Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej
27 marca 2017
Tutaj prezentujemy protokół obrazowania komórek wyrażających receptory angiotensyny typu 1a znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zainicjowanej przez leczenie angiotensyną II. Technika ta obejmuje znakowanie lizosomów drugim markerem fluorescencyjnym, a następnie wykorzystanie oprogramowania do analizy kolokalizacji receptora i lizosomu w trzech wymiarach w czasie.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest uzyskanie ilościowych, przestrzennych i czasowych dowodów kolokalizacji lizosomów receptora angiotensyny typu pierwszego po leczeniu angiotensyną w wersji drugiej. Metoda ta została opracowana w celu wykrycia różnic w subkomórkowym przetwarzaniu typu Y w porównaniu ze zmutowanymi receptorami, podobnie jak podczas procesu internalizacji, który wypowiada się w odpowiedzi na symulację liganda. Zaletą tej techniki jest to, że obrazowanie żywych komórek eliminuje artefakty z komórek utrwalonych i przepuszczalnych detergentami oraz że dynamiczne zmiany w lokalizacji receptorów można ocenić w czasie rzeczywistym.
Zacznij od wybrania odpowiedniego obiektywu z aperturą numeryczną 1,4 i wyśrodkowania obiektywu nad stolikiem mikroskopu. Dodaj kroplę olejku immersyjnego o wysokiej lepkości i niskiej automatycznej florescencji na obiektyw i przenieś komorę z przeniesionymi komórkami do stolika mikroskopowego. Delikatnie podnieś obiektyw, aż olej dotknie dna pierwszego suwaka i zlokalizuj przyciemnione ogniwa.
Mając zdrową komórkę będącą przedmiotem zainteresowania, w centrum pola widzenia, przełącz się w tryb konfokalny i upewnij się, że komórka jest dobrze rozciągnięta, z jej brzuszną stroną ściśle przylegającą do szkiełka nakrywkowego. Otwórz okno dialogowe Stos Z, kliknij przycisk Na żywo, skoncentruj się na górnej krawędzi komórki, a następnie kliknij przycisk Rozpocznij. Następnie skoncentruj się na dolnej krawędzi komórki, wprowadź rozmiar kroku Z 1,00 mikrometra, a następnie kliknij przycisk Koniec.
Następnie wybierz Tryb XYZT w obszarze Ustawienia akwizycji u góry. Na koniec ustaw przedział czasu skanowania i czas skanowania, aby zaobserwować celowanie receptora angiotensyny typu 1A znakowanego GFP do lizosomów. Następnie, aby rozpocząć stymulację liganda, dodaj trzy mikrolitry 100 X podstawowego roztworu liganda do dołka, który jest obrazowany i kliknij Start, aby zobrazować odpowiedź w 3D dla żądanego okresu i częstotliwości.
Aby przeanalizować obrazy żywych komórek, otwórz odpowiednie oprogramowanie do kwantyfikacji obrazów 3D. W tym protokole Prędkość. Kliknij prawym przyciskiem myszy w polu obrazu i wybierz Właściwości.
Wprowadź odpowiednie właściwości pikseli obrazu XY i Z, aby utworzyć sekwencję pomiarową w celu analizy intensywności pęcherzyków receptorowych i komórek dziurowych oznaczonych GFP w odpowiedzi na traktowanie ligandem. W menu 2D wybierz rozszerzony tryb ostrości, aby obserwować komórkę. Następnie użyj narzędzia region freestyle, aby narysować interesujący Cię obszar wokół komórki i kliknij obraz prawym przyciskiem myszy, aby wybrać opcję Przytnij do zaznaczenia.
Zostanie wygenerowany nowy element obrazu. Kliknij nazwę obrazu, aby wybrać przycięty obraz komórki i otworzyć kartę pomiaru. Aby zmierzyć ekspresję GFP zinternalizowanych pęcherzyków, przeciągnij pole Znajdź obiekty z Znajdowanie do pola sekwencji powyżej.
