Name: Celowane dostarczanie przez błonę plazmatyczną hydrofobowego ładunku zamkniętego w nośniku nanocząstek ciekłokrystalicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj metodę dostarczania hydrofobowych ładunków do błony plazmatycznej komórek ssaczych przy użyciu nanocząstek ciekłokrystalicznych. Technika ta zwiększa wchłanianie komórkowe i redukuje cytotoksyczność.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Program Finansowania Bazy NRL (Jednostka Robocza MA041-06-41-4943). ON jest wspierany przez National Research Council Postdoctoral Research Associateship.

1. Przygotowanie DiO-LCNP i DiO-LCNP-PEG-Chol
<ol>
	<li>W 2 ml chloroformu rozpuścić ciekłokrystaliczny środek sieciujący diakrylan (DACTP11, 45 mg), nadchloran 3,3′-dioktadecyloksakarbocyjaniny (DiO, 2 mg) i inicjator wolnych rodników (azobisisobutyronitryl) do polimeryzacji w 2 ml chloroformu. Dodać go do wodnego roztworu środka powierzchniowo czynnego funkcjonalizowanego akrylanem (AC10COONa, 13 mg w 7 ml).</li>
	<li>Mieszaj mieszaninę przez 1 godzinę i sonikuj przy amplitudzie 80% przez 5 minut, aby wytworzyć miniemulsję składającą się z małych kropelek materiału organicznego otoczonych polimeryzowalnym środkiem powierzchniowo czynnym w wodzie.</li>
	<li>Podgrzej mieszaninę do temperatury 64 °C w kąpieli olejowej, aby zainicjować polimeryzację zarówno środka sieciującego, jak i środka powierzchniowo czynnego, gdy chloroform powoli odparowuje, pozostawiając zawiesinę NP zawierającą DiO, która jest stabilizowana przez środek powierzchniowo czynny.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę NP (3 razy) przez filtr strzykawkowy 0,2 μm, aby usunąć agregację. Przefiltrowany roztwór NP przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	<li>Koniugacja PEG-Chol do DiO-LCNP poprzez sprzężenie EDC.
	<ol>
		<li>Rozpuścić Chol-PEG-NH2·HCl (PEG-Chol, 0,9 mM) w 25 mM buforze HEPES (pH 7,0).</li>
		<li>Przygotować roztwór roboczy zawierający sól sodową N-hydroksysulfosukcynimidu (NHSS, 40 mM) i chlorowodorek 1-etylo-3-(3-(dimetyloamino)-propylo)karbodimidu (EDC, 400 mM) w buforze HEPES ze stężonych roztworów podstawowych.</li>
		<li>Natychmiast dodać 20 μl świeżo przygotowanego roztworu roboczego NHSS/EDC do 1,0 ml DiO-LCNP w buforze HEPES i mieszać przez 5 minut.</li>
		<li>Do tej mieszaniny dodać 20 μl roztworu podstawowego Chol-PEG-NH2·HCl i mieszać przez 2 godziny.</li>
		<li>Krótko odwirować mieszaninę reakcyjną z maksymalną prędkością (~2,000 x g) przez 30 sekund za pomocą mini wirówki stołowej i przepuścić supernatant przez kolumnę chromatografii wykluczającej o wielkości PD-1013 zrównoważoną solą fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco (DPBS, 0,1x).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Charakterystyka DiO-LCNP i DiO-LCNP-PEG-Chol
<ol>
	<li>Potwierdź udane sprzężenie kowalencyjne PEG-Chol z powierzchnią DiO-LCNP za pomocą elektroforezy żelowej.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 0,5 g agarozy w 50 ml (1x) buforze do elektroforezy tris-boranowej (TBE; 89 mM Tris (pH 7,6), 89 mM kwasu borowego i 2 mM EDTA). Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę. Poczekaj, aż roztwór lekko ostygnie i wlej zawartość do płytki żelowej w pudełku do elektroforezy. Włóż grzebień żelowy, aby utworzyć dołki na próbki.</li>
		<li>Gdy żel zastygnie, dodaj wymaganą ilość (wystarczającą do zanurzenia żelu w komorze) buforu do pracy TBE do komory.</li>
		<li>Dodać 35 μl próbki DiO-LCNP (zmodyfikowanej glicerolem, 5% v/v) do studzienek żelu i pracować przez 20 minut pod napięciem 110 V.</li>
		<li>Zobrazuj żel za pomocą systemu obrazowania żelu z filtrami wzbudzenia i emisji odpowiednio przy 488 nm i 500-550 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń wielkość i rozkład cząstek za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS), rozcieńczając roztwór DiO-LCNP (~200-krotne rozcieńczenie) w PBS (pH ~8, 0,1x) i mierząc na przyrządzie DLS14. Zmierzyć potencjał zeta DiO-LCNP za pomocą odpowiedniego przyrządu do pomiaru potencjału zeta.</li>
</ol>
3. Przygotowanie naczyń z kultur komórkowych do eksperymentów z dostarczeniem i obrazowania
