Name: Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek i analizy 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca badawcza przedstawiona w tym manuskrypcie została wsparta grantem R01 HL121456-01A1 dla Kathryn Sandberg. Prace te były dodatkowo wspierane przez dostępność Leica SP8 AOBS w Microscopy and Imaging Shared Resource (MISR) w Georgetown University Medical Center, który jest częściowo finansowany przez P30-CA051008 z National Institutes of Health of the United States of America. Wyrażamy wdzięczność za pomoc w obrazowaniu Leica SP8 przez Petera Johnsona oraz za użycie Zeiss LSM880 w laboratorium Thomasa Coate'a z Wydziału Biologii Uniwersytetu Georgetown z pomocą w obrazowaniu zapewnioną przez Almę Arnold z Carl Zeiss Microscopy LLC. Wyłączną odpowiedzialność za treść tego manuskryptu ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health.

<ol><li>Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+angiotensin+II+type+1A+receptor+intracellular+retention%2C+degradation%2C+and+recycling+by+Rab5%2C+Rab7%2C+and+Rab11+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases.</a> J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).</li>
<li>Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+trafficking+of+angiotensin+II+and+its+AT1+and+AT2+receptors%3A+evidence+for+selective+sorting+of+receptor+and+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand.</a> Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).</li>
<li>Hunyady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+PI+3-kinase+dependence+of+early+and+late+phases+of+recycling+of+the+internalized+AT1+angiotensin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor.</a> J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).</li>
<li>Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+angiotensin+II+in+rat+myometrial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells.</a> Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).</li>
<li>Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab4+and+Rab11+coordinately+regulate+the+recycling+of+angiotensin+II+type+I+receptor+as+demonstrated+by+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> J Biomed Opt. 13 (3), 031206(2008).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton-dependent+Rab+GTPase-regulated+angiotensin+type+I+receptor+lysosomal+degradation+studied+by+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> J Biomed Opt. 15 (5), 056003(2010).</li>
<li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1+prevents+maturation+of+autophagic+vacuoles+by+inhibiting+fusion+between+autophagosomes+and+lysosomes+in+rat+hepatoma+cell+line%2C+H-4-II-E+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells.</a> Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).</li>
<li>Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+angiotensin+II+activates+rat+myometrium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular angiotensin II activates rat myometrium.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).</li>
<li>Fortian, A., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+fluorescence+imaging+reveals+high+stoichiometry+of+Grb2+binding+to+the+EGF+receptor+sustained+during+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).</li>
<li>Aymerich, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+G-protein-coupled+receptor+imaging+to+understand+and+quantify+receptor+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22ScientificWorldJournal%22%5BJournal%5D)">Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics.</a> ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).</li>
<li>Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+Detection+of+Diversity+and+Bias+in+GPCR+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26(2014).</li>
<li>Inuzuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+ligand-induced+activation+of+angiotensin+II+type+1+receptor+signaling+by+the+type+2+receptor+via+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase.</a> C. Sci Rep. 6, 21613(2016).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+angiotensin+receptor+signaling+through+Erk1%2F2+pathway+by+a+novel+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li>
<li>Mueller, S. C., Hubbard, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+asialoglycoproteins+by+rat+hepatocytes%3A+receptor-positive+and+receptor-negative+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes.</a> J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).</li>
<li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670(2015).</li>
<li>Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+of+Lysotracker+Red+to+a+green+fluorescent+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule.</a> Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).</li>
<li>Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1%2C+a+specific+inhibitor+of+vacuolar-type+H%28%2B%29-ATPase%2C+inhibits+acidification+and+protein+degradation+in+lysosomes+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells.</a> J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawione tutaj wstępne eksperymenty pokazują, że w dość krótkim czasie trwającym 24 minuty nie nastąpiła żadna znacząca zmiana w dostarczaniu AT1aR-GFP do lizosomów. Ogólnie rzecz biorąc, dostarczenie zinternalizowanych receptorów do lizosomów może nastąpić już po 15-20 minutach. Eksperyment ten jest zgodny z hipotezą, że większość zinternalizowanego AT1aR jest ukierunkowana na duże, okołojądrowe endosomy. Dowody na to, że przynajmniej część AT1aR dociera do lizosomów, zostały wykaza...

