Name: Rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Poznaj metodę sita dwuhybrydowego do identyfikacji interakcji białkowych efektora bakteryjnego z białkami gospodarza Malus domestica. Ta technika pozwala badać mechanizmy choroby proliferacji jabłoni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Christine Kerschbamer, Thomasowi Letschce, Sabine Oettl, Margot Raffeiner i Florianowi Senonerowi z Centrum Badawczego w Laimburgu oraz Mirelle Borges Dias Schnetzer z Dualsystems Biotech AG za wsparcie techniczne i Julii Strobl za korektę manuskryptu. Prace te zostały wykonane w ramach projektu APPL2.0 i zostały częściowo sfinansowane przez Autonomiczną Prowincję Bolzano/Bolzano z Włoch oraz Konsorcjum Jabłek Południowego Tyrolu.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W badaniu przesiewowym Y2H potencjalne białko efektorowe ulega koekspresji z różnymi hipotetycznymi białkami oddziałującymi (krok 7). Każdy rosnący klon drożdży zawiera przynętę, ale (potencjalnie) inny interaktor. Oddziałujące białka są kodowane w bibliotece cDNA, która jest klonowana do plazmidów ofiar. Przynęta i plazmidy ofiary kocystronycznie kodują część czynnika transkrypcyjnego drożdży. W przypadku fizycznej interakcji między przynętą (efektorem) a interaktorem zakodowanym przez plazmid ofiary, dwie części czynnika transkrypcyjnego (domena wiążąca DNA i domena aktywacji) są łączone i indukowana jest ekspresja genu reporterowego. Drożdże są w stanie rosnąć na płytkach selekcyjnych SD zubożonych w histydynę i adeninę. Rodzaj biblioteki cDNA ofiary zależy od efektora przesiewowego i musi być odpowiednio dobrany. Wektor ofiary i przynęty, a także szczep drożdży muszą być kompatybilne. W tym badaniu przesiewowym domena wiążąca DNA LexA i domena aktywacji Gal4 zostały użyte jako kompatybilne jednostki czynnika transkrypcyjnego drożdży. Biblioteka cDNA może być skonstruowana indywidualnie, wykonana na zamówienie lub uzyskana komercyjnie. Przygotowanie biblioteki zdobyczy cDNA nie jest częścią tego protokołu. W tym protokole wykorzystano samodzielnie skonstruowaną, znormalizowaną bibliotekę cDNA z RNA liści Malus x domestica i sklonowano ją do pGAD-HA41. Szczep drożdży wyrażający efektor (przynętę) poddano transformacji za pomocą biblioteki zdobyczy, a klony wybrano na płytkach selekcyjnych SD zubożonych w histydynę i adeninę. Aby wyekstrahować plazmidowe DNA z kolonii drożdży, zaleca się mini zestaw plazmidu DNA oparty na kolumnie dla bakterii w połączeniu z etapem mechanicznego rozrywania przy użyciu szklanych kulek w celu poprawy lizy drożdży (krok 8). W tym oczyszczaniu plazmidu przynęta i wektor ofiary zostaną oczyszczone jednocześnie w stosunkowo niskich stężeniach. Jednak ilość plazmidowego DNA jest wystarczająca do zidentyfikowania partnera interakcji poprzez sekwencjonowanie bez wcześniejszej propagacji plazmidu (krok 8.4). Alternatywnie, DNA oczyszczone w kroku 8.4 może zostać przekształcone w kompetentną E. coli i wyselekcjonowane z opornością na antybiotyki, w której pośredniczy wektor ofiary (np. ampicylina w przypadku pGAD-HA). Wybrane kolonie E. coli zawierają tylko plazmid biblioteki pGAD-HA, a za pomocą tych klonów można przeprowadzić wysokowydajne oczyszczanie plazmidu.
Udana transformacja konstruktów pLexA-N i pGAD-HA uzupełnia auksotrofię tryptofanu i leucyny NMY51. Interakcja między efektorem a białkiem (kodowanym na pGAD-HA) prowadzi do aktywacji układu reporterowego w szczepach NMY51. W przypadku samoaktywacji, NMY51 transformowany efektorem wyrażającym pLexA-N w połączeniu z wektorem pustej biblioteki pGAD-HA rośnie na selektywnych płytkach pozbawionych trp-leu-his-ade, z powodu niepożądanej aktywacji systemu reporterowego NMY5140. Samoaktywacja może być słaba i może wystąpić przy braku trp-leu-his, lub aktywacja może być silna i charakteryzować się wzrostem na płytkach trp-leu-his-ade41. Samoaktywacja może spowodować ogromne tło fałszywie dodatnich klonów na rzeczywistym ekranie Y2H. Aby tego uniknąć, należy przeprowadzić test samoaktywacji z przynętą, w którym wektor wyrażający efektor jest współprzekształcany z wektorem pustej biblioteki. W tym środowisku eksperymentalnym nie wolno indukować ekspresji genu reporterowego. Jeśli w badaniu widoczna jest samoaktywacja (tj. wzrost na selektywnych płytkach), pożywkę można uzupełnić różnymi stężeniami 3-amino-1,2,4-triazolu45 (3-AT). 3-AT jest inhibitorem dehydratazy imidazolelicerofosforanowej (HIS3), enzymu ważnego podczas biosyntezy histydyny46. Suplementacja 3-AT może zmniejszyć słabe efekty samoaktywacji podczas badań przesiewowych Y2H47,48. Należy badać różne stężenia 3-AT. W tym protokole zastosowano 1 - 40 mM 3-AT. Najniższe stężenie, które prowadzi do zahamowania samoaktywacji, powinno być następnie stosowane w sicie Y2H. Selektywne płytki testu samoaktywacji można ocenić tylko wtedy, gdy płytki SD-trp-leu kotransformacji zawierają wystarczającą liczbę klonów. Jako wskazówkę≥ wystarczy 500 kolonii na 90 mm (średnicy) szalki Petriego. W celu określenia dokładnej skuteczności transfekcji zaleca się przygotowanie seryjnych rozcieńczeń drożdży przekształconych i rozprowadzenie ich na płytkach SD-trp-leu.
Aby zmniejszyć samoaktywację, efektor można sklonować do pLexA-C, wektora ekspresji przynęty, który łączy znacznik LexA z C-końcem białka. Orientacja znacznika Lex-A może tłumić samoczynną aktywację24. Jednak nie w każdym przypadku możliwe jest ograniczenie lub zniesienie samoaktywacji. Tworzenie się czerwonych lub czerwonawych kolonii wskazuje na słabą lub fałszywie dodatnią interakcję. Gen reporterowy ade2 NMY51 jest aktywowany tylko wtedy, gdy dochodzi do interakcji białko-białko, co z kolei blokuje akumulację czerwonego barwnika w tym szczepie drożdży40. W przypadku braku interakcji, NMY51 są czerwonawe, podczas gdy kolonie zawierające silne interakcje są białe. Obserwacja koloru kolonii na płytkach selekcyjnych stanowi zatem kolejną ważną wskazówkę do oceny, czy poszczególne kolonie są prawdziwymi, czy fałszywie dodatnimi interaktorami.
Ostatecznie konieczne jest dostosowanie lub zmiana niektórych ustawień testu w odniesieniu do charakteru przynęty i charakterystyki interakcji. Do tej pory opracowano szereg ulepszeń i technik pochodnych powszechnego Y2H, aby umożliwić analizę dość trudnych interakcji białek w różnych systemach gospodarza. Przegląd autorstwa Stynena i wsp.49 omawia i opisuje różne aspekty Y2H, jego ulepszenia i adaptacje, a tym samym dostarcza przydatnych informacji o tym, jak wybrać odpowiedni test interakcji.
