznikiem papierowym przed powtórzeniem przemywania 70% etanolem. Do poszczególnych studzienek płytki PCR 96-dołkowej należy dodać osiem mikrolitrów wody z zestawu do amplifikacji całego genomu, WGA. Następnie płytkę PCR 96-dołkową należy przykryć pokrywką od płytki hodowlanej 96-dołkowej i umieścić płytkę na lodzie.Następnie dodaj 1 000 komórek do 10 mililitrów pożywki lub PBS w 15-centymetrowej szalce Petriego i umieść szalkę na lodzie, aby zapobiec przyleganiu komórek do powierzchni szalki. Następnie, wciąż na lodzie, przenieś komórki w szalce Petriego oraz 96-dołkową płytkę PCR pod mikroskop świetlny z obiektywem 10X. Powiększ otwór igły aspiratora, delikatnie stukając wyciągniętym końcem igły o twardą powierzchnię, tak aby końcówka odłamała się.Następnie wsuń szeroki koniec igły w przezroczysty koniec mikroaspiratora. Dalej umieść szalkę Petriego z komórkami na stoliku mikroskopu. Włóż czerwony ustnik aspiratora do ust.Następnie, używając jednej ręki do przesuwania igły aspiratora, a drugiej do przesuwania szalki Petriego, należy zidentyfikować pojedyncze komórki do sekwencjonowania. Za pomocą ssania ustnego należy wciągnąć pojedynczą komórkę do igły aspiratora wraz z około 1-2 µL medium lub PBS. Komórkę należy przenieść do 8 µL wody w pojedynczym dołku płytki PCR z 96 dołkami.Jakość i użyteczność danych z sekwencjonowania pojedynczych komórek zależą od stanu każdej komórki oraz jej genomu, dlatego podczas przygotowania komórek i mikroaspiracji należy zachować ostrożność, aby wyizolować komórki żywe i nieapoptotyczne. Po aspiracji każdej komórki i przeniesieniu jej do dołka płytki PCR, należy oznaczyć dołek, do którego trafiła komórka. Powtórz tę czynność dla pożądanej liczby komórek.W międzyczasie rozmroź 10X Single Cell Lysis Fragmentation Buffer z zestawu Whole Genome Amplification. Aby zapobiec kontaminacji podczas amplifikacji całego genomu, dodawaj wszystkie odczynniki w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Używaj końcówek do pipet z filtrami i wymieniaj końcówkę między poszczególnymi studzienkami.Dla każdego zestawu do 32 komórek połącz 32 µL 10X Single Cell Lysis and Fragmentation Buffer oraz 2 µL roztworu Proteinase K w probówce do mikrocentryfugi, a następnie wymieszaj zawartość probówki za pomocą wibratora typu vortex. Dodaj 1 µL roztworu do każdego dołka i wymieszaj poprzez pipetowanie w górę i w dół. Przykryj płytkę i użyj folii plastikowej, aby uszczelnić wszystkie dołki.Następnie krótko odwiruj płytkę w miniwirówce do płytek. Dalej, poddaj płytkę cyklom w termocyklerze zgodnie z poniższym programem. Następnie schłodź płytkę na lodzie i krótko ją odwiruj.Aby przygotować roboczy bufor do przygotowania biblioteki z zestawu do amplifikacji całego genomu, dla każdej komórki połącz 2 µL 1X Single Cell Library Preparation Buffer oraz 1 µL Library Stabilization Solution. Odpowiednia liza komórek i całkowita fragmentacja genomu są kluczowe dla zminimalizowania błędów podczas amplifikacji całego genomu i zapewnienia przygotowania wysokiej jakości bibliotek sekwencyjnych. W związku z tym należy zadbać o to, aby wykonane kroki były zgodne z opisem.Zdejmij folię plastikową z płytki i dodaj trzy µL roztworu do każdego dołka. Pipetuj zawartość dołka w górę i w dół w celu wymieszania, a następnie ponownie nałóż folię plastikową. Po krótkim wirowaniu płytki inkubuj komórki w temperaturze 95 °C przez dwie minuty, następnie schłodź płytkę na lodzie i ponownie krótko odwiruj płytkę.Następnie należy zdjąć folię plastikową, dodać jeden mikrolitr enzymu do przygotowania biblioteki (Library Preparation Enzyme) do każdego dołka i wymieszać zawartość dołka poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie ponownie nałożyć folię plastikową. Po krótkim wirowaniu płytki należy umieścić ją w termocyklerze i uruchomić następujący program. Po ochłodzeniu płytki i krótkim wirowaniu należy przygotować roboczą mieszaninę do amplifikacji z zestawu do amplifikacji całego genomu (Whole Genome Amplification kit), łącząc 48,5 mikrolitra wody, 7,5 mikrolitra 10X amplification master mix oraz 5 mikrolitrów polimerazy WGA DNA dla każdej komórki.Mieszaninę roboczą należy przechowywać w lodzie. Usuń folię plastikową z płytki. Do każdej studni dodaj 61 µL roboczej mieszaniny amplifikacyjnej, a następnie pipetuj zawartość każdej studni w górę i w dół w celu wymieszania i ponownie załóż folię plastikową.Krótko odwiruj płytkę w wirówce i przeprowadź cykling termiczny zgodnie z poniższym schematem. Wykonaj sekwencjonowanie próbek oraz analizę danych zgodnie z protokołem tekstowym. Jak pokazano na tej rycinie, w przypadku pomyślnej amplifikacji całego genomu, próbka pojawi się jako rozmazana smuga w żelu agarozowym.Słabo widoczny lub nieobecny smear świadczy o niepowodzeniu reakcji amplifikacji, w związku z czym próbka nie powinna być sekwencjonowana. Jak pokazano tutaj, analiza wielkości fragmentów została przeprowadzona za pomocą elektroforezy kapilarnej na analizatorze fragmentów. Prawidłowo przygotowane biblioteki będą charakteryzować się dość równomiernym rozkładem wielkości fragmentów od 150 do 900 par zasad.Nieudane przygotowanie biblioteki spowoduje zaburzenie rozkładu wielkości fragmentów, a takich bibliotek nie należy sekwencjonować. Z wykorzystaniem ukrytego modelu Markowa oraz okrężnej segmentacji binarnej, genom każdej komórki został podzielony na segmenty o szacowanej liczbie kopii. Tabela ta przedstawia nałożone na siebie wyniki z pojedynczej komórki i wykazuje przyrost na chromosomie 10 od 67 do 130 megabase oraz przyrost na chromosomie 19 od 0 do 20 megabase.Izolacja i amplifikacja całego genomu pojedynczych komórek mogą i powinny być przeprowadzone w ciągu jednego dnia. Przygotowanie bibliotek do sekwencjonowania, sekwencjonowanie całego genomu oraz analiza danych mogą być następnie wykonane zgodnie z elastycznym harmonogramem. Jeśli izolacja komórek i amplifikacja całego genomu zostaną przeprowadzone prawidłowo, a analiza danych zostanie wykonana rygorystycznie zgodnie z opisem, zmiany liczby kopii przekraczające 5 Mb mogą zostać wykryte z wysoką czułością i swoistością.Choć nasz protokół opisuje konkretnie zastosowanie sekwencjonowania pojedynczych komórek do wykrywania zmian liczby kopii, elementy tej procedury, takie jak izolacja pojedynczych komórek i przygotowanie bibliotek, mogą zostać zastosowane do wykrywania innych zmian genomicznych.

detection-of-copy-number-alterations-using-single-cell-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie

Tablica CGH do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych zastąpiła analizę kariotypów w pasmach G. W artykule opisano technologię i jej zastosowanie w laboratorium usług diagnostycznych.

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych

Tutaj prezentujemy adresowalne mikromacierze kropelkowe (ADM), metodę opartą na tablicy kropelkowej, która jest w stanie określić bezwzględną obfitość białek w pojedynczych komórkach. Wykazujemy zdolność ADM do charakteryzowania niejednorodności ekspresji białka supresorowego p53 w ludzkiej linii komórek nowotworowych.

Zliczanie białek w pojedynczych komórkach za pomocą adresowalnych mikromacierzy kropelkowych

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Ten manuskrypt opisuje analizę zmienności liczby kopii przeprowadzoną w DNA surowicy lub osocza przy użyciu metody PCR w czasie rzeczywistym. Metoda ta jest odpowiednia do przewidywania oporności na leki u pacjentów z rakiem gruczołu krokowego opornym na kastrację, ale może być również pouczająca w przypadku innych chorób.

Wykrywanie liczby kopii w surowicy i osoczu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

Rękopis opisuje cyfrowy test PCR oparty na chipie, który wykrywa rzadki wariant transkryptu CDH1 (CDH1a) w świeżo zamrożonych tkankach normalnych i nowotworowych pobranych od pacjentów z rakiem żołądka.

Wykrywanie rzadkiego wariantu transkryptu CDH1 w świeżo mrożonych tkankach raka żołądka za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

W artykule opisano metodę identyfikacji zmian klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od danego pacjenta. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na określonym typie nowotworu, podejście to ma szerokie zastosowanie do innych guzów litych.

Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania

Protokół przedstawia ogólne procedury laboratoryjne wymagane w preimplantacyjnych testach genetycznych na aneuploidię na platformie sekwencjonowania nowej generacji opartej na półprzewodnikach. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe etapy amplifikacji całego genomu, selekcji fragmentów DNA, budowy biblioteki, przygotowania szablonów i przepływu roboczego sekwencjonowania z reprezentatywnymi wynikami.

Preimplantacyjne badania genetyczne w kierunku aneuploidii na półprzewodnikowej platformie sekwencjonowania nowej generacji

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru bezwzględnej liczby kopii mitochondrialnego (mt)DNA i poziomów heteroplazmii delecji mtDNA w pojedynczych komórkach.

Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Protokół ten opisuje zautomatyzowany, akredytowany przez ISO15189 proces sekwencjonowania nowej generacji do wykrywania celowanych zmian genomowych w tkankach formalinowych osadzonych w parafinie tkankach raka płuc niedrobnokomórkowych (NSCLC).

Wykrywanie celowalnych zmian w niedrobnokomórkowym raku płuc za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Poznaj metodę sekwencjonowania pojedynczych komórek do wykrywania megabazowych zmian liczby kopii DNA. Protokół zwiększa czułość i swoistość analizy genomowej w porównaniu z tradycyjnymi podejściami cytologicznymi.

Wykrywanie zmian numeru kopii za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek

Przeglądaj więcej filmów