Name: Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek i analizy 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca badawcza przedstawiona w tym manuskrypcie została wsparta grantem R01 HL121456-01A1 dla Kathryn Sandberg. Prace te były dodatkowo wspierane przez dostępność Leica SP8 AOBS w Microscopy and Imaging Shared Resource (MISR) w Georgetown University Medical Center, który jest częściowo finansowany przez P30-CA051008 z National Institutes of Health of the United States of America. Wyrażamy wdzięczność za pomoc w obrazowaniu Leica SP8 przez Petera Johnsona oraz za użycie Zeiss LSM880 w laboratorium Thomasa Coate'a z Wydziału Biologii Uniwersytetu Georgetown z pomocą w obrazowaniu zapewnioną przez Almę Arnold z Carl Zeiss Microscopy LLC. Wyłączną odpowiedzialność za treść tego manuskryptu ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health.

<ol><li>Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+angiotensin+II+type+1A+receptor+intracellular+retention%2C+degradation%2C+and+recycling+by+Rab5%2C+Rab7%2C+and+Rab11+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases.</a> J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).</li>
<li>Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+trafficking+of+angiotensin+II+and+its+AT1+and+AT2+receptors%3A+evidence+for+selective+sorting+of+receptor+and+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand.</a> Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).</li>
<li>Hunyady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+PI+3-kinase+dependence+of+early+and+late+phases+of+recycling+of+the+internalized+AT1+angiotensin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor.</a> J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).</li>
<li>Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+angiotensin+II+in+rat+myometrial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells.</a> Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).</li>
<li>Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab4+and+Rab11+coordinately+regulate+the+recycling+of+angiotensin+II+type+I+receptor+as+demonstrated+by+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> J Biomed Opt. 13 (3), 031206(2008).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton-dependent+Rab+GTPase-regulated+angiotensin+type+I+receptor+lysosomal+degradation+studied+by+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> J Biomed Opt. 15 (5), 056003(2010).</li>
<li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1+prevents+maturation+of+autophagic+vacuoles+by+inhibiting+fusion+between+autophagosomes+and+lysosomes+in+rat+hepatoma+cell+line%2C+H-4-II-E+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells.</a> Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).</li>
<li>Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+angiotensin+II+activates+rat+myometrium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular angiotensin II activates rat myometrium.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).</li>
<li>Fortian, A., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+fluorescence+imaging+reveals+high+stoichiometry+of+Grb2+binding+to+the+EGF+receptor+sustained+during+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).</li>
<li>Aymerich, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+G-protein-coupled+receptor+imaging+to+understand+and+quantify+receptor+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22ScientificWorldJournal%22%5BJournal%5D)">Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics.</a> ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).</li>
<li>Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+Detection+of+Diversity+and+Bias+in+GPCR+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26(2014).</li>
<li>Inuzuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+ligand-induced+activation+of+angiotensin+II+type+1+receptor+signaling+by+the+type+2+receptor+via+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase.</a> C. Sci Rep. 6, 21613(2016).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+angiotensin+receptor+signaling+through+Erk1%2F2+pathway+by+a+novel+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li>
<li>Mueller, S. C., Hubbard, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+asialoglycoproteins+by+rat+hepatocytes%3A+receptor-positive+and+receptor-negative+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes.</a> J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).</li>
<li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670(2015).</li>
<li>Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+of+Lysotracker+Red+to+a+green+fluorescent+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule.</a> Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).</li>
<li>Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1%2C+a+specific+inhibitor+of+vacuolar-type+H%28%2B%29-ATPase%2C+inhibits+acidification+and+protein+degradation+in+lysosomes+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells.</a> J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawione tutaj wstępne eksperymenty pokazują, że w dość krótkim czasie trwającym 24 minuty nie nastąpiła żadna znacząca zmiana w dostarczaniu AT1aR-GFP do lizosomów. Ogólnie rzecz biorąc, dostarczenie zinternalizowanych receptorów do lizosomów może nastąpić już po 15-20 minutach. Eksperyment ten jest zgodny z hipotezą, że większość zinternalizowanego AT1aR jest ukierunkowana na duże, okołojądrowe endosomy. Dowody na to, że przynajmniej część AT1aR dociera do lizosomów, zostały wykaza...

