Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej
27 marca 2017
Tutaj prezentujemy protokół obrazowania komórek wyrażających receptory angiotensyny typu 1a znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zainicjowanej przez leczenie angiotensyną II. Technika ta obejmuje znakowanie lizosomów drugim markerem fluorescencyjnym, a następnie wykorzystanie oprogramowania do analizy kolokalizacji receptora i lizosomu w trzech wymiarach w czasie.
Ogólnym celem niniejszego doświadczenia jest uzyskanie ilościowych dowodów przestrzennych i czasowych na kolokalizację receptorów angiotensyny typu 1 z lizosomami po podaniu angiotensyny II. Metoda ta została opracowana w celu wykrycia różnic wyprocesowaniu wewnątrzkomórkowym receptorów typu Y w porównaniu z receptorami zmutowanymi podczas procesu internalizacji, który zachodzi w odpowiedzi na stymulację ligandem. Zaletą tej techniki jest obrazowanie żywych komórek, co eliminuje artefakty wynikające z utrwalania i permeabilizacji komórek detergentami, a także możliwość oceny dynamicznych zmian w lokalizacji receptorów w czasie rzeczywistym.
Zacznij od wybrania odpowiedniego obiektywu o aperturze numerycznej 1,4 i wycentrowania go nad stolikiem mikroskopu. Nanieś kroplę oleju imersyjnego o wysokiej lepkości i niskiej autofluorescencji na obiektyw, a następnie przenieś komorę z transfektowanymi komórkami na stolik mikroskopu. Delikatnie podnoś obiektyw, aż olej dotknie spodu pierwszego preparasu, i zlokalizuj słabo świecące komórki.
Gdy zdrowa komórka badawcza znajduje się w centrum pola widzenia, przełącz urządzenie w tryb konfokalny i upewnij się, że komórka jest dobrze rozprzestrzeniona, a jej strona brzuszna ściśle przylega do szkiełka nakrywkowego. Otwórz okno dialogowe Z Stack, kliknij Live, ustaw ostrość na górną część komórki, a następnie kliknij Begin. Następnie ustaw ostrość na dolną część komórki, wprowadź wielkość kroku Z wynoszącą 1.00 micrometer i kliknij End.
Następnie w ustawieniach akwizycji (Acquisition settings) u góry wybierz tryb XYZT. Na koniec ustaw odstęp czasowy skanowania oraz całkowity czas skanowania, aby zaobserwować kierowanie receptora angiotensyny typu 1A znacznikowanego GFP do lizosomów. Aby rozpocząć stymulację ligandem, dodaj 3 µL 100-krotnego roztworu zapasowego liganda do studzienki, która jest obrazowana, a następnie kliknij Start, aby obrazować odpowiedź w 3D przez wybrany czas i z określoną częstotliwością.
Aby przeanalizować obrazy żywych komórek, otwórz odpowiednie oprogramowanie do ilościowego obrazowania 3D. W niniejszym protokole jest to Velocity. Kliknij prawym przyciskiem myszy w polu obrazu i wybierz Właściwości.
Wprowadź odpowiednie właściwości pikseli obrazu XY i Z w celu utworzenia sekwencji pomiarowej do analizy intensywności pęcherzyków receptorowych znakowanych GFP oraz całej komórki w odpowiedzi na traktowanie ligandem. W menu 2D wybierz tryb rozszerzonego ogniskowania (extended focus), aby zaobserwować komórkę. Następnie użyj narzędzia obszaru dowolnego (freestyle region), aby narysować obszar zainteresowania wokół komórki, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na obraz i wybierz opcję Crop to Selection.
Zostanie wygenerowany nowy element obrazu. Kliknij nazwę obrazu, aby wybrać przycięty obraz komórki i otworzyć kartę pomiarów. Aby zmierzyć ekspresję GFP w zinternalizowanych pęcherzykach, przeciągnij funkcję Find Objects z sekcji Finding do powyższego pola sekwencji.