Ustaw kanał wyszukiwania obiektów na GFP i otwórz ikonę ustawień, aby ustawić próg za pomocą odchylenia standardowego i dolnego limitu na sześć, aby wybrać obiekty o najjaśniejszej intensywności GFP. Ustaw minimalny rozmiar obiektu na zero mikrometrów sześciennych. Następnie kliknij przycisk Zmierz i wybierz kanały oraz typy pomiarów.
Aby zdefiniować progi i filtry służące do identyfikowania całej komórki oraz zmierzyć całkowitą intensywność GFP, przeciągnij drugie pole Znajdź obiekty. Następnie ustaw kanał Znajdź obiekty na GFP i ustaw odchylenie standardowe na zero, aby wybrać obiekty o dowolnej intensywności GFP i minimalnym rozmiarze obiektu do dwóch mikrometrów sześciennych. Przeciągnij pozycję Filtruj populację do pola Populacja dwóch Znajdź obiekty i wybierz objętość mikrometrów sześciennych większą niż 100, aby zaznaczyć całą komórkę i wyeliminować wszystkie mniejsze obiekty.
Następnie wybierz pomiary i Wykonaj element pomiaru, aby dokonać pomiaru we wszystkich punktach czasu. Aby przeanalizować zmierzoną ekspresję GFP w pęcherzykach i całą komórkę w czasie, kliknij nazwę pliku elementu pomiarowego poniżej nazwy obrazu. Aby wyodrębnić dane dotyczące GFP i pęcherzyków z danych całkowitych, otwórz kartę raw i wybierz populację pierwszą.
Następnie otwórz zakładkę analizowane i klikając prawym przyciskiem myszy na dane, wybierz analizę, a następnie ogranicz analizę do wyboru populacji pierwszej. Aby zmierzyć ilość GFP w całej komórce, zmień obie na populację drugą. W obszarze Analizuj te dane i Podsumowuj według wybierz opcję suma, GFP, kanał koloru i suma.
Następnie w obszarze Organizuj dane według wiersza i wybierz punkt czasowy. Aby wyodrębnić dane dotyczące ilości GFP w lizosomach, w polu Znajdź obiekty dla populacji pierwszej ustaw kanał wyszukiwania obiektów na kanał czerwony. Na ikonie koła w oknie dialogowym ustaw próg za pomocą odchylenia standardowego, dolną granicę na sześć, aby wybrać czerwone obiekty o najjaśniejszych intensywnościach, a minimalny rozmiar obiektu na 0,017 mikrometra sześciennego.
Wybierz pomiary i dokonaj pomiaru, aby dokonać pomiaru we wszystkich punktach czasowych. Aby przeanalizować zmierzone wyrażenie GFP w lizosomach, kliknij nazwę pliku elementu pomiarowego poniżej nazwy obrazu. Wybierz populację pierwszą na karcie surowe, a następnie wybierz populację jedną i zsumuj kanał koloru i sumę GFP na karcie analizy, klikając prawym przyciskiem myszy jak poprzednio, aby zmierzyć ilość GFP w czerwonych pęcherzykach.
Przed stymulacją ligandów, receptory angiotensyny typu 1A oznaczone GFP są zlokalizowane głównie w błonie komórkowej. Ale w ciągu 2,5 minuty od dodania angiotensyny dwa, receptory te ulegają internalizacji, tworząc jasne pęcherzyki, a później grupowanie i duże pęcherzyki paranuklearzomowe. Zmarszczenie wywołane angiotensyną dwójkową komplikuje ilościowe określenie całkowitej intensywności GFP pęcherzyka, obserwowanej dla tych reprezentatywnych danych pomiarowych ekspresji GFP.
Filtrowanie rozmiarów nie rozróżnia większych falban i skupionych pęcherzyków, ale ujawnia, że GFP w mniejszych obiektach wzrasta szybciej niż GFP w większych obiektach. W tym reprezentatywnym przebiegu czasowym ekspresji GFP bez autofokusa, zinternalizowany GFP mierzono jako procent całkowitego komórkowego GFP. Analiza całkowitego GFP w komórce wykazała, że komórka ta nie wybielała się znacząco z upływem czasu.