UWAGA: Znakowanie DiO-LCNP jest wykonywane na ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych HEK 293T/17 (między przejściami 5 i 15), które są hodowane zgodnie z wcześniejszym opisem4. Wykonaj eksperymenty z dostarczaniem i późniejsze obrazowanie komórek, jak opisano poniżej.
<ol>
	<li>Przygotować szalki do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm (wyposażone w wkładki ze szkła nakrywkowego nr 1 o średnicy 14 mm), pokrywając je fibronektyną bydlęcą (~100 μl o stężeniu 20 μg/ml) w DPBS przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usuń roztwór powlekający fibronektynę z naczynia hodowlanego. Pobrać komórki HEK 293 T1/7 z kolby T-25, najpierw przemłukując monowarstwę komórek 3 ml DPBS, a następnie dodając 2 ml trypsyny-EDTA (0,5% trypsyny-0,25% EDTA).</li>
	<li>Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez ~3 min. Usunąć trypsynę-EDTA i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze. Po odłączeniu komórek od kolby należy zneutralizować trypsynę, dodając 4 ml kompletnej pożywki (Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM; zmodyfikowana tak, aby zawierała 10% płodowej surowicy bydlęcej, 5% pirogronianu sodu i 5% antybiotyku/antybiotyku/antybiotyku) do kolby. Określić stężenie komórek w zawiesinie, licząc je w liczniku komórek.</li>
	<li>Dostosuj stężenie komórek do ~ 8 x 104 komórek / ml za pomocą pożywki wzrostowej. Dodać 3 ml zawiesiny komórkowej do naczynia i hodować w inkubatorze przez noc; Następnego dnia ogniwa powinny osiągnąć ~70% konfluencji i powinny być gotowe do użycia. Odpowiednia gęstość komórek ma kluczowe znaczenie dla solidnego i wydajnego znakowania dużego odsetka komórek.</li>
</ol>
4. Komórkowe dostarczanie DiO i DiO-LCNP oraz obrazowanie stałych komórek
<ol>
	<li>Przygotować 1 ml roztworów DiO, DiO-LCNP i DiO-LCNP-PEG-Chol w pożywce (HEPES-DMEM; DMEM zawierający 25 mM HEPES) przez rozcieńczanie roztworów podstawowychDiO Free i DiO-LCNP; odpowiednie stężenia DiO do inkubacji na komórkach wynoszą ~1-10 μM (wyrażone jako stężenieDiO free lub DiO w postaci DiO-LCNP).</li>
	<li>Usunąć pożywkę wzrostową z szalek hodowlanych za pomocą pipety serologicznej i przemyć monowarstwy komórek (patrz krok 3) dwa razy za pomocą HEPES-DMEM (2 ml każde przemycie). Wykonuj mycie, delikatnie dodając i usuwając HEPES-DMEM za pomocą pipety do/od krawędzi naczyń.</li>
	<li>Dodać 0,2 ml przygotowanych roztworówdo dostarczania DiO Free lub DiO-LCNP do środka szalek hodowlanych i umieścić szalki z powrotem w inkubatorze na odpowiedni okres czasu (zwykle 15 lub 30 minut, w zależności od potrzeb eksperymentu). Dłuższe czasy inkubacji przyczyniają się do bardziej niespecyficznego znakowania komórkowego obszarów niebłoniastych (np. cytozolu).</li>
	<li>Po okresie inkubacji usunąć roztwory doprowadzające za pomocą pipety serologicznej. Umyj monowarstwy komórek dwa razy DPBS (2 ml każde płukanie). Wykonuj mycie, delikatnie dodając i usuwając DPBS do/od krawędzi naczynia.</li>
	<li>Utrwalić monowarstwy komórek za pomocą 4% paraformaldehydu (przygotowanego w DPBS) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Paraformaldehyd jest łatwopalny, działa drażniąco na drogi oddechowe i podejrzewa się, że jest rakotwórczy.</li>
	<li>Usunąć roztwór paraformaldehydu za pomocą pipety i delikatnie umyć komórki 1 raz DPBS (2 ml), dodając i usuwając DPBS za pomocą pipety do/od krawędzi szalek.</li>
	<li>Utrwalone komórki są gotowe do zobrazowania pod kątem obecności błoniastego sygnału fluorescencyjnego za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM). Obrazowanie należy wykonać natychmiast lub, alternatywnie, zastąpić pożywkę DPBS zawierającą 0,05% NaN3i przechowywać szalki w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: NaN3jest toksyczny; zachować szczególną ostrożność podczas korzystania z NaN3. 
	UWAGA: Utrwalone próbki przechowywane w ten sposób powinny zostać zobrazowane w ciągu 48 godzin, aby uzyskać optymalne wyniki.</li>
</ol>
5. Komórkowe dostarczanie DiO i DiO-LCNP oraz obrazowanie FRET w żywych komórkach