Badania przesiewowe Y2H i techniki pochodne stały się szeroko stosowane w różnych dziedzinach badawczych, wszędzie tam, gdzie wymagana jest identyfikacja interakcji białek binarnych. Nawet jeśli przeprowadzane są krytyczne kontrole, takie jak testy samoaktywacji przynęty i retransformacje jeden do jednego zidentyfikowanych białek oddziałujących na siebie, Y2H jest podatny na dawanie fałszywych wyników 26,50,51. Drożdże jako model nie nadają się do wszystkich badań interakcji. Drożdże niekoniecznie stanowią środowisko komórkowe, które wspiera odpowiednią modyfikację potranslacyjną i fałdowanie dla każdego białka24. Ponadto w ustawieniu Y2H białka są nadmiernie eksprymowane, a ich ekspresja nie jest kontrolowana przez ich naturalny promotor. Y2H zmusza partnerów interakcji białkowych do jądra, które niekoniecznie jest ich naturalnym subkomórkowym miejscem docelowym. Natywne warunki komórkowe interakcji mogą zatem nie być odzwierciedlone przez drożdże i mogą prowadzić do wyników fałszywie ujemnych lub fałszywie dodatnich. Większość Y2H opiera się na komplementacji auksotrofii drożdży jako zasadzie selektywnej. Ta selekcja żywieniowa charakteryzuje się wysoką czułością, ale kosztem zmniejszonej selektywności w porównaniu z innymi (np. chromatogennymi testami reporterowymi)49. Jeżeli dla określonego efektora występuje nieredukowalna samoaktywacja (patrz wyżej) lub inne ograniczenia, Y2H nie jest odpowiednim testem25. W Tabeli 1 i Rysunku 1 przedstawiono oczekiwane wyniki testu samoaktywacji. Brak rzeczywistych interakcji (tj. wyników fałszywie ujemnych) może być spowodowany toksycznością białek, nieprawidłowym przetwarzaniem białek translacyjnych, steryczną przeszkodą interakcji, niedostatecznie reprezentowanymi partnerami interakcji w bibliotece ofiar, lokalizacją błony przynęty lub brakującymi składnikami niezbędnymi do interakcji24.
Zaleca się de novo amplifikację pełnej długości genu zidentyfikowanego białka oddziałującego z cDNA, subklonowanie go do pGAD-HA i przeprowadzenie testu interakcji jeden do jednego poprzez przekształcenie wygenerowanego konstruktu pGAD-HA w szczep NMY51 wykazujący ekspresję przynęty. Jest to konieczne, ponieważ obserwowany interaktor obecny w bibliotece ofiar może być tylko fragmentem większego białka. Jednak informacje dotyczące odpowiedniego genu o pełnej długości są dostępne tylko wtedy, gdy dostępne są znaczne dane dotyczące sekwencji genomicznej i transkryptomicznej. Opisany tutaj protokół transformacji dla testu samoaktywacji może być zastosowany do takiego testu jeden do jednego, a interakcja między przynętą a interaktorem musi być odtwarzalna.
Interakcje zidentyfikowane na ekranie Y2H muszą być zawsze potwierdzone inną, niezależną techniką. Ta niezależna technika musi być bliższa naturalnym ustawieniom rzeczywistej interakcji białko-białko. W przypadku efektora fitoplazmatycznego ATP_00189 interakcję z czynnikami transkrypcyjnymi TCP Malus x domestica zweryfikowano w planta z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencyjną (BiFC) w protoplastach Nicotiana benthamiana 28 (nieobjętych tym protokołem). Efektorowy ATP_00189 białkowy pochodził od patogenu roślinnego P. mali. In planta W związku z tym wybrano BiFC do weryfikacji ATP_00189 interakcji z czynnikami transkrypcyjnymi Malus x domestica zidentyfikowanymi wcześniej w Y2H28. BiFC to test interakcji białko-białko, który nie wymaga subkomórkowej translokacji oddziałujących białek do jądra w celu aktywacji systemu reporterowego52. Co więcej, maszyneria ekspresji i modyfikacji in planta naśladuje środowisko naturalnej interakcji między efektorem bakteryjnym rośliny a jej gospodarzem roślinnym. Jednak globalny ekran przy użyciu BiFC nie jest wykonalny.
W protokole jest kilka kroków, które należy dokładnie przeanalizować. Podczas amplifikacji genu będącego przedmiotem zainteresowania (krok 4) ważne jest, aby wykluczyć, że startery wiążą się z DNA rośliny. W związku z tym DNA z roślin niezakażonych musi być włączone jako kontrola ujemna. Sekwencja genu będącego przedmiotem zainteresowania nie może zawierać miejsc restrykcyjnych EcoRI i SalI, które są wykorzystywane do kierunkowego klonowania insertu. Jeśli sekwencja zawiera te miejsca, należy wybrać różne enzymy restrykcyjne do klonowania. Transformacja drożdży jest centralną metodą podczas tego protokołu. Skuteczność transfekcji zależy od kompetencji komórek drożdży, ich żywotności, stanu wzrostu i jakości odczynnika do transfekcji53,54. W przypadku proponowanego protokołu zdecydowanie zaleca się stosowanie drożdży ze świeżych płytek nie starszych niż dwa tygodnie (przechowywanych w temperaturze 4 °C) podczas przeprowadzania przemian. Często wzrost przekształconych drożdży jest opóźniony, gdy selektywne płynne kultury są inokulowane koloniami ze starych płytek agarowych. Pomocne jest również użycie płynnej kultury starterowej jako inokulum do właściwych eksperymentów, a nie używanie drożdży bezpośrednio z płytki. Niska skuteczność transfekcji ofiary do drożdży wykazujących ekspresję przynęty może prowadzić do niedostatecznej reprezentacji niektórych białek ofiary (potencjalnych interaktorów), a tym samym może zniekształcić całe sito. W tym protokole dobrze zadziałała skuteczność transfekcji drożdży wynosząca ~150 000 cfu/μg transfekowanego DNA w Y2H.
Znajomość wad i wad techniki Y2H oraz interpretacja wyników w sposób krytyczny i odpowiedni jest niezbędna do wyciągnięcia prawidłowych wniosków. Testy Y2H i ich pochodne są stosowane od wielu lat i przeszły wiele ulepszeń i adaptacji w odniesieniu do różnych cech przynęty, subkomórkowej lokalizacji interakcji, oczekiwanych partnerów wiążących i innych czynników, które mogą być wymagane do interakcji (patrz Y3H 55,56,57). Ostatnio opracowano ekrany Y2H oparte na tablicach, które pozwalają na zautomatyzowaną, wysokoprzepustową analizę wielu przynęt przeciwko milionom zdobyczy58. Przyszłość najprawdopodobniej leży w automatyzacji i wysokoprzepustowym podejściu do tego testu, aby umożliwić wyjaśnienie złożonych szlaków sygnałowych i interakcji w różnych dziedzinach badań.