Ogólnym celem jest uzyskanie ilościowych dowodów w czasie i przestrzeni kolokalizacji receptora z określonymi organellami subkomórkowymi po leczeniu agonistą receptora. W związku z tym bezpośrednim celem jest uchwycenie poklatkowych obrazów konfokalnych lizosomów i transbłonowego receptora obejmującego całą błonę w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych (HEK) po transfekcji, a następnie zebranie i przeanalizowanie danych obrazowania w 3D w celu ilościowego pomiaru dostarczania receptora do lizosomów. Badanie jednoczesnego transportu receptora transbłonowego z lizosomami lub innymi organellami podczas endocytozy, gdy jest aktywowany przez ligand receptora, może pomóc w ustaleniu, w jaki sposób receptor transbłonowy jest regulowany w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.
AT1aR przypuszcza się, że ulega degradacji w lizosomach po leczeniu Ang II w modelowych systemach komórkowych, głównie HEK293 1, chociaż większość receptorów jest przede wszystkim zlokalizowana w endosomach recyklingu wielopęcherzykowego w celu późniejszego recyklingu do błony plazmatycznej, podczas gdy większość liganda, Ang II, jest degradowana w lizosomie <klasa sup="xref">2,3, 4,5. Niedawno Li i in. wykazali, używając technik rezonansowego transferu energii rezonansu Förstera (FRET) i mikroskopii obrazowania fluorescencji czasu życia (FLIM), że AT1aR kolokalizuje się (w skali ~10 nm) z LAMP1, lizosomalnym białkiem błonowym, co sugeruje, że przynajmniej część receptora jest ukierunkowana i degradowana przez lizosomy 6. Autorzy ci zauważyli, że inhibitor lizosomalny chlorochina blokował asocjację AT1aR-LAMP1, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami sugerującymi, że efektem chlorochiny jest blokowanie fuzji późnych endosomów lub autofagosomów z lizosomami. Inne pośrednie podejścia do określania lokalizacji AT1aR w lizosomach wykorzystywały bafilomycynę, inhibitor lizosomów do wnioskowania o obecności AT1aR w lizosomach 3,4,5,6,7,8.
Obrazowanie żywych komórek pozwala uniknąć potencjalnego wpływu fiksacji na objętość komórki oraz utraty/ściemnienia/redystrybucji receptora chimerycznego GFP. Poprzednie badania opierały się na stałych komórkach w celu określenia kolokalizacji lub współwystępowania receptora z lizosomami lub przy użyciu żywych komórek znakowanych surogatami wiążącymi receptor, takimi jak β-arrestin 1,2,3,4,5,6. Obrazowanie żywych komórek innych GPCR za pomocą konfokalnych mikroskopów konfokalnych z wirującym dyskiem lub laserowym skaningiem punktowym wyposażonych w detektory GaASP lub HyD umożliwiło badaczom obserwację internalizacji i transportu receptorów w pojedynczych komórkach obrazowanych w stosach z w odstępach 30 s 9,10. Jednak nawet wtedy, gdy stosy z żywych komórek są szybko zbierane, analiza może nastąpić tylko po wybraniu pojedynczej płaszczyzny w każdym stosie, tj. w 2D 10. Chociaż może to być wystarczające do badania zinternalizowanego GPCR lub receptora kinazy tyrozynowej, o którym mowa, AT1aRs gromadzi się w pęcherzykach, które zmieniają rozmiar i położenie w czasie, a zatem są z natury trudniejsze do odpowiedniego pobrania próbki przy użyciu reprezentatywnego pojedynczego wycinka w każdym punkcie czasowym. Aby dokładnie określić drogę znakowanego AT1aR przez komórkę i wykryć każdą subpopulację pęcherzyków różniących się wielkością i położeniem, opracowaliśmy metodę obrazowania 3D i analizy 3D w celu śledzenia tych zmian i do stosowania w połączeniu z znakowaniem różnych przedziałów wewnątrzkomórkowych, takich jak lizosomy.
