Nowatorska diagnostyka w rewizyjnej endoprotezoplastyce: sonikacja implantu i multipleksowa reakcja łańcuchowa polimerazy
3 grudnia 2017
Diagnostyka różnicowa w bolesnej endoprotezoplastyce jest kluczowa dla powodzenia leczenia. Aspiracja stawu jest rutynowo wykonywana przed operacją. Opisano multipleksową reakcję łańcuchową polimerazy aspiratu stawowego i płynu sonikacyjnego, które jest wykonalnym narzędziem do szybkiego wykrywania patogenów na podstawie tych próbek.
Ogólnym celem procedur opisanych z aspiracją stawu, multipleksową reakcją łańcuchową polimerazy i sonikacją jest dostarczenie chirurgom ortopedom szybkich i wiarygodnych wyników mikrobiologicznych w przypadku podejrzenia infekcji stawu okołoprotetycznego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie diagnostyki i terapii zakażeń stawów okołoprotezowych, takie jak wczesne wykrycie patogenów, a tym samym wczesne leczenie celowane. Główną zaletą tych technik jest dostarczanie szybkich wyników.
Może to przyspieszyć diagnostykę różnicową w przypadku podejrzenia zakażenia stawu okołoprotezowego. Ułożyć pacjenta w pozycji leżącej na łóżku do badań. Jeśli kolano ma zostać przebite, należy umieścić rolkę kolanową pod kolanem pacjenta tak, aby kolano spoczywało w lekko zgiętej pozycji.
Użyj elektrycznych maszynek do strzyżenia, aby skrócić gęste lub długie włosy na ciele. Następnie przygotuj stół z instrumentami i ubierz się do operacji zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie należy użyć środka do dezynfekcji skóry, aby dokładnie umyć skórę pacjenta w miejscu wkłucia.
Za pomocą sterylnego serwetowania z fenestracją zakryj miejsce nakłucia. Następnie zidentyfikuj miejsce nakłucia przez zasłonę. Za pomocą spiczastego ostrza skalpela wykonaj małe nacięcie przez skórę w miejscu nacięcia.
Przymocować kaniulę do ślizgu typu luer strzykawki. Następnie włóż kaniulę przez nacięcie kłute. W górnym wgłębieniu stawu kolanowego wyceluj pod kątem 45 stopni grzbietowym i przyśrodkowym w kierunku wgłębienia, poniżej górnego bieguna rzepki i wbij igłę na głębokość około 5 cm.
Odessać płyn stawowy, wyciągając tłok strzykawki. Aby zapobiec tworzeniu się krwiaków, nałóż opatrunek, a następnie bandaż na nacięcie kłute. Użyj alkoholowego środka dezynfekującego do dezynfekcji membrany kolby do posiewu krwi u dzieci.
Następnie umieścić świeżą kaniulę na strzykawce i wstrzyknąć do kolby od 1 do 3 ml zasysanego płynu stawowego. Wymieszać przez delikatne mieszanie lub obracanie. Aby przygotować natywną próbkę aspiratu stawowego, wyjmij kaniulę ze strzykawki.
Następnie otworzyć probówkę do pobierania krwi bez dodatków i wstrzyknąć 1 ml aspiratu do probówki zbiorczej. Załóż i zamocuj pokrywkę do analizy PCR. Przenieść od 1 do 4 ml aspiratu stawowego do probówki do pobierania krwi zawierającej EDTA w celu zliczania i różnicowania komórek.
Rozmrozić główną probówkę mieszającą, ustawiając ją na temperaturę pokojową. Przenieść 180 mcl pobranej próbki do probówki z próbką. Zamknij probówkę z nakrętką probówki z próbką, która zawiera kinazę białkową K i gen kontroli wewnętrznej do kontroli jakości całego przepływu pracy.