Drożdżowe dwuhybrydowe sita (Y2H) zostały opracowane około 27 lat temu1 i od tego czasu są szeroko stosowane w różnych dziedzinach do określania specyficznych interakcji białko-białko2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Fizyczna interakcja efektora bakteryjnego z białkiem docelowym gospodarza jest często warunkiem wstępnym funkcjonalnej manipulacji tym białkiem docelowym. Analiza tych interakcji przeniosła się na obszar zainteresowania wielu różnych sektorów biologii infekcji12,13,14,15,16,17,18. Zasada działania badania przesiewowego Y2H polega na tym, że interakcja dwóch białek prowadzi do odtworzenia funkcjonalnego czynnika transkrypcyjnego, który napędza ekspresję genów reporterowych. Znany efektor ("przynęta") jest translacyjnie połączony z domeną wiążącą DNA (DBD) czynnika transkrypcyjnego, a potencjalni partnerzy interakcji ("ofiara") są połączeni z domeną aktywacji (AD) odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego. Ponieważ partner oddziałujący jest nieznany, biblioteka potencjalnych interaktorów jest klonowana do tak zwanej "biblioteki ofiar". Zwykle biblioteka ta jest tworzona przez klonowanie cDNA do odpowiedniego plazmidu ekspresji wektora ofiary kodującego AD, który jest kompatybilny z DBD zakodowanym jako wektor przynęty. W przypadku interakcji, odtworzone czynniki transkrypcyjne indukują ekspresję genów reporterowych, które na ogół umożliwiają selekcję wzrostu drożdży. Identyfikacja interaktorów odbywa się poprzez sekwencjonowanie plazmidu ofiary za pomocą starterów specyficznych dla plazmidu.
Bakterie rozwinęły różne strategie manipulowania i wykorzystywania metabolizmu swojego gospodarza lub unikania mechanizmów obronnych i wydzielania cząsteczek efektorowych za pośrednictwem różnych systemów wydzielania bakteryjnego19,20,21. Określenie partnerów wiążących te efektory bakteryjne jest zatem pierwszym krokiem w identyfikacji manipulowanego szlaku w gospodarzu. Prowadzi to do lepszego zrozumienia konkretnych mechanizmów patogenności.
Y2H są wykonywane w celu identyfikacji interakcji efektorowych bakterii podczas fitoplazmoz, a często, Y2H jest kluczowym początkowym eksperymentem dla dalszej charakterystyki mechanizmów molekularnej patogeniczności w badaniach fitoplazmy22,23. Jednak opis metody w większości publikacji jest raczej skąpy, a techniki te są często zlecane firmom biotechnologicznym. Aby zwrócić uwagę na wykonalność tej metody, protokół ten zawiera informacje krok po kroku w celu identyfikacji partnerów interakcji cząsteczki efektora bakteryjnego w jego naturalnym gospodarzu.
Pomimo szerokiego zastosowania i szybkiego podejścia do ekranów Y2H, nie można zapominać, że pewne interakcje mogą nie wystąpić w systemie drożdżowym. Wynika to z faktu, że komórka drożdży jest używana jako rodzaj "naczynia reakcyjnego in vivo" z pewnymi ograniczeniami biologicznymi. Kilku autorów omówiło zalety i wady Y2H i jego pochodnych11,24,25,26,27. Ogólne rozważania są takie, na przykład, że komórka drożdży może nie zapewniać odpowiedniej ekspresji genów, warunków (po)translacyjnych lub translokacyjnych dla odpowiednich badanych białek. Może to prowadzić do wyników fałszywie ujemnych na ekranie. Pozytywne interakcje mogą być z kolei artefaktami i mogą nie wystąpić w sytuacji naturalnej (np. w przypadku efektorów w odpowiednim gospodarzu). W związku z tym niezbędne jest potwierdzenie oddziaływań z heterologicznego systemu ekspresji drożdży za pomocą niezależnego testu interakcji w bliżej spokrewnionym systemie biologicznym.
W tym badaniu zidentyfikowano partnerów wiążących ATP_00189 efektorowe z nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego Candidatus Phytoplasma mali (P. mali). Wyniki dostarczają ważnych informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju objawów proliferacji jabłek28, choroby, która powoduje wysokie straty ekonomiczne w dotkniętych nią regionach uprawy jabłek w Europie29.