Badacze mogą korzystać z tego protokołu do obrazowania żywych komórek, aby bezpośrednio wizualizować ruch AT1aR do komórki i jego transfer do subkomórkowych przedziałów po stymulacji Ang II. Przedziały subkomórkowe są oznaczone fluorescencyjnymi chimerami białkowymi lub innymi markerami fluorescencyjnymi. Protokół ten może być również stosowany jako pierwsze podejście do lokalizacji receptorów w organellach subkomórkowych z minimalną rozdzielczością 200 nm w celu porównania receptorów zmutowanych i dzikich lub wykrycia zmian po leczeniu farmakologicznym. Technika ta jest dostępna, ponieważ można ją przeprowadzić na dowolnym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w obrazowanie żywych komórek. Względna łatwość tego podejścia kontrastuje ze zwiększoną wiedzą specjalistyczną i sprzętem potrzebnym do przeprowadzania technik FRET/FLIM/BRET, które wykrywają interakcje molekularne 6,11. Pomiary te definiują interakcje białko-białko w wysokiej rozdzielczości (~10 nm) i można wywnioskować lokalizację w organellach subkomórkowych. Te bardziej zaawansowane techniki są wykorzystywane do śledzenia i dalszego definiowania interesujących interakcji molekularnych, a nie przechodzenia receptorów przez przedziały subkomórkowe, i bezpośrednio pokazują interakcje białko-białko w określonym czasie i miejscu w komórce 11. FLIM, technika FRET niezależna od stężenia akceptora, jest najczęściej wykonywana na stałych próbkach, ponieważ akwizycja obrazu jest wolniejsza. W przeciwieństwie do tego, stosunek FRET zapewnia szybkie obrazowanie i kolokalizację oddziałujących białek w wysokiej rozdzielczości. Wadą ratio FRET jest to, że obrazowanie wykorzystuje epi-fluorescencję szerokokątnego, aby zwiększyć szybkość obrazowania i objąć całą komórkę, co skutkuje zmniejszoną rozdzielczością i kontrastem organelli 12. Transfer energii rezonansu bioluminescencyjnego (BRET) to kolejna zaawansowana technika, która została zastosowana do GPCR do pomiaru nabycia bliskości molekularnej w czasie 11. W tej technice białko fluorofor jest dzielone molekularnie, a każda połowa jest połączona z jednym z dwóch badanych białek. Kiedy dwa interesujące białka wiążą się ze sobą, części znacznika chimerycznego łączą się ponownie, aby uzyskać fluorescencję i zwiększoną fluorescencję określoną ilościowo w czasie.
Tutaj prezentujemy prostą technikę obrazowania żywych komórek w połączeniu z kwantyfikacją obrazu do badania transportu AT1aR w komórce po stymulacji Ang II oraz potencjalnej zmiany w dostarczaniu zinternalizowanego AT1aR do lizosomów po stymulacji Ang II. Ostatecznym zastosowaniem tej techniki jest scharakteryzowanie różnic w transporcie błonowym, porównując receptory typu dzikiego i zmutowanego. Różnice te pomogą zidentyfikować mechanizm (mechanizmy), które wpływają na fizjologiczne działanie AT1aR, prowadząc do regulacji ciśnienia krwi.

