Name: Synteza 1,2-azaborin i otrzymywanie ich kompleksów białkowych z mutantami lizozymu T4 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj metodę syntezy 1,2-azaborin i otrzymywania ich kompleksów białkowych z mutantami lizozymu T4. Technika ta umożliwia niezawodne wytwarzanie związków zawierających boron.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez National Institutes of Health NIGMS (R01-GM094541) i Boston College.

<ol><li>Ducruix, A., Giége, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDucruix%2C+A+%22Crystallization+of+Nucleic+Acids+and+Proteins%2C+A+Practical+Approach%22">Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach</a>. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).</li>
<li>Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/v08-110#.WLBilzsrLIU">B-N as a C-C substitute in aromatic systems.</a> Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).</li>
<li>Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22644658">Recent Advances in Azaborine Chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).</li>
<li>Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25469827">Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties.</a> Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).</li>
<li>Zhou, H. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+isomerism%3A+a+boron-nitrogen+surrogate+for+a+carbon-carbon+double+bond+increases+the+chemical+diversity+of+estrogen+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands.</a> Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).</li>
<li>Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization%2C+and+binding+property+of+isoelectronic+analogues+of+nucleobases%2C+B%286%29-substituted+5-aza-6-borauracils+and+-thymines%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines.</a> Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).</li>
<li>Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BN%2FCC+isosterism+in+borazaronaphthalenes+towards+phosphodiesterase+10A+%28PDE10A%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors.</a> Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).</li>
<li>Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzazaborinines+as+Novel+Bioisosteric+Replacements+of+Naphthalene%3A+Propranolol+as+an+Example%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example.</a> J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).</li>
<li>Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja01060a034">New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene.</a> J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).</li>
<li>White, D. G. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00905a022">2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes.</a> J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).</li>
<li>Ashe III, A. J., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Synthesis+of+Aromatic+Five-+and+Six-Membered+B%E2%88%92N+Heterocycles+via+Ring+Closing+Metathesis%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis.</a> Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).</li>
<li>Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hybrid+Organic%2FInorganic+Benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Hybrid Organic/Inorganic Benzene.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).</li>
<li>Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+Group-Free+Synthesis+of+1%2C2-Azaborines%3A+A+Simple+Approach+to+the+Construction+of+BN-Benzenoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).</li>
<li>Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodium-catalyzed+boron+arylation+of+1%2C2-azaborines%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).</li>
<li>Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negishi+Cross-Coupling+Is+Compatible+with+a+Reactive+B-Cl+Bond%3A+Development+of+a+Versatile+Late-Stage+Functionalization+of+1%2C2-Azaborines+and+Its+Application+to+the+Synthesis+of+New+BN+Isosteres+of+Naphthalene+and+Indenyl%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl.</a> J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).</li>
<li>Knack, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23355270">BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).</li>
<li>Eriksson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+a+Protein+Structure+to+Cavity-Creating+Mutations+and+Its+Relation+to+the+Hydrophobic+Effect%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect.</a> Science. 255 (5041), 178-183 (1992).</li>
<li>Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cavity-containing+mutant+of+T4+lysozyme+is+stabilized+by+buried+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene.</a> Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).</li>
<li>Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetic+Origins+of+Specificity+of+Ligand+Binding+in+an+Interior+Nonpolar+Cavity+of+T4+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme.</a> Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).</li>
<li>Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+Binding+Site+for+Testing+Scoring+Functions+in+Molecular+Docking%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking.</a> J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).</li>
<li>Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+Bonding+of+1%2C2-Azaborines+in+the+Binding+Cavity+of+T4+Lysozyme+Mutants%3A+Structures+and+Thermodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics.</a> J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).</li>
<li>Brown, H. C., Racherla, U. S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/280707532_Organoboranes_43_A_convenient_highly_efficient_synthesis_of_triorganylboranes_via_a_modified_organometallic_route">Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route.</a> J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halogenated+Benzenes+Bound+within+a+Non-polar+Cavity+in+T4+Lysozyme+Provide+Examples+of+I.S+and+I.Se+Halogen-bonding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding.</a> J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów finansowych w tym manuskrypcie.