W kokpicie otwórz oprogramowanie operacyjne, dotykając przycisku Nowy test w lewym dolnym rogu. Użyj ekranu dotykowego, aby wprowadzić dane pacjenta lub próbkę ID.To wybierz próbkę z listy rozwijanej, najpierw wybierz wkład ITI, następnie ortopedię jako tryb aplikacji, a na końcu wybierz płyn maziowy lub płyn sonikacyjny jako typ próbki. Następnie naciśnij przycisk Start.
Zeskanuj kod kreskowy na spodzie probówki z próbką. Następnie włóż probówkę z próbką do lizatora. Następnie wybierz próbkę na ekranie kokpitu, aby odblokować probówkę z próbką z Lysatora.
Następnie wyjmij probówkę z próbką z lizatora i zamknij górną pokrywę lizatora. Przenieś probówkę z próbką do szczeliny probówki z próbką we wkładzie PCR. Następnie włóż rozmrożoną probówkę z mieszanką główną do szczeliny mieszanki głównej we wkładzie PCR.
Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na monitorze w kokpicie, aby zeskanować kartusz PCR z mieszanką wzorcową i probówką z próbką. Włóż wkład PCR do wskazanego gniazda wkładu analizatora. Na ekranie dotykowym kokpitu w lewym dolnym rogu wybierz opcję Aktywne testy, a następnie wybierz prawidłowy identyfikator próbki, aby wyświetlić wyniki testu.
Zapisz wyniki w pamięci urządzenia i wydrukuj lub wyeksportuj w celu uzyskania dalszych informacji. Porozmawiaj ze swoim mikrobiologiem i poinformuj go o szczegółach przypadku, aby był przygotowany do szybkiej analizy próbek. Pod stołem roboczym z laminarnym przepływem powietrza otwórz plastikowy pojemnik, trzymając ex zasadzoną protezę z sali operacyjnej i dodaj sterylny 0,9% roztwór chlorku sodu, aż posadzone ciało obce zostanie pokryte co najmniej 80%Zamknij plastikowy pojemnik.
Następnie dokładnie potrząśnij lub mieszaj plastikowy pojemnik przez 30 sekund. Przenieść plastikowy pojemnik do kąpieli sonikacyjnej. Następnie sprawdź poziom płynów w wannie.
Sonikować próbkę przez pięć minut, z częstotliwością 40 plus minus 2 kiloherców i gęstością mocy 0,22 plus minus 0,04 wata na centymetr kwadratowy. Następnie potrząśnij lub dokładnie wiruj próbkę przez 30 sekund. Wewnątrz ławki z przepływem laminarnym zbierz 50 ml płynu sonikacyjnego i przenieś go do sterylnej probówki przed szczelnym zamknięciem probówki.
Aby wytworzyć skoncentrowany płyn sonikacyjny, odwirować probówkę o stężeniu 4200 razy G przez 10 minut, pozostawiając pozostałą objętość 10 ml, użyć pipety, aby wyrzucić pozostały supernatant. Ponownie zawiesić osad przez pipetowanie i wirowanie. Zaszczepić każdą kolbę z odpowiednią pożywką hodowlaną 0,5 ml stężonego płynu sonikacyjnego.
Zaszczep kolbę do posiewu krwi u dzieci 2 ml skoncentrowanego płynu sonikacyjnego, jak pokazano wcześniej w tym filmie. Następnie przenieś 1 ml stężonego płynu sonikacyjnego do sterylnej probówki bez dodatków do analizy PCR. Przenieść zaszczepione pożywki hodowlane do inkubatora.
Inkubuj kultury przez 14 dni i codziennie sprawdzaj wzrost. Obecność infekcji stawu okołoprotezowego uznano za udowodnioną, gdy spełnione było jedno z głównych kryteriów lub co najmniej trzy z pięciu kryteriów drugorzędnych. Do głównych kryteriów należy obecność przetoki lub wykrycie patogenu w dwóch oddzielnych próbkach mikrobiologicznych.
