Rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego

Bakteryjne białka efektorowe są ważne dla skutecznego leczenia infekcji. Protokół ten opisuje eksperymentalną identyfikację białkowych partnerów wiążących bakteryjne białko efektorowe w jego naturalnym żywicielu roślinnym. Identyfikacja tych oddziaływań efektorowych za pomocą dwuhybrydowych badań przesiewowych drożdży stała się ważnym narzędziem w odkrywaniu strategii patogenności molekularnej.

Ogólnym celem tej procedury jest rozwikłanie zjadliwych strategii i systemów patogenów gospodarza poprzez identyfikację interakcji białka złoczyńcy fitoplazmy Candidatus z białkami gospodarza z malus domestica. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w wielu różnych dziedzinach badań biologicznych i jest tutaj wykorzystywana w badaniach roślin w celu wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju choroby proliferacji jabłek. Główną zaletą tej techniki jest to, że pojedynczy efektor patogenu może być badany pod kątem tysięcy potencjalnych interaktorów, co sprawia, że metoda ta jest łatwo wykonalnym punktem wyjścia w badaniach nad infekcjami.

Na początek zidentyfikuj zainfekowane drzewa z objawami specyficznymi dla proliferacji jabłek i kontroluj drzewa, które są wolne od objawów. Za pomocą czystych sekatorów wytnij próbki korzeni z trzech różnych miejsc systemu korzeniowego o średnicy 0,5 1 cm i długości około 5 cm. Umieść próbki korzeni w odpowiednio oznakowanych plastikowych torebkach.

Następnie umieść próbki w zimnym pudełku ze schłodzonymi wkładami termicznymi i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszej obróbki. Opłucz próbki korzeni wodą, aby usunąć glebę. Następnie przenieś próbki na sterylną szalkę Petriego i za pomocą wysterylizowanego skalpela usuń naskórek korzeniowy i korę.

Czystą, niestrzępiącą się chusteczką wytrzyj skalpel. Następnie zanurz instrument w 70% etanolu i wysterylizuj go na gorąco nad otwartym ogniem. Użyj skalpela, aby podrapać łyko.

Pokrój próbkę na małe kawałki i podziel 30-100 miligramów kawałków na sterylną dwumililitrową probówkę reakcyjną. Przechowuj próbki w temperaturze 80 stopni Celsjusza lub natychmiast użyj ich do wyizolowania DNA, które służy jako matryca do amplifikacji genu efektorowego, a następnie klonowania efektora do wektora przynęty. Po wyizolowaniu polispecyficznego DNA fitoplazmy z zakażonych drzew, klonowaniu do wektorów przynęty i przetestowaniu go pod kątem samoaktywacji i ekspresji zgodnie z protokołem tekstowym.

Efektor ATP 00189 przekształcił NMY51 na świeżą płytkę SD-trp i hodował ją w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni, aż pojawią się czerwone kolonie. Użyj czerwonej kolonii z płytki agarowej, aby zaszczepić trzy mililitry pożywki SD-trp w małej kolbie do wytrząsania i inkubować kulturę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 120-150 obrotów na minutę. Następnego dnia, za pomocą jednego mililitra nocnej hodowli, zaszczepić 20 mililitrów SD-trp w kolbie do wytrząsania i pozostawić do wzrostu przez osiem godzin.

Użyj pożywki SD-trp, aby dostosować kulturę do OD600 0,2, a następnie za pomocą dziesięciu mililitrów kultury zaszczepić dwie kolby zawierające po 100 mililitrów pożywki SD-trp. Inkubuj kultury w temperaturze 30 stopni Celsjusza, potrząsając przez noc. Następnie zmierz OD600 w kulturze i osadzaj 120 jednostek OD600.

Na przykład, jeśli mierzony jest OD600 1,2, odwiruj 100 mililitrów próbki, wyrzuć supernatant i użyj 800 mililitrów wstępnie podgrzanego 2xYPAD do ponownego zawieszenia osadu w dwóch kolbach wytrząsarskich i inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Inkubuj kulturę drożdży w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 120-150 obrotów na minutę. Mierz OD600 co około 1,5 godziny zgodnie z protokołem tekstowym, aż do osiągnięcia OD600 0,6.

Po przygotowaniu DNA plemników łososia, Te Lithium OAc i PEG Lithium OAc zgodnie z protokołem tekstowym, odwiruj 800 mililitrów kultury drożdży przy 700 x G przez pięć minut, aby osadzać komórki. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki w łącznej ilości 200 mililitrów sterylnej, podwójnie destylowanej wody. Następnie ponownie osadzać komórki i wyrzucać supernatant.

Ponownie zawiesić osad w 16 mililitrach mieszanki Te Lithium OAc i ponownie odwirować próbkę. Następnie po wyrzuceniu supernatantu użyj 9,6 mililitra Te Lithium OAc do ponownego zawieszenia osadu. W naczyniach reakcyjnych o odpowiedniej wielkości przygotuj dwanaście fiolek z siedmioma mikrogramami piku Dodaj wektor biblioteki DNA HAC, 100 mikrolitrów 2% DNA plemników łososia i 2,5 mililitra mieszanki PEG Lithium OAc.