W pierwszej części niniejszego protokołu opisaliśmy zmodyfikowaną syntezę 1,2-azaboryny w oparciu o wcześniej opisane metody12, 13. Trialliloboran22 zastosowano jako substytut dróg wykorzystujących allitrifenylocycynę lub alliltrifluoroboran potasu do przygotowania adduktu chlorku N-allil-N-TBS-B (1). Ta metoda pozwala na bardziej ekonomiczne i przyjazne dla środowiska podejście. Do syntezy N-TBS...

Heterocykle zawierające azot borowy (np. 1,2-azaboryny) przyciągnęły ostatnio znaczną uwagę jako izosterydy aren. Ten izosteryzm może prowadzić do dywersyfikacji istniejących motywów strukturalnych w celu rozszerzenia przestrzeni chemicznej2,3,4. Azaboryny mają potencjalną użyteczność do zastosowania w badaniach biomedycznych5,6,7,8, zwłaszcza w dziedzinie chemii medycznej, w której chemicy przeprowadzają syntezę bibliotek strukturalnie i funkcjonalnie istotnych cząsteczek. Istotne jest jednak to, że chociaż istnieje wiele dobrze rozwiniętych metod syntezy do dostępnych cząsteczek zawierających arenę, opisano tylko ograniczoną liczbę metod syntezy azaboryn9,10,11,12,13. Wynika to głównie z ograniczonej liczby opcji źródła boru oraz wrażliwego na powietrze i wilgoć charakteru cząsteczki we wczesnym etapie sekwencji syntetycznej.
W pierwszej części tego artykułu opiszemy syntezę N-TBS-B-Cl-1,2-azaboryny na skalę wielogramową (3) przy użyciu standardowych technik bezpowietrznych. Związek ten służy jako wszechstronny półprodukt, który może być dalej funkcjonalizowany do strukturalnie bardziej złożonych cząsteczek14,15. Począwszy od punktu 3, opisana zostanie synteza i oczyszczanie N-H-B-etylo-1,2-azaboryny (5) do stosowania w badaniach wiązania białek. Ze względu na lotność 5, jego skuteczna izolacja wymaga precyzyjnej kontroli temperatury, czasu i warunków destylacji reakcji.
W drugiej części zostaną przedstawione protokoły ekspresji białek i izolacji mutantów lizozymu T4 (L99A i L99A/M102Q)17,18,19,20, a następnie krystalizacja białka i przygotowanie kompleksów krystalicznych białko-ligand. Mutanty lizozymu T4 L99A i L99A/M102Q zostały wybrane jako systemy modeli biologicznych w celu zbadania zdolności wiązania wodorowego cząsteczek N-H zawierających azaborynę17. Korzystając ze standardowego protokołu biologii molekularnej, białko ulega ekspresji w szczepie Escherichia coli RR1 i jest indukowane izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydem (IPTG). Oczyszczanie białek odbywa się za pomocą jonowymiennej chromatografii kolumnowej. Krystalizację białek przeprowadza się za pomocą wysoko stężonego oczyszczonego roztworu białka (czystość >95% metodą elektroforezy żelowej) metodą dyfuzji par w postaci wiszącej kropli. Ze względu na wrażliwość ligandów w tym badaniu na tlen, kompleksy białko-ligand są przygotowywane w warunkach bezpowietrznych.

<table><tbody><tr><td>Tetrahydrofuran (THF), wolny od inhibitorów, do HPLC, &ge; 99,9%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34865</td><td></td></tr><tr><td>Eter dietylowy (Et2O), do HPLC, &ge; 99,9%, bez inhibitorów</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek metylenu&nbsp; (CH2Cl2), (stabilizowany/certyfikowany ACS)</td><td>Fisher</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Fisher</td><td>T290-4</td><td></td></tr><tr><td>Pentan, HPLC</td><td>Fisher</td><td>P399-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher</td><td>A21-4</td><td></td></tr><tr><td>Wodorek wapnia (CaH2), klasa odczynnika, 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208027</td><td>Pallad piroforyczny</td></tr><tr><td>na węglu aktywnym (Pd/C), 10% wag. Pd</td><td>Strem</td><td>46-1900</td><td></td></tr><tr><td>1,0 M roztwór trichlorku boru w heksanie</td><td>Sigma Aldrich</td><td>211249</td><td>Wysoce toksyczna/piroforyczna</td></tr><tr><td>trietyloamina, &ge; 99.5%</td><td></td>Katalizator generacji 1st <td>Sigma Aldrich</td> 471283 <td></td></tr><tr><td>Grubbs&nbsp;</td><td>materia</td><td>C823</td><td></td></tr><tr><td>Acetamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0500</td><td></td></tr><tr><td>n-butanol, bezwodny, 99,8%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>281549</td><td></td></tr><tr><td>roztwór etylitu, 0,5&nbsp; M w benzenie/cykloheksanie</td><td>Sigma</td><td>Aldrich 561452</td><td>Wysoce toksyczny/piroforyczny</td></tr><tr><td>roztwór HCl, 2,0 M w Et2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>455180</td><td></td></tr><tr><td>2-metylobutan, bezwodny, &ge; 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli, (Migula) Castellani i Chalmers (ATCC&reg; 31343&trade;)</td><td>ATCC</td><td>31343</td><td></td></tr><tr><td>T4 lizozym WT* (L99A)</td><td>Addgene</td><td>18476</td><td></td></tr><tr><td>T4 mutant lizozymu (S38D, L99A, M102Q, N144D)</td><td>Addgene</td><td>18477</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>izopropylo-&beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy bezwodny</td><td>Fisher</td><td>BP329</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny</td><td>Fisher</td><td>BP332</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>S642212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Fisher</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Thermo naukowe przebijanie DNaseI</td><td>Fisher</td><td>PI-90083</td><td></td></tr><tr><td>GE Healthcare&nbsp; Sepharose Fast Flow KationExchange</td><td>Fisher</td><td>45-002-931</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>TCI</td><td>S0489</td><td>Wysoce toksyczny</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Fisher</td><td>ICN806443&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sartorius&nbsp; Koncentratory odśrodkowe Vivaspin 20</td><td>Fisher</td><td>14-558-501</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Dwusiarczek 2-hydroksyetylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>380474</td><td></td></tr><tr><td>N-paraton&nbsp;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-643</td><td></td></tr><tr><td>4 RC Rurki membranowe do dializy 12 000 do 14 000 daltonów MWCO&nbsp;</td><td>Rybak</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CryoLoop</td><td>Hampton Research</td><td></td><td>rurki kriogeniczne w kształcie pętli</td></tr><tr><td>CryoTong</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>szczypce kriogeniczne</td></tr><tr><td>Coot</td><td></td><td></td><td>Obrazy gęstości elektronów są generowane z oprogramowania</td></tr></tbody></table>

synteza 1,2-azaborin i otrzymywanie ich kompleksów białkowych z mutantami lizozymu t4

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Opisujemy ogólną syntezę 1,2-azaboryny przy użyciu standardowych technik bezpowietrznych i preparatu kompleksu białkowego z mutantami lizozymu T4 metodą dyfuzji pary. Związki wrażliwe na tlen i wilgoć są przygotowywane i izolowane w atmosferze obojętnej (N2) za pomocą próżniowego kolektora gazowego lub komory rękawicowej. Jako przykład syntezy azaboryny demonstrujemy syntezę i oczyszczanie lotnej N-H-B-etylo-1,2-azaboryny za pomocą pięcioetapowej sekwencji obejmującej destylację i chromatografię kolumnową w celu izolacji produktów. Mutanty lizozymu T4 L99A i L99A/M102Q ulegają ekspresji szczepu Escherichia coli RR1. Standardowe protokoły chemicznej lizy komórek, po której następuje oczyszczanie za pomocą kolumny jonowymiennej karboksymetylu, zapewniają białko o wystarczająco wysokiej czystości do krystalizacji. Krystalizację białek przeprowadza się w różnych stężeniach środka strącającego w różnych zakresach pH metodą dyfuzji par w postaci wiszących kropli. Złożone przygotowanie z małymi cząsteczkami odbywa się metodą dyfuzji parowej w atmosferze obojętnej. Analiza dyfrakcji rentgenowskiej kompleksu krystalicznego dostarcza jednoznacznych dowodów strukturalnych na oddziaływania wiążące między miejscem wiązania białka a 1,2-azaborynami.

Schematyczna trasa syntezy dla 1,2-azaboryn jest pokazana na rysunku 1. Protokół ten ma zastosowanie do syntezy pięciu różnych cząsteczek zawierających azot boru. Rysunek 2 przedstawia widma 11B NMR zmierzone w trakcie kroku 1.3 w celu monitorowania tworzenia się pożądanego produktu (3). Oczyszczanie białek przeprowadzono przy użyciu systemu chromatografii niskociśnieniowej, a reprezentatywny chromatogram przedstawiono na <stro...

Przedstawiono protokół Przedstawiono protokół syntezy 1,2-azaboryny i otrzymywania ich kompleksów białkowych z mutantami lizozymu T4.

Synteza 1,2-azaborin i otrzymywanie ich kompleksów białkowych z mutantami lizozymu T4

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opis ogólnej metody syntezy 1,2-azaborin oraz jej potencjalnego zastosowania w badaniach biomedycznych. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie pewnej syntezy związków 1,2-azaboriny, które stanowią łączące izostery zawierające bor wszechobecnego motywu benzenowego. Opisany prekursor może zostać dalej funkcjonalizowany w celu otrzymania potencjalnie bardziej złożonych cząsteczek.Przygotowanie kompleksów białkowych z 1, 2-azoboryną dostarczy wiedzy przydatnej w przyszłych zastosowaniach w badaniach biomedycznych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować produkt z zamkniętym pierścieniem zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Do tak przygotowanego produktu w toluenie należy dodać 14 g palladu na węglu.Następnie wyjmij kolbę z pudełka. Zamocuj w kolbie wysuszoną w ovenie chłodnicę zwrotną 24/40, która została przepłukana azotem i wyposażona w chłodzoną wodę. Umieść kolbę w łaźni olejowej i podgrzewaj mieszaninę reakcyjną do intensywnego wrzenia w temperaturze 135 °C podczas mieszania.Reakcję prowadzono w warunkach refluksu przez 16 godzin. Następnie kolbę wyjęto z łaźni olejowej, aby schłodzić mieszaninę reakcyjną do temperatury pokojowej. Po ochłodzeniu chłodnicę zwrotną zastąpiono septem w kolbie reakcyjnej.Za pomocą strzykawki wyposażonej w wysuszoną w piecu igłę Luer Lock pobrać 5 mililitrów próbki. Przenieść pobraną ilość do probówki NMR z nakrętką. Próbkę poddać analizie za pomocą spektroskopii NMR Boru-11.Jeśli reakcja nie została zakończona, przenieś kolbę reakcyjną do komory rękawicowej. Następnie dodaj dodatkowe trzy gramy palladu na węglu. W kolejnym kroku wyjmij kolbę z komory rękawicowej.Do kolby dopasuj chłodnicę zwrotną 24/40, która została przepłukana azotem i wyposażona w chłodną wodę. Wykorzystując kąpiel olejową, podgrzewaj mieszaninę reakcyjną do intensywnego wrzenia w temperaturze 135 °C, mieszając przez 24 godziny. Za pomocą NMR Boron-11 przeanalizuj kolejną alikwotową próbkę, aby upewnić się, że reakcja dobiegła końca.Następnie przenieś kolbę reakcyjną z powrotem do komory rękawicowej. Przepuść mieszaninę reakcyjną przez kolumnę do chromatografii błyskawicznej wypełnioną ręcznikami papierowymi. Następnie zbierz filtrat do kolby okrągłodennej o pojemności jednego litra wyposażonej w mieszadełko magnetyczne.Przemyj kolumnę 50 mililitrami toluenu. Wyjmij naczynie z filtrowanym roztworem z komory rękawicowej i podłącz je do próżniowego kolektora gazowego wyposażonego w linię azotu. Pod kolbą umieść kąpiel wodną oraz naczynie Dewara zawierające ciekły azot w celu wychwycenia rozpuszczalnika.Otwórz zawór wysokiej próżni, aby rozpocząć usuwanie wszystkich substancji lotnych z filtratu. Następnie przenieś mieszaninę reakcyjną z powrotem do komory dymnej (glove box). Przelej mieszaninę do wysuszonej w piecu kolby okrągłodennej o rozmiarze 24/40 i pojemności 250 mililitrów, zawierającej mieszadło magnetyczne.Przepłucz pozostałości mieszaniny reakcyjnej dichlorometanem i przenieś je do kolby. Zamknij kolbę za pomocą septa. Przenieś kolbę z komory rękawicowej do układu próżniowego i podłącz ją.Otwórz zawór wysokiej próżni, aby usunąć pozostałości rozpuszczalnika. Następnie szybko usuń septum i dodaj wodorek wapnia za pomocą scoopuli. Podłącz kolbę okrągłodenno do aparatury destylacyjnej opisanej w protokole tekstowym i ustaw temperaturę kąpieli olejowej na 100 °C.Po zakończeniu destylacji należy usunąć źródło ciepła i schłodzić aparaturę do temperatury pokojowej. Ponownie zwiększyć ciśnienie w schłodzonej aparaturze za pomocą azotu i szczelnie zamknąć zawór grzybkowy w kolbie do przechowywania w warunkach beztlenowych. Po przeniesieniu wyizolowanego produktu z kolby do fiolki w komorze rękawicowej, należy przechowywać fiolkę w zamrażarce komory rękawicowej.Po oczyszczeniu białka przenieś oczyszczony roztwór do rurek z membrany dializacyjnej. Umieść rurki dializacyjne w naczyniu zawierającym cztery litry roztworu 100 mM fosforanu sodu, 550 mM chlorku sodu i 0,2% azotku sodu. Mieszaj przez noc w temperaturze 4 °C.Następnego dnia do dializowanej próbki należy dodać 2-merkaptoetanol tak, aby stężenie końcowe wyniosło 5 mM. Następnie, za pomocą koncentratora wirówkowego, należy zagęścić roztwór do stężenia 40 mg/ml. Próbkę wiruje się przy 5 000 RPM w temperaturze 6 °C, a po zakończeniu koncentracji usuwa się wszelkie osady.Następnie, w płytce 24-dołkowej, przygotuj różne warunki z użyciem roztworu z rezerwuaru, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby zapewnić szczelne zamknięcie, nałóż smar na krawędź każdego dołka. Wymieszaj 5 µL skoncentrowanego roztworu białka z 5 µL roztworu z rezerwuaru na silikonizowanej szklanej lamellce.Połóż szkiełko nakrywkę odwrócone do góry dnem nad studniami zawierającymi roztwór rezerwuarowy. Przechowuj płytkę w temperaturze 4 °C w celu wzrostu kryształów. Za pomocą pętli z rurki kriogenicznej pobierz wyrośnięte kryształy i umieść je w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 6 ml.Dodaj 50 µL ługu macierzystego. Następnie przenieś probówkę do komory rękawicowej. Przenieś 5 µL przygotowanego ligandu azaborynowego do wnętrza zakrętki probówki.Zakręć probówkę i przechowuj ją w lodówce wewnątrz komory rękawicowej od dwóch do siedmiu dni w celu równoważenia poprzez dyfuzję par. Następnie nanieś kroplę N Paratone na szkiełko przedmiotowe. Za pomocą mikropipety przenieś kryształ na szkiełko.Następnie, używając pętli z rurki kriogenicznej, pobierz kryształ i przenieś go z roztworu wodnego do N Paratone. Zanurz kryształ zabezpieczony N Paratone w naczyniu typu dewar zawierającym ciekły azot. Używając kleszczy kriogenicznych, zamocuj gwałtownie zamrożony kryształ na pętli.Następnie należy przeanalizować zebrane dane krystalograficzne zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W niniejszym badaniu przedstawiono zmodyfikowaną syntezę 1, 2-azaborin w oparciu o wcześniej opisane metody. Tri-allele borine jest wykorzystywane do przygotowania adduktu N-allele NTBSB-allele chloride.Do syntezy NTBS BCl 1, 2-azaboriny zastosowano sekwencję „one pot two step” (jednogarnkową dwuetapową), co pozwala na uzyskanie wyższej wydajności izolacji niż w przypadku metod stosowanych wcześniej. Synteza N-H-B-etylu-1, 2-azaboriny została przeprowadzona w dwóch etapach, z wykorzystaniem etylolitu zamiast kompleksu chromu stosowanego w metodach opisanych w poprzednich doniesieniach. Białko oczyszczono za pomocą niskociśnieniowego systemu chromatograficznego.Chromatogram uzyskany przy 280 nanometrach wykazuje pik odpowiadający mutantowi lizozymu T4, L99am102q. Następnie białko zostaje poddane krystalizacji i tworzy kompleksy z ligandami. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że synteza azaboriny wymaga zachowania warunków beztlenowych, takich jak użycie komory rękawicowej i próżniowej linii gazowej, aby zapobiec rozkładowi związków.Po opracowaniu technika ta otworzyła drogę do badania unikalnych właściwości chemicznych i fizycznych azaborin w porównaniu z aromatami węglowymi w klasycznych biologicznych kieszeniach rekultywacyjnych.

synthesis-12-azaborines-preparation-their-protein-complexes-with-t4

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Cząsteczki adenowirusów są modyfikowane tak, aby zawierały albo nienaturalny analog aminokwasu azydohomoalaninę, albo azydocukier O-GlcNAz. Grupa azydowa każdego z nich jest chemoselektywnie łączona za pomocą reakcji chemii „click” w celu modyfikacji powierzchni wirusa.

Chemoselektywna modyfikacja powierzchni wirusów za pomocą bioortogonalnej chemii klik

Opisano protokół diastereoselektywnego jednogarnkowego przygotowania cis-N-Ts-jodoazyrydyn. Wykazano wytwarzanie dijodometyllitu, dodawanie do N-T aldimin i cyklizację aminokwasu pośredniego z dijodydem kaminu i jodozyrydyn. Dołączony jest również protokół szybkiej i ilościowej oceny najodpowiedniejszej fazy stacjonarnej do oczyszczania za pomocą chromatografii.

Synteza i oczyszczanie jodoazyrydyn polegające na ilościowym doborze optymalnej fazy stacjonarnej do chromatografii

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego dla danego miejsca wprowadzania sond chemicznych do fragmentu przeciwciała poprzez genetyczne włączenie aminokwasu zawierającego azydek, a następnie sprzężenie azydu z sondą chemiczną za pomocą promowanej przez szczep cykloaddycji azydkowo-alkinowej (SPAAC).

Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez cykloaddycję azydowo-alkinową promowaną przez szczep

Dwucykliczne jony azyrydynowe, takie jak 1-azoniabicyclo[4.1.0]tosylan heptanu, zostały wygenerowane z 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]azirydyny, która została wykorzystana do przygotowania podstawionych piperydyn i azepanów poprzez regio- i stereospecyficzne rozszerzanie pierścienia z różnymi nukleofilami. Ten wysoce wydajny protokół pozwolił nam przygotować różnorodne azaheterocykle, w tym produkty naturalne, takie jak fagomina, analog febryfuginy i balanol.

Otrzymywanie stabilnych dwucyklicznych jonów azyrydynowych i ich otwieranie pierścieni do syntezy azaheterocykli

3-Aroyl-N-hydroksy-5-nitroindole zostały zsyntetyzowane przez cykloaddycję 4-nitronitrozobenzenu ze sprzężonym końcowym alkinonem w jednoetapowej procedurze termicznej. Przygotowanie nitrozoenu i alkinonów zostało odpowiednio opisane i odpowiednio poprzez procedury utleniania na odpowiedniej anilinie i alkinolu.

Bezpośrednia, regioselektywna i ekonomiczna atomowo synteza 3-aroilo-N-hydroksy-5-nitroindoli przez cykloaddycję 4-nitronitrozobenzenu z alkinonami

W tym badaniu przygotowujemy zarówno enancjomery 2-karboksylanu azyrydyny, które są używane w asymetrycznej syntezie alkaloidów, w tym biemamid B i D, jak i (-)-epiallo-izomuskarynę.

Otrzymywanie enancjoczystych nieaktywowanych azyrydyn oraz synteza biemamidu B, D i epiallo-izomuskaryny

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić znakowanie białek specyficznych dla typu komórki za pomocą azydonorleucyny (ANL) przy użyciu linii myszy wyrażającej zmutowaną syntetazę tRNA L274G-metioniny (MetRS*) oraz niezbędne kroki do izolacji białek specyficznych dla znakowanego typu komórki. Przedstawiamy dwie możliwe drogi podawania ANL żywym myszom poprzez (1) picie wody i (2) wstrzyknięcia dootrzewnowe.

Oczyszczanie i identyfikacja białek specyficznych dla typu komórki ze złożonych tkanek przy użyciu zmutowanej linii myszy syntetazy tRNA metioniny

Sąsiadujące ze sobą bizyrydyny zawierające nieaktywowane i aktywowane azyrydyny zostały zsyntetyzowane przez asymetryczne azyrydynacje organokatalityczne, a następnie poddane chemoselektywnym reakcjom otwierania pierścieni w warunkach kwaśnych lub zasadowych. Nieaktywowany pierścień azyrydynowy otwiera się z mniej reaktywnymi nukleofilami w warunkach kwaśnych, podczas gdy aktywowany pierścień azyrydynowy otwiera się z bardziej reaktywnymi nukleofilami w warunkach zasadowych.

Przygotowanie sąsiadujących ze sobą bisazyrydyn do rekreacji regioselektywnego otwierania pierścieni

Protokół ten opisuje metodę produkcji i oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz cytotoksyczności peptydu kationowego Mel4 oraz naśladowcy peptydu RK758. Integrując syntezę chemiczną, ekspresję rekombinowaną oraz standaryzowane testy funkcjonalne, zapewnia usprawniony proces produkcji i testowania peptydów oraz naśladowców małych cząsteczek.

Produkcja i testowanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz ich naśladowców

Opisujemy procedury przygotowania i dostarczania mikrokryształów białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej do krystalografii szeregowej w laserach rentgenowskich na swobodnych elektronach i źródłach synchrotronowych. Protokoły te mogą być również stosowane do wprowadzania i dostarczania rozpuszczalnych mikrokryształów białek, co prowadzi do znacznego zmniejszenia zużycia próbki w porównaniu z wstrzykiwaniem cieczy.

Otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej

Poznaj metodę syntezy 1,2-azaborin i otrzymywania ich kompleksów białkowych z mutantami lizozymu T4. Technika ta umożliwia niezawodne wytwarzanie związków zawierających boron.

Synteza 1,2-azaborin i otrzymywanie ich kompleksów białkowych z mutantami lizozymu T4

Przeglądaj więcej filmów