Badanie fenotypów gospodarza w Gambusia affinis po leczeniu antybiotykami

Ogólnym celem tego eksperymentalnego systemu jest zbadanie negatywnych skutków ubocznych dla organizmu gospodarza po leczeniu antybiotykami. Tak więc ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiomu, takie jak skutki uboczne związane z enbac dla zdrowia gospodarza, w których pośredniczy zakłócony mikrobiom. Tak więc głównymi zaletami tej techniki jest to, że system ten jest prosty, niedrogi w badaniu fizjologicznych fenotypów gospodarzy kręgowców i pozwala na nieinwazyjne zakłócenie mikrobiomu błony śluzowej.

Implikacje tej techniki charakteryzują, w jaki sposób zakłócenie mikrobiomu zwierzęcia może prowadzić do poważnych skutków ubocznych. Na początek nałóż wcześniej uzyskany i zamrożony zakaźny szczep Edwardsiella ictaluri na selektywny i różnicowy agar E.Ictaluri. Inkubuj kulturę w temperaturze 27 stopni Celsjusza przez dwa dni.

Przenieś czystą izolowaną kolonię z kultury i zatruj 150-mililitrową kolbę zawierającą 40 mililitrów bulionu odżywczego. Umieścić kolbę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 27 stopni Celsjusza i prędkości 150 obr./min na dwa dni. Po inkubacji, w celu skalibrowania kultury E.Ictaluri dla pożądanych objętości dawki zakaźnej, należy użyć PBST do rozcieńczenia próbki kultury do OD 650 0,2.

Po zebraniu Gambusia affinis i potraktowaniu ryb ryfampicyną w słupie wody przez trzy dni, przenieś zarówno grupy ryb traktowane antybiotykiem, jak i nieleczone do indywidualnych plastikowych kubków zawierających 130 mililitrów świeżej sztucznej wody w stawie lub APW na około 10 godzin w celu usunięcia leku z tkanek ryb. Następnie ponownie podziel rybę na pojedyncze plastikowe kubki o pojemności ośmiu uncji zawierające 130 mililitrów czystego APW. Podaj śmiertelną dawkę kultury E.Ictaluri każdej rybie i inkubuj ryby w temperaturze 27 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Po kąpieli E.Ictaluri przenieś każdą rybę do nowego kubka ze 130 mililitrami APW. Bez karmienia ryb rejestruj śmiertelność ryb w ciągu tygodnia. Zbierz zebrany kał do sterylnej plastikowej torby przed przeniesieniem jej do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów, a następnie użyj PBST, aby stworzyć podstawowe stężenie kału na poziomie od 500 do 800 miligramów na mililitr, używając plastikowej pipety o pojemności jednego mililitra lub większej z odciętą końcówką, przygotuj 130 mililitrów na filiżankę 15 miligramów na mililitr lub 10 miligramów na mililitr kału w APW.

Przenieś ryby poddane działaniu antybiotyku lub niepoddane działaniu antybiotyku do pojedynczych kubków roztworu, a następnie inkubuj ryby w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwa dni, uważnie obserwując i rejestrując śmiertelność w tym czasie. Aby potraktować ryby glebą, zbierz od jednego do kilogramów bogatej organicznej wierzchniej warstwy gleby, około siedmiu na głębokość 15 centymetrów, i przenieś ją do czystego plastikowego pojemnika. Przygotuj indywidualne plastikowe kubki zawierające 18,2 grama gleby i 130 mililitrów APW, dobrze mieszając glebę ręcznie, a następnie przenieś rybę potraktowaną antybiotykiem lub niepoddaną działaniu antybiotyku do kubków i pozostaw w temperaturze 25 stopni Celsjusza na trzy dni, rejestrując śmiertelność.

Po 10-godzinnym okresie odpoczynku w APW po leczeniu antybiotykami, przenieść ryby do pojedynczych kubków zawierających 17,5 miligrama na mililitr chlorku sodu i APW, obserwować ryby przez 36 godzin pod kątem śmiertelności, w celu przeprowadzenia prowokacji toksyczności azotanów, po 10-godzinnym okresie odpoczynku, jak poprzednio, oddzielić ryby do pojedynczych kubków zawierających 10 lub 17,5 miligrama na mililitr azotanu sodu i 130 mililitrów APW. Przez jeden dzień obserwować ryby pod kątem śmiertelności przy dużej dawce azotanu sodu i przez cztery dni w przypadku ryb przy niskiej dawce. Po zakończeniu trzydniowej ekspozycji na antybiotyki lub kontrolę w grupach, dla poszczególnych ryb, napełnij kubki styropianowe o pojemności ośmiu uncji 150 mililitrami APW, a po zważeniu napełnionych kubków przenieś rybę do kubków, a następnie zapisz całkowitą masę ciała do wstępnej oceny.