Do każdej z dwunastu fiolek dodać 600 mikrolitrów wcześniej przygotowanej zawiesiny komórek drożdży i energicznie mieszać przez jedną minutę. Następnie inkubuj reakcje w łaźni wodnej w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 45 minut, mieszając co 15 minut. Następnie dodaj 160 mikrolitrów DMSO do każdej fiolki i energicznie wymieszaj.

Następnie inkubować fiolki w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez dodatkowe 20 minut. Po osadzeniu komórek wyrzuć supernatant i użyj trzech mililitrów 2xYPAD do ponownego zawieszenia każdej osadki. Zebrać komórki ze wszystkich dwunastu fiolek w 100-mililitrowej kolbie do wytrząsania i inkubować drożdże przez 90 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 120 obrotów na minutę.

Po inkubacji, po zagnieżdżeniu komórek i odrzuceniu supernatantu, należy użyć dziesięciomililitrowej pipety serologicznej i 4,5 mililitra sterylnego 0,9% chlorku sodu w celu dokładnego ponownego zawieszenia osadu poprzez ostrożne pipetowanie w górę iw dół. Pobrać 50 mikrolitrów zawiesiny i użyć 0,9% chlorku sodu do przygotowania dziesięciokrotnych rozcieńczeń od 1:10 do 1:1000. Następnie rozłożyć 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na 90-milimetrowych szalkach Petriego zawierających agar SD-trp-leu.

Resztę nierozcieńczonej zawiesiny drożdży rozprowadzić na szalkach Petriego o średnicy 16x150 milimetrów agarem SD-trp-leu-His-ade. Inkubować płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy dni w przypadku płytek SD-trp-leu i przez cztery dni w przypadku płytek SD-trp-leu-his-ade. Określić skuteczność transfekcji, zliczając kolonie różnych seryjnych rozcieńczeń na płytkach selekcyjnych SD-trp-leu.

Przenieś każdy klon za pomocą sterylnej końcówki pipety, aby pobrać i rozprowadzić kolonię na świeżych selektywnych płytkach SD-trp-leu-his-ade. Inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Powtarzaj przenoszenie klonów każdego dnia, aż do osiągnięcia łącznie pięciu przejść.

Aby przeanalizować klony, pod sterylnym kapturem przygotuj jedną sterylną dwumililitrową probówkę reakcyjną z jednym mililitrem SD-trp-leu-his-ade dla każdego klonu. Użyj gorącej igły, aby wybić otwór w każdej tubie i użyj gazoprzepuszczalnego uszczelniacza, aby zakryć otwór. Zaszczepić każdą fiolkę świeżym materiałem kolonijnym z jednego klonu i inkubować fiolki w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 150 obrotów na minutę przez 24 godziny.

Po zagnieżdżeniu komórek i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w odpowiednim buforze i przenieść go do świeżej dwumililitrowej probówki reakcyjnej. Do zawiesiny dodać 100 mikrolitrów szklanych kulek przemytych kwasem i energicznie mieszać probówkę przez pięć minut. Na koniec oczyść plazmidowe DNA zgodnie z protokołem tekstowym.

Podsumowanie oczekiwanych wyników testu samoaktywacji i ich interpretacji przedstawiono w poniższej tabeli i na rysunku. Słaba autoaktywacja prowadzi do wzrostu na trp-leu-his, ale nie na płytkach selekcyjnej zubożonych trp-leu-his-ade. Podczas gdy drożdże przekształcone w silną, samoaktywującą się przynętę rosłyby na trp-leu-his-ade bez pożywki.

Udana kotransformacja przynęty i ofiary charakteryzuje się wzrostem na selektywnych płytkach pozbawionych trp i leu. Interakcja przynęty i białka ofiary prowadzi do komplementacji oksytrofii jego i ade NMY51 Pokazano tutaj przykład interakcji między przynętą a zdobyczą w eksperymencie hybrydowym drożdży 2. Zidentyfikowano partnerów interakcji gospodarza malus domestica, MdTCP24 i MdTCP25, a interakcję potwierdzono przez transformację stożka denovo z efektorem.

Po opanowaniu hybrydę drożdży 2 można wykonać w ciągu jednego dnia, jeśli wszystkie niezbędne urządzenia i materiały, zwłaszcza drożdże, zostaną wcześniej odpowiednio przygotowane. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby unikać zanieczyszczenia i zawsze pracować w sterylnych warunkach. Po tej procedurze należy wykonać kolejną niezależną metodę, taką jak na przykład dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencyjna, aby potwierdzić znalezione interakcje białko-białko.

Jest to szczególnie ważne, ponieważ drożdże lub hybryda same w sobie są stosunkowo podatne na generowanie wyników fałszywie dodatnich. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z wielu różnych dziedzin badawczych do lepszego zrozumienia zasad molekularnych, które obejmują interakcje białko-białko, zwłaszcza w interakcjach gospodarz-patogen, a także w wielu innych dziedzinach badań biologicznych. Co więcej, zrozumiesz, że wykonanie tej metody jest łatwo wykonalne w każdym przyzwoicie wyposażonym laboratorium biologii molekularnej.

Nie zapominaj, że praca z niektórymi chemikaliami, skalpelami i otwartym ogniem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy wziąć pod uwagę pewne środki ostrożności. Oznacza to, że należy używać osobistego sprzętu ochronnego, takiego jak rękawice i okulary, oraz ogólnego sprzętu laboratoryjnego.