Kwantyfikacja GFP w lizosomach transfekowanych komórek wskazuje również, że intensywność receptora angiotensyny typu 1A obecnego w lizosomach nie zmienia się do 24 minut po podaniu angiotensyny w dwóch. Podczas tej procedury ważne jest, aby pamiętać o monitorowaniu stanu zdrowia komórek przed i w trakcie obrazowania, ponieważ procedura jest czasochłonna, eksperyment powinien zostać przerwany, jeśli hodowle komórkowe są w jakikolwiek sposób nieprawidłowe. Po tej procedurze barwienie immunologiczne i FRET lub FLIM mogą być stosowane do wykrywania i potwierdzania subkomórkowej lokalizacji receptorów.
Western blot można wykonać w celu zbadania tożsamości i zmian w cząsteczkach sygnałowych zaangażowanych podczas transportu receptorów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać obrazowanie i analizę żywych komórek w celu zmierzenia indukowanego ligandem receptora transbłonowego ukierunkowanego na lizosomy, a także na inne przedziały subkomórkowe.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół obrazowania komórek wykazujących ekspresję receptorów angiotensyny typu 1a znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zaindukowanej traktowaniem angiotensyną II. Metoda ta umożliwia analizę kolokalizacji receptorów i lizosomów w czasie rzeczywistym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Mikroskopia fluorescencyjna
Wstęp
- Receptory angiotensyny typu 1 odgrywają kluczową rolę w sygnalizacji komórkowej.
- Zrozumienie endocytozy receptorów jest istotne dla wyjaśnienia odpowiedzi komórkowych na ligandy.
- Techniki obrazowania w czasie rzeczywistym mogą dostarczyć wiedzy na temat dynamicznych procesów komórkowych.
- Poprzednie metody mogą wprowadzać artefakty, które przesłaniają rzeczywiste zachowanie komórek.
Cel badania
- Aby uzyskać ilościowe dowody przestrzenne i czasowe na kolokalizację receptorów z lizosomami.
- Aby porównać procesy internalizacji receptorów typu dzikiego oraz receptorów zmutowanych.
- Aby pogłębić zrozumienie dynamiki receptorów w żywych komórkach.
Zastosowane Metody
- Obrazowanie żywych komórek z użyciem obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej.
- Zastosowanie olejku immersyjnego w celu poprawy jakości obrazowania.
- fluorescencyjne znakowanie lizosomów w celu śledzenia lokalizacji receptora.
- Analiza programowa w celu oceny kolokalizacji trójwymiarowej.
Główne wyniki
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym pozwala na skuteczne uchwycenie dynamiki receptorów.
- Zaobserwowano różnice w internalizacji pomiędzy receptorami typu dzikiego a receptorami zmutowanymi.
- Pomyślnie określono ilościowo kolokalizację receptorów i lizosomów.
- Technika ta minimalizuje artefakty związane z wykorzystaniem utrwalonych komórek.
Wnioski
- Niniejszy protokół dostarcza niezawodnej metody badania endocytozy receptorów.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym może dostarczyć kluczowych informacji na temat mechanizmów sygnalizacji komórkowej.
- Wyniki mogą mieć znaczenie dla zrozumienia funkcji receptorów w różnych kontekstach biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie żywych komórek w celu badania transportu receptorów umożliwia ilościową ocenę dynamiki subkomórkowej indukowanej przez ligandy w czasie rzeczywistym, co ogranicza powstawanie artefaktów związanych z fiksacją i wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej walidacji celu. Podejście to zapewnia pewność prognostyczną w odniesieniu do zachowania receptorów, co pozwala na podejmowanie decyzji typu go/no-go podczas identyfikacji wiodących związków oraz wyboru modeli przedklinicznych. Poprzez rejestrację danych o kolokalizacji przestrzennej i czasowej, metoda ta wzmacnia ciągłość translacyjną od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację internalizacji receptorów i transportu lizosomalnego w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na stymulację ligandem.
- Wartość operacyjna: Eliminacja artefaktów fiksacji, które utrudniają lokalizację receptorów błonowych, co zwiększa wiarygodność danych w procesie walidacji celu.
- Wartość prognostyczna: Ilościowa ocena kolokalizacji receptor-lizosom w czasie w celu analizy kinetyki transportu oraz wsparcia przesiewu fenotypowego wariantów receptorów.
Przesiewy i rozwój testów
- Gotowość do analizy: Przygotuj zwalidowane systemy komórkowe HEK-293 wykazujące ekspresję receptorów z tagiem EGFP dla ustandaryzowanych i powtarzalnych procesów obrazowania żywych komórek.
- Wyniki ilościowe: Generuj pomiary intensywności receptorów w pęcherzykach i lizosomach w czasie, oparte na voxelach 3D, co umożliwia ocenę efektu działania związków.
- Skalowalność: Wspieraj platformy obrazowania wysokoprzepustowego (high-content imaging) poprzez zdefiniowane parametry akwizycji (skok Z, odstęp czasowy, rozmiar voxela) oraz zautomatyzowaną segmentację.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modelowanie transportu receptorów angiotensyny w ludzkim układzie komórkowym w celu opracowania strategii modulacji celów sercowo-naczyniowych.
- Biomarker translacyjny: Powiązanie akumulacji lizosomalnej receptorów z efektami sygnalizacji w dół, co wspiera modele przedkliniczne zgodne z biomarkerami.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wykorzystanie kinetyki transportu do priorytetyzacji wariantów receptorów lub ligandów o korzystnych profilach przetwarzania wewnątrzkomórkowego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, dostarczając dynamicznych i ilościowych danych, które służą do wczesnej oceny przedklinicznej funkcji receptora.
- Biologia odkrywcza: Wsparcie testowania hipotez dotyczących mechanizmów transportu receptorów i wyjaśniania szlaków poprzez wizualizację w czasie rzeczywistym internalizacji indukowanej przez Ang II.
- Przesiewanie: Zapewnienie gotowości testów poprzez standaryzację parametrów transfekcji, barwienia i obrazowania, co gwarantuje powtarzalną detekcję pęcherzyków i lizosomów.
- Analityka: Dostarczenie ilościowych odczytów intensywności GFP w pęcherzykach receptorowych i lizosomach, znormalizowanych do całkowitego poziomu GFP w komórce, w celu porównania warunków w różnych punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Powiązanie danych z obrazowania żywych komórek z ciągłością przedkliniczną poprzez połączenie lokalizacji receptora z efektami funkcjonalnymi w systemach istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Stworzenie wielokrotnego użytku platformy obrazowania do badań nad transportem GPCR dla wielu celów i linii komórkowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w zakresie zachowania receptorów poprzez minimalizację artefaktów fiksacji i rejestrację dynamicznych zdarzeń transportu wewnątrzkomórkowego.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja protokołów obrazowania i analizy pomiędzy zespołami, co poprawia powtarzalność danych dotyczących lokalizacji subkomórkowej.
- Wartość strategiczna: Umożliwienie podejmowania decyzji go/no-go w optymalizacji wiodących związków na podstawie danych, poprzez ujawnienie różnic w przetwarzaniu receptorów między wariantami typu dzikiego a zmutowanymi.
- Wpływ na portfolio: Wsparcie priorytetyzacji kandydatów celujących w receptory z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowaną kinetykę transportu oraz zaangażowanie lizosomalne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu mikroskopii konfokalnej, znakowania białek fluorescencyjnymi oraz protokołów obrazowania żywych komórek.
- Kluczowe znaczenie dla optymalnej detekcji sygnału mają obiektywy o wysokiej aperturze numerycznej, olej imersyjny oraz konfokalne systemy skanowania laserowego.
- Niezbędna jest standaryzacja parametrów obrazowania (skok Z, odstęp czasowy, rozmiar woksela) oraz progów analizy pomiędzy zespołami w celu uzyskania spójnych wyników.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacji dla różnych znaczników receptorowych, barwników fluorescencyjnych oraz typów komórek innych niż HEK-293.
- Należy wziąć pod uwagę ograniczenia praktyczne, takie jak ryzyko fotobielenia przy wysokich prędkościach obrazowania oraz kompromis między rozdzielczością czasową a zbieraniem fotonów.