<table><tbody><tr><td>Bromek cetylotrimetyloamoniowy (CTAB)</td><td>Applichem</td><td>A6284</td><td>do otrzymywania DNA</td></tr><tr><td>Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td><td>Applichem</td><td>A2264</td><td>do pożywki i buforu</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Applichem</td><td>A2942</td><td>do pożywki i buforu</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy Sól disodowa (NaEDTA)</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td>do pożywki i buforu</td></tr><tr><td>Sól sodowa N-lauroilosarkozyny</td><td>Applichem</td><td>A7402</td><td>do preparatu DNA</td></tr><tr><td>octan amonu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>9688</td><td>do otrzymywania DNA</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Applichem</td><td>A1108</td><td>do otrzymywania DNA</td></tr><tr><td>Izopropanol (2-propanol)</td><td></td><td>A3928</td><td>do otrzymywania DNA</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>51976</td><td>do otrzymywania DNA</td></tr><tr><td>RNAzy</td><td>Applichem</td><td>A2760</td><td>do otrzymywania DNA</td></tr><tr><td>Chloroform:Izoamyl 24:1</td><td>Aplikacja</td><td>A1935</td><td>do przygotowania DNA</td></tr><tr><td>Korekta polimerazy (np. iProof)</td><td>Bio-Rad</td><td>203433</td><td>do PCR</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0271</td><td>do klonowania</td></tr><tr><td>SalI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0641</td><td>do klonowania</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania DNA oparty na kolumnie (np. QIAquick)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>do klonowania</td></tr><tr><td>siarczanu kanamycyny</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>do selekcji mikrobiologicznej</td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8056</td><td>do testu samoaktywacji</td></tr><tr><td>Monochlorowodorek L-argininy&nbsp;</td><td>Aplikacja</td><td>A3680</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>L-izoleucyna&nbsp;</td><td>Aplikacja</td><td>A3642</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>Monohydrat L-lizyny&nbsp;</td><td>Aplikacja</td><td>A3448</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>L-Metionina&nbsp;</td><td>Aplikacja</td><td>A3897</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>L-fenyloalaniny&nbsp;</td><td>Aplikacja</td><td>A3464</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>L-treoniny&nbsp;</td><td>Aplikacja</td><td>A3946</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>L-tyrozyna&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3401</td><td>dla kultur drożdży</td></tr><tr><td>L-Uracile</td><td>Applichem</td><td>A0667</td><td>dla kultur drożdży</td></tr><tr><td>L-walina&nbsp;</td><td>Aplikacja</td><td>A3406</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>Sól półsiarczanu L-adeniny&nbsp;</td><td>Aplikacja</td><td>A1596</td><td>do kultur drożdży</td></tr><tr><td>0,22 i mikro; m Filtr porów</td><td>Sartorius</td><td>16541</td><td>do sterylnej filtracji</td></tr><tr><td>Monochlorowodorek L-histydyny</td><td>Applichem</td><td>A3719</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>L-Leucyna&nbsp;</td><td>Aplikacja</td><td>A3496</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>L-Tryptofan&nbsp;</td><td>Aplikacja</td><td>A3410</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>Baza azotowa drożdży&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51483</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>D-Glukoza Monohydrat&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1349</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-1</td><td>do hodowli drożdży i bakterii</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Applichem</td><td>A2208</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 4000 (PEG)</td> <td>Applichem</td><td>A1249</td><td>do przemiany drożdży</td></tr><tr><td>Octan litu dwuwodny (LiOAc)</td> <td>Applichem</td><td>A3478</td><td>do przemiany drożdży</td></tr><tr><td>DNA plemników łososia&nbsp;</td><td>Aplikacja</td><td>A2159</td><td>do transformacji drożdży</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko znacznikowi Lex-A (np. region wiążący DNA anty-LexA)</td><td>Millipore</td><td>06-719</td><td>do plazmidu Western blot</td></tr><tr><td>Zestaw miniprep (np. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>350 zł</td><td>do oczyszczania plazmidu z drożdży i bakterii</td></tr><tr><td>Koraliki szklane myte kwasem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>do oczyszczania plazmidu z drożdży</td></tr><tr><td>Ampicillin Sodium Salt</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td>do selekcji mikrobiologicznej</td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>Koncentrator próżniowy wirówka (np. Koncentrator 5301)</td><td>Eppendorf</td><td>Z368245 (Sigma)</td> <td>do przygotowania DNA</td></tr><tr><td>Wektor przynęty (np. pLexA-N)</td><td>Systemy dualne</td><td>P01004</td> dla <td></td></tr><tr><td>wektora zdobyczy Y2H (np. pGAD-HA)</td><td>Systemy dualne</td><td>P01004</td><td>dla wektora</td></tr><tr><td>kontroli zdobyczy Y2H (np. pLexA-p53)</td><td>Systemy dualne</td><td>P01004</td><td>dla wektora</td></tr><tr><td>przynęty kontrolnej Y2H (np. pACT-largeT)</td><td>Systemy dualne</td><td>P01004</td><td>dla Y2H</td></tr><tr><td>Elektrokompetentne E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td><td>Invitrogen</td><td>C640003</td><td>do klonowania</td></tr><tr><td>szczepu reporterowego drożdży (NMY51:MATahis3&Delta; 200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, np. NMY51)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>dla Y2H</td></tr><tr><td>Folia parafinowa z tworzywa sztucznego (np. Parafilm M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>do hodowli drożdży i bakterii</td></tr><tr><td>Uszczelniacz przepuszczający gaz (np. BREATHseal)</td><td>Greiner</td><td>676 051</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>Cykler do PCR (np. Termocykler T100)</td><td>1861096 Bio-Rad</td><td></td> do ilościowego <td></td></tr><tr><td>cyklera PCR do PCR (np. Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym CFX96)</td><td>1855195 Bio-Rad</td><td></td><td>do ilościowej</td></tr><tr><td>mikrowirówki PCR (np. Wirówka 5417 R)</td><td>Eppendorf</td><td>5417 R</td><td>ogólne wyposażenie laboratoryjne</td></tr><tr><td>Wirówka (np. Wirówka 5804 R)</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>ogólny sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz (bez DNAzy, bez RNAse, bez proteazy)</td><td>5Prime</td><td>2500010</td><td>do PCR i prac DNA</td></tr><tr><td>Scalpell</td><td>Swann-Morton</td><td>0301</td><td>do przygotowania DNA</td></tr><tr><td>Sterylny filtr (0,22 &mikro; m; Polieterosulfon)</td><td>VWR-International</td><td>514-0073 (europejski numer katalogowy)</td><td>do hodowli drożdży i bakterii</td></tr><tr><td>szalki Petriego &Oslash; 90 mm&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td>do hodowli drożdży i bakterii</td></tr><tr><td>szalki Petriego &Oslash; 150 mm&nbsp;</td><td>Fotometr Greiner Bio-One</td><td>639161</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>(np. BioPhotometer)</td><td>Eppendorf</td><td>550507804</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>Fotometr Kuwety</td><td>marki</td><td>759015</td><td>do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna (np. Kąpiel wodna Memmert WB7)</td><td>Memmert</td><td>WB7</td><td>do przemiany drożdży</td></tr><tr><td>Western Blot Sprzęt</td><td>Bio-Rad</td><td>diverse</td><td>do wykrywania białek</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>5Prime</td><td>2201210</td><td>do klonowania</td></tr><tr><td>kolb Shaker (Erlenmeyer) (100 ml; 1,000 ml; 2,000 mL) i oddychających zatyczek bawełnianych (np. Termosy Duran Erlenmeyer z wąską szyjką)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z232793, Z232858, Z232866</td><td>do hodowli drożdży i bakterii</td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem (np. GFL 3031)</td><td>GFL</td><td>3031</td><td>do hodowli drożdży i bakterii</td></tr><tr><td>Spoiwo</td><td>do inkubatora</td><td>KB 53 (E3.1)</td><td>do hodowli drożdży i bakterii</td></tr><tr><td>Kostkarka do lodu (np. Kostkarka do lodu IF 825)</td><td>Omniwash</td><td>IF 825</td><td>ogólny sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>0,2 mL, 1,5 ml i 2,0 ml Fiolki reakcyjne (polipropylen)</td><td>Eppendorf</td><td>0030.124.332 (0,2 ml); 0030.123.328 (1,5 ml); 0030.123.344 (2,0 ml)</td><td>ogólny sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Pipety i jednorazowe końcówki do pipet (różne objętości: 10 - 1,000 &mikro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>różnorodny</td><td>ogólny sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Rozrzutnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SPR-L-S01</td><td>do hodowli drożdży i bakterii</td></tr><tr><td>Wytrząsarka wirowa (np. MS 3 Minishaker)</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td>ogólny sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>T4-Ligase</td><td>Thermo Fisher</td><td>EL0011</td><td>do klonowania</td></tr><tr><td>Lodówka (4 &deg; C) (np. Liebherr Medline FKEX 5000)</td><td>Liebherr</td><td>81.767.580.4</td><td>ogólny sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Zamrażarka (-20 &deg; C) (np. Liebherr Comfort Professional G5216)</td><td>Ogólny sprzęt laboratoryjny</td> <td>Liebherr</td><td>G5216</td></tr><tr><td>Cylinder z podziałką (np. Marka)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z327352; Z327417; Z327441&nbsp; &nbsp;</td><td>Ogólny sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne (np. Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S55701</td><td>do hodowli drożdży i bakterii</td></tr><tr><td>Pipetor mechaniczny (np. Pipetboy acu 2)</td> <td>Integra-Biosciences</td><td>155000</td><td>ogólny sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Kuwety do elektroporacji (1 mm)</td><td>Molecular Bio Products</td><td>5510-11</td><td>do transformacji</td></tr> <tr><td>bakteriiElektroporator (np. Eporator)</td><td>Eppendorf</td><td>4309000019</td><td>do transformacji bakterii</td></tr><tr><td>System obrazowania żelem i plamami (np. ChemiDoc MP System)</td><td>Bio-Rad</td><td>1708280</td><td>ogólne wyposażenie</td></tr><tr><td>laboratoryjne Stożkowe probówki wirówkowe (polipropylen) (50 ml)</td><td>VWR-International&nbsp;</td><td>525-0403 (europejski numer katalogowy)</td><td>ogólne wyposażenie</td></tr><tr><td>laboratoryjne Stożkowe probówki wirówkowe (polipropylen) (13 ml)</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>ogólne wyposażenie laboratoryjne</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT; 1 M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>P2325</td><td>do ligacji</td></tr><tr><td>adenozynotrifosforanu (ATP, np. Roztwór ATP (10 mM))</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM8110G (dystrybuowany przez Thermo Scientific)</td><td>do podwiązania</td></tr><tr><td>Dropout mix bez histydyny, leucyny, tryptofanu i adeniny (DO, np. Syntetyczne suplementy drożdżowe Drop-out Medium)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2021 Sigma&nbsp;</td><td>do hodowli drożdży (gotowa mieszanka)</td></tr></tbody></table>

rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Odkrywanie molekularnych mechanizmów objawów choroby jest ważne dla zrozumienia patologii i rozwoju objawów w nauce o roślinach. Bakterie wyewoluowały różne strategie manipulowania metabolizmem gospodarza dla własnej korzyści. Ta manipulacja bakteryjna często łączy się z poważnymi objawami lub śmiercią dotkniętych roślin. Określenie konkretnych cząsteczek bakteryjnych odpowiedzialnych za manipulację gospodarzem stało się ważną dziedziną badań mikrobiologicznych. Po zidentyfikowaniu tych cząsteczek bakteryjnych, zwanych "efektorami", ważne jest wyjaśnienie ich funkcji. Prostym podejściem do określenia funkcji efektora jest zidentyfikowanie jego białkowego partnera wiążącego w naturalnym gospodarzu za pomocą badania przesiewowego drożdży dwuhybrydowych (Y2H). Zwykle gospodarz zawiera wielu potencjalnych partnerów wiążących, których nie można wystarczająco przewidzieć za pomocą żadnego algorytmu in silico. Jest to zatem najlepszy wybór do przeprowadzenia badania przesiewowego z hipotetycznym efektorem na całej bibliotece eksprymowanych białek gospodarza. Jest to szczególnie trudne, jeśli czynnik sprawczy jest nieuprawie jak fitoplazma. Protokół ten zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące oczyszczania DNA z zakażonej fitoplazmą drzewiastej rośliny żywicielskiej, amplifikacji potencjalnego efektora, a następnie identyfikacji partnera interakcji molekularnej rośliny za pomocą badania przesiewowego Y2H. Mimo że ekrany Y2H są powszechnie stosowane, istnieje tendencja do zlecania tej techniki firmom biotechnologicznym, które oferują usługę Y2H za opłatą. Protokół ten zawiera instrukcje, jak wykonać Y2H w każdym przyzwoicie wyposażonym laboratorium biologii molekularnej przy użyciu standardowych technik laboratoryjnych.