UWAGA: W tej metodzie, komórki są koznakowane 6 μM każdy DiO-LCNP-PEG-Chol (gdzie DiO jest donorem FRET) i nadchloranem 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny (wolny od DiI, gdzie DiI jest akceptorem FRET). Uwolnienie DiO z DiO-LCNP-PEG-Chol i jego wbudowanie w błonę plazmatyczną potwierdza obserwowany wzrost transferu energii od dawcy DiO do akceptora DiI.
<ol>
	<li>Oznacz komórki sekwencyjnie za pomocą DiO-LCNP-PEG-Chol i DiIfree, stosując metodę opisaną w kroku 4.</li>
	<li>Po barwieniu przemyć komórki 1 raz DPBS (2 ml) za pomocą pipety serologicznej i zastąpić bufor płuczący 2 ml roztworu do obrazowania żywych komórek (LCIS).</li>
	<li>Na stoliku mikroskopowym wyposażonym w podgrzewaną komorę inkubacyjną zobrazuj żywą próbkę komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego (obiektyw 60X) z konfiguracją obrazowania FRET w odstępach 30-minutowych przez okres 4 godzin, wzbudzając donor DiO przy 488 nm i zbierając pełne widma emisyjne zarówno donora DiO, jak i akceptora DiI od 490-700 nm za pomocą 32-kanałowego detektora spektralnego.</li>
	<li>UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat obrazowania FRET, patrz odniesienie15.</li>
	<li>Określ czasowo-rozdzielczą intensywność emisji zarówno donora DiO, jak i akceptora DiI z komórek barwionych DiO-LCNP-PEG-Chol i DiI. Oblicz czasowo rozdzielczy stosunek FRET akceptora/dawcy (DiIemi/DiOemi) dla obrazów, który będzie stale wzrastał i ostatecznie ustabilizuje się, gdy ilość donora DiO podzielonego na membranę osiągnie maksimum16.</li>
</ol>
6. Test cytotoksyczności DiO i DiO-LCNP dla komórek HEK 293T/17
UWAGA: Cytotoksyczność materiałów DiO-LCNP jest oceniana za pomocą testu proliferacji na bazie barwnika tetrazoliowego17. Komórki są hodowane na płytce wielodołkowej w obecności różnych stężeń materiałów w warunkach naśladujących dostarczanie/etykietowanie. Komórki są następnie hodowane przez 72 godziny, aby umożliwić proliferację. Barwnik (MTS, (3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolium) jest następnie dodawany do studzienek, a metabolicznie aktywne komórki przekształcają barwnik w niebieski produkt formazanu. Ilość tworzenia się koloru jest wprost proporcjonalna do liczby żywotnych komórek.
<ol>
	<li>Pobrać komórki HEK 293 T1/7 z kolby T-25, postępując zgodnie z procedurą opisaną w kroku 3.2.Wysiewać komórki HEK 293T/17 (5 000 komórek/100 μl/basenik) do dołków na 96-dołkowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych i hodować przez 24 godziny.</li>
	<li>Całkowicie usunąć pożywkę hodowlaną z dołków za pomocą mikropipety i dodać 50 μl HEPES-DMEM zawierającegoDiO free, DiO-LCNPs lub DiO-LCNP-PEG-Chol w rosnących stężeniach, aby powtórzyć studzienki. Inkubować na komórkach w temperaturze 37 °C przez 30 min. 
	UWAGA: Zazwyczaj powtórzenia wykonane w trzech lub czterech powtórzeniach są wystarczające do uzyskania statystycznie wiarygodnych danych.
	<ol>
		<li>Po inkubacji usunąć pożywkę zawierającą materiały za pomocą mikropipety i zastąpić ją 100 μl pożywki wzrostowej. Hoduj komórki przez 72 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 20 μl substratu tetrazolowego do każdej studzienki, umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze i pozostawić do tworzenia koloru w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Odczytać absorbancję (abs) produktu formazanu przy 570 nm (minima absorpcji dla DiO-LCNP użytych w tym badaniu) i 650 nm (dla odjęcia niespecyficznej absorbancji tła) za pomocą czytnika płytek do mikromiareczkowania.</li>
	<li>Wykreślić różnicową wartość absorbancji (abs570 - abs650) w stosunku do stężenia materiału i podać wyniki jako procent proliferacji komórek kontrolnych (stopień proliferacji komórek tylko w pożywce do hodowli komórkowych).</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Statystyczna analiza danych za pomocą jednowymiarowej analizy wariancji (ANOVA). W przypadku wielokrotnych porównań należy zastosować test post hoc Bonferroniego. Podać wszystkie wartości średnie ± wartości standardowe błędu średniej (SEM), chyba że zaznaczono inaczej. 
	UWAGA: Dopuszczalne prawdopodobieństwo istotności wynosiło p < 0,05.</li>
</ol>

<ol><li>Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+actuation+of+therapeutic+nanoparticles%3A+an+update+on+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Deliv%22%5BJournal%5D)">Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress.</a> Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).</li>
<li>Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+low-dose+toxicity+of+the+universal+solvent+DMSO%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO.</a> FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).</li>
<li>Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+tuning+of+organic+nanocolloids+by+controlled+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions.</a> ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).</li>
<li>Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+Liquid+Crystal+Nanoparticles+for+Intracellular+Fluorescent+Imaging+and+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery.</a> ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).</li>
<li>Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+DiO-labelled+tumour+cells+in+liver+sections+by+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy.</a> J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).</li>
<li>Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+neuronal+connections+in+postmortem+human+hippocampal+complex+with+the+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI.</a> Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).</li>
<li>Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in neuroanatomical tracing.</a> Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dil+and+DiO%3A+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).</li>
<li>Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).</li>
<li>Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+in+developing+visual+systems+with+a+new+method+of+staining+neurones+and+their+processes+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue.</a> Development. 101 (4), 697-713 (1987).</li>
<li>Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+with+fluorescent+carbocyanine+dyes+of+cultured+endothelial+and+smooth+muscle+cells+by+growth+in+dye-containing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium.</a> Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).</li>
<li>Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevation+of+intracellular+glucosylceramide+levels+results+in+an+increase+in+endoplasmic+reticulum+density+and+in+functional+calcium+stores+in+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons.</a> J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).</li>
<li>Garrett, R. H., Grisham, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarrett%2C+RH+%22Biochemistry%22">Biochemistry</a>. , 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).</li>
<li>Berne, B. J., Pecora, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerne%2C+BJ+%22Dynamic+Light+Scattering%22">Dynamic Light Scattering</a>. , Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).</li>
<li>Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html">Basics of FRET Microscopy</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html ">http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html </a> (2016).</li>
<li>Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+hydrophobic+molecules+from+polymer+micelles+into+cell+membranes+revealed+by+Fo%CC%88rster+resonance+energy+transfer+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).</li>
<li>Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+MTT+assay+for+rapid+determination+of+chemosensitivity+of+human+leukemic+blast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells.</a> Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).</li>
<li>Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+raft-mediated+membrane+tethering+and+delivery+of+hydrophobic+cargos+from+liquid+crystal-based+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers.</a> Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).</li>
<li>Karve, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revival+of+the+abandoned+therapeutic+wortmannin+by+nanoparticle+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Stałym celem NMDD jest kontrolowane celowanie i dostarczanie preparatów leczniczych do komórek i tkanek, w połączeniu z jednoczesną poprawą skuteczności leków. Jedną ze specyficznych klas cząsteczek leków, dla których stanowi to poważne wyzwanie, są leki hydrofobowe/środki do obrazowania, które mają niewielką lub żadną rozpuszczalność w środowisku wodnym. Problem ten był plagą w procesie przechodzenia silnych leków z systemów hodowli komórkowych in vitro do warunków klinicznych i spowodował, że wiele obiecującyc...

Od czasu pojawienia się łączących nanomateriały (materiały ≤100 nm w co najmniej jednym wymiarze) z żywymi komórkami, nieustającym celem było wykorzystanie unikalnych właściwości nanocząstek (NP) zależnych od wielkości do różnych zastosowań. Zastosowania te obejmują znakowanie/obrazowanie komórek i tkanek (zarówno in vitro, jak i in vivo), wykrywanie w czasie rzeczywistym oraz kontrolowane dostarczanie leków i innych ładunków1. Przykładami takich istotnych właściwości nanocząsteczek są: zależna od wielkości emisja nanokryształów półprzewodnikowych (kropek kwantowych, QD); właściwości fototermiczne nanocząstek złota; duża nośność wodnego rdzenia liposomów; oraz przewodność balistyczna alotropów węgla, takich jak jednościenne nanorurki węglowe i grafen.
Ostatnio pojawiło się duże zainteresowanie wykorzystaniem NP do kontrolowanej modulacji leków i innych ładunków, takich jak środki kontrastowe/obrazujące. W tym przypadku uzasadnieniem jest znaczne zwiększenie/optymalizacja ogólnej rozpuszczalności, dostarczonej dawki, czasu krążenia i ostatecznej odprawy ładunku leku poprzez dostarczenie go jako preparatu NP. Stało się to znane jako dostarczanie leków za pośrednictwem NP (NMDD), a obecnie istnieje siedem zatwierdzonych przez FDA preparatów leków NP do stosowania w klinice w leczeniu różnych nowotworów i setki innych na różnych etapach badań klinicznych. Zasadniczo celem jest "osiągnięcie więcej za mniej; ", to znaczy wykorzystanie NP jako rusztowania do dostarczania większej ilości leku przy mniejszej liczbie dawek, wykorzystując dużą powierzchnię: objętość (np. twarde cząstki, takie jak QD i tlenki metali) NP lub ich dużą objętość wewnętrzną do załadunku dużych ładunków (np. liposomów lub miceli). Celem jest zmniejszenie konieczności stosowania wielu schematów dawkowania podawanych ogólnoustrojowo, przy jednoczesnym promowaniu stabilności wodnej i poprawie krążenia, szczególnie w przypadku trudnych hydrofobowych ładunków leków, które, choć wysoce skuteczne, są trudno rozpuszczalne w środowisku wodnym.
Tak więc, celem opisanej tutaj pracy było określenie opłacalności użycia nowego rusztowania NP do specyficznego i kontrolowanego dostarczania hydrofobowych ładunków do dwuwarstwy lipofilowej błony plazmatycznej. Motywacją do podjęcia prac była nieodłącznie ograniczona rozpuszczalność i trudność w dostarczaniu cząsteczek hydrofobowych do komórek z pożywki wodnej. Zazwyczaj dostarczenie takich hydrofobowych cząsteczek wymaga użycia rozpuszczalników organicznych (np. DMSO) lub amfifilowych środków powierzchniowo czynnych (np. Poloxamers), które mogą być toksyczne i zagrażać żywotności komórek i tkanek2, lub nośników micel, które mogą mieć ograniczoną zdolność ładowania wewnętrznego. Wybrany tutaj nośnik NP był nowym preparatem ciekłokrystalicznym NP (LCNP) opracowanym wcześniej3 i który, jak wykazano wcześniej, osiąga ~40-krotną poprawę skuteczności leku przeciwnowotworowego doksorubicyny w hodowanych komórkach4.
W pracy opisanej tutaj, reprezentatywnym wybranym ładunkiem był potencjometryczny barwnik membranowy, nadchloran 3,3'-dioctadecyloxacarbocyaniny (DiO). DiO to nierozpuszczalny w wodzie barwnik, który był używany do śledzenia następczego i wstecznego w żywych i utrwalonych neuronach, pomiarów potencjału błonowego oraz do ogólnego znakowania błony5,6,7,8,9. Ze względu na swoją hydrofobową naturę, DiO jest zwykle dodawany bezpośrednio do monowarstw komórek lub tkanek w postaci krystalicznej10, lub jest inkubowany w bardzo wysokich stężeniach (~1-20 μM) po rozcieńczeniu z roztworu podstawowego o stężeniu11,12.
Tutaj podejście zostało wykorzystane do platformy LCNP, wielofunkcyjnego NP, którego wewnętrzny rdzeń jest całkowicie hydrofobowy, a którego powierzchnia jest jednocześnie hydrofilowa i podatna na biokoniugację, jako nośnik dla DiO. DiO jest włączane do rdzenia LCNP podczas syntezy, a powierzchnia NP jest następnie funkcjonalizowana ugrupowaniem pegylowanym cholesterolem, aby promować wiązanie błonowe zespołu DiO-LCNP z błoną plazmatyczną. Podejście to zaowocowało systemem dostarczania, który podzielił DiO na błonę plazmatyczną z większą wiernością i czasem przebywania w błonie niż wolna forma DiO dostarczana z roztworu masowego (DiO free). Co więcej, metoda ta wykazała, że dostarczanie DiO za pośrednictwem LCNP znacznie moduluje i napędza szybkość specyficznego podziału barwnika na dwuwarstwę lipofilowej błony plazmatycznej. Osiąga się to przy jednoczesnym zmniejszeniu cytotoksyczności wolnego leku o ~40% poprzez dostarczanie go w postaci preparatu LCNP.
Przewiduje się, że opisana tutaj metodologia będzie potężną techniką umożliwiającą dla badaczy, których praca obejmuje lub wymaga komórkowego dostarczania wysoce hydrofobowych ładunków, które są trudno rozpuszczalne lub całkowicie nierozpuszczalne w roztworze wodnym.

<table><tbody><tr><td>Chlorowodorek 1-etylo-3-(3-(dimetyloamino)-propylo)karbodimidu (EDCA)</td><td>ThermoFisher</td><td>E2247</td><td></td></tr><tr><td>3,3&-dioctadecyloxacarbocyanina nadchloran (DiO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4292-20MG</td><td>Niebezpieczne; zrobić roztwór podstawowy w DMSO</td></tr><tr><td>Chlorowodorek poli(glikolu etylenowego) aminy</td><td>Nanocs, Inc.</td><td>PG2-AMCS-2k</td><td></td></tr><tr><td>Hrabina automatyczny licznik komórek</td><td>ThermoFisher</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Dioctadecyl-3,3,3&prime; &#8288;,3&prime;-tetrametyloindokarbocyjaniny nadchloran (DiI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495-100MG</td><td>Niebezpieczne; zrobić roztwór podstawowy w DMSO</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>21063045</td><td>Warm w 37 stopniach; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy DulbeccoThermoFisher</td><td></td> <td>14040182</td><td>Ciepła w 37 stopniach; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Przyrząd do dynamicznego rozpraszania światła</td><td>ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, Wielka Brytania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna Białko bydlęce, Plazma</td><td>ThermoFisher</td><td>33010018</td><td>Przygotować roztwór podstawowy 1 mg/ml za pomocą DPBS. Użyj 20-30 i mikro; g/ml do powlekania naczynia MetTek, 2 godz. w 37 stopniach; C</td></tr><tr><td>Formaldehyd (16%, w/v)</td><td>ThermoFisher</td><td>28906</td><td>Niebezpieczny; rozcieńczyć do 4% przy użyciu DPBS</td></tr><tr><td>Ludzkie embrionalne komórki nerkowe (HEK 293T/17)</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC&reg; CRL-11268 i handel;</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie do obrazowania żywych komórek (LCIS)</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td>Warm w 37 stopniach; C przed użyciem</td></tr><tr><td>MatTek 14 mm # 1.0 wkładka do hodowli komórkowych</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Modified Eagle Medium (DMEM) zawierające 25 mM HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>21063045</td><td>Warm w 37 stopniach; C przed użyciem</td></tr><tr><td>N-sól sodowa hydroksysulfosukcynimidu (NHSS)</td><td>ThermoFisher</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop spektralny konfokalny Nikon A1si</td><td>Nikon Instruments Trypan Blue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stain (0,4%)&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>mieszać jako 50% do zawiesiny komórek przed zliczeniem komórek</td></tr><tr><td>Instrument potencjału</td><td>Zeta ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, Wielka Brytania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Procesor ultradźwiękowy</td><td>Sonics and Materials Inc</td><td>GEX 600-5</td><td></td></tr><tr><td>Mini Cetntrifuge</td><td>Benchmark</td><td>Mini-fuge-04477</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Sephadex&trade; G-25 Medium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania Bio-Rad ChemiDoc XRS</td><td>Bio-RAD</td><td>76S/07434</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

celowane dostarczanie przez błonę plazmatyczną hydrofobowego ładunku zamkniętego w nośniku nanocząstek ciekłokrystalicznych

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

Kontrolowane dostarczanie leków/środków obrazujących do komórek jest kluczowe dla rozwoju terapii i badania procesów sygnalizacji komórkowej. W ostatnim czasie nanocząstki (NP) okazały się bardzo obiecujące w rozwoju takich systemów dostarczania. W tym przypadku zastosowano system dostarczania oparty na ciekłokrystalicznym NP (LCNP) do kontrolowanego dostarczania nierozpuszczalnego w wodzie barwnika, nadchloranu 3,3′-dioctadecyloksakarbocyjaniny (DiO), z wnętrza rdzenia NP do hydrofobowego obszaru dwuwarstwy błony plazmatycznej. Podczas syntezy nanocząsteczek barwnik został skutecznie wkomponowany w hydrofobowy rdzeń LCNP, co potwierdziły liczne analizy spektroskopowe. Koniugacja pegylowanej pochodnej cholesterolu z powierzchnią NP (DiO-LCNP-PEG-Chol) umożliwiła wiązanie naładowanych barwnikiem nanocząsteczek z błoną plazmatyczną w komórkach HEK 293T/17. Czasowo-rozdzielcza laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna i obrazowanie rezonansowego transferu energii Förstera (FRET) potwierdziły bierny wypływ DiO z rdzenia LCNP i jego wprowadzenie do dwuwarstwy błony plazmatycznej. Wreszcie, dostarczenie DiO w postaci LCNP-PEG-Chol osłabiło cytotoksyczność DiO; forma NP DiO wykazywała ~ 30-40% mniejszą toksyczność w porównaniu doDiO free dostarczanego z roztworu luzem. Podejście to demonstruje użyteczność platformy LCNP jako wydajnej metody specyficznego dla błony dostarczania i modulacji hydrofobowych ładunków molekularnych.

Przygotowano LCNP, w których hydrofobowy rdzeń nanocząstki (NP) został załadowany reprezentatywną sondą do znakowania błon, aby wykazać użyteczność LCNP jako wydajnego nośnika dla ładunków hydrofobowych. W tym celu wybrano wysoce nierozpuszczalny w wodzie potencjometryczny barwnik do znakowania błon, DiO. LCNP załadowane DiO (DiO-LCNPs) zsyntetyzowano przy użyciu dwufazowej techniki mini-emulsji z wykorzystaniem komponentów chemicznych DACTP11, AC10COONa oraz DiO, jak pokazano na Rysunku 1</stron...

Nanonośnik ciekłokrystalicznej nanocząstki (LCNP) jest wykorzystywany jako narzędzie do kontrolowanego dostarczania hydrofobowego ładunku do błony komórkowej żywych komórek.

Celowane dostarczanie przez błonę plazmatyczną hydrofobowego ładunku zamkniętego w nośniku nanocząstek ciekłokrystalicznych

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest wykorzystanie nanocząsteczki na bazie kryształów ciekłych jako platformy dostarczania do kontrolowanego transportu hydrofobowego ładunku do lipofilowej części błony komórkowej żywych komórek ssaków. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie dostarczania leków, takie jak sposób efektywnego umożliwienia transportu i poboru komórkowego hydrofobowych ładunków o słabej rozpuszczalności w wodzie. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na bardziej specyficzne dostarczanie hydrofobowych ładunków skierowanych do błony, bezpośrednio do błony komórkowej, przy jednoczesnym zmniejszeniu ich cytotoksyczności.Procedurę zaprezentuje dr Okhil Nag, postdoc z mojego laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania nanocząstek ciekłokrystalicznych DiO zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodaj 20 µL świeżo przygotowanego roztworu roboczego NHSS/EDC do 1,0 mL nanocząstek ciekłokrystalicznych DiO w buforze HEPES.Następnie mieszać przez pięć minut. Potem dodać 20 µL roztworu zapasowego cholesterol PEG amine do tej mieszaniny i mieszać przez dwie godziny. Po dwóch godzinach krótko odwirować mie

targeted-plasma-membrane-delivery-hydrophobic-cargo-encapsulated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Szybka mechaniczna deformacja komórek pojawiła się jako obiecująca, bezwektorowa metoda wewnątrzkomórkowego dostarczania makrocząsteczek i nanomateriałów. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z systemu w szerokim zakresie zastosowań.

Ściskanie komórek jako solidna, mikroprzepływowa platforma dostarczania wewnątrzkomórkowego

W tym badaniu opisano metodę syntezy ultra-małych populacji biokompatybilnych nanocząstek, a także kilka metod in vitro, za pomocą których można ocenić ich interakcje komórkowe.