<table><tbody><tr><td>Angiotensyna II (Ang II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9525&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x)</td><td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td><td>11960-044</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem&nbsp;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Ciepła w 37 & stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna (Pen Strep)</td><td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco (life technologies)</td><td>25030-081</td><td>Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Ludzka nerka embrionalna (HEK)-293 komórki</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)&nbsp;</td><td>CRL-1573</td><td>Przejście numer 5 - 12</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II komorowy 1.5 Niemiecki system szkła nakrywkowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Przechowywać pod kątem 4 stopni; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM, Zredukowana surowica Medium</td><td>Gibco- ThermoFisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>Ciepłe w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>PBS 10x&nbsp;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x)&nbsp;</td><td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td><td>31053-028</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>LysoTracker Red DND-99</td> -ThermoFisher Scientific <td>L7528</td><td>Przechowywać porcjkwotowania w ciemności w temperaturze -20 & stopni; C .&nbsp;</td></tr><tr><td>Volocity Ver. 6.3 Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Moduły wizualizacji i kwantyfikacji</td><td>PerkinElmer</td><td>Do analizy obrazów 3D stosów obrazów</td></tr><tr><td>Leica SP8 AOBS</td><td>Leica Microsystems</td><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Do zbierania obrazów</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>Carl Zeiss</td><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Do zbierania obrazów</td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek i analiza 3d transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Obrazowanie żywych komórek jest używane do jednoczesnego przechwytywania obrazów poklatkowych receptorów angiotensyny typu 1a (AT1aR) i wewnątrzkomórkowych przedziałów w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerki-293 (HEK) po stymulacji angiotensyną II (Ang II). Komórki HEK są przejściowo transfekowane plazmidowym DNA zawierającym AT1aR znakowane wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji (EGFP). Lizosomy identyfikuje się za pomocą czerwonego barwnika fluorescencyjnego. Obrazy żywych komórek są rejestrowane na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym po stymulacji Ang II i analizowane przez oprogramowanie w trzech wymiarach (3D, woksele) w czasie. Obrazowanie żywych komórek umożliwia prowadzenie badań nad transportem receptorów i pozwala uniknąć zakłóceń związanych z fiksacją, a w szczególności utraty lub artefaktowego przemieszczenia receptorów błonowych znakowanych EGFP. W ten sposób, gdy poszczególne komórki są śledzone w czasie, można obrazować i mierzyć subkomórkową lokalizację receptorów. Obrazy muszą być uzyskiwane wystarczająco szybko, aby uchwycić szybki ruch pęcherzyków. Jednak przy większych prędkościach obrazowania liczba zbieranych fotonów jest zmniejszona. Należy również pójść na kompromis w doborze parametrów obrazowania, takich jak rozmiar woksela, aby zwiększyć szybkość obrazowania. Znaczące zastosowania obrazowania żywych komórek to między innymi badanie transportu białek, migracji, proliferacji, cyklu komórkowego, apoptozy, autofagii oraz interakcji i dynamiki białko-białko.

