Name: Obrzęk organoidów jelitowych wywołany forskoliną: test in vitro do oceny odpowiedzi na lek u pacjentów z mukowiscydozą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj metodę obrzęku wywołanego forskoliną w organoidach jelitowych pacjentów z mukowiscydozą. Ta technika umożliwia ocenę funkcji CFTR i skuteczności modulatorów w podejściu spersonalizowanym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez program HIT-CF holenderskiej fundacji CF (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103), Fundusz Badawczy Szpitala Dziecięcego Wilhelmina i CZ oraz Zilverenkruis/Achmea. Chcielibyśmy podziękować S. Heida-Michel, M. Geerdink, K.M. de Winter-de Groot i G. Berkers (Oddział Pulmonologii Dziecięcej, Szpital Dziecięcy Wilhelmina, UMC Utrecht) oraz R.H.J. Houwen (Oddział Gastroenterologii Dziecięcej, Szpital Dziecięcy Wilhelmina, UMC Utrecht) za kontakt z pacjentami i pobranie biopsji w celu stworzenia biobanku mukowiscydozy.

<ol><li>De Boeck, K., Amaral, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+therapies+for+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Progress in therapies for cystic fibrosis.</a> Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).</li>
<li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+genetics%3A+from+molecular+understanding+to+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).</li>
<li>Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+disease+liability+of+variants+in+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene.</a> Nature Genet. 45 (10), 1160-1167 (2013).</li>
<li>Zielenski, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10773783">Genotype and phenotype in cystic fibrosis.</a> Respiration. 67 (2), 117-133 (2000).</li>
<li>Van Goor, F., Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+CF+airway+epithelial+cell+function+in+vitro+by+a+CFTR+potentiator%2C+VX-770%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106 (44), 18825-18830 (2009).</li>
<li>Van Goor, F., Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+the+F508del-CFTR+protein+processing+defect+in+vitro+by+the+investigational+drug+VX-809%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108 (46), 18843-18848 (2011).</li>
<li>Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+VX-770+in+persons+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D-CFTR+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation.</a> N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).</li>
<li>Ramsey, B. W., Davies, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>De Boeck, K., Munck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+a+non-G551D+gating+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation.</a> J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).</li>
<li>Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+corrector+%28lumacaftor%29+and+a+CFTR+potentiator+%28ivacaftor%29+for+treatment+of+patients+with+cystic+fibrosis+who+have+a+phe508del+CFTR+mutation%3A+a+phase+2+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial.</a> Lancet Respir Med. 2 (7), 527-538 (2014).</li>
<li>Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).</li>
<li>Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1569199313001136">Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function.</a> J Cyst Fibros. 13 (1), 29-36 (2014).</li>
<li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).</li>
<li>Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+epithelial+cell+models+for+cystic+fibrosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research.</a> Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).</li>
<li>Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiated+human+airway+epithelia.+Methods+for+establishing+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures.</a> Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).</li>
<li>Sato, T., Vries, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Stange, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li>
<li>Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+opportunities+for+CFTR-targeting+drug+development+using+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids.</a> Rare Diseases. 1 (1), e27112(2014).</li>
<li>Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rectal+forceps+biopsy+procedure+in+cystic+fibrosis%3A+technical+aspects+and+patients+perspective+for+clinical+trials+feasibility%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility.</a> BMC gastroenterology. 13, 91(2013).</li>
<li>Ommen, D. D. Z. -V., Vijftigschild, L. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+premature+termination+codon+suppression+by+read-through+agents+in+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids.</a> J Cyst Fibros. 15 (2), 158-162 (2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+correction+of+distinct+CFTR+folding+mutants+in+rectal+cystic+fibrosis+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids.</a> Eur Respir J. , (2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiator+synergy+in+rectal+organoids+carrying+S1251N%2C+G551D%2C+or+F508del+CFTR+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations.</a> J Cyst Fibros. , (2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+responses+to+CFTR-modulating+drugs+using+rectal+organoids+derived+from+subjects+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 8 (344), 344ra84(2016).</li>
<li>Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+electrical+measurements+with+the+Ussing+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber.</a> J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).</li>
<li>Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+a+model+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium.</a> Am J Physiol. 266 (4 Pt 1), L405-L413 (1994).</li>
<li>Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+sources+of+Wnt+regulate+intestinal+stem+cells+and+promote+formation+of+Paneth+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B22-adrenergic+receptor+agonists+activate+CFTR+in+organoids+and+subjects+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis.</a> Eur Respir J. 48 (3), 768-779 (2016).</li>
<li>Dekkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioassay+using+intestinal+organoids+to+measure+CFTR+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma.</a> J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).</li>
<li>Graeber, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+Current+Measurements+Detect+Activation+of+Mutant+CFTR+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+with+the+G551D+Mutation+Treated+with+Ivacaftor%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor.</a> Am J Respir Crit Care Med. 192 (10), 1252-1255 (2015).</li>
<li>Van Goor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ivacaftor+potentiation+of+multiple+CFTR+channels+with+gating+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%3A+Official+Journal+of+the+Eur+Cyst+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11 (3), 237-245 (2012).</li>
</ol>

Hans Clevers jest wynalazcą patentów na hodowlę organoidów i test obrzęku indukowanego forskoliną. Jeffrey M. Beekman jest wynalazcą patentu na test obrzęku indukowanego forskoliną. Sylvia F. Boj i Robert Vries są zatrudnieni przez Fundację Hubrecht Organoid Technology (HUB), która posiada wyłączną licencję na technologię organoidów. Poza tym autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj zapewniamy kompletny protokół wytwarzania, namnażania, zamrażania i rozmrażania ludzkich organoidów jelita grubego. Chociaż już jakiśczas temu opracowaliśmy hodowle ludzkich organoidów, czasami okazywało się trudno wprowadzić tę technologię w innych laboratoriach bez praktycznego szkolenia. Przewidujemy, że te protokoły zastąpią takie szkolenia.
Pożywka kondycjonowana Wnt-3A jest jednym z najważniejszych odczynników, aby odnieść sukces w ustanowieniu i utrzymaniu ...

CF jest spowodowany mutacjami w genie CFTR (transmembrane conductance regulator) mukowiscydozy, który koduje nabłonkowy kanał anionowy. Mukowiscydoza dotyka około 85 000 osób na całym świecie1. Zidentyfikowano ponad 2000 mutacji CFTR (<a href="http://www.genet.sickkids.on.ca">www.genet.sickkids.on.ca</a>). Ta różnorodność częściowo wyjaśnia szerokie spektrum obserwowanych fenotypów chorób (<a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a>)2,3. Sześć klas mutacji CFTR zdefiniowano na podstawie ich wpływu na ekspresję i funkcję białka CFTR: (I) brak syntezy, (II) upośledzony transport, (III) wadliwe bramkowanie kanałów, (IV) zmienione przewodnictwo, (V) obniżony poziom normalnie funkcjonującego CFTR i (VI) upośledzona stabilność powierzchni komórki4. Chociaż powszechne mutacje CFTR są dobrze zbadane, funkcja CFTR i związek ze statusem klinicznym pozostają słabo poznane na poziomie jednostki, szczególnie w przypadku dużej grupy rzadkich mutacji "sierocych" (<a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a>)1,3.
Ostatnio opracowano leki, które celują w białko CFTR w sposób specyficzny dla mutacji. Dwie klasy leków ukierunkowanych na białko CFTR są obecnie w użyciu klinicznym i mają różne sposoby działania. Wzmacniacze, takie jak VX-770, zwiększają otwarte prawdopodobieństwo wystąpienia zmutowanego CFTR zlokalizowanego wierzchołkowo i działają bezpośrednio po ich dodaniu do komórek5. Korektory, takie jak VX-809, przywracają transport nieprawidłowo sfałdowanego CFTR zlokalizowanego w retikulum endoplazmatycznym i wymagają wstępnej inkubacji z komórkami, zanim zaobserwuje się efekty6. Wzmacniacz CFTR, VX-770, został zarejestrowany dla pacjentów z mutacją G551D7,8, a także dla ośmiu innych mutacji bramkowania CFTR, w tym S1251N9; Łącznie mutacje te są nosicielami 5% wszystkich pacjentów z mukowiscydozą. Inne badania kliniczne wykazały, że VX-770 w połączeniu z korektorem VX-809 ma ograniczony, ale znaczący wpływ na czynność płuc i powoduje zmniejszenie częstości zaostrzeń u osób homozygotycznych pod względem mutacji F508del przenoszonych przez 45-50% pacjentów10,11.
Konwencjonalne badania kliniczne mające na celu zidentyfikowanie osób reagujących na leki u pozostałych 50% pacjentów z mukowiscydozą są kosztowne i czasochłonne oraz niewykonalne dla osób z niezwykle rzadkimi genotypami CFTR. Nowatorskie, opłacalne i spersonalizowane metody mają kluczowe znaczenie dla dopasowania rosnącej liczby modulatorów CFTR do osób będących nosicielami dowolnego rodzaju mutacji CFTR. Do tej pory włączenie do badania grup pacjentów z określonymi mutacjami CFTR opierało się na badaniach z wykorzystaniem transfekcji zmutowanego genu CFTR w heterologicznych układach komórkowych, a następnie na badaniach elektrofizjologicznych w komorach Usinga5,6,12. Ze względu na brak odpowiednich modeli zwierzęcych mukowiscydozy, do opracowania leków wykorzystano badania skuteczności leków w komórkach nabłonka oskrzeli różnicowanych powietrzem, cieczą i interfejsem, pochodzących z materiałów eksplantatów płuc mukowiscydozy13,14,15. Jednak ograniczona dostępność tkanek eksplantacyjnych płuc i inwazyjne procedury pozyskiwania komórek oskrzeli od osób bez schyłkowej fazy choroby utrudniają analizę rzadziej występujących mutacji CFTR i uniemożliwiają testowanie leków w spersonalizowany sposób. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, "łatwo dostępne" tkanki, takie jak organoidy jelita grubego, komórki dróg oddechowych nosa i komórki dróg oddechowych pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, są obecnie badane pod kątem spersonalizowanych terapii lekowych.
Poprzednio ustaliliśmy protokoły hodowli nabłonkowych komórek macierzystych z dowolnego narządu przewodu pokarmowego w formie organoidów 3D16,17. W przypadku ludzkiej okrężnicy/odbytnicy warunki hodowli obejmują określone czynniki wzrostu (nabłonkowy czynnik wzrostu (EGF), gastryna, Wnt-3A, R-spondyna 3 (Rspo3) i Noggin) w połączeniu z małymi cząsteczkami (nikotynamid, A83-01 i SB202190) w macierzy błony podstawnej. W tych warunkach pojedyncze komórki macierzyste lub małe fragmenty tkanek wyrastają w zamknięte, torbielowate, trójwymiarowe struktury utworzone przez silnie spolaryzowany nabłonek, którego podstawa jest skierowana na zewnątrz. Wszystkie typy komórek zwykle pojawiają się w swoich normalnych proporcjach i pozycjach. Organoidy mogą być namnażane przez długi czas poprzez cotygodniowe mechaniczne zakłócenia i ponowne powlekanie. Są one stabilne genetycznie i fenotypowo i mogą być przechowywane, co pozwala na długoterminową ekspansję i biobankowanie17. Są one podatne na wszystkie standardowe manipulacje biologiczno-genetyczne i techniki analityczne opracowane dla linii komórkowych 2D18.
Niedawno wykazaliśmy, że funkcję CFTR można łatwo zmierzyć w organoidach jelita grubego w teście na obrzęk wywołany forskoliną (FIS)19,20. Pod wpływem forskoliny (Fsk) lub, alternatywnie, toksyny, organoidy gwałtownie zwiększają poziom cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP), co z kolei powoduje otwarcie kanału CFTR19. Organoidy pochodzące od osób zdrowych lub od osób z mutacjami CFTR związanymi z funkcją resztkową będą następnie pęcznieć w wyniku transportu jonów i wody do światła organoidu, co jest odpowiednikiem biegunki wydzielniczej in vitro. Wcześniej wykazano, że odpowiedź FIS organoidów jelita grubego jest w pełni zależna od CFTR, na co wskazują organoidy pochodzące od osób bez CFTR oraz zastosowanie specyficznych farmakologicznych inhibitorów CFTR19. Duże zestawy danych specyficznych dla pacjenta można uzyskać w ciągu kilku tygodni po wykonaniu biopsji.
Dla szczegółowo opisanego tutaj testu FIS, organoidy są hodowane z biopsji doodbytniczej, które można uzyskać w każdym wieku i z ograniczonym dyskomfortem21. Organoidy są przenoszone co tydzień przez mechaniczne rozerwanie do pojedynczych krypt, które łatwo ponownie się zamykają i tworzą nowe organoidy. Do przeprowadzenia testu FIS, ~30-80 tych uszkodzonych małych organoidów jest platerowanych w każdym dołku 96-dołkowej płytki19. W dniu testu organoidy są barwione zielenią kalceinową, fluorescencyjnym barwnikiem przepuszczalnym dla komórek, który jest zatrzymywany w żywych komórkach, ułatwiając obrazowanie na żywo. Następnie dodaje się Fsk, który podnosi wewnątrzkomórkowy cAMP i tym samym aktywuje CFTR, w celu stymulacji obrzęku organoidów. Wzmacniacze, które działają na wierzchołkowy CFTR, są dodawane jednocześnie z forskoliną, podczas gdy korektory, które przywracają transport CFTR, są dodawane 24 godziny przed dodaniem Fsk. Pęcznienie organoidów określa się ilościowo za pomocą automatycznej analizy obrazu, która oblicza względny wzrost całkowitej powierzchni wszystkich obiektów fluorescencyjnych dla każdego punktu czasowego po dodaniu forskoliny.
3D organoidowe pęcznienie zapewnia zalety i wady w porównaniu z istniejącymi elektrofizjologicznymi odczytami CFTR w hodowanych komórkach dróg oddechowych 2D w komorach Ussing. Główną zaletą jest przepustowość testu pęcznienia. Komórki są hodowane i oznaczane przy użyciu jednego rodzaju pożywki hodowlanej, a doświadczony technik może hodować do 25 próbek organoidów tygodniowo, jednocześnie określając ilościowo około 1200 punktów danych tygodniowo w 12 próbkach pacjentów. Konwencjonalnie typujemy pojedynczy warunek eksperymentalny poprzez zduplikowane lub potrójne pomiary na płytce i powtarzamy takie pomiary w trzech niezależnych punktach czasowych inkubacji. W sumie mierzy się około 300-500 pojedynczych struktur organoidowych w każdym warunku eksperymentalnym, co prowadzi do bardzo precyzyjnych pomiarów funkcji CFTR przy ograniczonej zmienności technicznej. Ta precyzja pozwala nam jasno zdefiniować różnice w funkcji resztkowej i odpowiedzi na modulatory CFTR i pozwala nam łatwo wychwycić genetyczne efekty tła między pacjentami z identycznymi mutacjami CFTR19,22,23,24,25. Jakość danych można łatwo ocenić na podstawie obrazów mikroskopowych. Chociaż FIS jest w pełni zależny od CFTR, jest pośrednią miarą wyniku dla funkcji CFTR, a jego odczyt jest spowodowany sprzężeniem transportu jonów z transportem płynów. Kontrastuje to z bezpośrednimi pomiarami funkcji CFTR w komorach Ussing, które mierzą transnabłonkowe prądy jonowe26. Komory użytkowe umożliwiają selektywną stymulację przedziałów wierzchołkowych lub podstawno-bocznych (na co nie pozwala test organoidowy); poprzez przepuszczalnie błon podstawno-bocznych, wierzchołkowe wydzielanie anionów zależne od CFTR może być selektywnie mierzone27.

<table><tbody><tr><td>Zaawansowany Dulbecco' s Modyfikowana Pożywka Orły z Mieszanką Składników Odżywczych Szynki F-12 (Ad-DF) 500 ml&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy:&nbsp; Invitrogen</td><td>#12634</td><td>przechowywany w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo Fisher Naukowy:&nbsp; Invitrogen</td><td>#35050</td><td>przechowywany w temperaturze 4 stopni C</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Thermo Fisher Naukowy:&nbsp; Invitrogen</td><td># 15630-056</td><td>przechowywany w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td>przechowywany w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka hodowlana</td><td>Cellstar</td><td>#655180</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka hodowlana</td><td>Cellstar</td><td>#662160</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka hodowlana</td><td>Cellstar</td><td>#657160</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS)</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#14190-094</td><td>przechowywany w temperaturze 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane Orły Średnie&nbsp; (DMEM) 500 ml&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy:&nbsp; Invitrogen</td><td>#31966-021</td><td>Do produkcji kondycjonowanej pożywki Wnt-3A. Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>#SFBS LOT#11113</td><td>do produkcji pożywki kondycjonowanej Wnt-3A. Przechowywany w temperaturze -20 &deg; </td></tr><tr><td>Linia komórkowa CL Wnt3A</td><td>ATCC</td><td>#CRL-2647</td><td>Do produkcji pożywki kondycyjnej Wnt-3A.</td></tr><tr><td>Plazmidy TOP/FOP</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>#17-285</td><td>Do pomiaru aktywności Wnt</td></tr><tr><td>pTK-Renilla</td><td>Promega&nbsp;</td><td>#E2241</td><td>Do pomiaru aktywności Wnt</td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td><td>#CRL-1573</td><td>Do pomiaru aktywności Wnt</td></tr><tr><td>System testowy reporterowy z podwójnym lucyferazy</td><td>, Promega&nbsp;</td><td>#E1910</td><td>Do pomiaru aktywności Wnt</td></tr><tr><td>Zeocyna&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy:&nbsp; Invitrogen</td><td>#R250-01</td><td>Do wyboru linii komórkowej Wnt-3A</td></tr><tr><td>suplement B27&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy:&nbsp; Invitrogen</td><td>#17504-044</td><td>przechowywany w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A9165-5G</td><td>przechowywana w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#N0636</td><td>przechowywany w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Ludzki nabłonkowy czynnik wzrostu (hEGF)</td><td>PrepoTech</td><td>#AF-100-15</td><td>przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G9145</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Inhibitor receptora TGFb typu I (A83-01)&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>#2939</td><td>przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek (RhoKi)</td><td>Selleckchem</td><td>#S1049</td><td>przechowywany w temperaturze -20 &; C</td></tr><tr><td>p38 Inhibitor MAPK (p38i) (SB202190)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#S7067</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>#ant-pm-1</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Human Noggin (hNoggin)</td><td>PrepoTech</td><td>#120-10C</td><td>przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Ludzka R-spondyna 3 (hRspo-3)</td><td>R& D Systems</td><td>#3500-RS/CF</td><td>przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Vancomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#861987- 250mg</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & C</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#15710-049</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#431788</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>#354230</td><td>przechowywany w temperaturze -80 & deg; C</td></tr><tr><td>TryplE Express&nbsp;</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#12605-010</td><td>do trypsynizacji organoidów do zamrażania</td></tr><tr><td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#12648010</td><td>do zamrażania</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#C3100MP</td><td>przechowywany w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Forskolina</td><td>R& D Systems</td><td>#1099-50 mg</td><td>przechowywane w temperaturze -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Lumacaftor (VX-809)</td><td>Selleckchem</td><td>#s1565</td><td>przechowywany w temperaturze -80 &; C</td></tr><tr><td>Ivacaftor (VX-770)</td><td>Selleckchem</td><td>#s1144</td><td>przechowywany w temperaturze -80 & deg; C</td></tr><tr><td>Nazwa odczynników/Materiał</td><td>Solvent</strong</td><td>>Stężenie zapasów</td><td>Stężenie końcowe</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td></td><td>200 mM</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td>1 M</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td></td><td>10K U/ml 10K &mikro; g/ml</td><td>100 U/ml 100 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Zeocyny&nbsp;</td><td></td><td>100 mg/ml&nbsp;</td><td>125 i mikro; g/ml</td></tr><tr><td>B27 suplement&nbsp;</td><td></td><td>100x</td><td>1x</td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>MiliQ H2O</td><td>500 mM</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>DPBS</td><td>1 M</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Ludzki nabłonkowy czynnik wzrostu (hEGF)</td><td>DPBS 0,1% BSA</td><td>0,5 mg/ml</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Gastryna</td><td>DPBS</td><td>100 &mikro; M</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Inhibitor receptora TGFb typu I (A83-01)&nbsp;</td><td>DMSO</td><td>5 mM</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek (RhoKi)</td><td>DMSO</td><td>10 mM</td><td>10 &mikro; Inhibitor M</td></tr><tr><td>p38 MAPK (p38i) (SB202190)</td><td>DMSO</td><td>30 mM</td><td>10 &mikro; M</td></tr><tr><td>Primocin</td><td></td><td>50 mg/ml&nbsp;</td><td>100 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Ludzki Noggin (hNoggin)</td><td>DPBS 0,1%BSA</td><td>100 &mikro; g/ml</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Ludzka R-spondyna 3 (hRspo-3)</td><td></td><td>zmienia się w zależności od partii</td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>Wankomycyna</td><td></td><td>10 mg/ml</td><td>50 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td></td><td>10 mg/ml</td><td>50 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>MiliQ H2O</td><td>0,5 M</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Kalceina</td><td>DMSO</td><td>10 &mikro; g/ml</td><td>3,3 ng/ml</td></tr><tr><td>Forskolina</td><td>DMSO</td><td>10 mM</td><td>zmienna</td></tr><tr><td>Lumakaftor (VX-809)</td><td>DMSO</td><td>20 mM</td><td>zmienna</td></tr><tr><td>Ivacaftor (VX-770)</td><td>DMSO</td><td>20 mM</td><td>zmienna</td></tr></tbody></table>

obrzęk organoidów jelitowych wywołany forskoliną: test in vitro do oceny odpowiedzi na lek u pacjentów z mukowiscydozą

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Niedawno opracowane leki modulujące transbłonowy regulator przewodnictwa (CFTR) dla mukowiscydozy poprawiają ekspresję powierzchniową i/lub funkcję zmutowanego kanału CFTR u osób z mukowiscydozą (CF). Identyfikacja osób, które mogą odnieść korzyści z tych leków, jest trudna ze względu na dużą heterogeniczność mutacji CFTR, a także inne nieznane czynniki, które przyczyniają się do skuteczności poszczególnych leków. W tym miejscu opisujemy prosty i stosunkowo szybki test do pomiaru indywidualnej funkcji CFTR i odpowiedzi na modulatory CFTR in vitro. Trójwymiarowe (3D) organoidy nabłonkowe są hodowane z biopsji odbytnicy w standardowym podłożu organoidowym. Po ustaleniu, organoidy mogą zostać wykorzystane w biobankach do przyszłej analizy. Do testu 30-80 organoidów wysiewa się na 96-dołkowych płytkach w macierzy błony podstawnej, a następnie poddaje się działaniu leków. Dzień później organoidy są barwione zielenią kalceinową, a obrzęk wywołany forskoliną jest monitorowany za pomocą konfokalnej mikroskopii żywych komórek w temperaturze 37 °C. Obrzęk wywołany forskoliną jest w pełni zależny od CFTR i jest wystarczająco czuły i precyzyjny, aby umożliwić rozróżnienie między reakcjami na lek u osób z różnymi, a nawet identycznymi mutacjami CFTR. Reakcje na pęcznienie in vitro korelują z odpowiedzią kliniczną na leczenie. Test ten zapewnia opłacalne podejście do identyfikacji osób reagujących na leki, niezależnie od ich mutacji CFTR. Może również odegrać zasadniczą rolę w rozwoju przyszłych modulatorów CFTR.

Rysunek 1A przedstawia reprezentatywną świeżą izolację krypt osadzonych na BMM. Krypty pochodzą z biopsji jelita grubego pacjenta z CF. Zazwyczaj z każdej krypty generowany jest jeden organoid (Rysunek 1A-C). Ze względu na dysfunkcję CFTR większość organoidów jelita grubego w CF nie ma charakteru torbielowatego, lecz są one zwarte, z wypustkami i pączkowaniami (Rysunek 2A-2B). Jednakże niektóre hodowle or...

Ten protokół opisuje test do pomiaru funkcji CFTR i odpowiedzi modulatora CFTR w hodowanej tkance od osób z mukowiscydozą (CF). Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji pęcznieją w sposób napędzany przez cAMP, odpowiedź ta jest wadliwa (lub silnie zmniejszona) w organoidach CF i może zostać przywrócona przez ekspozycję na modulatory CFTR.

Obrzęk organoidów jelitowych wywołany forskoliną: test in vitro do oceny odpowiedzi na lek u pacjentów z mukowiscydozą

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena indywidualnej funkcji białka CFTR oraz skuteczności leczenia modulującego CFTR z wykorzystaniem testu pęcznienia indukowanego forskoliną (FIS), przeprowadzanego na organoidach jelitowych generowanych od pacjentów z mukowiscydozą. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mukowiscydozy. Co najważniejsze, pomaga ona w identyfikacji pacjentów, którzy mogą odnieść długoterminowe korzyści z obecnie dostępnych lub eksperymentalnych leków.Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania łatwo dostępnej tkanki do generowania organoidów od dowolnego pacjenta z CF, niezależnie od jego wieku. Zastosowania tej metody obejmują ortoterapię mukowiscydozy i odpowiadają na pilną potrzebę testowania skuteczności leków w sposób kosztowo efektywny i zindywidualizowany. Procedurę zaprezentują Marvin Statia z Hubrecht Organoid Technology oraz Annelot Vonk z grupy Jeffrey’ego Beekmana.Aby uzyskać optymalne wyniki testu obrzęku indukowanego forskoliną, niezbędne jest użycie hodowli zawierającej duże organoidy z licznymi wypustkami. Po zidentyfikowaniu takiej hodowli, należy opisać jedną probówkę stożkową o pojemności 15 ml nazwą pr

forskolin-induced-swelling-intestinal-organoids-an-vitro-assay-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tutaj opisany jest protokół zbierania, utrzymywania i leczenia organoidów jelita cienkiego myszy z wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP) i Listeria monocytogenes, a także nacisk na ekspresję genów i właściwe techniki normalizacji białka.

Hodowla ex vivo i stymulacja receptorów rozpoznawania wzorców organoidów jelitowych myszy

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Tutaj opisujemy metodę generowania trójwymiarowych kultur sferoidalnych ludzkich komórek nabłonka nosa. Sferoidy są następnie stymulowane do napędzania wydzielania jonów i płynów zależnych od cyscydozy Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), określając ilościowo zmianę wielkości sferoidalnego światła jako wskaźnik zastępczy dla funkcji CFTR.

Generowanie sferoid ludzkich komórek nabłonka nosa do zindywidualizowanego badania transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy

Szczegółowy protokół jest tutaj przedstawiony w celu opisania modelu organoidowego in vitro z ludzkich komórek nabłonka nosa. Protokół posiada opcje pomiarów wymagających standardowego sprzętu laboratoryjnego, z dodatkowymi możliwościami dla specjalistycznego sprzętu i oprogramowania.

Hodowla i obrazowanie ludzkich organoidów nabłonkowych nosa

Ten protokół opisuje metodę badania elektrogenicznych białek błonowych poprzez pomiar zmian potencjału błonowego. Test ten stanowi platformę do funkcjonalnego odczytu wielu kanałów jonowych ulegających endogenicznej ekspresji w liniach komórkowych nabłonka.

Oparty na fluorescencji test potencjału błonowego do wysokoprzepustowego badania funkcjonalnego dwóch endogennych kanałów jonowych w dwóch nabłonkowych liniach komórkowych

Tutaj prezentujemy protokół opisujący hodowlę organoidów jelitowych psów w dwukomorowym, przepuszczalnym systemie wsparcia. Opisano wysiewanie organoidów w przepuszczalnych podporach, utrzymanie monowarstwy i późniejsze eksperymenty z przepuszczalnością leków.

Organoidy jelitowe psów w dwukomorowym przepuszczalnym systemie nośnym

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

Ten protokół opisuje analizę morfologii organoidów odbytniczych (ROMA), nowatorski test diagnostyczny mukowiscydozy (CF). Cechy morfologiczne, a mianowicie okrągłość (wskaźnik kolistości, CI) i obecność światła (współczynnik natężenia, IR), są miarą funkcji CFTR. Analiza 189 osób wykazała doskonałe rozróżnienie między mukowiscydozą a bez mukowiscydozy.

Analiza morfologii organoidów odbytniczych (ROMA): test diagnostyczny w mukowiscydozie

Współhodowle organoidów i fibroblastów dostarczają modelu do badania niszy komórek macierzystych in vivo. W tym miejscu opisano protokół dla kokultur organoidów i fibroblastów przełyku. Dodatkowo obrazowanie całego mocowania służy do wizualizacji interakcji fibroblast-organoid.

Charakterystyka funkcjonalna i wizualizacja fibroblastów przełyku przy użyciu kokultur organoidowych

Tutaj prezentujemy protokół do generowania organoidów jelitowych szczurów i używania ich w kilku dalszych zastosowaniach. Szczury są często preferowanym modelem przedklinicznym, a solidny układ organoidów jelitowych wypełnia zapotrzebowanie na system in vitro towarzyszący badaniom in vivo.

Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Poznaj metodę obrzęku wywołanego forskoliną w organoidach jelitowych pacjentów z mukowiscydozą. Ta technika umożliwia ocenę funkcji CFTR i skuteczności modulatorów w podejściu spersonalizowanym.

Obrzęk organoidów jelitowych wywołany forskoliną: test in vitro do oceny odpowiedzi na lek u pacjentów z mukowiscydozą

Przeglądaj więcej filmów