Name: Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnego pomiaru wapnia mitochondrialnego i potencjału błony w żywych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej. Technika ta pozwala badać dynamikę wapnia bez manipulacji genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Kirstin Elgass i dr Sarah Creed z Monash Micro Imaging za pomoc techniczną, a także Wellcome Trust i Radzie Badań Medycznych UK za wsparcie finansowe. MMcK jest wspierany przez Australian Research Council Future Fellowship Scheme (FT120100459), William Buckland Foundation, The Australian Mitochondrial Disease Foundation (AMDF), The Hudson Institute of Medical Research oraz Monash University. Prace te były wspierane przez Program Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej Rządu Wiktorii.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Hodować komórki na 10 cm szalkach do hodowli komórkowych lub 75 cm2 kolbach w pożywkach hodowlanych [10 ml Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) uzupełnione 5% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1x penicylina/streptomycyna (p/s)] w temperaturze 37 °C/5% CO2.</li>
	<li>Aby pobrać komórki, należy usunąć pożywkę przez aspirację, a następnie przemyć 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (1x PBS). Usunąć 1x PBS przez aspirację, a następnie dodać 1,5 ml 0,25% (m/v) trypsyny/0,25% (w/v) kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 2 min. Delikatnie postukać w naczynie lub kolbę, aby usunąć komórki, a następnie ponownie zawiesić w 5 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Policz komórki, dodając 12 μl zawieszonych komórek do hemocytometru.</li>
	<li>Komórki płytkowe w naczyniach lub komorowych szkiełkach nakrywkowych do obrazowania konfokalnego. 
	UWAGA: Będą one miały odpowiednie plastikowe lub szklane dno, które zostało zaprojektowane do użytku z odwróconymi mikroskopami.</li>
	<li>Płytki komórkowej tak, aby w dniu obrazowania osiągano ~80% zbieżności. Na przykład około 2 x 104 143B komórek kostniakomięsaka można umieścić w jednym dołku 8-dołkowego szkiełka na dzień przed obrazowaniem.</li>
	<li>Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO2 , aby umożliwić komórkom przyczepienie się i regenerację.</li>
</ol>
2. do obrazowania TMRM i Fluo-4
<ol>
	<li>Przygotować roztwór zapisowy (RS) zawierający 156 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mMMgSO4, 1,25 mM KH2PO4, 10 mM D-glukozy, 2 mM CaCl2 i 10 mM HEPES pH 7,35. Przechowywać RS w porcjach w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować pożywkę wewnątrzkomórkową (IM) zawierającą 6 mM NaCl, 130 mM KCl, 7,8 mM MgCl2, 1 mM KH2PO4, 0,4 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 10 mM HEDTA, 2 mM jabłczan, 2 mM glutaminianu, 2 mM ADP i 20 mM HEPES pH 7,1. 200 mM roztwory podstawowe jabłczanu, glutaminianu i ADP można przygotować oddzielnie, i przechowywane w temperaturze -20 °C. Zapasy te można dodać do IM tuż przed użyciem.</li>
	<li>Wolny od Ca2+ buforowany roztwór soli Hanka (HBSS) można uzyskać wstępnie przygotowany od dostawców komercyjnych. Dodać kwas bis(β-aminoetylowy) glikolu etylenowego-N,N',N'-tetraoctowego (EGTA) do końcowego stężenia 500 μM.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 10 mM tetrametylorodaminy, estru metylowego, nadchloranu (TMRM) w 100% metanolu. Z tego wywaru zrobić zapas roboczy o wielkości 2 μM w destylowanymH2O.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 10 mM werapamilu w 100% etanolu.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 1 mg/ml (w/v) estru acetoksymetylowego fluo-4 (Fluo-4, AM) w dimetylosulfotlenku (DMSO). 