Ustaw kanał wyszukiwania obiektów na GFP i otwórz ikonę ustawień, aby ustawić próg na odchylenie standardowe, a dolną granicę na sześć, w celu wyboru obiektów o najwyższej intensywności sygnału GFP. Ustaw minimalny rozmiar obiektu na 0 µm³. Następnie kliknij pomiar i wybierz kanały oraz rodzaje pomiarów.
Aby zdefiniować progi i filtry służące do identyfikacji całej komórki oraz pomiaru całkowitej intensywności GFP, przeciągnij drugie pole Find Objects. Następnie ustaw kanał Find Objects na GFP, a odchylenie standardowe na zero, aby wybrać obiekty o dowolnej intensywności GFP, oraz ustaw minimalny rozmiar obiektu na 2 µm³. Przeciągnij Filter Population do pola Population drugiego modułu Find Objects i wybierz objętość w µm³ większą niż 100, aby zaznaczyć całą komórkę i wyeliminować wszystkie mniejsze obiekty.
Następnie wybierz pomiary oraz pozycję Make Measurement, aby wykonać pomiar we wszystkich punktach czasowych. Aby przeanalizować zmierzoną ekspresję GFP w pęcherzykach oraz w całej komórce w czasie, kliknij nazwę pliku pozycji pomiarowej pod nazwą obrazu. Aby wyodrębnić dane dla GFP i pęcherzyków z całkowitej puli danych, otwórz zakładkę raw i wybierz population one.
Następnie otwórz zakładkę analizy i klikając prawym przyciskiem myszy na dane, wybierz opcję analizy, a następnie ogranicz analizę do populacji jeden. Aby zmierzyć ilość GFP w całej komórce, zmień oba parametry na populację dwa. W sekcjach Analiza tych danych oraz Podsumowane według wybierz sumę kanału koloru GFP oraz sumę.
Następnie w sekcji Organize the data by i w polu row wybierz time point. Aby wyekstrahować dane dotyczące ilości GFP w lizosomach, w oknie Find Objects dla pierwszej populacji ustaw find objects channel na kanał czerwony. W ikonie koła zębatego w polu dialogowym ustaw threshold using na standard deviation, lower limit na sześć, aby wybrać czerwone obiekty o najwyższej intensywności, oraz minimum object size na 0,017 µm³.
Wybierz pomiary i utwórz element pomiarowy, aby przeprowadzić pomiary we wszystkich punktach czasowych. Aby przeanalizować zmierzoną ekspresję GFP w lizosomach, kliknij nazwę pliku elementu pomiarowego pod nazwą obrazu. W karcie „raw” wybierz populację 1, a następnie w karcie „analyze” wybierz populację 1, sumę kanału koloru GFP oraz sumę, klikając prawym przyciskiem myszy jak poprzednio, aby zmierzyć ilość GFP w czerwonych pęcherzykach.
Przed stymulacją ligandem receptory angiotensyny typu 1A znakowane GFP lokalizują się głównie w błonie komórkowej. Jednak w ciągu 2,5 minuty od dodania angiotensyny II receptory te ulegają internalizacji, tworząc jasne pęcherzyki, a następnie skupiając się w duże pęcherzyki paranuklearne. Indukowane przez angiotensynę II marszczenie błony utrudnia kwantyfikację całkowitej intensywności GFP w pęcherzykach, co obrazują przedstawione reprezentatywne dane z pomiaru ekspresji GFP.
Filtracja wielkościowa nie pozwala odróżnić większych fałd błonowych od skupisk pęcherzyków, ale wykazuje, że poziom GFP w mniejszych obiektach wzrasta szybciej niż w obiektach większych. Na tym reprezentatywnym przebiegu czasowym ekspresji GFP bez funkcji autofocus, zmierzoną wartość zinternalizowanego GFP przedstawiono jako procent całkowitego GFP w komórce. Analiza całkowitej ilości GFP wewnątrz komórki wykazała, że w badanej komórce nie wystąpiło znaczącego fotowyblakania w czasie.
Ilościowe oznaczenie GFP w lizosomach transfekowanych komórek wskazuje również, że intensywność sygnału receptora angiotensyny typu 1A obecnego w lizosomach nie zmienia się do 24 minut po podaniu angiotensyny II. Podczas tej procedury ważne jest monitorowanie stanu zdrowia komórek przed obrazowaniem i w jego trakcie; ze względu na czasochłonność procedury eksperyment należy przerwać, jeśli kultury komórkowe wykazują jakiekolwiek nieprawidłowości. Po wykonaniu tej procedury można zastosować immunobarwienie oraz FRET lub FLIM w celu wykrycia i potwierdzenia subkomórkowej lokalizacji receptorów.
W celu zidentyfikowania i przeanalizowania zmian w cząsteczkach sygnałowych zaangażowanych w transport receptorów można przeprowadzić analizę Western blot. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiąść gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania obrazowania i analizy żywych komórek w celu pomiaru indukowanego ligandem kierowania receptorów błonowych do lizosomów, a także do innych przedziałów subkomórkowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół obrazowania komórek wykazujących ekspresję receptorów angiotensyny typu 1a znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zaindukowanej traktowaniem angiotensyną II. Metoda ta umożliwia analizę kolokalizacji receptorów i lizosomów w czasie rzeczywistym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Mikroskopia fluorescencyjna
Wstęp
- Receptory angiotensyny typu 1 odgrywają kluczową rolę w sygnalizacji komórkowej.
- Zrozumienie endocytozy receptorów jest istotne dla wyjaśnienia odpowiedzi komórkowych na ligandy.
- Techniki obrazowania w czasie rzeczywistym mogą dostarczyć wiedzy na temat dynamicznych procesów komórkowych.
- Poprzednie metody mogą wprowadzać artefakty, które przesłaniają rzeczywiste zachowanie komórek.
Cel badania
- Aby uzyskać ilościowe dowody przestrzenne i czasowe na kolokalizację receptorów z lizosomami.
- Aby porównać procesy internalizacji receptorów typu dzikiego oraz receptorów zmutowanych.
- Aby pogłębić zrozumienie dynamiki receptorów w żywych komórkach.
Zastosowane Metody
- Obrazowanie żywych komórek z użyciem obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej.
- Zastosowanie olejku immersyjnego w celu poprawy jakości obrazowania.
- fluorescencyjne znakowanie lizosomów w celu śledzenia lokalizacji receptora.
- Analiza programowa w celu oceny kolokalizacji trójwymiarowej.
Główne wyniki
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym pozwala na skuteczne uchwycenie dynamiki receptorów.
- Zaobserwowano różnice w internalizacji pomiędzy receptorami typu dzikiego a receptorami zmutowanymi.
- Pomyślnie określono ilościowo kolokalizację receptorów i lizosomów.
- Technika ta minimalizuje artefakty związane z wykorzystaniem utrwalonych komórek.
Wnioski
- Niniejszy protokół dostarcza niezawodnej metody badania endocytozy receptorów.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym może dostarczyć kluczowych informacji na temat mechanizmów sygnalizacji komórkowej.
- Wyniki mogą mieć znaczenie dla zrozumienia funkcji receptorów w różnych kontekstach biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie żywych komórek w celu badania transportu receptorów umożliwia ilościową ocenę dynamiki subkomórkowej indukowanej przez ligandy w czasie rzeczywistym, co ogranicza powstawanie artefaktów związanych z fiksacją i wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej walidacji celu. Podejście to zapewnia pewność prognostyczną w odniesieniu do zachowania receptorów, co pozwala na podejmowanie decyzji typu go/no-go podczas identyfikacji wiodących związków oraz wyboru modeli przedklinicznych. Poprzez rejestrację danych o kolokalizacji przestrzennej i czasowej, metoda ta wzmacnia ciągłość translacyjną od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację internalizacji receptorów i transportu lizosomalnego w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na stymulację ligandem.
- Wartość operacyjna: Eliminacja artefaktów fiksacji, które utrudniają lokalizację receptorów błonowych, co zwiększa wiarygodność danych w procesie walidacji celu.
