Obrzęk organoidów jelitowych wywołany forskoliną: test in vitro do oceny odpowiedzi na lek u pacjentów z mukowiscydozą

Ogólnym celem tej procedury jest ocena indywidualnej funkcji CFTR w skuteczności leczenia modulującego CFTR za pomocą obrzęku wywołanego forskoliną lub testu FIS w organoidach jelitowych generowanych od pacjentów z mukowiscydozą. Metoda ta odpowiada na kluczowe pytania w dziedzinie mukowiscydozy. Przede wszystkim pomaga w identyfikacji pacjentów, którzy mogą odnieść długoterminowe korzyści z istniejących lub eksperymentalnych leków.

Główną zaletą tej techniki jest to, że łatwo dostępna tkanka może być wykorzystana do wygenerowania organoidów od każdego pacjenta z mukowiscydozą, niezależnie od wieku. Implikacje tej techniki rozciągają się na ortoterapię mukowiscydozy i odpowiadają na pilną potrzebę testowania skuteczności leków w opłacalny i indywidualny sposób. Procedurę zademonstrują Marvin Statia z Hubrecht Organoid Technology oraz Annelot Vonk z grupy Jeffrey Beekman.

Aby uzyskać optymalne dane z testu pęcznienia wywołanego forskoliną, niezbędna jest praca z kulturą zawierającą duże organoidy z wieloma pączkami. Po zidentyfikowaniu takiej kultury oznacz jedną 15-mililitrową stożkową probówkę nazwą próbki i jedną probówkę jako umytą. Następnie użyj pipety p1000, aby ostrożnie zassać pożywkę z dołków hodowli organoidów, nie naruszając kropli matrycy błony podstawnej.

I dodaj jeden mililitr podłoża podstawowego do każdej studzienki. Teraz użyj pipety, aby rozbić krople matrycy błony podstawnej w każdej studzience i przenieś powstałe zawiesiny organoidów do 15-mililitrowej probówki z nazwą próbki. Przepłukać każdą studzienkę kolejnym milimetrem podłoża podstawowego i wciągnąć popłuczyny do probówki z próbką.

Po pobraniu wszystkich próbek napełnić probówkę z próbką do końcowej objętości 12 mililitrów podłożem podstawowym i użyć wstępnie zwilżonej pipety o pojemności pięciu mililitrów do wymieszania roztworu. Następnie odwirować organoidy, ponownie zawieszając osad w jednym mililitrze świeżego podłoża podstawowego. Przykryj tę samą końcówkę pipety p1000 końcówką p10 bez filtra i spróbuj nachylić zawiesinę 20 razy.

Następnie wyrzuć obie końcówki i użyj pięciomililitrowej pipety, aby dodać do próbki cztery mililitry świeżej pożywki podstawowej. Przechyl probówkę o około 70 stopni i energicznie wymieszaj roztwór dwa do trzech razy za pomocą nowej, wstępnie zwilżonej końcówki do pipety p1000. Przytrzymaj rurkę w pozycji przechylonej przez 10 sekund.

Następnie użyj tej samej pipety p1000, aby czterokrotnie przenieść górny mililitr próbki do umytych probówek. Po zebraniu ostatniej próbki zebrać organoidy przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 120 mikrolitrach 50% matrycy membrany podstawnej. Następnie umieść trzymikrolitrową kroplę na szklanym szkiełku mikroskopowym i potwierdź obecność co najmniej 30 do 50 organoidów w kropli pod mikroskopem świetlnym.

Następnie umieść trzy mikrolitrowe kropelki oraganoidowe na środku każdej studzienki 96-dołkowej płytki i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 minut, aby zestalić matrycę błony podstawnej. Następnie dodać 100 mikrolitrów pełnej pożywki okrężnicy plus VX809 lub samą pożywkę z pełną okrężnicą do odpowiednich dołków organoidowych i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na 18 do 24 godzin. Następnego dnia użyj pipety powtarzalnej, aby dodać 10 mikrolitrów roztworu wapnia do każdej studzienki, ponownie zawieszając studzienki za pomocą pipety wielokanałowej, aby upewnić się, że się mieszają, i włóż płytkę z powrotem do inkubatora na kolejne 30 minut.

Podczas barwienia komórek ustaw narzędzie do obrazowania na żywo w mikroskopie konfokalnym do obrazowania żywych komórek na 37 stopni i pięć procent dwutlenku węgla, aby wstępnie inkubować komorę obrazowania. Pod koniec inkubacji przenieś płytkę do uchwytu płytki w mikroskopie konfokalnym i użyj opcji inteligentnej konfiguracji, aby wybrać ścieżkę Alexa floor 488. Następnie ustaw pięć obiektywów przeciw wizji i obszar skanowania na 0,6x, aby pomniejszyć i uchwycić całą studnię.

Dostosuj moc lasera i czułość detektora, aby umożliwić optymalne wykrywanie organoidów oznaczonych kolorem wapń na zielono na tle. I ustaw głębię bitową na osiem, a rozmiar klatki na 512 na 512 pikseli. Użyj opcji szeregów czasowych, aby ustawić czas pomiaru, częstotliwość i interwały.

I opcja kafelka do ręcznego określania poszczególnych pozycji studni. Teraz dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanej forskoliny i/lub VX770 do odpowiednich dołków, zaczynając od pierwszego dołka, który ma być zobrazowany, i rozpocznij pomiar. Ze względu na dysfunkcję przezbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR), większość organoidów mukowiscydozy jelita grubego ma zwarte rozmiary i albo nie pęcznieje, albo wykazuje bardzo mały obrzęk 60 minut po stymulacji forskoliny, w zależności od ich genotypu.

Jednakże, gdy organoidy CF są traktowane modulatorami CFTR przed stymulacją forskoliny, organoidy wykazują wzrost obrzęku. Aby określić ilościowo obrzęk, można zmierzyć całkowite obszary powierzchni zieleni wapniowej w każdym punkcie czasowym. Po opanowaniu techniki te można ukończyć w ciągu trzech lub czterech godzin, jeśli są wykonywane prawidłowo.

Przed przystąpieniem do tej procedury najważniejszym krokiem jest optymalizacja warunków hodowli organoidów jelitowych, ponieważ dobrej jakości hodowle określą optymalną wydajność testu FIS. Po obejrzeniu tego filmu będziesz dobrze rozumiał, jak pracować z hodowlami organoidów jelitowych, a następnie mierzyć aktywność CFTR i odpowiedź modulatorów CFDR za pomocą testu obrzęku wywołanego forskoliną.