Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Ogólnym celem tego eksperymentu jest uzyskanie ilościowych, przestrzennych i czasowych dowodów kolokalizacji lizosomów receptora angiotensyny typu pierwszego po leczeniu angiotensyną w wersji drugiej. Metoda ta została opracowana w celu wykrycia różnic w subkomórkowym przetwarzaniu typu Y w porównaniu ze zmutowanymi receptorami, podobnie jak podczas procesu internalizacji, który wypowiada się w odpowiedzi na symulację liganda. Zaletą tej techniki jest to, że obrazowanie żywych komórek eliminuje artefakty z komórek utrwalonych i przepuszczalnych detergentami oraz że dynamiczne zmiany w lokalizacji receptorów można ocenić w czasie rzeczywistym.

Zacznij od wybrania odpowiedniego obiektywu z aperturą numeryczną 1,4 i wyśrodkowania obiektywu nad stolikiem mikroskopu. Dodaj kroplę olejku immersyjnego o wysokiej lepkości i niskiej automatycznej florescencji na obiektyw i przenieś komorę z przeniesionymi komórkami do stolika mikroskopowego. Delikatnie podnieś obiektyw, aż olej dotknie dna pierwszego suwaka i zlokalizuj przyciemnione ogniwa.

Mając zdrową komórkę będącą przedmiotem zainteresowania, w centrum pola widzenia, przełącz się w tryb konfokalny i upewnij się, że komórka jest dobrze rozciągnięta, z jej brzuszną stroną ściśle przylegającą do szkiełka nakrywkowego. Otwórz okno dialogowe Stos Z, kliknij przycisk Na żywo, skoncentruj się na górnej krawędzi komórki, a następnie kliknij przycisk Rozpocznij. Następnie skoncentruj się na dolnej krawędzi komórki, wprowadź rozmiar kroku Z 1,00 mikrometra, a następnie kliknij przycisk Koniec.

Następnie wybierz Tryb XYZT w obszarze Ustawienia akwizycji u góry. Na koniec ustaw przedział czasu skanowania i czas skanowania, aby zaobserwować celowanie receptora angiotensyny typu 1A znakowanego GFP do lizosomów. Następnie, aby rozpocząć stymulację liganda, dodaj trzy mikrolitry 100 X podstawowego roztworu liganda do dołka, który jest obrazowany i kliknij Start, aby zobrazować odpowiedź w 3D dla żądanego okresu i częstotliwości.

Aby przeanalizować obrazy żywych komórek, otwórz odpowiednie oprogramowanie do kwantyfikacji obrazów 3D. W tym protokole Prędkość. Kliknij prawym przyciskiem myszy w polu obrazu i wybierz Właściwości.

Wprowadź odpowiednie właściwości pikseli obrazu XY i Z, aby utworzyć sekwencję pomiarową w celu analizy intensywności pęcherzyków receptorowych i komórek dziurowych oznaczonych GFP w odpowiedzi na traktowanie ligandem. W menu 2D wybierz rozszerzony tryb ostrości, aby obserwować komórkę. Następnie użyj narzędzia region freestyle, aby narysować interesujący Cię obszar wokół komórki i kliknij obraz prawym przyciskiem myszy, aby wybrać opcję Przytnij do zaznaczenia.

Zostanie wygenerowany nowy element obrazu. Kliknij nazwę obrazu, aby wybrać przycięty obraz komórki i otworzyć kartę pomiaru. Aby zmierzyć ekspresję GFP zinternalizowanych pęcherzyków, przeciągnij pole Znajdź obiekty z Znajdowanie do pola sekwencji powyżej.

Ustaw kanał wyszukiwania obiektów na GFP i otwórz ikonę ustawień, aby ustawić próg za pomocą odchylenia standardowego i dolnego limitu na sześć, aby wybrać obiekty o najjaśniejszej intensywności GFP. Ustaw minimalny rozmiar obiektu na zero mikrometrów sześciennych. Następnie kliknij przycisk Zmierz i wybierz kanały oraz typy pomiarów.

Aby zdefiniować progi i filtry służące do identyfikowania całej komórki oraz zmierzyć całkowitą intensywność GFP, przeciągnij drugie pole Znajdź obiekty. Następnie ustaw kanał Znajdź obiekty na GFP i ustaw odchylenie standardowe na zero, aby wybrać obiekty o dowolnej intensywności GFP i minimalnym rozmiarze obiektu do dwóch mikrometrów sześciennych. Przeciągnij pozycję Filtruj populację do pola Populacja dwóch Znajdź obiekty i wybierz objętość mikrometrów sześciennych większą niż 100, aby zaznaczyć całą komórkę i wyeliminować wszystkie mniejsze obiekty.