- Wartość prognostyczna: Ilościowa ocena kolokalizacji receptor-lizosom w czasie w celu analizy kinetyki transportu oraz wsparcia przesiewu fenotypowego wariantów receptorów.
Przesiewy i rozwój testów
- Gotowość do analizy: Przygotuj zwalidowane systemy komórkowe HEK-293 wykazujące ekspresję receptorów z tagiem EGFP dla ustandaryzowanych i powtarzalnych procesów obrazowania żywych komórek.
- Wyniki ilościowe: Generuj pomiary intensywności receptorów w pęcherzykach i lizosomach w czasie, oparte na voxelach 3D, co umożliwia ocenę efektu działania związków.
- Skalowalność: Wspieraj platformy obrazowania wysokoprzepustowego (high-content imaging) poprzez zdefiniowane parametry akwizycji (skok Z, odstęp czasowy, rozmiar voxela) oraz zautomatyzowaną segmentację.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modelowanie transportu receptorów angiotensyny w ludzkim układzie komórkowym w celu opracowania strategii modulacji celów sercowo-naczyniowych.
- Biomarker translacyjny: Powiązanie akumulacji lizosomalnej receptorów z efektami sygnalizacji w dół, co wspiera modele przedkliniczne zgodne z biomarkerami.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wykorzystanie kinetyki transportu do priorytetyzacji wariantów receptorów lub ligandów o korzystnych profilach przetwarzania wewnątrzkomórkowego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, dostarczając dynamicznych i ilościowych danych, które służą do wczesnej oceny przedklinicznej funkcji receptora.
- Biologia odkrywcza: Wsparcie testowania hipotez dotyczących mechanizmów transportu receptorów i wyjaśniania szlaków poprzez wizualizację w czasie rzeczywistym internalizacji indukowanej przez Ang II.
- Przesiewanie: Zapewnienie gotowości testów poprzez standaryzację parametrów transfekcji, barwienia i obrazowania, co gwarantuje powtarzalną detekcję pęcherzyków i lizosomów.
- Analityka: Dostarczenie ilościowych odczytów intensywności GFP w pęcherzykach receptorowych i lizosomach, znormalizowanych do całkowitego poziomu GFP w komórce, w celu porównania warunków w różnych punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Powiązanie danych z obrazowania żywych komórek z ciągłością przedkliniczną poprzez połączenie lokalizacji receptora z efektami funkcjonalnymi w systemach istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Stworzenie wielokrotnego użytku platformy obrazowania do badań nad transportem GPCR dla wielu celów i linii komórkowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w zakresie zachowania receptorów poprzez minimalizację artefaktów fiksacji i rejestrację dynamicznych zdarzeń transportu wewnątrzkomórkowego.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja protokołów obrazowania i analizy pomiędzy zespołami, co poprawia powtarzalność danych dotyczących lokalizacji subkomórkowej.
- Wartość strategiczna: Umożliwienie podejmowania decyzji go/no-go w optymalizacji wiodących związków na podstawie danych, poprzez ujawnienie różnic w przetwarzaniu receptorów między wariantami typu dzikiego a zmutowanymi.
- Wpływ na portfolio: Wsparcie priorytetyzacji kandydatów celujących w receptory z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowaną kinetykę transportu oraz zaangażowanie lizosomalne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu mikroskopii konfokalnej, znakowania białek fluorescencyjnymi oraz protokołów obrazowania żywych komórek.
- Kluczowe znaczenie dla optymalnej detekcji sygnału mają obiektywy o wysokiej aperturze numerycznej, olej imersyjny oraz konfokalne systemy skanowania laserowego.
- Niezbędna jest standaryzacja parametrów obrazowania (skok Z, odstęp czasowy, rozmiar woksela) oraz progów analizy pomiędzy zespołami w celu uzyskania spójnych wyników.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacji dla różnych znaczników receptorowych, barwników fluorescencyjnych oraz typów komórek innych niż HEK-293.
- Należy wziąć pod uwagę ograniczenia praktyczne, takie jak ryzyko fotobielenia przy wysokich prędkościach obrazowania oraz kompromis między rozdzielczością czasową a zbieraniem fotonów.