Mniejsze kryteria obejmują dodatnią liczbę komórek lub dodatnie różnicowanie komórek w aspiracie stawowym, dodatnie CRP i wskaźnik sedymentacji w próbkach krwi, dodatnią histologię w próbkach tkanek lub wykrycie patogenu w tylko jednej próbce mikrobiologicznej. Wyniki wykazały umiarkowaną czułość w diagnostyce PCR płynu sonikacyjnego i aspiratu stawowego, ale bardzo silną swoistość wynoszącą 100%Ilekroć PCR wykazywał dodatni wynik w aspiracie stawowym lub płynie sonikacyjnym, ten sam patogen wykrywano później w jednej z konwencjonalnych kultur mikrobiologicznych. PCR różnych próbek przypadków niezakażonych nie wykazał wyników fałszywie dodatnich.
Sześć z 16 prawdziwych patogenów w próbkach płynu sonikacyjnego i pięć z 13 patogenów z hodowli płynu stawowego zostało pominiętych przez detekcję PCR. Połączona diagnostyka PCR obu materiałów, aspiratu stawowego i płynu sonikacyjnego prawidłowo zidentyfikowała 12 z 18 przypadków infekcji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak poprawić swoją ścieżkę diagnostyczną w przypadku infekcji stawu okołoprotetycznego.
Można zobaczyć, jak mikrobiolodzy i chirurdzy ortopedzi muszą ściśle ze sobą współpracować, aby jak najlepiej poprawić diagnostykę różnicową. Jeśli zostanie wykonane prawidłowo, w ciągu pięciu godzin po aspiracji stawu otrzymasz klinicznie wartościowe wyniki multipleksowego PCR na bazie kartridża. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o tym, aby przez cały proces pracować w sterylnym tonie.
Nie zapominaj, że praca z próbkami tkanek ludzkich lub mikrobiologicznymi może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować wszelkie środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej.
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia znaczenie diagnostyki różnicowej w przypadku bolesnej artroplastyki, ze szczególnym uwzględnieniem aspiracji stawu oraz seryjnej reakcji łańcuchowej polimerazy (multiplex PCR) w celu wykrycia patogenów. Metody te mają na celu dostarczenie szybkich i wiarygodnych wyników mikrobiologicznych chirurgom ortopedom zajmującym się podejrzeniem infekcji okołoprotetycznych stawów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Chirurgia ortopedyczna
- Mikrobiologia
- Diagnostyka infekcji
Wstęp
- Bolesna artroplastyka wymaga dokładnej diagnostyki w celu skutecznego leczenia.
- Aspiracja stawu jest powszechną procedurą przedoperacyjną.
- Multiplex PCR i sonikacja to rozwijające się narzędzia do wykrywania patogenów.
- Szybkie wyniki mogą mieć istotny wpływ na decyzje terapeutyczne.
Cel badania
- W celu zwiększenia dokładności diagnostycznej w przypadku podejrzenia okołoprotetycznych infekcji stawów.
- W celu przyspieszenia identyfikacji patogenów w celu zastosowania celowanej terapii.
- W celu oceny skuteczności metod aspiracji stawowej i sonikacji.
Zastosowane metody
- Aspiracja stawu przeprowadzona w warunkach sterylnych.
- Analiza multiplex PCR aspiratu ze stawu oraz płynu z sonikacji.
- Sonikacja usuniętych protez w celu odzyskania patogenów.
- Ocena kryteriów diagnostycznych zakażenia okołoprotetycznego stawu.
Główne wyniki
- Wykazano umiarkowaną czułość diagnostyki PCR w przypadku płynu z sonikacji.
- Zidentyfikowano kluczowe kryteria diagnostyczne potwierdzające infekcje.
- Podkreślono znaczenie szybkiego uzyskania wyników mikrobiologicznych.
- Przedstawiono ustrukturyzowane podejście przeznaczone dla chirurgów ortopedów.
Wnioski
- Aspiracja z przestawek stawowych oraz wielokrotny PCR są skuteczne w ramach szybkiej diagnostyki.
- Wczesne wykrycie patogenów może prowadzić do wdrożenia terminowego leczenia.
- Metody te usprawniają postępowanie w przypadku okołoprotezowych zakażeń stawów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna i szybka diagnostyka infekcji okołoprotetycznych (PJI) jest kluczowa dla prowadzenia terminowej interwencji terapeutycznej oraz zmniejszenia obciążenia związanego z rewizyjną artroplastyką. Integracja sonikacji implantów z multipleksową reakcją PCR oferuje wysoce specyficzne podejście diagnostyczne, które umożliwia wczesne wykrycie patogenów i podejmowanie świadomych decyzji terapeutycznych. Metodyka ta zwiększa pewność diagnostyczną w badaniach i rozwoju ortopedycznym, dostarczając powtarzalnych wyników mikrobiologicznych, które mogą być wykorzystane do oceny strategii przeciwdrobnoustrojowych oraz modeli infekcji związanych z implantami.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie obecności patogenów w biofilmach związanych z implantami w celu walidacji celów terapeutycznych w chorobach zakaźnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowaną metodę odzyskiwania mikroorganizmów o niskiej liczebności z powierzchni implantów na potrzeby badań mechanistycznych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe, multipleksowe odczyty oparte na metodzie PCR z płynu po sonikacji, co wspiera standaryzację i powtarzalność analizy.
- Wartość operacyjna: Dostarcza szybkich wyników w ciągu pięciu godzin, umożliwiając wysokoprzepustowy screening związków przeciwdrobnoustrojowych przeciwko patogenom istotnym dla PJI.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera opracowywanie istotnych w kontekście chorób modeli zakażeń z wykorzystaniem eksplantowanych protez w celu oceny interakcji między gospodarzem a patogenem.
- Wartość operacyjna: Ułatwia pobieranie próbek wzdłużnych oraz ocenę obciążenia mikrobiologicznego w przedklinicznych modelach zakażeń implantów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w schemat diagnostyki infekcji – od pobrania próbki po identyfikację patogenu – umożliwiając płynne przejście od aspiracji stawu do analizy molekularnej w warunkach przedklinicznych i translacyjnych.
- Biologia odkryć: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących tworzenia biofilmu i żywotności patogenów na powierzchniach implantów.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzowane przygotowanie płynu do sonikacji w celu zapewnienia spójności testów podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe.
- Analityka: Dostarcza wyniki z multiplex PCR, które pozwalają na jednoczesne wykrywanie wielu patogenów, co poprawia rozdzielczość diagnostyczną.
- Badania translacyjne: Łączy analizę eksplantów śródoperacyjnych z przedkliniczną walidacją modeli infekcji poprzez standaryzowane odzyskiwanie patogenów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do testowania infekcji związanych z implantami w ramach wielu programów badawczo-rozwojowych w ortopedii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Wysoka swoistość (100%) ogranicza liczbę fałszywie dodatnich wyników wykrywania patogenów, co zwiększa pewność walidacji celu oraz badań mechanistycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja procesów sonikacji i PCR poprawia odtwarzalność wyników pomiędzy różnymi laboratoriami i ośrodkami.
- Wartość strategiczna: Szybki czas realizacji analiz wspiera szybsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w programach opracowywania środków przeciwdrobnoustrojowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia postęp prac nad kandydatami z uwzględnieniem stratyfikacji ryzyka w oparciu o potwierdzoną obecność patogenu w modelach zakażeń.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga biegłości w technice aseptycznej, aspiracji stawowej oraz procedurach sonikacji.
- Zależne od dostępu do kąpieli sonikacyjnych, blatów z laminarnym przepływem powietrza oraz analizatorów PCR opartych na kartridżach.
- Wymaga międzyfunkcyjnej koordynacji między zespołami ortopedycznymi, mikrobiologicznymi i badawczo-rozwojowymi (R&D) w zakresie obsługi i interpretacji próbek.
- Adaptacja do różnych materiałów implantów i typów stawów może wymagać walidacji wydajności sonikacji.
- Czułość PCR jest umiarkowana, co wymaga zastosowania uzupełniających metod hodowlanych w celu kompleksowego wykrywania patogenów.
