Name: Badanie fenotypów gospodarza w Gambusia affinis po leczeniu antybiotykami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj metodę badania fenotypów gospodarza Gambusia affinis po leczeniu antybiotykami. Technika ta pozwala nieinwazyjnie zakłócać mikrobiom błon śluzowych i analizować fizjologiczne skutki uboczne u ryb.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ten projekt został częściowo sfinansowany przez nagrodę FAST (Faculty and Student Team) dla TPP i JMC od EURECA (Center for Enhancing Undergraduate Research Experiences and Creative Activities) na Uniwersytecie Stanowym Sam Houston.

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami IACUC o numerach 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 i 14-04-17-1018-3-01.
1. Zbieranie, obchodzenie się ze zwierzętami i etyczna opieka
<ol>
	<li>Zebrać Gambusia affinis z pola (przewodnik identyfikacyjny na http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) za pomocą małej siatki zanurzeniowej i umieścić w wiadrach o pojemności 19 litrów. Użyj oględzin, aby zidentyfikować gatunki.</li>
	<li>Odpoczywaj ryby przez 1 - 2 dni w wiadrze z wodą ze stawu. Następnie przenieś ryby do zbiorników akwariowych o pojemności 76 lub 189 litrów, wypełnionych w połowie wodą ze stawu, a w połowie wodą z kranu o temperaturze 25 °C, napowietrzonych bulgoczącym kamieniem napowietrzającym. Podczas pracy z rybami należy używać małej siatki do zanurzania, aby w minimalnym stopniu zakłócić ich mikrobiom skóry. 
	UWAGA: Gęstość ryb nie powinna być wyższa niż 20 ryb/38 l wody w akwarium. Ryby aklimatyzują się w akwarium przez co najmniej 5 dni przed eksperymentami.</li>
	<li>Karm ryby w codziennym schemacie z 5 mg pokarmu w płatkach na rybę. Trzymaj ryby w cyklu 12 godzin światła / 12 godzin ciemności.</li>
</ol>
2. Wstępna ekspozycja na antybiotyki we wszystkich eksperymentach
<ol>
	<li>Pobierając wszystkie ryby z każdego eksperymentu z tego samego akwarium, umieść je w dwóch oddzielnych grupach (leczone: wystawione na antybiotyk i kontrolowane: nienarażone) w 19-litrowych wiadrach. Poprzednie zebrane dane pokazują, że ryby w tym samym akwarium mają zhomogenizowane mikrobiomy skóry, które mają niewielkie różnice w składzie społeczności. 12</li>
	<li>Podczas eksperymentów trzymaj ryby w 2 l sztucznej wody w stawie (APW; 0,33 g/L CaCl2, 0,33 g/L MgSO4, 0,19 g/L NaHCO3), która jest sterylizowana w autoklawie przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy antybiotyku ryfampicyny, dodając 50 mg/ml do dimetylosulfotlenku (DMSO). Ryfampicyna jest reprezentatywnym antybiotykiem o szerokim spektrum działania, który jest nietoksyczny dla ryb. U ludzi i myszy dobrze rozprowadza się w tkankach.</li>
	<li>Z zapasu ryfampicyny podawać końcowe stężenie 25 μg/ml w 2 litrach APW w celu ekspozycji na antybiotyki leczonej grupy ryb przez 3 dni. Należy pamiętać, że po 3 dniach liczba bakterii skórnych nadających się do hodowli powraca podobnie jak w przypadku wstępnie poddanej obróbce skóry ryb.</li>
	<li>Równolegle należy trzymać grupę ryb niepoddanych działaniu substancji w APW i podać równoważną ilość DMSO (0,5 ml na l APW) do słupa wody, aby działała jako grupa kontrolna.</li>
	<li>Ponieważ eksperymenty mają na celu zmierzenie wpływu mikrobiomu zmienionego antybiotykiem na fenotypy ryb, w celu uniknięcia skutków bezpośrednio z samego antybiotyku, po trzydniowym okresie ekspozycji na antybiotyk (lub kontroli) należy przenieść ryby do wiadra z 2 litrami świeżego APW.
	<ol>
		<li>Stosuj 10-godzinny okres odpoczynku, aby antybiotyk został usunięty przez ciała ryb. Oprzyj ten czas eliminacji na eksperymentach, w których ryby były wystawione na działanie 25 μg/ml antybiotyku przez trzy dni. Poddaj rybę eutanazji poprzez przecięcie rdzenia kręgowego, a następnie zmiażdżenie całego ciała za pomocą młynka do tkanek.</li>
		<li>Określić obecność antybiotyku, umieszczając 50 μl tej zawiesiny po przefiltrowaniu 0,2 μm w środku agarowej szalki Petriego. Zrób otwór na tę zawiesinę, wciskając do góry nogami sterylną końcówkę pipety o pojemności 200 μl do agaru, która usuwa małą zatyczkę.</li>
		<li>Użyj płytek agarowych z odmierzoną objętością 20 ml agaru odżywczego i równomiernie rozprowadź za pomocą bawełnianego wacika z organizmem wskaźnikowym, Bacillus subtilis, który jest wrażliwy na ryfampicynę. Otrzymać B. subtilis z agatora odżywczego inkubowanego w temperaturze 25 °C O/N i za pomocą bawełnianego wacika w celu uzyskania kolonii. Obserwowanie strefy inhibicji po całonocnej inkubacji w temperaturze 25 °C wskazuje na obecność antybiotyku w tkankach ryb.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ekstrakcja mikrobiomu
<ol>
	<li>Ekstrahuj próbkę mikrobiomu skóry z zewnętrznego naskórka błony śluzowej, umieszczając ryby w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml wypełnionej 2 ml sterylnego roztworu PBST (137 mM NaCl, 10 mM fosforanu, 0,1% Tween-20, pH 7,4) i wirując w ustawieniu 10 przez 1 minutę z 10-sekundowymi przerwami. Detergent i sól w buforze sprzyjają równomiernemu rozpraszaniu się bakterii w roztworze. Porównywalne wyniki uzyskano przy 0,85% soli fizjologicznej, ale obniżonej liczbie bakterii przy użyciu czystej wody.</li>
	<li>Przenieś rybę z rurki stożkowej do wiadra do odzyskiwania. Śmiertelność ekstrakcji skóry jest zwykle niższa niż 10%. Albo przeanalizować zawiesinę bakteryjną w probówce natychmiast po ekstrakcji, albo zagnieździć bakterie przez 2-minutowe wirowanie w wirówce w temperaturze pokojowej przy 15 000 x g i przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy. 
	UWAGA: Wszystkie analizy hodowli i biochemiczne są natychmiastowe; Ekstrakcja DNA lub białka może odbywać się z zamrożonych próbek.</li>
	<li>Aby uzyskać próbkę mikrobiomu jelitowego, najpierw umieść rybę na sterylnej szalce Petriego. Poddaj rybę eutanazji, przecinając rdzeń kręgowy szyjny bezpośrednio za głową nożyczkami chirurgicznymi, a następnie wkłuw, a następnie zewnętrznie zdezynfekuj ciało chusteczkami z 70% etanolu.</li>
	<li>Po rozbiorzeniu usuń całe jelito, przecinając za przełykiem i przed odbytem.</li>
	<li>Pokrój jelito na małe kawałki o długości 1-2 mm i umieść wszystkie sekcje w dwóch ml roztworu PBST w stożkowej probówce. Po wirowaniu przez 1 minutę usunąć supernatant do innej czystej probówki (należy uważać, aby nie wyciągnąć skrawków jelit). 
	UWAGA: Supernatant zawiera wyekstrahowane bakterie jelitowe, które mogą być wykorzystane do bezpośrednich analiz lub granulowane poprzednią metodą opisaną dla próbek skóry.</li>
</ol>
4. Przygotowanie modelu infekcji i kąpiel określonego patogenu
<ol>
	<li>Uzyskać zakaźny szczep Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) i przechowywać kulturę w temperaturze -80 °C. Szczep 93 - 146 użyty w tym badaniu, wyizolowany z zakażonego suma, uzyskano od Marka Lawrence'a, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University.</li>
	<li>Umieść E. ictaluri na selektywnym i różnicowym podłożu zwanym E. ictaluri (EIM) agar19 w celu hodowli bakterii i inkubacji przez 2 dni w temperaturze 27 °C.</li>
	<li>Przenieść czystą izolowaną kolonię z kultury i zaszczepić 150 ml kolby zawierającej 40 ml bulionu odżywczego (NB; 5 g/l peptonu, 4 g/l ekstraktu wołowego). Umieścić kolbę w wytrząsarce ustawionej na 150 obr./min na 2 dni w temperaturze 27 °C.</li>
	<li>Po inkubacji rozcieńczyć próbkę kultury w PBST do odczytu spektrometru 0,2 OD przy 650 nm, aby skalibrować kulturę E. ictaluri dla pożądanych objętości dawki zakaźnej.</li>
	<li>Następnie przenieś zarówno leczone (po 3 dniach ekspozycji na antybiotyki), jak i nieleczone grupy ryb do indywidualnych plastikowych kubków zawierających 130 ml świeżej sztucznej wody ze stawu lub APW przez około 10 godzin w celu usunięcia leku z tkanek ryb.</li>
	<li>Następnie z obu grup przenieś ponownie każdą rybę do 8-uncjowych plastikowych kubków zawierających 130 ml czystego APW.</li>
	<li>Każdej rybie należy podać śmiertelną dawkę zawierającą 2,8 x 10 6 jtk/ml kultury E. ictaluri do APW (model infekcji kąpielowej) i przechowywać w inkubatorze o temperaturze 27 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Po kąpieli z E. ictaluri przenieść ryby pojedynczo do nowych kubków ze 130 ml APW.</li>
	<li>Po wymianie wody rekordowa śmiertelność ryb w ciągu tygodnia. W tym okresie ryby nie są karmione. W przeciwieństwie do sumów, Gambusia nie wykazuje zewnętrznych oznak infekcji, dlatego konieczne jest zastosowanie śmiertelności jako eksperymentalnego punktu końcowego.</li>
</ol>
5. Wyzwanie wielomikrobiologiczne z kałem i glebą
<ol>
	<li>Leczenie kału
	<ol>
		<li>Uzyskaj świeży kał ludzki od zdrowego ochotnika, który nie otrzymał antybiotyków w ciągu ostatnich dwóch tygodni, używając sterylnych rękawiczek i sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Po pobraniu zbierz kał do sterylnej plastikowej torby, a następnie przenieś do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Utworzyć stężenie zapasowe, zawieszając kał w PBST, aby uzyskać roztwór podstawowy 500 - 800 mg/ml. Tę gęstą mieszaninę najlepiej przenosić za pomocą plastikowej końcówki do pipety o pojemności 1 ml lub większej, która została przecięta na dole sterylnymi nożyczkami, tak aby otwór był większy.</li>
		<li>Po wstępnej ekspozycji na antybiotyk grupy ryb poddanych działaniu substancji i kontrolnych nieleczonych, rozdzielić do oddzielnych plastikowych kubków zawierających zawiesinę kału w końcowych stężeniach 15 mg/ml lub 10 mg/ml do APW o całkowitej objętości 130 ml. Przechowywać kubki w inkubatorze w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Rejestruj śmiertelność ryb podczas ekspozycji na kał poprzez ścisłą obserwację przez 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzdatnianie gleby
	<ol>
		<li>Zbierz 1 - 2 kg bogatej organicznej wierzchniej warstwy gleby (powinna zawierać największą gęstość i różnorodność drobnoustrojów) na głębokość około 7 - 15 cm i umieść w czystym plastikowym pojemniku. Należy pamiętać, że glebę należy zużyć w ciągu dwóch dni po pobraniu.</li>
		<li>Bezpośrednio po początkowym okresie ekspozycji oddziel obie grupy ryb leczonych i nietraktowanych antybiotykami do indywidualnych plastikowych kubków zawierających 18,2 g gleby w 130 ml APW. Dobrze wymieszaj glebę w wodzie ręcznie przed dodaniem ryby. Większość cząstek stałych nie zawiesza się i pozostaje na dnie kubka.</li>
		<li>Wystawić ryby na działanie promieni słonecznych przez 3 dni w temperaturze 25 °C i odnotować ewentualną śmiertelność.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Wyzwanie stresu osmotycznego
<ol>
	<li>Po poddaniu działaniu substancji, po którym następuje 10-godzinny okres odpoczynku, jak opisano powyżej, należy zindywidualizować ryby w oddzielnych kubkach zawierających NaCl w stężeniu 17,5 mg/ml (300 mM) w 150 ml APW. Jest to połowa typowego zasolenia wody morskiej, która nie jest w pełni śmiertelna (<50%) do zwalczania ryb, ale jest silnie stresująca, wymagająca skutecznej osmoregulacji.</li>
	<li>Obserwuj śmiertelność ryb w czasie 36 godzin.</li>
</ol>
7. Wyzwanie dotyczące toksyczności azotanów
<ol>
	<li>Odpoczywaj ryby przez okres 10 godzin po ekspozycji na antybiotyk, a następnie oddziel ryby do indywidualnych kubków zawierających stężenie azotanu sodu 10 mg/ml (118 mM) lub 17,5 mg/ml (206 mM) w 130 ml APW.</li>
	<li>Rekord śmiertelności powyżej 4 dni dla małej dawki i 1 d dla wysokiej dawki.</li>
</ol>
8. Analiza wzrostu ryb zindywidualizowanych lub zgrupowanych
<ol>
	<li>Ukończ 3-dniowy okres ekspozycji na antybiotyk lub okres kontrolny jako grupy w wiadrach.</li>
	<li>W przypadku Individual napełnij kubki styropianowe o pojemności 8 uncji po 150 ml APW każdy, przenieś pojedynczą rybę do kubka i zapisz całkowitą masę ciała w celu wstępnej oceny.
	<ol>
		<li>Powtórzyć tę czynność dla wszystkich ryb zarówno w grupie poddanej działaniu substancji, jak i niepoddanej zabiegowi. Używaj białych kubków styropianowych zamiast przezroczystych plastikowych kubków, ponieważ ryby nie będą jeść, gdy są w przezroczystych kubkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Karm ryby codziennie standardową dietą składającą się z dwóch granulek na rybę. Użyto granulek zamiast płatków, ponieważ granulki mają niską zmienność indywidualnej masy (3,53 ±0,42 mg każdy, czyli 8% różnicy), co powoduje, że ryby otrzymują podobne ilości pokarmu. Monitoruj zużycie, wizualnie rejestrując niezjedzone granulki. Wskaźniki konsumpcji zazwyczaj przekraczały 80%.</li>
	<li>Pod koniec każdego tygodnia przez 4 tygodnie określ wagę ryby. Przygotuj nową filiżankę ze świeżym APW, umieść na wadze, a następnie zapisz wagę. Następnie wlej rybę do siatki zanurzeniowej z oryginalnego kubka i przenieś do nowego kubka, który następnie jest ponownie ważony. Nie obchodzi się z rybami, aby uniknąć stresu.</li>
	<li>W przypadku grup umieść 2 litry APW w wiadrze o pojemności 19 litrów i wytaruj wagę. Trzymaj ryby razem w obu grupach podczas przenoszenia do nowych wiader APW, a następnie zapisuj całkowitą wagę grupy. Rejestruj masę grupy ryb co tydzień przez miesiąc, przenosząc ją do nowego koszyka.</li>
</ol>
9. Czas tranzytu jelit
<ol>
	<li>Użyć anionowego dekstranu 70 kDa znakowanego fluoresceiną. Dekstran nie jest znacząco trawiony i jest zbyt duży, aby mógł zostać wchłonięty przez warstwę jelitową, dlatego pasaż będzie mierzył czas przejścia przez jelita. Oznakowany dekstran został dodany do pokarmu dla ryb.</li>
	<li>Do sterylnej probówki o pojemności 1,7 ml dodać 360 μl sterylnej wody dejonizowanej i 52 mg żelatyny (13% roztwór) i umieścić probówkę na bloku grzewczym o temperaturze 60 °C, aż żelatyna się rozpuści i całkowicie się rozpuści.
	<ol>
		<li>Zmiel płatki pokarmu dla złotych rybek na drobny proszek za pomocą moździerza i tłuczka, a następnie dodaj 40 mg tego proszku do probówki wraz z 20 μl oleju rybnego. Po wymieszaniu dodać 1,6 mg dekstranu FITC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dozuj gorącą mieszaninę płynów do kropli o pojemności 20 μl na Parafilm na stole laboratoryjnym i pozwól im szybko ostygnąć i zestalić się. Krople można przechowywać do 4 dni, zanim staną się zbyt twarde do zjedzenia przez ryby. Przechowuj krople w lodówce, umieszczając Parafilm na połowie szalki Petriego, która jest następnie unoszona na sterylnej wodzie w szczelnie zamkniętym plastikowym pojemniku, który utrzymuje krople w stanie nawilżenia.</li>
	<li>Tuż przed karmieniem ćwiartka rozpada się na sekcje za pomocą żyletki. Przyzwyczajaj ryby do kubków styropianowych indywidualnie przez 2 dni bez karmienia (Uwaga: Użyto tylko nienarażonych ryb kontrolnych). Umieść cztery ćwiartki jedzenia w kubku z rybą i obserwuj rybę przez 30 minut, ile kawałków jedzenia każda z nich zjada.</li>
	<li>Aby rozpocząć okres monitorowania, należy przenieść ryby pojedynczo do kubków z 80 ml APW za pomocą sieci zanurzeniowej. Co 2 godziny delikatnie obracać ręcznie APW, a następnie pobrać próbkę o objętości 1 ml i przechowywać w oznakowanej probówce o pojemności 1,7 ml w temperaturze 4 °C. Próbki pobiera się przez 36 godzin.</li>
	<li>Zarejestrować fluorescencję wszystkich próbek za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego w tym samym czasie po zakończeniu testu. Umieścić całą 1 ml próbkę w kuwecie i zarejestrować fluorescencję zmierzoną za pomocą wzbudzenia przy długości fali 495 nm i emisji przy długości fali 520 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Panda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-Term+Effect+of+Antibiotics+on+Human+Gut+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Short-Term Effect of Antibiotics on Human Gut Microbiota.</a> PloS ONE. 9 (4), 95476(2014).</li>
<li>Perez-Cobas, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+disturbance+during+antibiotic+therapy%3A+a+multi-omic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota disturbance during antibiotic therapy: a multi-omic approach.</a> Gut. 62 (11), 1591-1601 (2013).</li>
<li>Theriot, C. M., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+and+metabolic+interactions+between+the+gastrointestinal+tract+and+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Microbial and metabolic interactions between the gastrointestinal tract and Clostridium difficile infection.</a> Gut Microbes. 5 (1), 86-95 (2014).</li>
<li>Buffie, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+microbiome+reconstitution+restores+bile+acid+mediated+resistance+to+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile.</a> Nature. 517, 205-208 (2015).</li>
<li>Sekirov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-Induced+Perturbations+of+the+Intestinal+Microbiota+Alter+Host+Susceptibility+to+Enteric+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-Induced Perturbations of the Intestinal Microbiota Alter Host Susceptibility to Enteric Infection.</a> Infect Immun. 76 (10), 4726-4736 (2008).</li>
<li>Looft, T., Allen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+effects+of+antibiotics+on+mammalian+gut+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Collateral effects of antibiotics on mammalian gut microbiomes.</a> Gut Microbes. 3 (5), 463-467 (2012).</li>
<li>Magnadottir, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15950491">Innate immunity of fish.</a> Fish Shellfish Immunol. 20 (2), 137-151 (2006).</li>
<li>Gomez, D., Sunyer, J., Salinas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mucosal+immune+system+of+fish%3A+the+evolution+of+tolerating+commensals+while+fighting+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">The mucosal immune system of fish: the evolution of tolerating commensals while fighting pathogens.</a> Fish Shellfish Immunol. 35 (6), 1729-1739 (2013).</li>
<li>Nunes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Effects+of+Tetracycline+Exposure+in+the+Freshwater+Fish+Gambusia+holbrooki%3A+Antioxidant+Effects%2C+Neurotoxicity+and+Histological+Alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Environ+Contam+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Acute Effects of Tetracycline Exposure in the Freshwater Fish Gambusia holbrooki: Antioxidant Effects, Neurotoxicity and Histological Alterations.</a> Arch Environ Contam Toxicol. 68 (2), 331-381 (2014).</li>
<li>Fryxell, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+ratio+variation+shapes+the+ecological+effects+of+a+globally+introduced+freshwater+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Sex ratio variation shapes the ecological effects of a globally introduced freshwater fish.</a> Proc Biol Sci. , 22(2015).</li>
<li>Nunes, B., Miranda, M. T., Correia, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27074930">Absence of effects of different types of detergents on the cholinesterase activity and histological markers of mosquitofish (Gambusia holbrooki) after a sub-lethal chronic exposure.</a> Environ Sci Pollu Res Int. , 1-8 (2016).</li>
<li>Leonard, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://file.scirp.org/pdf/AiM_2014051916164703.pdf">The Skin Microbiome of Gambusia affinis Is Defined and Selective.</a> Adv Microbiol. 4, 335-343 (2014).</li>
<li>Carlson, J. M., Hyde, E. R., Petrosino, J. F., Manage, A. B. W., Primm, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+effects+of+Gambusia+affinis+with+an+antibiotic-disrupted+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+C+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The host effects of Gambusia affinis with an antibiotic-disrupted microbiome.</a> Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 163-168 (2015).</li>
<li>Karsi, A., Gulsoy, N., Corb, E., Dumpala, P. R., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+bioluminescence-based+mutant+screening+strategy+for+identification+of+bacterial+virulence+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High-throughput bioluminescence-based mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (7), 2166-2175 (2009).</li>
<li>Hawke, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edwardsiellosis+caused+by+Edwardsiella+ictaluri+in+Laboratory+Populations+of+Zebrafish+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J+Aquat+Anim+Health%22%5BJournal%5D)">Edwardsiellosis caused by Edwardsiella ictaluri in Laboratory Populations of Zebrafish Danio rerio.</a> J Aquat Anim Health. 25 (3), 171-183 (2013).</li>
<li>Petrie-Hanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Zebrafish+Danio+rerio+as+a+Model+for+Enteric+Septicemia+of+Catfish+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Aquat+Anim+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Zebrafish Danio rerio as a Model for Enteric Septicemia of Catfish (ESC).</a> J Aquat Anim Health. 19 (3), 151-158 (2007).</li>
<li>Fultz, R. S., Primm, T. P. A Laboratory Module for Host-Pathogen Interactions: America's Next Top Model. J. Microbiol. Biol. Educ. 11, abstract 20-B (2010).</li>
<li>Uliano, E., Cataldi, M., Carella, F., Migliaccio, O., Iaccarino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+changes+in+salinity+and+temperature+on+routine+metabolism+and+nitrogen+excretion+in+gambusia+%28Gambusia+affinis%29+and+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Effects of acute changes in salinity and temperature on routine metabolism and nitrogen excretion in gambusia (Gambusia affinis) and zebrafish (Danio rerio).</a> Comp Biochem Physiol A. 157, 283-290 (2010).</li>
<li>Shotts, E. B., Waltman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+medium+for+the+selective+isolation+of+Edwardsiella+ictaluri%5BTitle%5D)+AND+%22J+Wildl+Dis%22%5BJournal%5D)">A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri.</a> J Wildl Dis. 26, 214-218 (1990).</li>
<li>Under animal toxicity studies, sodium chloride entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from:
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Under animal toxicity studies, sodium nitrate entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from:
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Under animal toxicity studies, sodium nitrite entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from:
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Vilz, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Assessment+of+Intestinal+Motility+and+Gut+Wall+Inflammation+in+Rodents%3A+Analyses+in+a+Standardized+Model+of+Intestinal+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation.</a> J Vis Exp. (67), e4086(2012).</li>
<li>Katoh, H. International Harmonization of Laboratory Animals. National Research Council (US) International Committee of the Institute for Laboratory Animal Research. Microbial Status and Genetic Evaluation of Mice and Rats: Proceedings of the 1999 US/Japan Conference. , National Academies Press. (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niektóre wyzwania wymagają okresu odpoczynku w czystym APW po leczeniu antybiotykami, aby lek został wyczerpany w tkankach ryb. Jeśli okres odpoczynku zostanie pominięty, obecność antybiotyku może zakłócić wyniki, zwłaszcza gdy test wiąże się z narażeniem na bakterie. W celu zbadania skutków zmienionego składu mikrobiomu bez dużych zmian w całkowitej liczbie drobnoustrojów na gospodarzu, wymagane byłyby wstępne eksperymenty monitorujące skład mikrobiomu (profilowanie 16S lub sekwencjonowanie całego genomu) i gęstość popu...

Ustalono, że antybiotyki mogą zaburzać ludzki mikrobiom, prowadząc do dysbiozy, co oznacza brak równowagi w społeczności mikrobiologicznej. Wykazano, że zmiana składu mikrobioty po leczeniu antybiotykami zmniejsza różnorodność społeczności, zmniejsza liczbę kluczowych członków i zmienia metabolizm społeczności, zwłaszcza w klasie gut<sup="xref">1,<klasa sup="xref">2. Zaburzenia mikrobiomu jelitowego spowodowane antybiotykami mogą zmniejszyć odporność na kolonizację Clostridium difficile3,4 i Salmonella5.
Dodatkowo, zakłócenie mikrobioty zostało powiązane z rozwojem wielu syndromów i chorób u ludzi (np. zapalenie jelit związane z antybiotykami, nieswoiste zapalenie jelit, zaburzenia metaboliczne, itp.). Antybiotyki są również szeroko stosowane w rolnictwie jako stymulatory wzrostu w produkcji zwierzęcej i drobiarskiej6. Stosowanie tych potężnych narzędzi nie jest pozbawione skutków ubocznych, co jest widoczne w szybkim wzroście oporności na antybiotyki, a także w skutkach zaburzonego mikrobiomu u zamieszkałego gospodarza. Wiele badań wykazało, że stosowanie antybiotyków o szerokim spektrum działania ma długotrwałe konsekwencje dla struktury i funkcji mikrobioty, jednak skutki uboczne mikrobiomu zaburzonego przez antybiotyki, wpływającego na fizjologię gospodarza, to tylko spekulacje, które nie zostały jeszcze potwierdzone.
Wzajemne oddziaływanie między gospodarzem, mikrobiotą i antybiotykami jest dalekie od zwięzłego zrozumienia. Dlatego prosty i łatwiejszy w obsłudze model jest korzystny dla rzucenia światła na bardzo złożony system ssaków. Powierzchnie błon śluzowych u ludzi, w tym jelita, są siedliskiem największej gęstości i różnorodności drobnoustrojów, a także najbardziej intymnych interakcji między drobnoustrojami a gospodarzem. Mikrobiom błony śluzowej skóry ryb ma kilka zalet jako system modelowy. Teleostei (ryba kostna) jest jedną z najwcześniejszych linii, które rozdzieliły się w kręgowcach, co oznacza, że teleosty mają zarówno wrodzone, jak i nabyte układy odpornościowe, które współewoluowały w związku ze społecznościami bakterii komensalnych7. Skóra ryb ma wiele cech wspólnych z powierzchniami błony śluzowej typu 1 ssaków, takich jak funkcje fizjologiczne, składniki odporności i rozmieszczenie komórek wytwarzających śluz8. Zewnętrzne położenie powierzchni błony śluzowej skóry ryb zapewnia mikrobiom, który można łatwo eksperymentalnie manipulować i pobierać próbki.
Zachodni komar, Gambusia affinis (G. affinis), to modelowa ryba, która była używana w przeszłości do badania krycia i toksykologii9,10,11. Biorąc pod uwagę niewielkie rozmiary, liczebność populacji w środowisku naturalnym jako gatunek inwazyjny, minimalne koszty opieki i odporną naturę, opracowaliśmy G. affinis jako model mikrobiomu błony śluzowej. Co więcej, Gambusia dzielą fizjologię rodzenia młodych z żyworodnymi ssakami, co jest rzadkie u gatunków ryb. Przeprowadziliśmy najobszerniejsze badanie dotyczące prawidłowej mikrobioty skóry ryb przy użyciu profilowania 16S z Gambusia12. Dalsze prace wykazały trzy negatywne skutki dla gospodarza wynikające z zakłócenia mikrobioty skóry i jelit przy użyciu antybiotyku o szerokim spektrum działania13.
Pięć różnych efektów zostało zbadanych u ryb po ekspozycji na antybiotyki. Najbardziej ugruntowaną korzyścią dla gospodarza dla mikrobiomu jest konkurencyjne wykluczenie patogenów. Wiadomo, że patogen ryb Edwardsiella ictaluri powoduje ogniska posocznicy jelitowej w komercyjnych hodowlach sumów14. Wykazano również, że E. ictaluri śmiertelnie infekuje danio pręgowanego15,16 i Gambusia17. Wyzwanie tym patogenem ze słupa wody może służyć jako miara wykluczenia. Dla porównania z podatnością na pojedynczy patogen przeprowadzono również przeżycie podczas ekspozycji na duże zagęszczenie organizmów mieszanych. Kał i gleba bogata w substancje organiczne były wykorzystywane jako powszechnie spotykane źródła zbiorowisk mikroorganizmów.
Inną ustaloną rolą, jaką pełni społeczność bakteryjna jelitowa, jest przetwarzanie składników odżywczych i zbieranie energii, wpływając w ten sposób na ogólne pobieranie składników odżywczych przez gospodarza. Jako ogólny pomiar wartości odżywczych, masa ciała ryb została porównana przed i po miesiącu karmienia standardową dietą. Ryby traktowane antybiotykiem jako średnia straciły na wadze, podczas gdy ryby kontrolne średnio przybrały na wadze w ciągu miesiąca. Mechanizm tego braku przyrostu masy ciała jest niejasny. Jednym z możliwych czynników przyczyniających się do tego jest czas pasażu pokarmu w jelitach. Metoda ruchliwości przewodu pokarmowego została zaadaptowana na podstawie danych z ryb zebry (Adam Rich, SUNY Brockport, komunikacja osobista) w celu określenia czasu tranzytu. Nie ustalono jeszcze, czy ryby poddane działaniu antybiotyków mają zmieniony czas pasażu.
Częstym wyzwaniem, którego doświadczają w naturalnym środowisku wszystkie organizmy, zwłaszcza ryby, jest stres osmotyczny. Wykazano, że Gambusia szybko przystosowuje się do ostrego stresu w wysokich stężeniach zasolenia18. Co zaskakujące, ryby z mikrobiomem zmienionym przez antybiotyk wykazywały obniżoną przeżywalność z powodu wysokiego stresu solnego. Mechanizm tego nowego fenotypu jest obecnie badany. Innym częstym stresem u zwierząt wodnych, zwłaszcza w akwariach, są toksyczne formy azotu (amoniak, azotany i azotyny). Przeżywalność przeciwko azotanom nie różniła się istotnie między rybami leczonymi antybiotykami i kontrolnymi. Metody przedstawione w tym manuskrypcie mogą być stosowane w przypadku Gambusia lub podobnych organizmów modelowych ryb, takich jak danio pręgowany i medaka, do pomiaru fenotypów ryb po manipulacji eksperymentalnej.

<table><tbody><tr><td>Ryfampicyna</td><td>Calbiochem</td><td>557303-1GM</td><td></td></tr><tr><td>Azotan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>znakowany fluoresceiną 70 kDa anionowy dekstran</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) Tabletki</td><td>Calbiochem</td><td>6500-OP</td><td>rozpuszczają się w wodzie, aby wytworzyć PBS</td></tr></tbody></table>

badanie fenotypów gospodarza w gambusia affinis po leczeniu antybiotykami

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Powszechność stosowania antybiotyków w medycynie oznacza, że zrozumienie wynikających z tego konsekwencji dla gospodarza jest niezbędne. Antybiotyki często zmniejszają różnorodność społeczności mikrobiomu gospodarza i zmieniają skład społeczności drobnoustrojów. Wiele chorób, takich jak zapalenie jelit związane z antybiotykami, nieswoiste zapalenie jelit i zaburzenia metaboliczne, powiązano z zaburzoną mikrobiotą. Złożona interakcja między gospodarzem, mikrobiomem i antybiotykami wymaga elastycznego modelu do badania interakcji gospodarz-mikrobiom. Nasze słodkowodne ryby kręgowe służą jako użyteczny model do badania uniwersalnych aspektów struktury i funkcji mikrobiomu błony śluzowej, a także do analizowania wynikających z wpływu gospodarza na społeczność drobnoustrojów. Metody obejmują wyzwania związane z gospodarzem, takie jak zakażenie znanym patogenem ryb, narażenie na drobnoustroje kałowe lub glebowe, stres osmotyczny, toksyczność azotanów, analiza wzrostu i pomiar ruchliwości jelit. Techniki te demonstrują elastyczny i użyteczny system modelowy do szybkiego określania fenotypów gospodarza.

Ogólny schemat układu eksperymentalnego wykorzystanego do badania wpływu ekspozycji na antybiotyki u ryb gospodarzy13 przedstawiono na Rysunku 1A; obejmuje on technikę ekstrakcji mikrobiomu skóry (Rysunek 1B) oraz jelit (Rysunek 1C) z ryb. Wybrano trzy dni jako okres ekspozycji na antybiotyk, ponieważ wcześniejsze dane wskazują, że choć całkowita liczba kulturatywnych drobnoustrojów na skórze spada na początku lecz...

To badanie obejmuje metody mające na celu ujawnienie wpływu na modelowego gospodarza ryb po zmianie składu społeczności mikrobiomu skóry i jelit przez antybiotyk.

Badanie fenotypów gospodarza w Gambusia affinis po leczeniu antybiotykami

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Ogólnym celem tego systemu eksperymentalnego jest zbadanie negatywnych skutków ubocznych dla organizmu gospodarza po zastosowaniu antybiotykoterapii. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny mikrobiomu, takie jak skutki uboczne związane z antybiotykami, które wpływają na zdrowie gospodarza poprzez zaburzenie mikrobiomu. Głównymi zaletami tej techniki są prostota systemu, niski koszt badania fenotypów fizjologicznych kręgowców oraz możliwość nieinwazyjnego zaburzenia mikrobiomu śluzówkowego.Implikacje tej techniki charakteryzują sposób, w jaki zaburzenia mikrobiomu zwierzęcia mogą prowadzić do poważnych skutków ubocznych. W celu rozpoczęcia, wykonaj posiew metodą smugowy wcześniej pozyskanego i zamrożonego zakaźnego szczepu Edwardsiella ictaluri na selektywnym i różnicującym agarze dla E.Ictaluri. Inkubuj kulturę w temperaturze 27 °C przez dwa dni.Przenieś czystą, wyizolowaną kolonię z hodowli i zaszczep kolbę o pojemności 150 ml zawierającą 40 ml pożywki nutrient broth. Umieść kolbę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 27 °C i przy 150 RPM przez dwa dni. Po inkubacji, w celu skalibrowania hodowli E.Ictaluri dla pożądanych objętości dawki zakaźnej, uż

examination-host-phenotypes-gambusia-affinis-following-antibiotic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Bernut, A. i in., Rozszyfrowanie i obrazowanie patogenezy oraz układania korzeni Mycobacterium abscessus w embrionach danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2015).Ten film pokazuje protokół izolowania i ilościowego określania ropnia Mycobacterium z zakażonego zarodka danio pręgowanego. Procedura obejmuje eutanazję zarodków, lizę tkanek oraz homogenizację w celu uwolnienia bakterii, a następnie wirowanie i ponowną zawiesinę w buforze powierzchniowo czynnym. Na koniec zawiesina bakteryjna jest...

Izolacja i hodowla bakterii z zarodków danio dano w celu oceny obciążenia infekcją

Źródło: Le, T. A. N., i in., Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Jelit of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje test oparty na fluorescencji mającycy na celu ilościową przepuszczalność jelit u osób C. elegans, które były narażone na Pseudomonas aeruginosa. W porównaniu z kontrolami karmionymi Escherichia coli, robaki poddane patogenom wykazują zwiększoną przeciekliwość fluoroforu do jamy ciała, co wskazuje na uszkodzenie bariery nabłonkowej.

Ocena przepuszczalności jelit u C. elegans po ekspozycji na bakterie

Ten film demonstruje metodę ilościowego określania infekcji grzybiczej u larw danio pręgowanego. Zarodniki grzybów są mikrowstrzykiwane do larwalnej komory tyłomózgowia, a larwy są inkubowane, aby umożliwić rozwój infekcji. Zakażone larwy są zbierane w określonych odstępach czasu, a postęp infekcji ocenia się poprzez wyliczenie jednostek tworzących kolonie.

Technika ilościowego określania infekcji grzybiczej u larw danio pręgowanego

Optycznie przezroczyste embriony danio pręgowanego są szeroko stosowane do badania i wizualizacji w czasie rzeczywistym interakcji między patogennymi mikroorganizmami a wrodzonymi komórkami odpornościowymi. Mikroiniekcja Mycobacterium abscessus, w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, służy do badania podstawowych cech chorobotwórczych, takich jak tworzenie się pępowiny w zarodkach danio pręgowanego.

Rozszyfrowywanie i obrazowanie patogenezy i sznurowania Mycobacterium abscessus w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje użycie wymazów z miski olejowej i analizy osadu w systemach danio pręgowanego, co prowadzi do zwiększenia wykrywalności w porównaniu do samego użycia wartowników do wykrywania patogenów, takich jak Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa. Zaproponowano również system monitorowania jaj P. tomentosa w kwarantannie.

Badania przesiewowe środowiskowe Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa w systemach danio pręgowanego

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Danio rerio) stają się powszechnie używanym modelem zwierzęcym kręgowców do kolonizacji i patogenezy mikrobiologicznej. Protokół ten opisuje zastosowanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji przenoszonych przez żywność u larw danio pręgowanego. P. caudatum łatwo internalizuje bakterie i jest wchłaniany przez larwy danio pręgowanego poprzez naturalne zachowania żerowania.

Wykorzystanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji przenoszonych przez żywność u larw danio pręgowanego

Ten protokół opisuje model infekcji Aspergillus u larw danio pręgowanego. Zarodniki Aspergillus są mikrowstrzykiwane do tyłomózgowia larw, a leczenie chemiczne stosuje się w celu wywołania immunosupresji. Postęp infekcji jest monitorowany za pomocą codziennego zestawu do obrazowania w celu monitorowania wzrostu grzybów i odpowiedzi immunologicznej, a także liczenia żywych zarodników przez posiewanie jednostek tworzących kolonie.

Zakażenie larw danio pręgowanego zarodnikami Aspergillus w celu analizy interakcji gospodarz-patogen

Ten artykuł przedstawia protokół do badania wpływu poszczególnych bakterii jelitowych komarów, w tym izolację i identyfikację mikrobów hodowlanych w jelicie środkowym komarów, antybiotykowe zubożenie bakterii jelitowych komarów i ponowne wprowadzenie jednego konkretnego gatunku bakterii.

Bakteryjny test żywienia doustnego z komarami leczonymi antybiotykami

Obecnie brakuje modeli in vivo , które można by poddać badaniom przesiewowym w kierunku przewlekłych zakażeń bakteryjnych. W tym miejscu opisujemy protokół zakażenia rany za pomocą izolatu klinicznego Pseudomonas aeruginosa w celu wywołania trwałej infekcji u larw danio pręgowanego.

Modelowanie uporczywego zakażenia Pseudomonas aeruginosa u zranionych larw danio pręgowanego

Poznaj metodę badania fenotypów gospodarza Gambusia affinis po leczeniu antybiotykami. Technika ta pozwala nieinwazyjnie zakłócać mikrobiom błon śluzowych i analizować fizjologiczne skutki uboczne u ryb.

Badanie fenotypów gospodarza w Gambusia affinis po leczeniu antybiotykami

Przeglądaj więcej filmów