	UWAGA: Fluo-4, AM jest wskaźnikiem wapnia, który wykazuje zwiększoną fluorescencję po związaniu Ca2+. Fluo-4 jest analogiem fluo-3, w którym dwa podstawniki chloru są zastąpione fluorami. Powoduje to zwiększone wzbudzenie fluorescencji przy 488 nm i wyższe poziomy sygnału fluorescencji. Grupa estrów AM powoduje powstanie nienaładowanej cząsteczki Fluo-4, która może przenikać przez błony komórkowe. Po wejściu do komórki ester AM jest rozszczepiany przez niespecyficzne esterazy, w wyniku czego powstaje naładowana forma Fluo-4, która jest uwięziona w komórce.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 1 mM cyjanku karbonylu p-trifluorometoksyfenylohydrazonu (FCCP) w 100% etanolu.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 25 mg/ml (w/v) digitoniny w destylowanymH2O.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 100 μM thapsigargin w DMSO.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 40 mM chlorku wapnia (CaCl2) w destylowanymH2O.</li>
</ol>
3. Barwienie komórek za pomocą TMRM i Fluo-4, AM
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór barwiący RS z 20 nM TMRM, 5 μg/ml (w/v) Fluo-4, AM i 0,005% środkiem powierzchniowo czynnym, takim jak Pluronic F-127 w RS. 
	UWAGA: Ten środek powierzchniowo czynny jest niejonowym poliolem, który ułatwia solubilizację Fluo-4, AM. Uwaga: 10 μM Werapamilu można również dodać w celu zahamowania eksportu TMRM przez wielolekowy transporter błony komórkowej, jeśli ulega on ekspresji w analizowanym typie komórki.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek za pomocą pipety i przemyć 100 μl 1x PBS.</li>
	<li>Usunąć 1x PBS za pomocą pipety i inkubować komórki w 250 μl roztworu barwiącego RS przez 45 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Gdy Fluo-4, AM dostanie się do komórki, ester AM jest rozszczepiany przez esterazy komórkowe. Inkubacja w temperaturze pokojowej hamuje aktywność esterazy, umożliwiając Fluo-4, AM wejście do mitochondriów.</li>
	<li>Usunąć roztwór barwiący RS za pomocą pipety i umyć komórki w 100 μl Ca2+ wolnego od HBSS, aby usunąć nadmiar Fluo-4, AM i TMRM.</li>
	<li>Przygotować roztwór do obrazowania domięśniowego z 25 μg/ml (w/v) digitoniny, 200 nM TMRM i 1 μM thapsigarginą w IM. 
	UWAGA: Może być konieczne dostosowanie stężenia digitoniny, aby zapewnić, że nie dojdzie do przepuszczalności wewnętrznej błony mitochondrialnej. Można to określić empirycznie, oceniając intensywność sygnału TMRM przy różnych stężeniach digitoniny.</li>
	<li>Usunąć pipetą HBSS wolny od Ca2+ i dodać 300 μl roztworu do obrazowania IM do komórek. Pozostaw komórki do zrównoważenia w temperaturze pokojowej na 10 minut. Komórki są teraz gotowe do obrazowania z dodatkami CaCl2.</li>
</ol>
4. Obrazowanie komórek
<ol>
	<li>Umieścić naczynie lub szkiełko nakrywkowe z komórkami w roztworze do obrazowania IM na odwróconym laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym.</li>
	<li>Użyj ustawień na laserach mikroskopowych dla widm wzbudzenia i emisji TMRM i Fluo-4. Na przykład użyj linii laserowych He-Ne i argonu o długości fali 543 nm, aby wzbudzić odpowiednio TMRM i Fluo-4. Użyj niskiej mocy lasera wynoszącej około 5%, aby zminimalizować wszelkie fotouszkodzenia komórek.</li>