Następnie wybierz pomiary i Wykonaj element pomiaru, aby dokonać pomiaru we wszystkich punktach czasu. Aby przeanalizować zmierzoną ekspresję GFP w pęcherzykach i całą komórkę w czasie, kliknij nazwę pliku elementu pomiarowego poniżej nazwy obrazu. Aby wyodrębnić dane dotyczące GFP i pęcherzyków z danych całkowitych, otwórz kartę raw i wybierz populację pierwszą.

Następnie otwórz zakładkę analizowane i klikając prawym przyciskiem myszy na dane, wybierz analizę, a następnie ogranicz analizę do wyboru populacji pierwszej. Aby zmierzyć ilość GFP w całej komórce, zmień obie na populację drugą. W obszarze Analizuj te dane i Podsumowuj według wybierz opcję suma, GFP, kanał koloru i suma.

Następnie w obszarze Organizuj dane według wiersza i wybierz punkt czasowy. Aby wyodrębnić dane dotyczące ilości GFP w lizosomach, w polu Znajdź obiekty dla populacji pierwszej ustaw kanał wyszukiwania obiektów na kanał czerwony. Na ikonie koła w oknie dialogowym ustaw próg za pomocą odchylenia standardowego, dolną granicę na sześć, aby wybrać czerwone obiekty o najjaśniejszych intensywnościach, a minimalny rozmiar obiektu na 0,017 mikrometra sześciennego.

Wybierz pomiary i dokonaj pomiaru, aby dokonać pomiaru we wszystkich punktach czasowych. Aby przeanalizować zmierzone wyrażenie GFP w lizosomach, kliknij nazwę pliku elementu pomiarowego poniżej nazwy obrazu. Wybierz populację pierwszą na karcie surowe, a następnie wybierz populację jedną i zsumuj kanał koloru i sumę GFP na karcie analizy, klikając prawym przyciskiem myszy jak poprzednio, aby zmierzyć ilość GFP w czerwonych pęcherzykach.

Przed stymulacją ligandów, receptory angiotensyny typu 1A oznaczone GFP są zlokalizowane głównie w błonie komórkowej. Ale w ciągu 2,5 minuty od dodania angiotensyny dwa, receptory te ulegają internalizacji, tworząc jasne pęcherzyki, a później grupowanie i duże pęcherzyki paranuklearzomowe. Zmarszczenie wywołane angiotensyną dwójkową komplikuje ilościowe określenie całkowitej intensywności GFP pęcherzyka, obserwowanej dla tych reprezentatywnych danych pomiarowych ekspresji GFP.

Filtrowanie rozmiarów nie rozróżnia większych falban i skupionych pęcherzyków, ale ujawnia, że GFP w mniejszych obiektach wzrasta szybciej niż GFP w większych obiektach. W tym reprezentatywnym przebiegu czasowym ekspresji GFP bez autofokusa, zinternalizowany GFP mierzono jako procent całkowitego komórkowego GFP. Analiza całkowitego GFP w komórce wykazała, że komórka ta nie wybielała się znacząco z upływem czasu.

Kwantyfikacja GFP w lizosomach transfekowanych komórek wskazuje również, że intensywność receptora angiotensyny typu 1A obecnego w lizosomach nie zmienia się do 24 minut po podaniu angiotensyny w dwóch. Podczas tej procedury ważne jest, aby pamiętać o monitorowaniu stanu zdrowia komórek przed i w trakcie obrazowania, ponieważ procedura jest czasochłonna, eksperyment powinien zostać przerwany, jeśli hodowle komórkowe są w jakikolwiek sposób nieprawidłowe. Po tej procedurze barwienie immunologiczne i FRET lub FLIM mogą być stosowane do wykrywania i potwierdzania subkomórkowej lokalizacji receptorów.

Western blot można wykonać w celu zbadania tożsamości i zmian w cząsteczkach sygnałowych zaangażowanych podczas transportu receptorów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać obrazowanie i analizę żywych komórek w celu zmierzenia indukowanego ligandem receptora transbłonowego ukierunkowanego na lizosomy, a także na inne przedziały subkomórkowe.