Rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyjaśnienie strategii wirulencji oraz systemów gospodarz-patogen poprzez identyfikację oddziaływań białka efektorowego Candidatus Phytoplasma Malefactor z białkami gospodarza z gatunku Malus domestica. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w wielu różnych dziedzinach badań biologicznych, a w niniejszym przypadku została zastosowana w badaniach nad roślinami w celu wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju choroby proliferacji jabłoni. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przesiewowej analizy pojedynczego efektora patogenu pod kątem tysięcy potencjalnych interaktorów, co czyni tę metodę łatwo dostępnym punktem wyjścia w badaniach nad infekcjami.

Na początek należy zidentyfikować drzewa zainfekowane, wykazujące specyficzne objawy proliferacji jabłoni (Apple Proliferation), oraz drzewa kontrolne, które są wolne od objawów. Za pomocą czystych sekatorów należy pobrać próbki korzeni z trzech różnych miejsc systemu korzeniowego, o średnicy 0,5–1 cm i długości około 5 cm. Próbki korzeni należy umieścić w odpowiednio opisanych plastikowych woreczkach.

Następnie umieścić próbki w lodówce przenośnej z wkładami chłodzącymi i przechowywać je w temperaturze 4 °C do czasu dalszej obróbki. Przepłukać próbki korzeni wodą w celu usunięcia gleby. Następnie przenieść próbki do sterylnej szalki Petriego i za pomocą wysterylizowanego skalpela usunąć epidermę oraz korę korzenia.

Za pomocą czystej, niepozostawiającej kłaczków chusteczki przetrzyj skalpel. Następnie zanurz narzędzie w 70% ethanol i wysterylizuj je nad otwartym płomieniem. Użyj skalpla, aby zeskrobać łyko.

Poszatkuj próbkę na małe kawałki i odważ 30-100 mg tych fragmentów do sterylnej probówki reakcyjnej o pojemności 2 ml. Próbki przechowuj w temperaturze 80 °C lub wykorzystaj je niezwłocznie do izolacji DNA, które posłuży jako matryca do amplifikacji genu efektora i późniejszego klonowania efektora do wektora przynęty. Po izolacji polispecyficznego DNA fitoplazm z zakażonych drzew, dokonaj klonowania do wektorów przynęty i sprawdź autoaktywację oraz ekspresję zgodnie z protokołem tekstowym.

Wymaż efektor ATP 00189 przekształcony do szczepu NMY51 na świeżą płytkę SD-trp i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni, aż pojawią się czerwone kolonie. Użyj czerwonej kolonii z płytki agarowej do zaszczepienia 3 ml pożywki SD-trp w małej kolbie z wytrząsaniem i inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza przy wytrząsaniu z prędkością 120-150 obrotów na minutę. Następnego dnia, używając 1 ml kultury nocnej, zaszczep 20 ml pożywki SD-trp w kolbie z wytrząsaniem i pozostaw do wzrostu na osiem godzin.

Użyj podłoża SD-trp, aby dostosować kulturę do wartości OD600 wynoszącej 0.2, a następnie dziesięcioma mililitrami kultury zaszczep dwie kolby zawierające po 100 mililitrów podłoża SD-trp. Inkubuj kultury w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przez noc. Następnie zmierz OD600 kultury i odwiruj osad odpowiadający 120 jednostkom OD600.

Na przykład, jeśli zmierzona wartość OD600 wynosi 1,2, należy odwir就ować 100 ml próbki, odrzucić nadsącz, a następnie użyć 800 ml uprzednio ogrzanego medium 2xYPAD, aby resuspender osad w dwóch kolbach z wytrząsaniem i inkubować w temperaturze 30 °C. Hodowlę drożdży inkubować w temperaturze 30 °C przy prędkości 120-150 obr./min. Wartość OD600 należy mierzyć mniej więcej co 1,5 godziny zgodnie z protokołem tekstowym, aż do osiągnięcia wartości OD600 wynoszącej 0,6.

Po przygotowaniu DNA nasienia łososia, octanu litu (LiOAc) i PEG z octanem litu zgodnie z protokołem tekstowym, odwiruj 800 mililitrów kultury drożdży przy 700 x G przez pięć minut, aby uzyskać osad komórkowy. Usuń nadsącz i resuspenduj osad w łącznie 200 mililitrach sterylnej wody dwukrotnie destylowanej. Następnie ponownie odwiruj komórki i odrzuć nadsącz.

Resuspenduj osad w 16 mililitrach mieszaniny Te Lithium OAc i ponownie odwiruj próbkę. Następnie, po odlaniu nadsączu, użyj 9,6 mililitrów Te Lithium OAc, aby ponownie resuspendować osad. W naczyniach reakcyjnych o odpowiedniej pojemności przygotuj dwanaście probówek zawierających siedem mikrogramów wektora biblioteki DNA peak Add HAC, 100 mikrolitrów 2% DNA z sperm łososia oraz 2,5 mililitrów mieszaniny PEG Lithium OAc.

Do każdej z dwunastu probówek należy dodać 600 µL wcześniej przygotowanej zawiesiny komórek drożdży i intensywnie mieszać przez jedną minutę. Następnie reakcje należy inkubować w kąpieli wodnej w temperaturze 30 °C przez 45 minut, mieszając co 15 minut. W kolejnym kroku do każdej probówki należy dodać 160 µL DMSO i intensywnie wymieszać.