	<li>Ustaw mikroskop tak, aby skanował obrazy co 25 sekund. Skanuj komórki przez 10 minut, aby ustalić odczyty linii bazowej dla sygnałów TMRM i Fluo-4. 
	UWAGA: Sygnał Fluo-4 może być słaby lub niewykrywalny przy spoczynkowych stężeniach wapnia.</li>
	<li>Dodać 3 μl 40 mM roztworu podstawowego CaCl2 bezpośrednio do komórek w 300 μl roztworu do obrazowania IM (rozcieńczenie 1:100) i delikatnie wymieszać pipetą. W razie potrzeby wstrzymaj skanowanie obrazu podczas dodawania i mieszania CaCl2. 
	UWAGA: Końcowe stężenie wolnych jonów Ca2+ [Ca2+] w roztworze do obrazowania IM można obliczyć za pomocą oprogramowania takiego jak Maxchelator WEBMAXC EXTENDED (<a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a>) lub Chelator11. Szczegółowy opis sposobu obliczania końcowego stężenia wolnych jonów Ca2+ [Ca2+] opisano w sekcji 6 poniżej.</li>
	<li>Kontynuuj skanowanie obrazu przez około 4 minuty, a następnie powtarzaj dodawanie CaCl2 co 4 minuty, aż do osiągnięcia pożądanych sygnałów TMRM lub Fluo-4, zwykle około 8 do 10 dodatków.</li>
	<li>Za pomocą pipety dodać rozcieńczenie 1:100 1 mM FCCP (końcowe stężenie 10 μM) bezpośrednio do komórek, aby rozproszyć ΔΨm. Obrazuj komórki przez kolejne 5 minut. Eksperyment został już zakończony.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Po zakończeniu obrazowania określ intensywność sygnałów Fluo-4 i TMRM za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, na przykład oprogramowania ImageJ z wtyczką Bio-Formats (pobierz http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/ "bioformats_package.jar" i zapisz go w folderze "C:\Program Files\ImageJ\plugins").</li>
	<li>Otwórz plik obrazowania (na przykład plik .oif) w ImageJ. Kliknij narzędzie do zaznaczania i wybierz obszar zainteresowania (ROI), który zawiera mitochondria. Użyj początkowego sygnału TMRM, aby wybrać zwrot z inwestycji.</li>
	<li>Otwórz "Analyze>Tools>ROI Manager", kliknij "Dodaj", aby dołączyć wybrany ROI do pomiaru intensywności. Na jednym obrazie można wybrać wiele ROI do pomiaru. Powtarzaj poprzednie kroki, aż wszystkie ROI zostaną dodane do Menedżera ROI.</li>
	<li>Kliknij "Więcej>Multi Measure", upewnij się, że wybrana jest opcja "Zmierz wszystkie plasterki" i że opcja "Jeden wiersz na plasterek" jest odznaczona, a następnie kliknij "OK", aby uzyskać tabelę średniej intensywności fluorescencji sygnałów TMRM i Fluo-4 dla każdego ROI w każdym punkcie czasowym.</li>
	<li>Wykorzystaj dane ze wszystkich ROI, aby obliczyć średnią intensywność i odchylenie standardowe dla sygnałów TMRM i Fluo-4.</li>
</ol>
6. Obliczanie końcowego stężenia wolnych jonów Ca2+ [Ca2+]
<ol>
	<li>Stężenie wolnych jonówCa2+ [Ca2+] w roztworze do obrazowania IM można określić za pomocą oprogramowania takiego jak Maxchelator WEBMAXC EXTENDED (<a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a>) lub Chelator11. Na przykład ustaw zmienne w WEBMAXC EXTENDED w następujący sposób: Temperatura = 24 °C, pH = 7,1, Siła jonowa = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, Ca2+ = 0,0004 M i Mg2+ = 0,0078 M. Daje to końcowe stężenie wolnych jonów Ca2+ [Ca2+] 62 nM. Należy pamiętać, że programy te nie mogą uwzględniać wszystkich zmiennych, takich jak czystość odczynnika, dokładność pomiarów i oznaczanie pH. Najdokładniejszą metodą oznaczania stężenia wolnego Ca2+ jest użycie skalibrowanej elektrody selektywnej Ca2+.</li>
</ol>

<ol><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+hub+of+cellular+Ca2%2B+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling.</a> Physiology. 23, 84-94 (2008).</li>
<li>Jacobson, J., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+mitochondria+and+cellular+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling.</a> Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).</li>
<li>Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+as+a+mediator+of+cell+energy+demand+and+a+trigger+to+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).</li>
<li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+calcium-dependent+neuronal+death+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease.</a> Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).</li>
<li>Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Ca2%2B+homeostasis+during+Ca2%2B+influx+and+Ca2%2B+release+in+gastric+myocytes+from+Bufo+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus.</a> J. Physiol. 522, 375-390 (2000).</li>
<li>Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+of+cytosolic+calcium+oscillations+in+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria.</a> Cell. 82, 415-424 (1995).</li>
<li>Davidson, S. M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22057570">Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).</li>
<li>Pozzan, T., Rudolf, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19100709">Measurements of mitochondrial calcium in vivo.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).</li>
<li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2%2B+revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li>
<li>Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+respond+to+Ca2%2B+already+in+the+submicromolar+range%3A+correlation+with+redox+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state.</a> Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).</li>
<li>Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHELATOR%3A+an+improved+method+for+computing+metal+ion+concentrations+in+physiological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions.</a> BioTechniques. 12, 870-879 (1992).</li>
<li>McKenzie, M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+Cellular+Bioenergetics+Causes+Mitochondrial+Calcium+Handling+Defects+in+MT-ND5+Mutant+Cybrids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids.</a> PLoS One. 11, e0154371(2016).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cellular+indicators+are+extruded+by+the+multidrug+resistance+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein.</a> J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).</li>
<li>Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. 2nd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cyclophilin+D+and+the+mitochondrial+permeability+transition+enhances+beta-cell+survival+and+prevents+diabetes+in+Pdx1+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).</li>
<li>Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+permeability+transition+pore+is+a+potential+drug+target+for+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wapń odgrywa kluczową rolę w wielu procesach komórkowych, w tym w skurczach mięśni, sygnalizacji neuronalnej i proliferacji komórek13. Wzrost stężenia wapnia w komórkach jest często związany z zapotrzebowaniem na energię, przy czym wapń jest w stanie bezpośrednio stymulować mitochondrialną fosforylację oksydacyjną w celu podniesienia generacjiATP 3. Dlatego tak ważne jest, abyśmy mieli możliwość skutecznego monitorowania akumulacji wapnia w mitochondriach i mogli porównać, ...