Ogólnym celem jest uzyskanie ilościowych dowodów w czasie i przestrzeni kolokalizacji receptora z określonymi organellami subkomórkowymi po leczeniu agonistą receptora. W związku z tym bezpośrednim celem jest uchwycenie poklatkowych obrazów konfokalnych lizosomów i transbłonowego receptora obejmującego całą błonę w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych (HEK) po transfekcji, a następnie zebranie i przeanalizowanie danych obrazowania w 3D w celu ilościowego pomiaru dostarczania receptora do lizosomów. Badanie jednoczesnego transportu receptora transbłonowego z lizosomami lub innymi organellami podczas endocytozy, gdy jest aktywowany przez ligand receptora, może pomóc w ustaleniu, w jaki sposób receptor transbłonowy jest regulowany w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.
AT1aR przypuszcza się, że ulega degradacji w lizosomach po leczeniu Ang II w modelowych systemach komórkowych, głównie HEK293 1, chociaż większość receptorów jest przede wszystkim zlokalizowana w endosomach recyklingu wielopęcherzykowego w celu późniejszego recyklingu do błony plazmatycznej, podczas gdy większość liganda, Ang II, jest degradowana w lizosomie <klasa sup="xref">2,3, 4,5. Niedawno Li i in. wykazali, używając technik rezonansowego transferu energii rezonansu Förstera (FRET) i mikroskopii obrazowania fluorescencji czasu życia (FLIM), że AT1aR kolokalizuje się (w skali ~10 nm) z LAMP1, lizosomalnym białkiem błonowym, co sugeruje, że przynajmniej część receptora jest ukierunkowana i degradowana przez lizosomy 6. Autorzy ci zauważyli, że inhibitor lizosomalny chlorochina blokował asocjację AT1aR-LAMP1, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami sugerującymi, że efektem chlorochiny jest blokowanie fuzji późnych endosomów lub autofagosomów z lizosomami. Inne pośrednie podejścia do określania lokalizacji AT1aR w lizosomach wykorzystywały bafilomycynę, inhibitor lizosomów do wnioskowania o obecności AT1aR w lizosomach 3,4,5,6,7,8.
Obrazowanie żywych komórek pozwala uniknąć potencjalnego wpływu fiksacji na objętość komórki oraz utraty/ściemnienia/redystrybucji receptora chimerycznego GFP. Poprzednie badania opierały się na stałych komórkach w celu określenia kolokalizacji lub współwystępowania receptora z lizosomami lub przy użyciu żywych komórek znakowanych surogatami wiążącymi receptor, takimi jak β-arrestin 1,2,3,4,5,6. Obrazowanie żywych komórek innych GPCR za pomocą konfokalnych mikroskopów konfokalnych z wirującym dyskiem lub laserowym skaningiem punktowym wyposażonych w detektory GaASP lub HyD umożliwiło badaczom obserwację internalizacji i transportu receptorów w pojedynczych komórkach obrazowanych w stosach z w odstępach 30 s 9,10. Jednak nawet wtedy, gdy stosy z żywych komórek są szybko zbierane, analiza może nastąpić tylko po wybraniu pojedynczej płaszczyzny w każdym stosie, tj. w 2D 10. Chociaż może to być wystarczające do badania zinternalizowanego GPCR lub receptora kinazy tyrozynowej, o którym mowa, AT1aRs gromadzi się w pęcherzykach, które zmieniają rozmiar i położenie w czasie, a zatem są z natury trudniejsze do odpowiedniego pobrania próbki przy użyciu reprezentatywnego pojedynczego wycinka w każdym punkcie czasowym. Aby dokładnie określić drogę znakowanego AT1aR przez komórkę i wykryć każdą subpopulację pęcherzyków różniących się wielkością i położeniem, opracowaliśmy metodę obrazowania 3D i analizy 3D w celu śledzenia tych zmian i do stosowania w połączeniu z znakowaniem różnych przedziałów wewnątrzkomórkowych, takich jak lizosomy.
Badacze mogą korzystać z tego protokołu do obrazowania żywych komórek, aby bezpośrednio wizualizować ruch AT1aR do komórki i jego transfer do subkomórkowych przedziałów po stymulacji Ang II. Przedziały subkomórkowe są oznaczone fluorescencyjnymi chimerami białkowymi lub innymi markerami fluorescencyjnymi. Protokół ten może być również stosowany jako pierwsze podejście do lokalizacji receptorów w organellach subkomórkowych z minimalną rozdzielczością 200 nm w celu porównania receptorów zmutowanych i dzikich lub wykrycia zmian po leczeniu farmakologicznym. Technika ta jest dostępna, ponieważ można ją przeprowadzić na dowolnym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w obrazowanie żywych komórek. Względna łatwość tego podejścia kontrastuje ze zwiększoną wiedzą specjalistyczną i sprzętem potrzebnym do przeprowadzania technik FRET/FLIM/BRET, które wykrywają interakcje molekularne 6,11. Pomiary te definiują interakcje białko-białko w wysokiej rozdzielczości (~10 nm) i można wywnioskować lokalizację w organellach subkomórkowych. Te bardziej zaawansowane techniki są wykorzystywane do śledzenia i dalszego definiowania interesujących interakcji molekularnych, a nie przechodzenia receptorów przez przedziały subkomórkowe, i bezpośrednio pokazują interakcje białko-białko w określonym czasie i miejscu w komórce 11. FLIM, technika FRET niezależna od stężenia akceptora, jest najczęściej wykonywana na stałych próbkach, ponieważ akwizycja obrazu jest wolniejsza. W przeciwieństwie do tego, stosunek FRET zapewnia szybkie obrazowanie i kolokalizację oddziałujących białek w wysokiej rozdzielczości. Wadą ratio FRET jest to, że obrazowanie wykorzystuje epi-fluorescencję szerokokątnego, aby zwiększyć szybkość obrazowania i objąć całą komórkę, co skutkuje zmniejszoną rozdzielczością i kontrastem organelli 12. Transfer energii rezonansu bioluminescencyjnego (BRET) to kolejna zaawansowana technika, która została zastosowana do GPCR do pomiaru nabycia bliskości molekularnej w czasie 11. W tej technice białko fluorofor jest dzielone molekularnie, a każda połowa jest połączona z jednym z dwóch badanych białek. Kiedy dwa interesujące białka wiążą się ze sobą, części znacznika chimerycznego łączą się ponownie, aby uzyskać fluorescencję i zwiększoną fluorescencję określoną ilościowo w czasie.
Tutaj prezentujemy prostą technikę obrazowania żywych komórek w połączeniu z kwantyfikacją obrazu do badania transportu AT1aR w komórce po stymulacji Ang II oraz potencjalnej zmiany w dostarczaniu zinternalizowanego AT1aR do lizosomów po stymulacji Ang II. Ostatecznym zastosowaniem tej techniki jest scharakteryzowanie różnic w transporcie błonowym, porównując receptory typu dzikiego i zmutowanego. Różnice te pomogą zidentyfikować mechanizm (mechanizmy), które wpływają na fizjologiczne działanie AT1aR, prowadząc do regulacji ciśnienia krwi.

<table><tbody><tr><td>Angiotensyna II (Ang II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9525&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x)</td><td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td><td>11960-044</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem&nbsp;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Ciepła w 37 & stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna (Pen Strep)</td><td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco (life technologies)</td><td>25030-081</td><td>Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Ludzka nerka embrionalna (HEK)-293 komórki</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)&nbsp;</td><td>CRL-1573</td><td>Przejście numer 5 - 12</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II komorowy 1.5 Niemiecki system szkła nakrywkowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Przechowywać pod kątem 4 stopni; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM, Zredukowana surowica Medium</td><td>Gibco- ThermoFisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>Ciepłe w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>PBS 10x&nbsp;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x)&nbsp;</td><td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td><td>31053-028</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>LysoTracker Red DND-99</td> -ThermoFisher Scientific <td>L7528</td><td>Przechowywać porcjkwotowania w ciemności w temperaturze -20 & stopni; C .&nbsp;</td></tr><tr><td>Volocity Ver. 6.3 Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Moduły wizualizacji i kwantyfikacji</td><td>PerkinElmer</td><td>Do analizy obrazów 3D stosów obrazów</td></tr><tr><td>Leica SP8 AOBS</td><td>Leica Microsystems</td><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Do zbierania obrazów</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>Carl Zeiss</td><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Do zbierania obrazów</td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek i analiza 3d transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Obrazowanie żywych komórek jest używane do jednoczesnego przechwytywania obrazów poklatkowych receptorów angiotensyny typu 1a (AT1aR) i wewnątrzkomórkowych przedziałów w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerki-293 (HEK) po stymulacji angiotensyną II (Ang II). Komórki HEK są przejściowo transfekowane plazmidowym DNA zawierającym AT1aR znakowane wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji (EGFP). Lizosomy identyfikuje się za pomocą czerwonego barwnika fluorescencyjnego. Obrazy żywych komórek są rejestrowane na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym po stymulacji Ang II i analizowane przez oprogramowanie w trzech wymiarach (3D, woksele) w czasie. Obrazowanie żywych komórek umożliwia prowadzenie badań nad transportem receptorów i pozwala uniknąć zakłóceń związanych z fiksacją, a w szczególności utraty lub artefaktowego przemieszczenia receptorów błonowych znakowanych EGFP. W ten sposób, gdy poszczególne komórki są śledzone w czasie, można obrazować i mierzyć subkomórkową lokalizację receptorów. Obrazy muszą być uzyskiwane wystarczająco szybko, aby uchwycić szybki ruch pęcherzyków. Jednak przy większych prędkościach obrazowania liczba zbieranych fotonów jest zmniejszona. Należy również pójść na kompromis w doborze parametrów obrazowania, takich jak rozmiar woksela, aby zwiększyć szybkość obrazowania. Znaczące zastosowania obrazowania żywych komórek to między innymi badanie transportu białek, migracji, proliferacji, cyklu komórkowego, apoptozy, autofagii oraz interakcji i dynamiki białko-białko.

W tym reprezentatywnym zestawie eksperymentów komórki HEK przetransfekowano konstruktem receptora angiotensyny typu 1a (AT1aR-GFP) (E1,2,3-AT1aR) sklonowanym do plazmidu pEGFP-N213. Obrazy time-lapse komórek HEK zostały zarejestrowane i odtworzone w formie filmu (Patrz: Filmy Live Cell Imaging 1 oraz Live Cell Imaging 2). Filmy i zdjęcia pokazują, że po stymulacji ligandem receptory AT1aR-EGFP lokal...

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania komórek wyrażających receptory angiotensyny typu 1a znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zainicjowanej przez leczenie angiotensyną II. Technika ta obejmuje znakowanie lizosomów drugim markerem fluorescencyjnym, a następnie wykorzystanie oprogramowania do analizy kolokalizacji receptora i lizosomu w trzech wymiarach w czasie.

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Ogólnym celem niniejszego doświadczenia jest uzyskanie ilościowych dowodów przestrzennych i czasowych na kolokalizację receptorów angiotensyny typu 1 z lizosomami po podaniu angiotensyny II. Metoda ta została opracowana w celu wykrycia różnic wyprocesowaniu wewnątrzkomórkowym receptorów typu Y w porównaniu z receptorami zmutowanymi podczas procesu internalizacji, który zachodzi w odpowiedzi na stymulację ligandem. Zaletą tej techniki jest obrazowanie żywych komórek, co eliminuje artefakty wynikające z utrwalania i permeabilizacji komórek detergentami, a także możliwość oceny dynamicznych zmian w lokalizacji receptorów w czasie rzeczywistym.Zacznij od wybrania odpowiedniego obiektywu o aperturze numerycznej 1,4 i wycentrowania go nad stolikiem mikroskopu. Nanieś kroplę oleju imersyjnego o wysokiej lepkości i niskiej autofluorescencji na obiektyw, a następnie przenieś komorę z transfektowanymi komórkami na stolik mikroskopu. Delikatnie podnoś obiektyw, aż olej dotknie spodu pierwszego preparasu, i zlokalizuj słabo świecące komórki.Gdy zdrowa komórka badawcza znajduje się w centrum pola widzenia, przełącz urządzenie w tryb konfokalny i upewnij się, że komórka jest dobrze rozprzestrzen

live-cell-imaging-3d-analysis-angiotensin-receptor-type-1a

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kardiomiocyty dorosłych są komórkami pierwotnymi, które można wyizolować z serc zwierząt i hodować przez kilka dni. W tym okresie hodowli można zastosować adenowirusowy transfer genów w celu ekspresji genetycznie kodowanych biosensorów (GEB) lub fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Obie metody umożliwiają badania komórkowe z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Izolacja i manipulacja genetyczna kardiomiocytów dorosłych do obrazowania konfokalnego

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Niniejszy artykuł opisuje metodologię wyznaczania odpowiedzi chemotaktycznej leukocytów na specyficzne ligandy oraz identyfikacji oddziaływań między receptorami powierzchniowymi komórek a białkami cytozolowymi przy użyciu technik obrazowania żywych komórek.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek zapośredniczonej przez leukotrien B4 oraz oddziaływań BLT1 z β-arrestyną

Obrazowanie mikroskopowe żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-actin pozwala na charakterystykę dynamicznych zmian w strukturach cytoszkieletu. W przeciwieństwie do technik wykorzystujących utrwalone preparaty, metoda ta umożliwia szczegółową ocenę zmian czasowych w cytoszkielecie aktynowym w tych samych komórkach przed, w trakcie i po różnych bodźcach fizycznych, farmakologicznych lub zapalnych.

Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Opracowaliśmy platformę programową wykorzystującą Imaris Neuroscience, ImarisXT oraz MATLAB do pomiaru zmian morfologii nieokreślonego kształtu uzyskanego z trójwymiarowej konfokalnej fluorescencji pojedynczych komórek. To nowatorskie podejście może być wykorzystane do ilościowego określania zmian w kształcie komórek po aktywacji receptorów, stanowiąc tym samym potencjalne dodatkowe narzędzie w procesie odkrywania leków.

Narzędzie analityczne do ilościowej oceny zmian morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Ten protokół opisuje metodę obrazowania żywych komórek przy użyciu pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji lentiwirusowej i adenowirusowej za pomocą konfokalnej mikroskopii wirującego dysku. Umożliwia to szczegółowe obserwacje procesów komórkowych w żywych kardiomiocytach.

Obrazowanie żywych komórek pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji adenowirusowej i lentiwirusowej przy użyciu konfokalnej mikroskopii wirującego dysku

Łącząc transplantację komórek, znakowanie cytoszkieletu i podejście do utraty/wzmocnienia funkcji, ten protokół opisuje, w jaki sposób migrująca prospektywna płytka przedstrunowa danio pręgowanego może być wykorzystana do analizy funkcji genu kandydującego w migracji komórek in vivo.

Analiza migracji komórek in vivo przy użyciu przeszczepów komórek i obrazowania poklatkowego w zarodkach danio pręgowanego

Ten manuskrypt opisuje zastosowanie transgenicznych myszy reporterowych i różnych dróg podawania barwników fluorescencyjnych w nadciśnieniu wywołanym angiotensyną II za pomocą przyżyciowej mikroskopii wideo naczyń krwionośnych do oceny aktywacji komórek odpornościowych i ich zdolności do zwijania się i przylegania do śródbłonka.

Wizualizacja wałowania i adhezji leukocytów u myszy z infuzją angiotensyny II: techniki i pułapki

Ten protokół zapewnia efektywne kosztowo podejście do izolowania i charakteryzowania pierwotnych komórek kanalików nerkowych myszy, które następnie mogą być subhodowane w celu oceny funkcji biologicznych nerek ex vivo, w tym bioenergetyki mitochondrialnej.

Izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek i analizy 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów