Wykrywanie zmian numeru kopii za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek
17 lutego 2017
Sekwencjonowanie pojedynczych komórek jest coraz bardziej popularnym i dostępnym narzędziem do rozwiązywania problemów związanych ze zmianami genomowymi w wysokiej rozdzielczości. Udostępniamy protokół, który wykorzystuje sekwencjonowanie pojedynczych komórek do identyfikacji zmian liczby kopii w pojedynczych komórkach.
Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja zmian liczby kopii DNA w skali megapodstawowej w pojedynczych komórkach. Aby skategoryzować heterogeniczność genomową w populacjach komórek, konieczne jest zidentyfikowanie zmian genomowych w rozdzielczości pojedynczej komórki. Tradycyjnie osiągano to za pomocą podejść cytologicznych, jednak metody te były ograniczone pod względem czułości i swoistości.
Sekwencjonowanie pojedynczych komórek może wykryć różne zmiany genomowe, ze zwiększoną czułością i swoistością w porównaniu z wcześniejszymi podejściami, ale tylko wtedy, gdy jest starannie wykonane. W tym miejscu opisujemy, jak używać sekwencjonowania pojedynczych komórek do niezawodnego wykrywania zmian liczby kopii w skali megabazowej w pojedynczych komórkach. Aby zmontować mikroaspirator, zacznij od usunięcia przezroczystej plastikowej końcówki z zespołu rurki aspiratora i włóż wąski koniec do jednego końca rurki PVC o długości jednej stopy i średnicy wewnętrznej 3/16 cala.
Włóż wylot filtra strzykawkowego o średnicy 0.2 mikrometra do drugiego końca rurki PVC o długości jednej stopy i średnicy wewnętrznej 3/16 cala. Następnie włóż wlot filtra strzykawkowego o średnicy 0,2 mikrometra do jednego końca sześciocalowej rurki PVC o średnicy wewnętrznej 5/16 cala. Rozbij pięciomililitrową plastikową pipetę serologiczną z podziałką jednego mililitra i włóż złamany koniec do otwartego końca rurki PVC o średnicy wewnętrznej 5/16 cala.
Następnie włóż wylot pięciomililitrowej plastikowej pipety serologicznej do elastycznego końca zespołu probówki aspiratora, a następnie użyj sterylnej plastikowej probówki, aby przykryć czerwony ustnik zespołu probówki do przechowywania. Wyciągnij szklaną rurkę kapilarną do średnicy wewnętrznej 10-30 mikrometrów, umieszczając środek rurki w pobliżu płomienia i wywierając napięcie na obu końcach rurki. Przełam narysowaną rurkę na dwie połówki, aby utworzyć dwie potencjalne igły aspiratora.
Powtórz ten krok z kilkoma probówkami, aby upewnić się, że przygotowana jest wystarczająca ilość igieł o odpowiedniej średnicy wewnętrznej do pobierania pojedynczych komórek. Aby przygotować komórki adhezyjne, takie jak ludzkie linie komórkowe fibroblastów, należy zebrać komórki przez trypsynizację i przenieść komórki do stożkowej rurki zawierającej odpowiednią pożywkę. Ustaw kaptur do amplifikacji całego genomu, używając 10% wybielacza do spryskania powierzchni kaptura, pudełek na końcówki do pipet i końcówek do pipet.
Następnie użyj ręcznika papierowego, aby wytrzeć je wszystkie przed powtórzeniem prania z 70% etanolem. Dodaj osiem mikrolitrów wody z zestawu do amplifikacji całego genomu (WGA) do poszczególnych studzienek na 96-dołkową płytkę PCR. Następnie przykryj 96-dołkową płytkę do PCR pokrywką z 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i umieść płytkę na lodzie.
Następnie dodaj 1 000 komórek do 10 mililitrów pożywki lub PBS na 15-centymetrowej szalce Petriego i umieść naczynie na lodzie, aby zapobiec przywieraniu komórek do naczynia. Następnie, będąc jeszcze na lodzie, przenieś komórki na szalce Petriego i 96-dołkowej płytce PCR do mikroskopu świetlnego z obiektywem 10X. Zwiększyć otwór igły aspiratora, delikatnie stukając wyciągniętym końcem igły o twardą powierzchnię, tak aby końcówka się oderwała.
Następnie włóż szeroki koniec igły do przezroczystej końcówki mikroaspiratora. Następnie umieść szalkę Petriego zawierającą komórki na stoliku mikroskopu. Włóż czerwony ustnik aspiratora do ust.
Następnie, podczas używania, trzeba było przesunąć igłę aspiratora, a drugą rękę, aby przesunąć szalkę Petriego, zidentyfikować pojedyncze komórki, które miały zostać zsekwencjonowane. Za pomocą odsysania przez usta wciągnij pojedynczą komórkę do igły aspiratora wraz z około jednym do dwóch mikrolitrów pożywki lub PBS. Przenieś komórkę do ośmiu mikrolitrów wody w jednym dołku 96-dołkowej płytki PCR.
Jakość i użyteczność danych sekwencjonowania pojedynczych komórek zależy od stanu każdej komórki i jej genomu, dlatego podczas przygotowania komórek i mikroaspiracji należy zachować ostrożność, aby wyizolować komórki żywotne i nieapoptotyczne. Po zaessaniu każdej komórki i przeniesieniu jej do dołka płytki PCR, zaznacz studzienkę, w której otrzymała się komórka. Powtórz tę czynność dla żądanej liczby komórek.
W międzyczasie rozmrozić 10X bufor fragmentacji pojedynczej komórki z zestawu do amplifikacji całego genomu. Aby zapobiec zanieczyszczeniu podczas amplifikacji całego genomu, dodaj wszystkie odczynniki do kaptura do hodowli tkankowych. Używaj końcówek do pipet z filtrami i wymieniaj końcówkę pipety między studzienkami.
Dla każdego zestawu do 32 komórek połącz 32 mikrolitry 10X buforu do lizy i fragmentacji pojedynczych komórek oraz dwa mikrolitry roztworu proteinazy K w probówce do mikrowirówki, a następnie zwiruj probówkę, aby wymieszać zawartość. Dodaj jeden mikrolitr roztworu do każdej studzienki i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Przykryj płytkę i użyj folii z tworzywa sztucznego, aby uszczelnić wszystkie dołki.
Następnie krótko odwirować płytkę w mini wirówce do płytek. Następnie przepuść płytkę przez termocykler za pomocą następującego programu. Następnie ostudzić płytkę na lodzie i krótko ją odwirować.
Aby przygotować działający roztwór buforowy do przygotowania biblioteki z zestawu do amplifikacji całego genomu, dla każdej komórki połącz dwa mikrolitry bufora do przygotowania biblioteki pojedynczej komórki 1X i jeden mikrolitr roztworu stabilizującego bibliotekę. Odpowiednia liza komórek i pełna fragmentacja genomu mają kluczowe znaczenie dla zminimalizowania stronniczości podczas amplifikacji całego genomu i zapewnienia przygotowania wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania. W związku z tym należy pamiętać o wykonaniu tych kroków dokładnie tak, jak jest to napisane.
Usuń plastikową folię z naczynia i dodaj trzy mikrolitry roztworu do każdej studzienki. Odpipetuj zawartość studzienki w górę iw dół, aby wymieszać, a następnie załóż plastikową folię. Po krótkim odwirowaniu płytki inkubować komórki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez dwie minuty, następnie schłodzić płytkę na lodzie i ponownie krótko odwirować płytkę.
Teraz usuń plastikową folię, dodaj jeden mikrolitr enzymu do przygotowania biblioteki do każdej studzienki i pipetuj zawartość studzienki w górę iw dół, aby wymieszać, a następnie wymień plastikową folię. Po krótkim odkręceniu płytki umieść ją w termocyklerze i uruchom następujący program. Po schłodzeniu płytki i krótkim zakręceniu, przygotuj działającą mieszankę amplifikacyjną z zestawu do amplifikacji całego genomu, łącząc 48,5 mikrolitra wody, 7,5 mikrolitra 10-krotnej mieszanki głównej amplifikacji i 5 mikrolitrów polimerazy DNA WGA dla każdej komórki.
Utrzymuj mieszankę roboczą na lodzie. Usuń plastikową folię z talerza. Dodaj 61 mikrolitrów roboczej mieszanki amplifikacyjnej do każdej studzienki i pipetuj zawartość każdej studzienki w górę iw dół, aby wymieszać, a następnie załóż plastikową folię.
Krótko odwirować płytkę i poddać cyklowi termicznemu w następujący sposób. Sekwencjonuj próbki i przeprowadzaj analizę danych zgodnie z protokołem tekstowym. Jak pokazano na tym rysunku, jeśli amplifikacja całego genomu zakończy się sukcesem, próbka pojawi się jako rozmaz na żelu agarozowym.
Słaby rozmaz lub jego brak wskazuje na nieudaną reakcję amplifikacji i próbka nie powinna być sekwencjonowana. Jak pokazano tutaj, analizę rozmiarów fragmentów przeprowadzono za pomocą elektroforezy kapilarnej na analizatorze fragmentów. Pomyślnie przygotowane biblioteki będą miały w miarę równomierny rozkład rozmiarów fragmentów od 150 do 900 par zasad.
Nieudane przygotowanie biblioteki spowoduje niesymetryczny rozkład rozmiaru fragmentów i takie biblioteki nie powinny być sekwencjonowane. Korzystając z ukrytego modelu Markowa i kołowej segmentacji binarnej, genom każdej komórki został przeanalizowany na segmenty o szacowanej liczbie kopii. Poniższa tabela przedstawia nakładające się na siebie wyniki z pojedynczej komórki i ujawnia przyrost chromosomu 10 od 67 do 130 megazasad oraz przyrost chromosomu 19 od 0 do 20 megazasad
.Izolacja i amplifikacja całego genomu pojedynczych komórek może i powinna być wykonana w ciągu jednego dnia. Przygotowanie bibliotek sekwencjonowania, sekwencjonowanie całego genomu i analiza danych mogą być następnie wykonywane według elastycznego harmonogramu. Gdy izolacja komórek i amplifikacja całego genomu są wykonywane prawidłowo, a analiza danych jest przeprowadzana rygorystycznie zgodnie z opisem, zmiany liczby kopii przekraczające pięć megazasad mogą być wykrywane z wysoką czułością i swoistością.
Podczas gdy nasz protokół szczegółowo opisuje zastosowanie sekwencjonowania pojedynczych komórek do wykrywania zmian liczby kopii, aspekty tego protokołu, takie jak izolacja pojedynczej komórki i przygotowanie biblioteki, mogą być stosowane do wykrywania innych zmian genomowych.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół wykorzystania sekwencjonowania pojedynczych komórek do identyfikacji zmian liczby kopii DNA w skali megabaz w pojedynczych komórkach. Metoda ta zwiększa czułość i swoistość w porównaniu do tradycyjnych podejść cytologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genomika
- Sekwencjonowanie pojedynczych komórek
- Biologia komórki
Wstęp
- Sekwencjonowanie pojedynczych komórek umożliwia wykrywanie zmian genomicznych z wysoką rozdzielczością.
- Tradycyjne metody nie charakteryzowały się wystarczającą czułością i swoistością w identyfikacji heterogeniczności genomicznej.
- Zmiany liczby kopii mogą dostarczyć informacji na temat różnorodności komórkowej.
- Niezawodna detekcja wymaga starannego przeprowadzenia protokołu sekwencjonowania.
Cel badania
- Przedstawienie szczegółowego protokołu identyfikacji zmian liczby kopii DNA w pojedynczych komórkach.
- Poprawa zrozumienia heterogeniczności genomicznej w populacjach komórek.
- Zwiększenie wiarygodności danych z sekwencjonowania pojedynczych komórek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie mikroaspiratorów do izolacji pojedynczych komórek.
- Amplifikacja całego genomu z wykorzystaniem specjalistycznego zestawu.
- Ostrożne obchodzenie się z komórkami w celu zapewnienia ich żywotności podczas sekwencjonowania.
- Zastosowanie termocyklingu do przygotowania biblioteki.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja i sekwencjonowanie pojedynczych komórek.
- Wykrywanie zmian liczby kopii w skali megabazy.
- Wykazanie poprawy czułości i swoistości w analizie genomicznej.
- Opracowanie niezawodnego protokołu dla przyszłych badań.
Wnioski
- Sekwencjonowanie pojedynczych komórek jest potężnym narzędziem analizy genomicznej.
- Protokół ten zwiększa wykrywalność zmian genomicznych.
- Przyszłe zastosowania mogą skorzystać z opracowanych metod.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Sekwencjonowanie pojedynczych komórek w celu wykrywania zmian liczby kopii pozwala na wysokorozdzielczą charakterystykę heterogeniczności genetycznej w populacjach komórkowych, co bezpośrednio wpływa na wczesne etapy odkryć oraz badania translacyjne. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji subklonalnych zdarzeń genomicznych istotnych dla progresji choroby i celowania terapeutycznego. Niezawodne wykrywanie wariantów liczby kopii w skali megabazowej wspiera decyzje portfelowe dostosowane do ryzyka oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w programach onkologicznych i opartych na genomice.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjne mapowanie heterogeniczności genomowej na poziomie pojedynczych komórek w celu rzetelnej walidacji celów terapeutycznych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez odróżnianie zmian subklonalnych od szumu tła.
- Ułatwia funkcjonalną ocenę potencjalnych celów w populacjach zróżnicowanych genetycznie.
- Zwiększa pewność prognostyczną dla dalszych hipotez biologicznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane profile genomiczne pojedynczych komórek w celu standaryzacji i powtarzalności analizy.
- Generuje wyniki ilościowe do wyznaczania punktów odniesienia dla czułości i swoistości analizy.
- Umożliwia przesiewowe badanie populacji komórek pod kątem rzadkich lub pojawiających się zmian liczby kopii.
- Wspiera skalowalność platformy i możliwość ponownego wykorzystania w różnych typach komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki genomiczne z modelami istotnymi dla choroby w celu opracowania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez śledzenie ewolucji klonalnej.
- Uzasadnia decyzje o dalszym rozwoju projektów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o dowody genomiczne z pojedynczych komórek.
- Usprawnia predykcyjną redukcję ryzyka przy wyborze kandydatów w potokach badawczych w onkologii.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, umożliwiając wysokorozdzielczą analizę genomiczną – od wczesnej walidacji celu po badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez rozstrzyganie wariancji genomicznej między komórkami.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, ilościowe dane o liczbie kopii w celu przygotowania testów i wyznaczenia punktów odniesienia.
- Analityka: Zapewnia wyniki statystyczne i określenia liczby kopii segmentowych dla niezawodnego porównywania warunków.
- Badania translacyjne: Łączy genomowe zmiany w pojedynczych komórkach z modelami chorób i strategiami biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny schemat pracy dla analizy genomicznej pojedynczych komórek w ramach różnych programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację pojedynczych komórek, amplifikację i analizę w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji typu go/no-go oraz efektywne zarządzanie kapitałem w portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój zasobów opartych na genomice.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie manipulacji pojedynczymi komórkami, amplifikacji całego genomu oraz analizy sekwencjonowania.
- Wymagany jest dostęp do wysokiej jakości aparatury do izolacji komórek, przygotowywania bibliotek i sekwencjonowania.
- Niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja między zespołami w celu zapewnienia porównywalności i powtarzalności danych.
- Może być wymagana adaptacja dla różnych typów komórek lub systemów modelowych w zależności od żywotności i integralności genomowej.
- Czułość detekcji jest ograniczona do zmian liczby kopii przekraczających pięć megabaz, zgodnie z opisem w protokole.