Stałe nanocząstki lipidowe (SLN) do zastosowań wewnątrzkomórkowych

Najczęściej stosowana metoda syntezy nanostrukturalnych nośników lipidowych (NLC) obejmuje emulsję typu olej w wodzie, homogenizację i krzepnięcie. Zostało to tutaj zmodyfikowane poprzez zastosowanie dyspersji przy wysokim ścinaniu po zestaleniu w celu uzyskania NLC o pożądanej wielkości, ulepszonej enkapsulacji leku i wydajności ładowania leku jako potencjalnego nośnika dostarczania dakarbazyny.

Kapsułkowanie przeciwnowotworowego środka terapeutycznego dakarbazyny za pomocą nanostrukturalnego nośnika lipidowego

Celem tego protokołu jest użycie kationowych/anionowych liposomów z peptydem neurotargetującym jako systemu dostarczania OUN, aby umożliwić siRNA przejście przez BBB.  Optymalizacja systemu dostarczania leków, takich jak siRNA, pozwoliłaby na więcej opcji leczenia prionów i innych chorób neurodegeneracyjnych.

Dostarczanie terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych

Nanocząsteczki stają się obiecującymi systemami dostarczania leków dla szerokiego zakresu wskazań. Tutaj opisujemy prostą, ale potężną metodę wytwarzania nanocząstek jedwabiu przy użyciu odwróconego jedwabiu Bombyx mori. Te nanocząstki jedwabiu można łatwo załadować ładunkiem terapeutycznym, a następnie zbadać pod kątem zastosowań związanych z dostarczaniem leków.

Produkcja i dostarczanie leków Zastosowania nanocząstek jedwabiu

Nanomateriały zapewniają wszechstronne mechanizmy kontrolowanego dostarczania terapeutycznego zarówno dla nauk podstawowych, jak i zastosowań translacyjnych, ale ich wytwarzanie często wymaga specjalistycznej wiedzy, która jest niedostępna w większości laboratoriów biomedycznych. W tym miejscu przedstawiamy protokoły skalowalnego wytwarzania i ładowania terapeutycznego różnorodnych, samoorganizujących się nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej.

Szybkie, skalowalne składanie i ładowanie bioaktywnych białek i immunostymulantów do różnych syntetycznych nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej

Tutaj opisujemy protokół generowania kationowych nanoliposomów, który opiera się na metodzie suchego filmu i może być wykorzystany do bezpiecznego i efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA.

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

Ten artykuł opisuje enkapsulację falkarindiolu w pokrytych lipidami nanocząstkach o długości fali 74 nm. Komórkowy wychwyt nanocząstek przez ludzkie komórki macierzyste do kropelek lipidów jest monitorowany za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. Nanocząstki są wytwarzane metodą szybkiego wstrzykiwania rozpuszczalnika, a ich rozmiar mierzy się za pomocą techniki dynamicznego rozpraszania światła.

Wychwyt nowych nanocząstek pokrytych lipidami zawierających falkarindiol przez ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste

Przedstawiono metody przygotowania i scharakteryzowania właściwości fizykochemicznych i bioaktywności neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek siRNA. Omówiono kryteria skutecznego stosowania nanoleków siRNA, takie jak rozmiar, morfologia, ładunek powierzchniowy, obciążenie siRNA i wyciszanie genów.

Przygotowanie neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek polimerowych do dostarczania cytozolowego siRNA

To badanie opisuje klasyczną hydratację przy użyciu metody cienkiego filmu lipidowego do przygotowania nanoliposomów, a następnie charakterystyki nanocząstek. Hydrofilowe i globularne białko o masie 47 kDa, taryna, jest z powodzeniem kapsułkowane jako strategia poprawiająca stabilność, unikająca szybkiego klirensu i promująca kontrolowane uwalnianie. Metoda może być dostosowana do enkapsulacji cząsteczek hydrofobowych.

Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych

Nanocząsteczki lipidowe są opracowywane przy użyciu mikroprzepływowej platformy mieszania do enkapsulacji mRNA i DNA.

Formułowanie i charakteryzowanie nanocząstek lipidowych do dostarczania genów przy użyciu platformy mieszania mikroprzepływowego

Poznaj metodę dostarczania hydrofobowych ładunków do błony plazmatycznej komórek ssaczych przy użyciu nanocząstek ciekłokrystalicznych. Technika ta zwiększa wchłanianie komórkowe i redukuje cytotoksyczność.

Celowane dostarczanie przez błonę plazmatyczną hydrofobowego ładunku zamkniętego w nośniku nanocząstek ciekłokrystalicznych

Przeglądaj więcej filmów