W tym reprezentatywnym zestawie eksperymentów komórki HEK przetransfekowano konstruktem receptora angiotensyny typu 1a (AT1aR-GFP) (E1,2,3-AT1aR) sklonowanym do plazmidu pEGFP-N213. Obrazy time-lapse komórek HEK zostały zarejestrowane i odtworzone w formie filmu (Patrz: Filmy Live Cell Imaging 1 oraz Live Cell Imaging 2). Filmy i zdjęcia pokazują, że po stymulacji ligandem receptory AT1aR-EGFP lokal...

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania komórek wyrażających receptory angiotensyny typu 1a znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zainicjowanej przez leczenie angiotensyną II. Technika ta obejmuje znakowanie lizosomów drugim markerem fluorescencyjnym, a następnie wykorzystanie oprogramowania do analizy kolokalizacji receptora i lizosomu w trzech wymiarach w czasie.

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Ogólnym celem niniejszego doświadczenia jest uzyskanie ilościowych dowodów przestrzennych i czasowych na kolokalizację receptorów angiotensyny typu 1 z lizosomami po podaniu angiotensyny II. Metoda ta została opracowana w celu wykrycia różnic wyprocesowaniu wewnątrzkomórkowym receptorów typu Y w porównaniu z receptorami zmutowanymi podczas procesu internalizacji, który zachodzi w odpowiedzi na stymulację ligandem. Zaletą tej techniki jest obrazowanie żywych komórek, co eliminuje artefakty wynikające z utrwalania i permeabilizacji komórek detergentami, a także możliwość oceny dynamicznych zmian w lokalizacji receptorów w czasie rzeczywistym.Zacznij od wybrania odpowiedniego obiektywu o aperturze numerycznej 1,4 i wycentrowania go nad stolikiem mikroskopu. Nanieś kroplę oleju imersyjnego o wysokiej lepkości i niskiej autofluorescencji na obiektyw, a następnie przenieś komorę z transfektowanymi komórkami na stolik mikroskopu. Delikatnie podnoś obiektyw, aż olej dotknie spodu pierwszego preparasu, i zlokalizuj słabo świecące komórki.Gdy zdrowa komórka badawcza znajduje się w centrum pola widzenia, przełącz urządzenie w tryb konfokalny i upewnij się, że komórka jest dobrze rozprzestrzeniona, a jej strona brzuszna ściśle przylega do szkiełka nakrywkowego. Otwórz okno dialogowe Z Stack, kliknij Live, ustaw ostrość na górną część komórki, a następnie kliknij Begin. Następnie ustaw ostrość na dolną część komórki, wprowadź wielkość kroku Z wynoszącą 1.00 micrometer i kliknij End.Następnie w ustawieniach akwizycji (Acquisition settings) u góry wybierz tryb XYZT. Na koniec ustaw odstęp czasowy skanowania oraz całkowity czas skanowania, aby zaobserwować kierowanie receptora angiotensyny typu 1A znacznikowanego GFP do lizosomów. Aby rozpocząć stymulację ligandem, dodaj 3 µL 100-krotnego roztworu zapasowego liganda do studzienki, która jest obrazowana, a następnie kliknij Start, aby obrazować odpowiedź w 3D przez wybrany czas i z określoną częstotliwością.Aby przeanalizować obrazy żywych komórek, otwórz odpowiednie oprogramowanie do ilościowego obrazowania 3D. W niniejszym protokole jest to Velocity. Kliknij prawym przyciskiem myszy w polu obrazu i wybierz Właściwości.Wprowadź odpowiednie właściwości pikseli obrazu XY i Z w celu utworzenia sekwencji pomiarowej do analizy intensywności pęcherzyków receptorowych znakowanych GFP oraz całej komórki w odpowiedzi na traktowanie ligandem. W menu 2D wybierz tryb rozszerzonego ogniskowania (extended focus), aby zaobserwować komórkę. Następnie użyj narzędzia obszaru dowolnego (freestyle region), aby narysować obszar zainteresowania wokół komórki, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na obraz i wybierz opcję Crop to Selection.Zostanie wygenerowany nowy element obrazu. Kliknij nazwę obrazu, aby wybrać przycięty obraz komórki i otworzyć kartę pomiarów. Aby zmierzyć ekspresję GFP w zinternalizowanych pęcherzykach, przeciągnij funkcję Find Objects z sekcji Finding do powyższego pola sekwencji.Ustaw kanał wyszukiwania obiektów na GFP i otwórz ikonę ustawień, aby ustawić próg na odchylenie standardowe, a dolną granicę na sześć, w celu wyboru obiektów o najwyższej intensywności sygnału GFP. Ustaw minimalny rozmiar obiektu na 0 µm³. Następnie kliknij pomiar i wybierz kanały oraz rodzaje pomiarów.Aby zdefiniować progi i filtry służące do identyfikacji całej komórki oraz pomiaru całkowitej intensywności GFP, przeciągnij drugie pole Find Objects. Następnie ustaw kanał Find Objects na GFP, a odchylenie standardowe na zero, aby wybrać obiekty o dowolnej intensywności GFP, oraz ustaw minimalny rozmiar obiektu na 2 µm³. Przeciągnij Filter Population do pola Population drugiego modułu Find Objects i wybierz objętość w µm³ większą niż 100, aby zaznaczyć całą komórkę i wyeliminować wszystkie mniejsze obiekty.Następnie wybierz pomiary oraz pozycję Make Measurement, aby wykonać pomiar we wszystkich punktach czasowych. Aby przeanalizować zmierzoną ekspresję GFP w pęcherzykach oraz w całej komórce w czasie, kliknij nazwę pliku pozycji pomiarowej pod nazwą obrazu. Aby wyodrębnić dane dla GFP i pęcherzyków z całkowitej puli danych, otwórz zakładkę raw i wybierz population one.Następnie otwórz zakładkę analizy i klikając prawym przyciskiem myszy na dane, wybierz opcję analizy, a następnie ogranicz analizę do populacji jeden. Aby zmierzyć ilość GFP w całej komórce, zmień oba parametry na populację dwa. W sekcjach Analiza tych danych oraz Podsumowane według wybierz sumę kanału koloru GFP oraz sumę.Następnie w sekcji Organize the data by i w polu row wybierz time point. Aby wyekstrahować dane dotyczące ilości GFP w lizosomach, w oknie Find Objects dla pierwszej populacji ustaw find objects channel na kanał czerwony. W ikonie koła zębatego w polu dialogowym ustaw threshold using na standard deviation, lower limit na sześć, aby wybrać czerwone obiekty o najwyższej intensywności, oraz minimum object size na 0,017 µm³.Wybierz pomiary i utwórz element pomiarowy, aby przeprowadzić pomiary we wszystkich punktach czasowych. Aby przeanalizować zmierzoną ekspresję GFP w lizosomach, kliknij nazwę pliku elementu pomiarowego pod nazwą obrazu. W karcie „raw” wybierz populację 1, a następnie w karcie „analyze” wybierz populację 1, sumę kanału koloru GFP oraz sumę, klikając prawym przyciskiem myszy jak poprzednio, aby zmierzyć ilość GFP w czerwonych pęcherzykach.Przed stymulacją ligandem receptory angiotensyny typu 1A znakowane GFP lokalizują się głównie w błonie komórkowej. Jednak w ciągu 2,5 minuty od dodania angiotensyny II receptory te ulegają internalizacji, tworząc jasne pęcherzyki, a następnie skupiając się w duże pęcherzyki paranuklearne. Indukowane przez angiotensynę II marszczenie błony utrudnia kwantyfikację całkowitej intensywności GFP w pęcherzykach, co obrazują przedstawione reprezentatywne dane z pomiaru ekspresji GFP.Filtracja wielkościowa nie pozwala odróżnić większych fałd błonowych od skupisk pęcherzyków, ale wykazuje, że poziom GFP w mniejszych obiektach wzrasta szybciej niż w obiektach większych. Na tym reprezentatywnym przebiegu czasowym ekspresji GFP bez funkcji autofocus, zmierzoną wartość zinternalizowanego GFP przedstawiono jako procent całkowitego GFP w komórce. Analiza całkowitej ilości GFP wewnątrz komórki wykazała, że w badanej komórce nie wystąpiło znaczącego fotowyblakania w czasie.Ilościowe oznaczenie GFP w lizosomach transfekowanych komórek wskazuje również, że intensywność sygnału receptora angiotensyny typu 1A obecnego w lizosomach nie zmienia się do 24 minut po podaniu angiotensyny II. Podczas tej procedury ważne jest monitorowanie stanu zdrowia komórek przed obrazowaniem i w jego trakcie; ze względu na czasochłonność procedury eksperyment należy przerwać, jeśli kultury komórkowe wykazują jakiekolwiek nieprawidłowości. Po wykonaniu tej procedury można zastosować immunobarwienie oraz FRET lub FLIM w celu wykrycia i potwierdzenia subkomórkowej lokalizacji receptorów.W celu zidentyfikowania i przeanalizowania zmian w cząsteczkach sygnałowych zaangażowanych w transport receptorów można przeprowadzić analizę Western blot. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiąść gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania obrazowania i analizy żywych komórek w celu pomiaru indukowanego ligandem kierowania receptorów błonowych do lizosomów, a także do innych przedziałów subkomórkowych.

live-cell-imaging-3d-analysis-angiotensin-receptor-type-1a

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kardiomiocyty dorosłych są komórkami pierwotnymi, które można wyizolować z serc zwierząt i hodować przez kilka dni. W tym okresie hodowli można zastosować adenowirusowy transfer genów w celu ekspresji genetycznie kodowanych biosensorów (GEB) lub fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Obie metody umożliwiają badania komórkowe z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Izolacja i manipulacja genetyczna kardiomiocytów dorosłych do obrazowania konfokalnego

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Niniejszy artykuł opisuje metodologię wyznaczania odpowiedzi chemotaktycznej leukocytów na specyficzne ligandy oraz identyfikacji oddziaływań między receptorami powierzchniowymi komórek a białkami cytozolowymi przy użyciu technik obrazowania żywych komórek.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek zapośredniczonej przez leukotrien B4 oraz oddziaływań BLT1 z β-arrestyną

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Opracowaliśmy platformę programową wykorzystującą Imaris Neuroscience, ImarisXT oraz MATLAB do pomiaru zmian morfologii nieokreślonego kształtu uzyskanego z trójwymiarowej konfokalnej fluorescencji pojedynczych komórek. To nowatorskie podejście może być wykorzystane do ilościowego określania zmian w kształcie komórek po aktywacji receptorów, stanowiąc tym samym potencjalne dodatkowe narzędzie w procesie odkrywania leków.

Narzędzie analityczne do ilościowej oceny zmian morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Ten protokół opisuje metodę obrazowania żywych komórek przy użyciu pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji lentiwirusowej i adenowirusowej za pomocą konfokalnej mikroskopii wirującego dysku. Umożliwia to szczegółowe obserwacje procesów komórkowych w żywych kardiomiocytach.

Obrazowanie żywych komórek pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji adenowirusowej i lentiwirusowej przy użyciu konfokalnej mikroskopii wirującego dysku

Łącząc transplantację komórek, znakowanie cytoszkieletu i podejście do utraty/wzmocnienia funkcji, ten protokół opisuje, w jaki sposób migrująca prospektywna płytka przedstrunowa danio pręgowanego może być wykorzystana do analizy funkcji genu kandydującego w migracji komórek in vivo.

Analiza migracji komórek in vivo przy użyciu przeszczepów komórek i obrazowania poklatkowego w zarodkach danio pręgowanego

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię identyfikacji i ilościowego określania funkcjonalnych podzbiorów limfocytów T obecnych w mysich nerkach, aorcie i węzłach chłonnych za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego i cytometrii przepływowej. Model nadciśnienia indukowanego angiotensyną II został wybrany, aby krok po kroku wyjaśnić procedury i podstawowe zasady cytometrii przepływowej i barwienia wewnątrzkomórkowego.

Barwienie wewnątrzkomórkowe i cytometria przepływowa w celu identyfikacji podzbiorów limfocytów w obrębie mysiej aorty, nerek i węzłów chłonnych w modelu nadciśnienia tętniczego

Ten manuskrypt opisuje zastosowanie transgenicznych myszy reporterowych i różnych dróg podawania barwników fluorescencyjnych w nadciśnieniu wywołanym angiotensyną II za pomocą przyżyciowej mikroskopii wideo naczyń krwionośnych do oceny aktywacji komórek odpornościowych i ich zdolności do zwijania się i przylegania do śródbłonka.

Wizualizacja wałowania i adhezji leukocytów u myszy z infuzją angiotensyny II: techniki i pułapki

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek i analizy 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów