Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
24 stycznia 2017
Mitochondria mogą wykorzystywać potencjał elektrochemiczny w swojej wewnętrznej błonie (ΔΨm) do sekwestracji wapnia (Ca2+), co pozwala im kształtować cytozolową sygnalizację Ca2+ w komórce. Opisano metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca2+ i ΔΨm w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej.
Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie prostej metody jednoczesnego pomiaru mitochondrialnego wychwytu wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mitochondriów, takie jak to, w jaki sposób mitochondria działają jako lokalne magazyny wapnia, aby ściśle regulować wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia. Główną zaletą tej techniki jest to, że zarówno mitochondrialny wapń, jak i potencjał błony mitochondrialnej mogą być specyficznie mierzone jednocześnie w żywych komórkach bez konieczności manipulacji genetycznej.
Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat regulacji wapnia w patologii chorób mitochondrialnych, może być również wykorzystana do badania innych nowszych stanów zwyrodnieniowych, w których regulacja wapnia w moczu ma kluczowe znaczenie. W tej procedurze hoduj komórki na dziesięciocentymetrowych szalkach do hodowli komórkowych lub kolbach o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych w pożywkach hodowlanych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Aby zebrać komórki, usuń pożywkę przez aspirację i umyj komórki pięcioma mililitrami PBS.
Następnie usuń PBS przez aspirację. Następnie dodaj 1,5 mililitra trypsyny EDTA i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 2 minuty. Następnie delikatnie postukaj w naczynie, aby usunąć komórki.
Zawieś je ponownie w pięciu mililitrach pożywki hodowlanej. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru. Dzień przed obrazowaniem konfokalnym umieść komórki w odległości od 60 do 70 procent zbiegu w szalkach lub komorowych szkiełkach nakrywkowych.
Następnie inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić komórkom przyczepienie się i regenerację. W tej procedurze przygotuj roztwór do barwienia zapisów z TMRM, Fluo 4 AM i środkiem powierzchniowo czynnym. Usuń pożywkę hodowlaną i umyj komórki 100 mikrolitrami PBS.
Następnie usuń PBS i inkubuj komórki w 100 mikrolitrach roztworu do barwienia rekordów przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń roztwór do barwienia zapisów i umyj komórki w 100 mikrolitrach bezwapniowego HBSS, aby usunąć nadmiar Fluo 4 AM i TMRM. Następnie przygotuj wewnątrzkomórkowy roztwór do wyobrażania sobie z digitoniną, TMRM i thapsigarginą.
Następnie usuń bezwapniowy HPSS i dodaj 300 mikrolitrów roztworu do obrazowania IM do komórek. Pozostaw komórki do zrównoważenia w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut przed obrazowaniem z dodatkami chlorku wapnia. Użyj niskiej mocy lasera wynoszącej około 5 procent, aby zminimalizować wszelkie uszkodzenia ogniw spowodowane przez foto.
Użyj ustawienia laserów mikroskopowych do widm wzbudzenia i emisji TMRM i Fluo 4 AM. Użyj niskiej mocy lasera wynoszącej około pięciu procent z wysokim wzmocnieniem, aby zminimalizować fotouszkodzenia ogniw. Następnie ustaw mikroskop tak, aby skanował obrazy co dwadzieścia pięć sekund. Skanuj komórki przez dziesięć minut, aby ustalić odczyty linii podstawowej dla sygnałów TMRM i Fluo 4.
Następnie wstrzymaj skanowanie obrazu i dodaj 3 mikrolitry 40-milimolowego roztworu podstawowego chlorku wapnia bezpośrednio do komórek w 300 mikrolitrach roztworu do obrazowania IM. Delikatnie wymieszaj pipetą. Podczas dodawania roztworu wapnia do komórek należy uważać, aby nie przesuwać naczynia na stoliku mikroskopu.
Kontynuuj skanowanie obrazu przez około cztery minuty. Następnie powtarzaj dodawanie chlorku wapnia co cztery minuty, aż do osiągnięcia pożądanych sygnałów TMRM lub Fluo 4, zwykle około ośmiu do dziesięciu dodatków. Następnie dodaj rozcieńczenie od 1 do 100 jednego milimolowego FCCP bezpośrednio do komórek, aby rozproszyć wewnętrzny potencjał błonowy.
Następnie obrazuj komórki przez kolejne pięć minut, zanim eksperyment zostanie zakończony. Po zakończeniu obrazowania określ intensywność sygnałów Fluo 4 i TMRM za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Aby to zrobić, otwórz obraz, kliknij narzędzie do zaznaczania i wybierz interesujący Cię obszar zawierający mitochondria.
Wiele obszarów zainteresowania można wybrać do pomiaru, otwierając Analizę, Narzędzia, Menedżer zwrotu z inwestycji. Kliknij przycisk Dodaj, aby uwzględnić wybrany zwrot z inwestycji dla pomiaru intensywności. Powtarzaj poprzednie kroki, aż wszystkie ROI zostaną dodane do menedżera ROI.
Zmierz średnią intensywność fluorescencyjną sygnałów TMRM i Fluo 4 dla każdego obszaru zainteresowania, wybierając funkcję bardziej wielomiarową. Upewnij się, że opcja Zmierz wszystkie plasterki jest zaznaczona, a opcja Jeden wiersz na plasterek nie jest zaznaczona. Następnie kliknij przycisk OK, aby uzyskać tabelę średniej intensywności fluorescencji sygnałów TMRM i Fluo 4 dla każdego zwrotu z inwestycji w każdym punkcie czasowym.
Następnie połącz dane, aby obliczyć średnią intensywność i odchylenie standardowe dla sygnałów TMRM i Fluo 4. W tym eksperymencie komórki 143B zostały wstępnie załadowane Fluo 4 AM i TMRM przed przenikaniem digitoniny. Po każdym dodaniu chlorku wapnia sygnał TMRM zmniejsza się, ponieważ napływ jonów wapnia do mitochondriów rozprasza potencjał błony mitochondrialnej.
Mały potencjał błonowy jest widoczny po przejściu przepuszczalności, ponieważ dodanie 10 mikromolowych FCCP nadal powoduje załamanie potencjału błonowego. Tutaj stężenie wapnia w mitochondriach, wskazane sygnałem Fluo 4, zaczyna rosnąć po drugim dodaniu chlorku wapnia, gdy wolny wapń w pożywce osiągnie 0,32 mikromola. Każdy kolejny dodatek chlorku wapnia powodował postępujący wzrost mitochondrialnego wapnia.
Pokazano tutaj obrazy przedstawiające równoczesne pomiary potencjału błonowego w mitochondrialnym wapniu. Sygnał czerwony oznacza TMRM, a sygnał zielony oznacza Fluo 4. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około dwie godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak jednocześnie mierzyć poziom wapnia w mitochondriach i potencjał błony mitochondrialnej pod mikroskopią konfokalną przy użyciu dodatku egzogennego wapnia do przepuszczalnych komórek. Nie zapominaj, że praca z FCCP i digitoniną może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę pomiaru poboru wapnia przez mitochondria oraz potencjału błonowego w żywych komórkach z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej. Technika ta pozwala badaczom badać, w jaki sposób mitochondria regulują wewnątrzkomórkowe stężenia wapnia bez konieczności manipulacji genetycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad mitochondriami
Wprowadzenie
- Mitochondria odgrywają kluczową rolę w sygnalizacji wapniowej.
- Zrozumienie funkcji mitochondriów jest istotne dla badania różnych jednostek chorobowych.
- Regulacja poziomu wapnia jest niezbędna dla zdrowia komórkowego.
- Obecne metody często wymagają manipulacji genetycznych, co ogranicza ich zastosowanie.
Cel badania
- Zapewnienie prostego sposobu pomiaru funkcji mitochondriów.
- Zbadanie roli mitochondriów jako lokalnych magazynów wapnia.
- Ułatwienie badań nad chorobami mitochondrialnymi i innymi schorzeniami degeneracyjnymi.
Zastosowane metody
- Komórki hoduje się w odpowiednich pożywkach w temperaturze 37°C.
- Komórki są zbierane i płukane w PBS.
- Do pomiaru poboru wapnia i potencjału błonowego wykorzystuje się barwniki fluorescencyjne.
- Do jednoczesnych pomiarów stosuje się mikroskopię konfokalną.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia monitorowanie dynamiki wapnia w mitochondriach w czasie rzeczywistym.
- Osiągnięto jednoczesny pomiar stężenia wapnia oraz potencjału błonowego.
- Technika ta może dostarczyć cennych informacji na temat patologii chorób mitochondrialnych.
- Można ją zastosować do badania innych stanów związanych z regulacją wapnia.
Wnioski
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie funkcji mitochondriów w żywych komórkach.
- Stanowi ona narzędzie do badania roli mitochondriów w zdrowiu i chorobie.
- Podejście to jest wszechstronne i znajduje zastosowanie w różnorodnych badaniach z zakresu biologii komórki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia bezpośredni pomiar dynamiki wapnia mitochondrialnego i potencjału błonowego w żywych komórkach, dostarczając kluczowych danych do walidacji punktów uchwytu w szlakach dysfunkcji mitochondriów. Poprzez kwantyfikację indukowanego wapniem przejścia przepuszczalności oraz utraty potencjału błonowego, pozwala ona na mechanistyczne zmniejszenie ryzyka w odniesieniu do hipotez terapeutycznych związanych z niewydolnością bioenergetyczną. Równoczesny odczyt zwiększa pewność prognostyczną wczesnej fazy odkryć, łącząc strumień wapnia ze stanem zdrowia mitochondriów bez konieczności manipulacji genetycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne dotyczące gospodarki wapniowej mitochondriów jako regulatora homeostazy wapnia w komórkach.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów mitochondrialnych w żywych komórkach przy użyciu odczytów fluorescencyjnych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfela związków poprzez identyfikację substancji modulujących wapniowo-zależny przejście permeability.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowanie permeabilizowanych komórek z Fluo-4 AM i TMRM do ilościowego, jednoczesnego wykrywania poboru wapnia i potencjału błonowego.
- Powtarzalność: Wykorzystanie sekwencyjnych dodatków chlorku wapnia do generowania krzywych dawka-odpowiedź w celu wyznaczenia progu przejścia przepuszczalności.
- Skalowalność: Kompatybilność z platformami mikroskopii konfokalnej w celu adaptacji do wielodołkowych płytek i analizy intensywności w oparciu o ROI.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje mitochondrialne przeciążenie wapniem, istotne w procesach neurodegeneracji i uszkodzeń niedokrwiennych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy pomiary gwałtownych przepływów wapnia z chroniczną dysfunkcją w przedklinicznych modelach chorób mitochondrialnych.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Dostarcza podstaw do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o pojemność retencyjną wapnia i stabilność potencjału błonowego.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od oddziaływania na cel po walidację funkcjonalną, w szczególności w przypadku szlaków obejmujących regulację wapnia w mitochondriach oraz stres oksydacyjny.
- Biologia odkrywcza: Badanie wpływu perturbacji na buforowanie wapnia w mitochondriach oraz sprzęganie potencjału błonowego.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych odczytów fluorescencyjnych, umożliwiających porównanie wpływu związków na depolaryzację indukowaną wapniem.
- Analityka: Zapewnia dane dotyczące średniej intensywności i odchylenia standardowego dla sygnałów Fluo-4 oraz TMRM w poszczególnych punktach czasowych i ROI.
- Badania translacyjne: Łączy ostre zdarzenia przejścia przepuszczalności z trwałym upośledzeniem bioenergetycznym w modelach chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalną platformę analityczną dla farmakologii bezpieczeństwa mitochondrialnego i ograniczania ryzyka związanego z celami terapeutycznymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez bezpośrednie powiązanie napływu wapnia z rozproszeniem potencjału błonowego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiar dzięki zastosowaniu pary barwników ratiometrycznych i sekwencyjnego wyzwania wapniowego.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez wczesne identyfikowanie wad mitochondrialnych na etapie optymalizacji wiodących związków.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w oparciu o zdolność do retencji wapnia oraz podatność na przejście przepuszczalności.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie obrazowania żywych komórek, wprowadzania barwników oraz protokołów permeabilizacji.
- Metoda jest zależna od mikroskopii konfokalnej z odpowiednimi ustawieniami lasera dla wzbudzenia/emisji TMRM oraz Fluo-4.
- Konieczna jest standaryzacja przygotowania bezwapniowego HBSS oraz roztworu do obrazowania wewnątrzkomórkowego pomiędzy zespołami.
- Wymaga rozważenia adaptacji metody dla różnych typów komórek i gęstości mitochondriów.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak ryzyko fototoksyczności wynikające z ekspozycji na laser oraz wyciek barwnika po permeabilizacji.