Karm ryby codziennie dwoma granulkami pokarmu na rybę, monitoruj spożycie, wizualnie rejestrując niezjedzone granulki. Pod koniec każdego tygodnia w ciągu czterech tygodni należy określić wagę ryby, ważąc najpierw filiżankę świeżego APW i zapisując wagę, a następnie wsypać rybę do siatki zanurzeniowej i przenieść ją do nowego kubka, przed ponownym zważeniem kubka. W przypadku grup ryb umieść 150 mililitrów APW w filiżance i wytaruj wagę.

Trzymaj ryby razem w obu grupach podczas przenoszenia ich do nowych pojemników APW, a następnie zapisuj całkowitą wagę grupy. Ważenie należy powtarzać pod koniec każdego tygodnia w ciągu miesiąca. Aby przeanalizować czas pasażu jelitowego, dodaj 360 mikrolitrów sterylnej wody dejonizowanej i 52 miligramy żelatyny do sterylnej probówki o pojemności 1,7 mililitra i umieść ją na bloku grzewczym o temperaturze 60 stopni Celsjusza, aż żelatyna się rozpuści i całkowicie się rozpuści.

Za pomocą śmiertelnika i tłuczka zmiel płatki pokarmu dla złotych rybek na drobny proszek i dodaj 40 miligramów proszku do probówki wraz z 20 mikrolitrami oleju rybnego. Po wymieszaniu dodaj 1,6 miligrama dekstranu FitC. Dozuj 20 mikrolitrowych kropli gorącego płynu na parafilm na stole laboratoryjnym i pozwól im szybko ostygnąć i zestalić się.

Umieść parafilm na połowie szalki Petriego i unieś go na sterylnej wodzie w szczelnie zamkniętym plastikowym pojemniku. Przechowuj zestalone krople w lodówce do czterech dni, zanim staną się zbyt twarde do zjedzenia przez ryby. Tuż przed karmieniem użyj żyletki, aby pokroić krople na ćwiartki.

Przyzwyczaj ryby do indywidualnych styropianowych kubków przez dwa dni bez karmienia, umieść cztery ćwiartki pokarmu w kubku na ryby i obserwuj ryby przez 30 minut, ile kawałków pokarmu każda z nich zjada. Aby rozpocząć monitorowanie, przenieś poszczególne ryby do kubków z 80 mililitrami APW i co dwie godziny pobieraj próbkę o wielkości 1 mililitra. Przechowuj go w oznaczonej tubie o pojemności 1,7 mililitra w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po zakończeniu testu umieść całą jednomililitrową próbkę w kuwecie i użyj spektrofotometru fluorescencyjnego, aby zarejestrować fluorescencję przy wzbudzeniu 495 nanometrów i emisji 520 nanometrów dla wszystkich próbek w tym samym czasie. jak pokazano tutaj, ryby z mikrobiomem zmienionym antybiotykiem były bardziej podatne na infekcję E.Ictaluri niż ryby kontrolne. Różnica w średnim czasie do śmierci dla ryb leczonych i kontrolnych nie była istotna.

Jest to prawdopodobnie spowodowane małą wielkością grupy. Ten wykres ilustruje, że ryby narażone na ryfampicynę były bardziej podatne na stres osmotyczny niż ryby kontrolne, w tym teście poziom zasolenia powyżej 18 miligramów na mililitr powodował szybką śmierć ryb. Jak wykazano w powyższej tabeli, w przypadku narażenia na działanie azotanu toksyny w słupie wody, wstępna ekspozycja na antybiotyki nie miała wpływu na przeżycie.

Przy dawce 10 miligramów na mililitr zaobserwowano 50% śmiertelność zarówno dla grupy leczonej antybiotykiem, jak i grupy kontrolnej po 90 godzinach. W tym eksperymencie z wykorzystaniem ryb kontrolnych w akwarium, albo dwie sekcje pokarmu znakowanego dekstranem FitC, albo jedna sekcja została podana rybom w celu zbadania czasu przejścia pokarmu poprzez pomiar fluorescencji w otaczającej wodzie w czasie. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak pomiar całkowitych zapasów tkanki tłuszczowej w organizmie i ilościowe określenie produkcji śluzu skóry, aby zrozumieć mechanizmy i zawęzić czynniki zakłócające, które mogą przyczyniać się do negatywnych skutków gospodarza.