Mitochondria odgrywają ważną rolę w regulacji wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+, działając jako lokalne Ca2+1. Ca2+ dostaje się do mitochondriów za pośrednictwem uniportera Ca2+, proces napędzany przez gradient elektrochemiczny, który występuje w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej (ΔΨm)2. Po wejściu do macierzy mitochondrialnej Ca2 + może aktywować fosforylację oksydacyjną poprzez stymulację trzech dehydrogenaz ograniczających szybkość cyklu kwasu cytrynowego3. Stymulacja ta utrzymuje ΔΨm, który jest tymczasowo rozpraszany, gdy dodatnie jony wapnia przechodzą przez wewnętrzną błonę mitochondriów do macierzy mitochondrialnej. Jeśli stężenie Ca2+ w mitochondriach stanie się bardzo wysokie, można zainicjować przejście przepuszczalności mitochondriów, co spowoduje rozproszenie ΔΨm, zaprzestanie fosforylacji oksydacyjnej i indukcję szlaków sygnalizacji śmierci komórki4.
Ważna rola, jaką mitochondria odgrywają w przestrzennym buforowaniu wapnia komórkowego, sprawia, że dokładne monitorowanie mitochondrialnego wapnia ma kluczowe znaczenie. Opracowano różne metody monitorowania mitochondrialnego wapnia, w tym stosowanie barwników na bazie rodaminy. Jeden z takich barwników, Rhod-2, AM, jest dość skuteczny w partycjonowaniu do mitochondriów w celu zmierzenia mitochondrialnych poziomów Ca2+ 5,6. Należy jednak zachować ostrożność, ponieważ część barwnika gromadzi się w innych organellach, takich jak liposomy, lub pozostaje w cytozolu komórkowym. Niemniej jednak, dalsze analizy mogą być wykorzystane do odróżnienia tych sygnałów od tych z mitochondriów7.
Inna technika monitorowania mitochondrialnego wapnia wykorzystuje fluorescencyjne konstrukty reporterowe8. Zaletą tych genetycznie kodowanych sond jest to, że mogą być one specyficznie ukierunkowane na mitochondria przy użyciu endogennych N-końcowych peptydów, na przykład N-końcowego sygnału docelowego ludzkiej podjednostki COX VIII. System ten został wykorzystany do wygenerowania ukierunkowanej na mitochondria sondy aequorin, która okazała się niezwykle przydatna do badania mitochondrialnej sygnalizacji wapnia9. Główną wadą tych genetycznie kodowanych sond jest to, że muszą one zostać wprowadzone do komórek przez przejściową ekspresję (co nie jest wykonalne dla niektórych typów komórek i może dawać zmienne wyniki) lub poprzez tworzenie stabilnych systemów ekspresji (co jest czasochłonne).
Aby obejść powyższe problemy, opracowaliśmy nowy protokół do jednoczesnego pomiaru mitochondrialnych Ca2+ i ΔΨm. Protokół ten opiera się na wcześniej opisanej metodzie, która dodaje egzogenny wapń do komórek przepuszczalnych10. Nasz protokół ma trzy główne zalety w porównaniu z innymi metodami: po pierwsze, używamy Fluo-4, AM i TMRM do monitorowania mitochondriów Ca2+ i ΔΨm, dwóch barwników, które mają bardzo różne właściwości spektralne; po drugie, komórki są przepuszczalne, tak że sygnał Fluo-4 wykrywa tylko mitochondrialny Ca2 +, a nie Ca2 + zlokalizowany w innych organellach lub cytozolu komórki; i po trzecie, zastosowanie Fluo-4 do wykrywania mitochondrialnego Ca2 + pozwala na szybkie i proste barwienie komórek, negując wszelkie problemy z transfekcją lub transformacją komórek, które występują przy użyciu sond kodowanych genetycznie.

<table><tbody><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100x penicylina/streptomycyna (p/s)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna/0,25% EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe 8-dołkowe</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>jabłczan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>glutaminian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ wolny Hank' s buforowany roztwór soli (HBSS)&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>tetrametylodamina, ester metylowy, nadchloran (TMRM)</td><td>ThermoFisher</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Ester acetoksymetylowy Fluo-4 (Fluo-4, AM)</td><td>ThermoFisher</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>cyjanek karbonylu p-trifluorometoksyfenylohydrazon (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>P3000MP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>hemytometr</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>10 cm szalki do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>COR430167</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 kolby do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>COR430641</td><td></td></tr></tbody></table>

jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Oprócz ich zasadniczej roli w generowaniu ATP, mitochondria działają również jako lokalne wapnia (Ca2+) do ścisłej regulacji wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+. Aby to zrobić, mitochondria wykorzystują potencjał elektrochemiczny przez swoją błonę wewnętrzną (ΔΨm) do sekwestracji Ca2+. Napływ Ca2+ do mitochondriów stymuluje trzy dehydrogenazy ograniczające szybkość cyklu kwasu cytrynowego, zwiększając transfer elektronów przez kompleksy fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS). Stymulacja ta utrzymuje ΔΨm, który jest tymczasowo rozpraszany, gdy dodatnie jony wapnia przechodzą przez wewnętrzną błonę mitochondriów do macierzy mitochondrialnej.
Opisujemy tutaj metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca2+ i ΔΨm w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej. Poprzez przenikanie komórek, mitochondrialny Ca2 + można zmierzyć za pomocą fluorescencyjnego wskaźnika Ca2 + Fluo-4, AM, z pomiarem ΔΨm przy użyciu barwnika fluorescencyjnego tetrametylorodaminy, estru metylowego, nadchloranu (TMRM). Zaletą tego systemu jest to, że nakładanie się widma między barwnikami fluorescencyjnymi jest bardzo niewielkie, co pozwala na dokładny pomiar mitochondriów Ca2+ i ΔΨm jednocześnie. Stosując sekwencyjne dodawanie podwielokrotności Ca2+, można monitorować wychwyt mitochondrialnego Ca2 + i określić stężenie, przy którym Ca2 + indukuje przejście przepuszczalności błony mitochondrialnej i utratę ΔΨm.

Niniejszego protokołu użyliśmy do zbadania wpływu mutacji MT-ND5 na zdolność mitochondriów w komórkach 143B do buforowania wzrostu poziomu wapnia12. W przedstawionym tutaj przykładzie kontrolne komórki 143B załadowano TMRM oraz Fluo-4, AM przed permeabilizacją przy użyciu digitoniny. Po 5 min obrazowania wykonano osiem sekwencyjnych dodań rozcieńczenia 1:100 40 mM egzogennego CaCl2, obliczając końcowe stężenie wolnych jonów Ca2+ [Ca<s...

Mitochondria mogą wykorzystywać potencjał elektrochemiczny w swojej wewnętrznej błonie (ΔΨm) do sekwestracji wapnia (Ca2+), co pozwala im kształtować cytozolową sygnalizację Ca2+ w komórce. Opisano metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca2+ i ΔΨm w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie prostej metody jednoczesnego pomiaru poboru wapnia przez mitochondria oraz potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań nad mitochondriami, takie jak sposób, w jaki mitochondria pełnią funkcję lokalnych magazynów wapnia w celu ścisłej regulacji wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Główną zaletą tej techniki jest możliwość specyficznego i jednoczesnego pomiaru poziomu wapnia mitochondrialnego oraz potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach bez konieczności manipulacji genetycznych.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat regulacji wapnia w patologii chorób mitochondrialnych, może być ona również wykorzystana do badania innych, nowszych stanów degeneracyjnych, w których regulacja wapnia w moczu ma kluczowe znaczenie. W tej procedurze należy hodować komórki na 10 cm szalkach do hodowli komórkowej lub w kolbach o powierzchni 75 cm², w pożywce hodowlanej w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Aby zebrać komórki, należy usunąć pożywkę poprzez aspirację, a następnie przemyć komórki 5 ml PBS.Następnie usuń PBS za pomocą aspiratora. Potem dodaj 1,5 ml Trypsyny EDTA i inkubuj komórki w temperaturze 37°C przez 2 minuty. Następnie delikatnie opukaj płytkę, aby odkleić komórki.Resuspenduj je w pięciu mililitrach pożywki hodowlanej. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru. Dzień przed obrazowaniem konfokalnym wysiej komórki do naczyń lub szkiełek podstawkowych z komorami, osiągając 60 do 70 procent konfluencji.Następnie inkubować komórki przez noc w temperaturze 37°C, aby umożliwić ich przyczepienie i regenerację. W tej procedurze przygotować roztwór barwiący z TMRM, Fluo 4 AM oraz surfaktantem. Usunąć medium hodowlane i przemyć komórki 100 µL PBS.Następnie należy usunąć PBS i inkubować komórki w 100 µl roztworu barwiącego przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie usuwa się roztwór barwiący i przemywa komórki w 100 µl bezwapniowego HBSS, aby usunąć nadmiar Fluo 4 AM oraz TMRM. Następnie przygotowuje się roztwór do obrazowania wewnątrzkomórkowego z digitoniną, TMRM i tapsygarginą.Następnie należy usunąć bezwapniowy roztwór HPSS i dodać do komórek 300 µL roztworu obrazującego IM. Pozostawić komórki do wyrównania temperatury w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut przed rozpoczęciem obrazowania z dodatkiem chlorku wapnia. Należy zastosować niską moc lasera, wynoszącą około 5%, aby zminimalizować ewentualne uszkodzenia fotochemiczne komórek.Ustaw lasery mikroskopu zgodnie ze spektrami wzbudzenia i emisji TMRM oraz Fluo 4 AM. Zastosuj niską moc lasera, wynoszącą około pięciu procent, przy wysokim wzmocnieniu, aby zminimalizować fotouszkodzenia komórek. Następnie skonfiguruj mikroskop tak, aby skanował obrazy co dwadzieścia pięć sekund. Skanuj komórki przez dziesięć minut, aby ustalić wartości bazowe dla sygnałów TMRM i Fluo 4.Następnie wstrzymaj skanowanie obrazu i dodaj 3 µL stężonego roztworu chlorku wapnia 40 mM bezpośrednio do komórek w 300 µL roztworu obrazującego IM. Wymieszaj delikatnie za pomocą pipety. Podczas dodawania roztworu wapnia do komórek należy uważać, aby nie przesunąć szalki na stole mikroskopu.Kontynuuj skanowanie obrazu przez około cztery minuty. Następnie powtarzaj dodawanie chlorku wapnia co cztery minuty, aż do uzyskania pożądanych sygnałów TMRM lub Fluo 4, zazwyczaj po około ośmiu do dziesięciu dodaniach. Następnie dodaj bezpośrednio do komórek rozcieńczenie 1 do 100 stężenia 1 mM FCCP, aby znieść potencjał błony wewnętrznej.Następnie obrazuj komórki przez kolejne pięć minut, aż do zakończenia eksperymentu. Po zakończeniu obrazowania określ intensywność sygnałów Fluo 4 oraz TMRM za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. W tym celu otwórz obraz, kliknij narzędzie zaznaczania i wybierz obszar zainteresowania zawierający mitochondria.Wiele obszarów zainteresowania można wybrać do pomiaru, otwierając Analyze, Tools, ROI Manager. Kliknij Add, aby dołączyć wybrany ROI do pomiaru intensywności. Powtarzaj poprzednie kroki, aż wszystkie ROI zostaną dodane do menedżera ROI.Zmierz średnią intensywność fluorescencji sygnałów TMRM i Fluo 4 dla każdego obszaru zainteresowania (ROI), wybierając funkcję multi measure. Upewnij się, że opcja Measure All Slices jest zaznaczona, a opcja One Row Per Slice odznaczona. Następnie kliknij Okay, aby uzyskać tabelę średniej intensywności fluorescencji sygnałów TMRM i Fluo 4 dla każdego ROI w każdym punkcie czasowym.Następnie połącz dane, aby obliczyć średnią intensywność i odchylenie standardowe dla sygnałów TMRM i Fluo 4. W tym eksperymencie komórki 143B zostały wstępnie załadowane Fluo 4 AM oraz TMRM przed permeabilizacją digitoniną. Po każdym dodaniu chlorku wapnia sygnał TMRM maleje, ponieważ napływ jonów wapnia do mitochondriów powoduje rozproszenie potencjału błony mitochondrialnej.Niewielki potencjał błonowy jest widoczny po przejściu przepuszczalności, ponieważ dodanie 10 µM FCCP nadal indukuje załamanie potencjału błonowego. W tym momencie mitochondrialne stężenie wapnia, wskazane przez sygnał Fluo 4, zaczyna wzrastać po drugim dodaniu chlorku wapnia, gdy stężenie wolnego wapnia w medium osiąga 0,32 µM. Każde kolejne dodanie chlorku wapnia powodowało stopniowy wzrost poziomu wapnia w mitochondriach.Przedstawiono tutaj obrazy jednoczesnych pomiarów potencjału błonowego i wapnia w mitochondriach. Sygnał czerwony oznacza TMRM, a sygnał zielony oznacza Fluo 4. Po opanowaniu techniki, jej przeprowadzenie zajmuje około dwóch godzin, jeśli jest ona wykonywana prawidłowo.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak jednocześnie pomiar poziomów wapnia mitochondrialnego i potencjału błony mitochondrialnej przy użyciu mikroskopii konfokalnej poprzez dodanie egzogennego wapnia do permeabilizowanych komórek. Należy pamiętać, że praca z FCCP i digitoniną może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie środków ochrony indywidualnej (PPE).

simultaneous-measurement-mitochondrial-calcium-mitochondrial-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru przepływów wapnia w mitochondriach w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta wykorzystuje ratiometryczny sensor wapnia oparty na cyklicznie permutowanej białku YFP z podwójnym wzbudzeniem (ratiometryczny pericam-mt), który jest selektywnie ekspresowany w mitochondriach.

Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy z wykorzystaniem genetycznie kodowanego sensora wapnia

Przedstawiamy metodę izolacji szybkich (mikrosekundowych) zdarzeń wapniowych od wolniejszych przepływów w żywych komórkach z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii skanującej. Metoda ta mierzy fluktuacje intensywności fluorescencji wskaźników wapnia poprzez rejestrację skanów liniowych obejmujących kilkaset pikseli w komórce. Analiza histogramowa pozwala na wyizolowanie skal czasowych różnych przepływów wapnia.

Pomiar szybkich przepływów jonów wapnia w kardiomiocytach

Fuzję mitochondriów mierzono poprzez śledzenie wyrównywania rozkładu fotokonwertowanego GFP skierowanego do macierzy w całej sieci mitochondrialnej w czasie. Do tej pory jednorazowo analizie kinetycznej trwającej godzinę mogła zostać poddana tylko jedna komórka. Przedstawiamy metodę, która umożliwia jednoczesny pomiar w wielu komórkach, co przyspiesza proces gromadzenia danych.

Szybszy test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, oparty na mtPA-GFP, umożliwiający równoległe pozyskiwanie danych kinetycznych z wielu komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Ten film opisuje test oparty na czytniku płytek do pomiaru mitochondrialnego wychwytu wapnia w izolowanych mitochondriach. Test analizuje sygnał fluorescencyjny wrażliwego na wapń barwnika fluorescencyjnego w celu zbadania kinetyki mitochondrialnego wychwytu wapnia i przeciążenia wapniem.

Mitochondrialny test wychwytu wapnia: metoda pomiaru wychwytu wapnia w izolowanych mitochondriach oparta na czytniku płytkowym

Ten film opisuje test oparty na obrazowaniu opartym na mikroskopii konfokalnej, mierzący pobieranie wapnia przez mitochondria w hodowanych komórkach. Test wykorzystuje wrażliwy na wapń barwnik fluorescencyjny Rhod-2/AM do pomiaru mitochondrialnego wapnia w permeabilizowanych komórkach hodowlanych.

Test napływu wapnia w celu pomiaru mitochondrialnego wychwytu wapnia w hodowanych komórkach

Wideo pokazuje jednoczesny pomiar wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia i zmian potencjału błonowego w komórkach śródbłonka mysich odcinków tętnic mózgowych. Izolowany śródbłonek jest ładowany fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia i traktowany lekiem, który indukuje wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia, powodując zmianę potencjału błony. Fluorescencja wskaźnika umożliwia pomiar poziomu wapnia, a elektroda rejestrująca jest wprowadzana do ogniwa w celu pomiaru zmian potencjału błony.

Jednoczesny pomiar wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w śródbłonku mózgu myszy

Ten protokół ma na celu opisanie metody badania krok po kroku zdolności zatrzymywania Ca2+ i wywołanego przez Ca2+ obrzęku mitochondriów izolowanych mitochondriów komórek SH-SY5Y.

Test zdolności retencyjnej mitochondriów Ca2+ i test obrzęku mitochondriów wywołany Ca2+

Tutaj prezentujemy dwa protokoły pomiaru napływu mitochondrialnego Ca2+ w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach. W przypadku izolowanych mitochondriów szczegółowo opisujemy test importu Ca2 + oparty na czytniku płytek przy użyciu wrażliwego barwnika Ca2 + zieleni wapniowej-5N. W przypadku hodowanych komórek opisujemy metodę mikroskopii konfokalnej z użyciem barwnika Ca2+ Rhod-2/AM.

Analizy napływu wapnia w mitochondriach w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach

Pokazane są tutaj protokoły (1) świeżo izolowania nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu oraz (2) jednoczesnych pomiarów śródbłonka wapnia i potencjału błonowego podczas hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka. Co więcej, metody te pozwalają na farmakologiczne dostrojenie wapnia w komórkach śródbłonka i sygnalizacji elektrycznej jako indywidualnych lub interaktywnych zmiennych eksperymentalnych.

Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy

Ta technika opisuje efektywny przepływ pracy do wizualizacji i ilościowego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w komórkach HeLa za pomocą obrazowania na żywo opartego na fluorescencji.

Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa

Poznaj metodę jednoczesnego pomiaru wapnia mitochondrialnego i potencjału błony w żywych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej. Technika ta pozwala badać dynamikę wapnia bez manipulacji genetycznych.

Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów