Celowane dostarczanie przez błonę plazmatyczną hydrofobowego ładunku zamkniętego w nośniku nanocząstek ciekłokrystalicznych

Ogólnym celem tej procedury eksperymentalnej jest wykorzystanie nanocząstki na bazie ciekłokrystalicznej jako platformy dostarczania do kontrolowanego dostarczania hydrofobowego diładunku do lipofilowej części błony komórkowej żywych komórek ssaków. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie dostarczania leków, takie jak to, jak skutecznie umożliwić dostarczanie i pobieranie przez komórki słabo rozpuszczalnych w wodzie ładunków hydrofobowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na bardziej specyficzne dostarczanie hydrofobowych ładunków ukierunkowanych na błonę do błony plazmatycznej, w połączeniu z ich zmniejszoną cytotoksycznością.

Procedurę zademonstruje dr Okhil Nag, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania nanocząstki ciekłokrystalicznej DiO zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodać 20 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu roboczego NHSS/EDC do 1,0 mililetów ciekłokrystalicznej nanocząstki DiO w buforze HEPES.

I mieszaj przez pięć minut. Następnie dodaj do tej mieszaniny 20 mikroletów podstawowego roztworu cholesterolu PEG aminy i mieszaj przez dwie godziny. Po dwóch godzinach krótko odwirować mieszaninę reakcyjną z maksymalną prędkością przez 30 sekund za pomocą mini wirówki stołowej.

Następnie przepuścić supernatant przez kolumnę chromatograficzną wykluczającą o wielkości PD 10 zrównoważoną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami Dulbecco. Aby potwierdzić pomyślne sprzężenie kowalencyjne cholesterolu PEG z powierzchnią ciekłokrystalicznej nanocząstki DiO za pomocą elektroforezy żelowej, należy przygotować żel agarozowy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Gdy żel zestali się, dodaj wystarczającą ilość buforu do pracy TBE, aby zanurzyć żel w komorze.

Następnie dodaj 35 mikroleterów próbki nanocząstek ciekłokrystalicznych DiO do studzienek żelu i pracuj przez 20 minut pod napięciem 110 woltów. Zobrazuj żel za pomocą systemu obrazowania żelu z filtrem wzbudzenia o długości 488 nanometrów i filtrami emisyjnymi o długości od 500 do 550 nanometrów. Przygotuj szalki do hodowli tkankowych o średnicy 35 milimetrów, wyposażone w 14-milimetrowe wkładki ze szkła nakrywkowego, pokrywając je fibronektyną bydlęcą w DPBS przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po dwóch godzinach usuń roztwór powlekający fibronektynę z naczynia hodowlanego. Zbierz komórki HEK 293 T17 z kolby T25, najpierw przemywając monowarstwę komórek trzema mililitrami DPBS, a następnie dodając dwa mililitry trypsyny EDTA. Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około trzy minuty.

Po odłączeniu komórek od kolby należy zneutralizować trypsynę, dodając do kolby cztery mililitry kompletnej pożywki. Określić stężenie komórek w zawiesinie, licząc je w liczniku komórek. Następnie dostosuj stężenie komórek do około 80 000 komórek na mililitr za pomocą pożywki wzrostowej.

Dodaj trzy mililitry zawiesiny komórkowej do naczynia i hoduj w inkubatorze przez noc. Następnego dnia ogniwa powinny być w około 70 procentach zbieżne i gotowe do użycia. Odpowiednia gęstość komórek ma kluczowe znaczenie dla solidnego i wydajnego znakowania dużego odsetka komórek.

Przygotuj jednomililitrowe roztwory DiO, nanocząstki ciekłokrystalicznej DiO i ciekłokrystalicznego nanocząsteczki cholesterolu PEG DiO w pożywce dostarczającej, rozcieńczając odpowiednie roztwory podstawowe. Usunąć pożywkę wzrostową z naczyń hodowlanych za pomocą pipety serologicznej i umyć monowarstwy komórek dwa razy za pomocą HEPES DMEM. Wykonaj mycie za pomocą pipety, aby delikatnie dodać HEPES DMEM do krawędzi naczyń, a następnie wyjmij go.

Dodaj 0,2 mililitra przygotowanych roztworów dostarczających nanocząstki ciekłokrystaliczne DiO lub DiO do środka naczyń hodowlanych. Następnie włóż naczynia z powrotem do inkubatora na odpowiedni okres czasu. Dłuższy czas inkubacji prowadzi do niespecyficznego znakowania komórkowego obszarów niebłonowych.

Po okresie inkubacji usunąć roztwory doprowadzające za pomocą pipety serologicznej. Umyj monowarstwy komórek dwa razy za pomocą DPBS, używając dwóch mililitrów na każde pranie. Utrwal monowarstwy komórek za pomocą czterech procent paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Usuń roztwór paraformaldehydu za pomocą pipety i delikatnie umyj komórki jednym raz dwoma mililitrami DPBS. Teraz utrwalone komórki są gotowe do obrazowania pod kątem obecności membranowego sygnału fluorescencyjnego za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Na stoliku mikroskopowym wyposażonym w podgrzewaną komorę inkubacyjną zobrazuj żywą próbkę komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego, aby ocenić znakowanie błony.

Jeśli obrazowanie nie zostanie wykonane natychmiast, zastąp pożywkę DPBS zawierającą 0,05 procent azydku sodu i przechowuj szalki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W tej metodzie komórki są koznakowane z DiO jako donorem FRET i DiI jako akceptorem FRET. Oznacz sprzedaż sekwencyjnie za pomocą ciekłokrystalicznego nanocząsteczki PEG DiO, cholesterolu i DiI wolne od DiI, jak poprzednio.

Po barwieniu przemyć komórki jeden raz dwoma mililetami DPBS za pomocą pipety serologicznej i zastąpić dwoma mililitrami roztworu do obrazowania żywych komórek. Na stoliku mikroskopowym wyposażonym w podgrzewaną komorę inkubacyjną zobrazuj żywą próbkę komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego z obrazowaniem FRET. Skonfiguruj eksperyment na 30-minutowe odstępy w ciągu czterech godzin, wzbudzając donor DiO na 488 nanometrach i zbierając pełne widma emisyjne zarówno donora DiO, jak i akceptora DiI od 490 do 700 nanometrów, za pomocą 32-kanałowego detektora spektralnego.

Następnie określ czasowo-rozdzielczą intensywność emisji zarówno donora DiO, jak i akceptora DiI z komórek barwionych ciekłokrystalicznymi nanocząstkami ciekłokrystalicznymi DiO, cholesterolem PEG i DiI. Na koniec oblicz współczynnik FRET akceptora donora w czasie dla obrazów, jak opisano w protokole tekstowym. Wolne DiO gromadzi się niespecyficznie we wnętrzu komórki, a nie w błonach plazmatycznych komórek, które zostały podbarwione dwuznacznym fosfolipidem błonowym.

Można to zwizualizować za pomocą scalonych obrazów. I odwrotnie, ciekłokrystaliczna nanocząstka DiO cholesterolu PEG specyficznie znakuje tylko błonę plazmatyczną komórki, co jest uwidocznione przez kolokalizację z oznaczonym fosfolipidem błonowym. FRET potwierdza diopartycję z nanocząstki ciekłokrystalicznej do dwuwarstwy lipidowej błony poprzez obserwowany wzrost transferu energii z donora DiO do akceptora DiI.

FRET między DiO i DiI, a także zmiany emisji DiO i DiI, potwierdzają wzrost FRET od DiO do DiI w funkcji czasu. Nanocząstki cholesterolu PEG z ciekłokrystalicznej nanocząstki DiO wykazują minimalną cytotoksyczność przy 90 procentach żywotności, w porównaniu ze znaczną toksycznością dla wolnego DiO przy około 50 procentach żywotności. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak syntetyzować nanocząstki ciekłokrystaliczne załadowane ładunkiem, biofunkcjonalizować je w celu kierowania komórkowego i obrazować komórki załadowane ładunkiem w celu pomyślnego dostarczenia komórkowego.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ specyficzne dostarczanie DiO z roztworu wodnego do błony plazmatycznej jest poważnym wyzwaniem. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody po tym, jak wykorzystaliśmy platformę nanocząstek ciekłokrystalicznych do komórkowego dostarczania leku przeciwnowotworowego doksorubicyny i zobaczyliśmy jej zdolność do modulowania kinetyki wychwytu komórkowego leku. Zgodnie z tą procedurą, podejście to może zostać wdrożone do dostarczania komórkowego szerokiej gamy ładunków hydrofobowych, które stanowią szczególne wyzwanie w odniesieniu do ich dostarczania do komórek z mediów wodnych.

Podejście to można wykorzystać do osiągnięcia bardziej wydajnego dostarczania leków ukierunkowanych na błonę i cząsteczek bioaktywnych, takich jak barwniki wrażliwe na napięcie do obrazowania mózgu lub leki fotodynamiczne do terapii lekowej wspomaganej fotonicznie.