Następnie inkubuj fiolki w temperaturze 42 °C przez dodatkowe 20 minut. Po odwirowaniu komórek odlej nadsącz i użyj 3 mL 2xYPAD do resuspensji każdego osadu. Połącz komórki ze wszystkich dwunastu fiolek w kolbie z wytrząsarką o pojemności 100 mL i inkubuj drożdże przez 90 minut w temperaturze 30 °C przy 120 obr./min.

Po inkubacji, po odwirowaniu komórek i usunięciu supernatantu, należy użyć dziesięciomililitrowej pipety serologicznej i 4,5 ml sterylnego 0,9% NaCl, aby dokładnie resuspender osad poprzez ostrożne pipetowanie w górę i w dół. Należy pobrać 50 µl zawiesiny i za pomocą 0,9% NaCl przygotować rozcieńczenia dziesięciokrotne od 1:10 do 1:1000. Następnie 100 µl każdego rozcieńczenia należy wysiać na 90 mm szalki Petriego zawierające agar SD-trp-leu.

Pozostałą część nierozcieńczonej zawiesiny drożdży wysiewamy na 16 szalek Petriego o średnicy 150 mm z agarem SD-trp-leu-His-ade. Szalki inkubujemy w temperaturze 30°C przez trzy dni w przypadku szalek SD-trp-leu oraz przez cztery dni w przypadku szalek SD-trp-leu-his-ade. Wydajność transfekcji określamy poprzez zliczenie kolonii dla poszczególnych rozcieńczeń seryjnych na płytkach selekcyjnych SD-trp-leu.

Przenieś każdy klon, używając sterylnego końcówki pipety do pobrania i wysiania kolonii na świeże selektywne płytki SD-trp-leu-his-ade. Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez 24 godziny. Powtarzaj przenoszenie klonów codziennie, aż do osiągnięcia łącznie pięciu pasażów.

Aby przeanalizować klony, przygotuj w sterylnej komorze przepływu laminarnego jedną sterylną probówkę reakcyjną o pojemności 2 ml zawierającą 1 ml pożywki SD-trp-leu-his-ade dla każdego klonu. Użyj rozgrzanej igły, aby zrobić otwór w każdej probówce, a następnie zakryj go uszczelniaczem przepuszczalnym dla gazów. Zaszczep każdą probówkę świeżym materiałem kolonii z jednego klonu i inkubuj probówki w temperaturze 30 °C przy 150 obr./min przez 24 godziny.

Po odwirowaniu komórek i usunięciu supernatantu, zawiesić osad w odpowiednim buforze i przenieść go do nowej probówki reakcyjnej o pojemności dwóch mililitrów. Do zawiesiny dodać 100 µL szklanych kulek płukanych kwasem i intensywnie mieszać zawartość probówki przez pięć minut. Na koniec oczyścić plazmidowe DNA zgodnie z protokołem tekstowym.

Podsumowanie oczekiwanych wyników testu samoaktywacji oraz ich interpretacja zostały przedstawione w poniższej tabeli i na rysunku. Słaba samoaktywacja prowadzi do wzrostu na płytkach selekcyjnych pozbawionych trp-leu-his, ale nie na płytkach pozbawionych trp-leu-his-ade. Z kolei drożdże transformowane silnie samoaktywującą przynętą rosłyby na pożywce pozbawionej trp-leu-his-ade.

Pomyślną kotransformację przynęty (bait) i ofiary (prey) charakteryzuje wzrost na płytkach selekcyjnych pozbawionych trp i leu. Interakcja białka przynęty i białka ofiary prowadzi do komplementacji oksytrofii his i ade szczepu NMY51. Przedstawiono tutaj przykład interakcji między przynętą a ofiarą w eksperymencie drożdżowego systemu dwuhybrydowego (Yeast 2 Hybrid). Zidentyfikowano partnerów interakcji gospodarza malus domestica, MdTCP24 i MdTCP25, a interakcję potwierdzono poprzez transformację stożka de novo efektorem.

Po opanowaniu techniki, badanie drożdżowego systemu dwuhybrydowego można przeprowadzić w jeden dzień, pod warunkiem, że cały niezbędny sprzęt i materiały, a w szczególności drożdże, zostaną odpowiednio przygotowane z wyprzedzeniem. Podczas wykonywania tej procedury należy unikać kontaminacji i zawsze pracować w warunkach sterylnych. Po zastosowaniu tej metody należy przeprowadzić inną, niezależną metodę, na przykład bimolekularną komplementację fluorescencji, aby potwierdzić wykryte oddziaływania białko-białko.

Jest to szczególnie istotne, ponieważ drożdże lub hybrydy same w sobie są stosunkowo podatne na generowanie wyników fałszywie dodatnich. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z wielu różnych dziedzin do lepszego zrozumienia zasad molekularnych dotyczących oddziaływań białko-białko, zwłaszcza w interakcjach gospodarz-patogen, a także w wielu innych obszarach badań biologicznych. Co więcej, przekonają się Państwo, że przeprowadzenie tej metody jest łatwo wykonalne w każdym odpowiednio wyposażonym laboratorium biologii molekularnej.

Należy pamiętać, że praca z niektórymi odczynnikami chemicznymi, skalpelami oraz otwartym ogniem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać określonych środków ostrożności. Oznacza to konieczność stosowania osobistego sprzętu ochronnego, takiego jak rękawiczki i gogle, oraz korzystania z ogólnego wyposażenia laboratoryjnego zapewniającego bezpieczeństwo.