Zanim zostanie przeprowadzony właściwy screening Y2H, należy przetestować przynętę pod kątem samoaktywacji. Osiąga się to poprzez transformację wektora ekspresyjnego przynęty wraz z pustym wektorem biblioteki ofiar i sprawdzenie wzrostu na płytkach selekcyjnych.
Aby przeanalizować, czy białko fitoplazmy ATP_00189 wykazuje samoaktywację, przeprowadzono test samoaktywacji zgodnie z opisem w sekcji 5. Plazmid przynęty (bait) kompensuje auksotrofię trp, a plazmid ofiary (prey) auksotrofię leu szczepu S. cerevisiae NMY5140. Pomyślna kotransformacja charakteryzuje się zatem wzrostem na płytkach selekcyjnych pozbawionych trp i leu. Interakcja białka przynęty i białka ofiary prowadzi do kompensacji auksotrofii his i ade szczepu NMY51. Jeśli występuje samoaktywacja przez przynętę w przypadku braku interakcji, drożdże rosną na płytkach selekcyjnych pozbawionych his i ade. Może wystąpić silna lub słaba samoaktywacja. Silna samoaktywacja przynęty charakteryzuje się wzrostem kotransformowanych drożdży na płytkach selekcyjnych pozbawionych trp-leu-his-ade. Słaba samoaktywacja prowadzi do wzrostu na płytkach pozbawionych trp-leu-his, ale nie na płytkach pozbawionych trp-leu-his-ade. Odpowiednie kontrole pozytywne są niezbędne do interpretacji wyników testu samoaktywacji. Podsumowanie oczekiwanych wyników testu samoaktywacji oraz ich interpretację przedstawiono w Table 1 i zobrazowano na Figure 1.
<img alt="Wyniki testu dwuhybrydowego drożdżowego; wzorzec wzrostu na płytkach z pożywką wskazujący na oddziaływanie białek." src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przykład testów samooktywacji przynęty przed przeprowadzeniem przesiewu Y2H. S. cerevisiae NMY51 poddano kotransformacji z oddziałującą przynętą (pLEX-p53) i ofiarą (pACT-largeT) jako kontrolę pozytywną (lewy panel: a-c), słabo samoaktywujący się oraz pusty wektor biblioteki ofiar (środkowy panel: d-f) oraz przynęty nieaktywującej się samodzielnie wraz z pustym wektorem biblioteki ofiar (prawy panel: g-i). Drożdże poddane kotransformacji hodowano na płytkach SD bez trp i leu (panel górny: a, d, g), trp, leu i his (panel środkowy: b, e, h) oraz trp, leu, his i ade (dolny panel: c, f, i). Selekcja na podłożu pozbawionym trp i leu stanowi kontrolę pozytywną udanej kotransformacji, ponieważ wektor przynęty (bait) uzupełnia auksotrofię trp, a wektor ofiary (prey) auksotrofię leu szczepu NMY51 (wzrost na SD-trp-leu). W przypadku wystąpienia interakcji między przynętą a ofiarą lub samoaktywacji przynęty, ekspresja genów reporterowych NMY51 zostaje uruchomiona i uzupełnia auksotrofię his oraz ade (wzrost na SD-trp-leu-his-ade). Słaba samoaktywacja charakteryzuje się wzrostem na płytkach SD-trp-leu-his (środkowy panel, d-f). Słaba samoaktywacja przynęty musi zostać zminimalizowana przed analizą tej przynęty w badaniu przesiewowym Y2H, np. poprzez dodanie 3-AT do pożywek selektywnych. Niedobory aminokwasów oznaczone są znakiem „-” w nazwach odpowiednich pożywek. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >pLexA-N-atp0189</td >
			<td >brak</td >
			<td >kolonie</td >
			<td >brak wzrostu</td >
			<td >brak wzrostu</td >
			<td >brak wzrostu</td >
			<td >brak wzrostu</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >brak</td >
			<td >pGAD-HA</td >
			<td >brak wzrostu</td >
			<td >kolonie</td >
			<td >brak wzrostu</td >
			<td >brak wzrostu</td >
			<td >brak wzrostu</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >pLexA-N</td >
			<td >brak</td >
			<td >kolonie</td >
			<td >brak wzrostu</td >
			<td >brak wzrostu</td >
			<td >brak wzrostu</td >
			<td >brak wzrostu</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >pLexA-N</td >
			<td >pGAD-HA</td >
			<td >kolonie</td >
			<td >kolonie</td >
			<td >kolonie</td >
			<td >brak wzrostu</td >
			<td >brak wzrostu</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >pLexA-p53</td >
			<td >pACT-largeT</td >
			<td >kolonie</td >
			<td >kolonie</td >
			<td >kolonie</td >
			<td >kolonie</td >
			<td >kolonie</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >pLexA-N-atp0189</td >
			<td >pGAD-HA</td >
			<td >kolonie</td >
			<td >kolonie</td >
			<td >kolonie</td >
			<td >brak wzrostu</td >
			<td >brak wzrostu</td >
		</tr >
	</tbody >
</table >
Tabela 1: Oczekiwane wyniki w teście samoaktywacji przynęty. Transformacja S. cerevisiae NMY51 skutkuje różnicami w przyroście na podłożach selektywnych, zależnymi od charakterystyki współtransformowanych przynęty (bait) i ofiary (prey). Wzrost na płytkach selektywnych oceniano po transformacji różnych kombinacji wektorów (a-f) po 72 h inkubacji w temperaturze 30 °C. Słaba samoaktywacja charakteryzuje się wzrostem drożdży na podłożu SD-trp-leu-his, a silna samoaktywacja wzrostem na płytkach selekcyjnych SD-trp-leu-his-ade w obecności partnera interakcji. Zakodowany w pLexA-N efektor fitoplazmy ATP_0189 nie wykazuje samoaktywacji, co objawia się brakiem zdolności do wzrostu transformowanych wektorem przynęty komórek NMY51 w przypadku braku his i ade.
W zależności od użytej przynęty, przesiew Y2H może przynieść liczne klony drożdży rosnące na płytkach selektywnych. Wszystkie klony muszą zostać przeanalizowane i sprawdzone pod kątem ewentualnych redundancji. Nawet w przypadku zastosowania znormalizowanej biblioteki cDNA jest bardzo prawdopodobne, że interaktor jest reprezentowany w wielu różnych klonach. W zależności od techniki klonowania biblioteki możliwe jest również, że w niektórych wektorach ofiary wstawiono jedynie fragmenty pełnego genu. Zaleca się zatem amplifikację de novo (z cDNA) i subklonowanie pełnej długości genu interaktora oraz przetestowanie oddziaływania w analizie Y2H w układzie jeden do jednego (Rysunek 2).
<img alt="Wyniki testu dwuhybrydowego drożdżowego. Interakcje BD-ATP_0189 z białkami AD-MdTCP." src="/files/ftp_upload/55150/55150fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykład oddziaływania między białkiem przynętą (bait) a białkiem ofiarą (prey) w eksperymencie Y2H. Przeprowadzono badanie metodą dwuhybrydowej analizy drożdżowej (Y2H) i oczyszczono plazmidy z klonów wykazujących pozytywną interakcję. Wysekwencjonowano wektor prey, a następnie Malus x domestica zidentyfikowano partnerów interakcji gospodarza MdTCP24 i MdTCP25. Jako kontrolę negatywną równolegle subklonowano MdTCP34 (dla którego nie zidentyfikowano interaktora w screeningu biblioteki Y2H). Geny o pełnej długości namnożono z cDNA jabłoni, subklonowano do wektora prey (wykazującego ko-cistroniczną ekspresję domeny aktywacyjnej AD) i de novo współtransformowane z wektorem przynęty wykazującym ekspresję bakteryjnego efektora ATP_0189 połączonego z domeną wiążącą DNA (BD). Rycina ta pochodzi z 28. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Bakteryjne białka efektorowe są ważne dla skutecznego leczenia infekcji. Protokół ten opisuje eksperymentalną identyfikację białkowych partnerów wiążących bakteryjne białko efektorowe w jego naturalnym żywicielu roślinnym. Identyfikacja tych oddziaływań efektorowych za pomocą dwuhybrydowych badań przesiewowych drożdży stała się ważnym narzędziem w odkrywaniu strategii patogenności molekularnej.

Rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyjaśnienie strategii wirulencji oraz systemów gospodarz-patogen poprzez identyfikację oddziaływań białka efektorowego Candidatus Phytoplasma Malefactor z białkami gospodarza z gatunku Malus domestica. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w wielu różnych dziedzinach badań biologicznych, a w niniejszym przypadku została zastosowana w badaniach nad roślinami w celu wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju choroby proliferacji jabłoni. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przesiewowej analizy pojedynczego efektora patogenu pod kątem tysięcy potencjalnych interaktorów, co czyni tę metodę łatwo dostępnym punktem wyjścia w badaniach nad infekcjami.Na początek należy zidentyfikować drzewa zainfekowane, wykazujące specyficzne objawy proliferacji jabłoni (Apple Proliferation), oraz drzewa kontrolne, które są wolne od objawów. Za pomocą czystych sekatorów należy pobrać próbki korzeni z trzech różnych miejsc systemu korzeniowego, o średnicy 0,5–1 cm i długości około 5 cm. Próbki korzeni należy umieścić w odpowiednio opisanych plastikowych woreczkach.Następnie umieścić próbki w lodówce przenośnej z wkładami chłodzącymi i przechowywać je w temperaturze 4 °C do czasu dalszej obróbki. Przepłukać próbki korzeni wodą w celu usunięcia gleby. Następnie przenieść próbki do sterylnej szalki Petriego i za pomocą wysterylizowanego skalpela usunąć epidermę oraz korę korzenia.Za pomocą czystej, niepozostawiającej kłaczków chusteczki przetrzyj skalpel. Następnie zanurz narzędzie w 70% ethanol i wysterylizuj je nad otwartym płomieniem. Użyj skalpla, aby zeskrobać łyko.Poszatkuj próbkę na małe kawałki i odważ 30-100 mg tych fragmentów do sterylnej probówki reakcyjnej o pojemności 2 ml. Próbki przechowuj w temperaturze 80 °C lub wykorzystaj je niezwłocznie do izolacji DNA, które posłuży jako matryca do amplifikacji genu efektora i późniejszego klonowania efektora do wektora przynęty. Po izolacji polispecyficznego DNA fitoplazm z zakażonych drzew, dokonaj klonowania do wektorów przynęty i sprawdź autoaktywację oraz ekspresję zgodnie z protokołem tekstowym.Wymaż efektor ATP 00189 przekształcony do szczepu NMY51 na świeżą płytkę SD-trp i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni, aż pojawią się czerwone kolonie. Użyj czerwonej kolonii z płytki agarowej do zaszczepienia 3 ml pożywki SD-trp w małej kolbie z wytrząsaniem i inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza przy wytrząsaniu z prędkością 120-150 obrotów na minutę. Następnego dnia, używając 1 ml kultury nocnej, zaszczep 20 ml pożywki SD-trp w kolbie z wytrząsaniem i pozostaw do wzrostu na osiem godzin.Użyj podłoża SD-trp, aby dostosować kulturę do wartości OD600 wynoszącej 0.2, a następnie dziesięcioma mililitrami kultury zaszczep dwie kolby zawierające po 100 mililitrów podłoża SD-trp. Inkubuj kultury w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przez noc. Następnie zmierz OD600 kultury i odwiruj osad odpowiadający 120 jednostkom OD600.Na przykład, jeśli zmierzona wartość OD600 wynosi 1,2, należy odwir就ować 100 ml próbki, odrzucić nadsącz, a następnie użyć 800 ml uprzednio ogrzanego medium 2xYPAD, aby resuspender osad w dwóch kolbach z wytrząsaniem i inkubować w temperaturze 30 °C. Hodowlę drożdży inkubować w temperaturze 30 °C przy prędkości 120-150 obr./min. Wartość OD600 należy mierzyć mniej więcej co 1,5 godziny zgodnie z protokołem tekstowym, aż do osiągnięcia wartości OD600 wynoszącej 0,6.Po przygotowaniu DNA nasienia łososia, octanu litu (LiOAc) i PEG z octanem litu zgodnie z protokołem tekstowym, odwiruj 800 mililitrów kultury drożdży przy 700 x G przez pięć minut, aby uzyskać osad komórkowy. Usuń nadsącz i resuspenduj osad w łącznie 200 mililitrach sterylnej wody dwukrotnie destylowanej. Następnie ponownie odwiruj komórki i odrzuć nadsącz.Resuspenduj osad w 16 mililitrach mieszaniny Te Lithium OAc i ponownie odwiruj próbkę. Następnie, po odlaniu nadsączu, użyj 9,6 mililitrów Te Lithium OAc, aby ponownie resuspendować osad. W naczyniach reakcyjnych o odpowiedniej pojemności przygotuj dwanaście probówek zawierających siedem mikrogramów wektora biblioteki DNA peak Add HAC, 100 mikrolitrów 2% DNA z sperm łososia oraz 2,5 mililitrów mieszaniny PEG Lithium OAc.Do każdej z dwunastu probówek należy dodać 600 µL wcześniej przygotowanej zawiesiny komórek drożdży i intensywnie mieszać przez jedną minutę. Następnie reakcje należy inkubować w kąpieli wodnej w temperaturze 30 °C przez 45 minut, mieszając co 15 minut. W kolejnym kroku do każdej probówki należy dodać 160 µL DMSO i intensywnie wymieszać.Następnie inkubuj fiolki w temperaturze 42 °C przez dodatkowe 20 minut. Po odwirowaniu komórek odlej nadsącz i użyj 3 mL 2xYPAD do resuspensji każdego osadu. Połącz komórki ze wszystkich dwunastu fiolek w kolbie z wytrząsarką o pojemności 100 mL i inkubuj drożdże przez 90 minut w temperaturze 30 °C przy 120 obr./min.Po inkubacji, po odwirowaniu komórek i usunięciu supernatantu, należy użyć dziesięciomililitrowej pipety serologicznej i 4,5 ml sterylnego 0,9% NaCl, aby dokładnie resuspender osad poprzez ostrożne pipetowanie w górę i w dół. Należy pobrać 50 µl zawiesiny i za pomocą 0,9% NaCl przygotować rozcieńczenia dziesięciokrotne od 1:10 do 1:1000. Następnie 100 µl każdego rozcieńczenia należy wysiać na 90 mm szalki Petriego zawierające agar SD-trp-leu.Pozostałą część nierozcieńczonej zawiesiny drożdży wysiewamy na 16 szalek Petriego o średnicy 150 mm z agarem SD-trp-leu-His-ade. Szalki inkubujemy w temperaturze 30°C przez trzy dni w przypadku szalek SD-trp-leu oraz przez cztery dni w przypadku szalek SD-trp-leu-his-ade. Wydajność transfekcji określamy poprzez zliczenie kolonii dla poszczególnych rozcieńczeń seryjnych na płytkach selekcyjnych SD-trp-leu.Przenieś każdy klon, używając sterylnego końcówki pipety do pobrania i wysiania kolonii na świeże selektywne płytki SD-trp-leu-his-ade. Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez 24 godziny. Powtarzaj przenoszenie klonów codziennie, aż do osiągnięcia łącznie pięciu pasażów.Aby przeanalizować klony, przygotuj w sterylnej komorze przepływu laminarnego jedną sterylną probówkę reakcyjną o pojemności 2 ml zawierającą 1 ml pożywki SD-trp-leu-his-ade dla każdego klonu. Użyj rozgrzanej igły, aby zrobić otwór w każdej probówce, a następnie zakryj go uszczelniaczem przepuszczalnym dla gazów. Zaszczep każdą probówkę świeżym materiałem kolonii z jednego klonu i inkubuj probówki w temperaturze 30 °C przy 150 obr./min przez 24 godziny.Po odwirowaniu komórek i usunięciu supernatantu, zawiesić osad w odpowiednim buforze i przenieść go do nowej probówki reakcyjnej o pojemności dwóch mililitrów. Do zawiesiny dodać 100 µL szklanych kulek płukanych kwasem i intensywnie mieszać zawartość probówki przez pięć minut. Na koniec oczyścić plazmidowe DNA zgodnie z protokołem tekstowym.Podsumowanie oczekiwanych wyników testu samoaktywacji oraz ich interpretacja zostały przedstawione w poniższej tabeli i na rysunku. Słaba samoaktywacja prowadzi do wzrostu na płytkach selekcyjnych pozbawionych trp-leu-his, ale nie na płytkach pozbawionych trp-leu-his-ade. Z kolei drożdże transformowane silnie samoaktywującą przynętą rosłyby na pożywce pozbawionej trp-leu-his-ade.Pomyślną kotransformację przynęty (bait) i ofiary (prey) charakteryzuje wzrost na płytkach selekcyjnych pozbawionych trp i leu. Interakcja białka przynęty i białka ofiary prowadzi do komplementacji oksytrofii his i ade szczepu NMY51. Przedstawiono tutaj przykład interakcji między przynętą a ofiarą w eksperymencie drożdżowego systemu dwuhybrydowego (Yeast 2 Hybrid). Zidentyfikowano partnerów interakcji gospodarza malus domestica, MdTCP24 i MdTCP25, a interakcję potwierdzono poprzez transformację stożka de novo efektorem.Po opanowaniu techniki, badanie drożdżowego systemu dwuhybrydowego można przeprowadzić w jeden dzień, pod warunkiem, że cały niezbędny sprzęt i materiały, a w szczególności drożdże, zostaną odpowiednio przygotowane z wyprzedzeniem. Podczas wykonywania tej procedury należy unikać kontaminacji i zawsze pracować w warunkach sterylnych. Po zastosowaniu tej metody należy przeprowadzić inną, niezależną metodę, na przykład bimolekularną komplementację fluorescencji, aby potwierdzić wykryte oddziaływania białko-białko.Jest to szczególnie istotne, ponieważ drożdże lub hybrydy same w sobie są stosunkowo podatne na generowanie wyników fałszywie dodatnich. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z wielu różnych dziedzin do lepszego zrozumienia zasad molekularnych dotyczących oddziaływań białko-białko, zwłaszcza w interakcjach gospodarz-patogen, a także w wielu innych obszarach badań biologicznych. Co więcej, przekonają się Państwo, że przeprowadzenie tej metody jest łatwo wykonalne w każdym odpowiednio wyposażonym laboratorium biologii molekularnej.Należy pamiętać, że praca z niektórymi odczynnikami chemicznymi, skalpelami oraz otwartym ogniem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać określonych środków ostrożności. Oznacza to konieczność stosowania osobistego sprzętu ochronnego, takiego jak rękawiczki i gogle, oraz korzystania z ogólnego wyposażenia laboratoryjnego zapewniającego bezpieczeństwo.

unravelling-function-bacterial-effector-from-non-cultivable-plant

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie opisujemy procedurę ekspresji bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach oraz identyfikację fenotypów zahamowania wzrostu indukowanego przez efektory. Takie fenotypy mogą być następnie wykorzystane do wyjaśnienia funkcji i celów działania efektorów.

Identyfikacja fenotypów hamowania wzrostu indukowanych przez ekspresję bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Zmodyfikowaliśmy konwencjonalny screening dwuhybrydowy drożdżowy, który jest skutecznym narzędziem genetycznym w identyfikacji oddziaływań białkowych. Modyfikacja ta znacznie skraca cały proces, zmniejsza nakład pracy i, co najważniejsze, redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich. Ponadto podejście to jest powtarzalne i wiarygodne.

Zmodyfikowany system dwuhybrydowy drożdżowy do identyfikacji białek oddziałujących z czynnikiem wzrostu progranuliną

Ten artykuł skupia się na identyfikacji wysoce pewnych zestawów danych interakcji między białkami gospodarza i patogenu przy użyciu kombinacji dwóch ortogonalnych metod: drożdży dwuhybrydowych, a następnie wysokoprzepustowego testu interakcji w komórkach ssaków o nazwie HT-GPCA.

Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Opisana tutaj metoda jest używana do indukowania kaskady sygnalizacji apoptotycznej na określonych etapach w celu zbadania aktywności antyapoptotycznego bakteryjnego białka efektorowego. Metoda ta może być również stosowana do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Oparte na białkach fluorescencyjnych podejścia do monitorowania efektorów wydzielanych przez bakterie do komórek gospodarza są wyzwaniem. Wynika to z niezgodności między białkami fluorescencyjnymi a układem wydzielania typu III. W tym przypadku zoptymalizowany system GFP z dzielonym superfolderem służy do wizualizacji efektorów wydzielanych przez bakterie do komórki rośliny gospodarza.

Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji

Przetwarzanie wsadowe drożdżowych 2-hybrydowych ekranów pozwala na bezpośrednie porównanie profili interakcji wielu białek przynęty z wysoce złożonym zestawem białek fuzyjnych ofiar. W tym miejscu opisujemy udoskonalone metody, nowe odczynniki oraz sposób ich zastosowania w takich badaniach przesiewowych.

Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek

Patogeny bakteryjne wydzielają do gospodarza białka, które kierują się na kluczowe procesy biologiczne. Identyfikacja szlaków gospodarza, na które ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe, ma kluczowe znaczenie dla rozwiązania problemu patogenezy molekularnej. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą zmodyfikowany supresor drożdży i badanie przesiewowe toksyczności w celu wyjaśnienia szlaków gospodarza, do których skierowane są toksyczne bakteryjne białka efektorowe.

Identyfikacja szlaków gospodarza, do których ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe przy użyciu toksyczności drożdży i badań supresorowych

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę przesiewową, która może być szeroko stosowana do szybkiego badania przesiewowego supresorów wyciszających RNA u patogenów roślinnych.

Badania przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych

Interakcje biomolekuł, takie jak interakcje białko-białko, są molekularną podstawą funkcji biologicznych. Jeśli uda się wyizolować mutanty bez interakcji/upośledzone, które specyficznie nie mają odpowiedniej interakcji, znacznie pomogą one w zrozumieniu funkcji tej interakcji. W tym artykule przedstawiono skuteczny sposób izolowania mutantów bez interakcji/z upośledzeniem.

Izolowanie mutantów o zerowej interakcji/upośledzonych przy użyciu testu dwuhybrydowego drożdży

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Poznaj metodę sita dwuhybrydowego do identyfikacji interakcji białkowych efektora bakteryjnego z białkami gospodarza Malus domestica. Ta technika pozwala badać mechanizmy choroby proliferacji jabłoni.

Rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego (Wideo) | JoVE Journal

Rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego

Przeglądaj więcej filmów