Celowane dostarczanie przez błonę plazmatyczną hydrofobowego ładunku zamkniętego w nośniku nanocząstek ciekłokrystalicznych

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest wykorzystanie nanocząsteczki na bazie kryształów ciekłych jako platformy dostarczania do kontrolowanego transportu hydrofobowego ładunku do lipofilowej części błony komórkowej żywych komórek ssaków. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie dostarczania leków, takie jak sposób efektywnego umożliwienia transportu i poboru komórkowego hydrofobowych ładunków o słabej rozpuszczalności w wodzie. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na bardziej specyficzne dostarczanie hydrofobowych ładunków skierowanych do błony, bezpośrednio do błony komórkowej, przy jednoczesnym zmniejszeniu ich cytotoksyczności.

Procedurę zaprezentuje dr Okhil Nag, postdoc z mojego laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania nanocząstek ciekłokrystalicznych DiO zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodaj 20 µL świeżo przygotowanego roztworu roboczego NHSS/EDC do 1,0 mL nanocząstek ciekłokrystalicznych DiO w buforze HEPES.

Następnie mieszać przez pięć minut. Potem dodać 20 µL roztworu zapasowego cholesterol PEG amine do tej mieszaniny i mieszać przez dwie godziny. Po dwóch godzinach krótko odwirować mieszaninę reakcyjną z maksymalną prędkością przez 30 sekund, używając miniwirówki nakładkowej.

Następnie przeprowadź nadsącz przez kolumnę do chromatografii wykluczania PD 10 równoważoną solą fizjologiczną z buforem fosforanowym Dulbecco. Aby za pomocą elektroforezy w żelu potwierdzić pomyślne kowalencyjne sprzężenie PEG-cholesterolu z powierzchnią nanocząsteczek ciekłokrystalicznych DiO, przygotuj żel agarozowy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po zastygnięciu żelu dolej odpowiednią ilość buforu do elektroforezy TBE, aby całkowicie zanurzyć żel w komorze.

Następnie do studni żelu należy dodać 35 µL próbki nanocząsteczek ciekłokrystalicznych DiO i prowadzić elektroforezę przez 20 minut przy napięciu 110 V. Żel należy zobrazować za pomocą systemu obrazowania żeli z filtrem wzbudzenia 488 nm oraz filtrami emisji od 500 do 550 nm. Należy przygotować szalki hodowlane o średnicy 35 mm z wkładkami z deactivate szkiełek nakrywkowych nr 1 o średnicy 14 mm, pokrywając je fibronectiną bydlęcą w DPBS przez dwie godziny w temperaturze 37 °C.

Po dwóch godzinach usunąć roztwór do powlekania fibronektyną z naczynia hodowlanego. Zebrać komórki HEK 293 T17 z kolby T25, najpierw przemywając monowarstwę komórkową 3 mL DPBS, a następnie dodając 2 mL trypsyny EDTA. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez około trzy minuty.

Po odłączeniu komórek z kolby należy zneutralizować trypsynę, dodając do kolby cztery mililitry pożywki kompletnej. Oznacz stężenie komórek w zawiesinie, odliczając je za pomocą licznika komórek. Następnie dostosuj stężenie komórek do poziomu około 80 000 komórek na mililitr za pomocą pożywki wzrostowej.

Dodaj trzy mililitry zawiesiny komórkowej do naczynia i inkubuj w inkubatorze przez noc. Następnego dnia komórki powinny osiągnąć około 70% konfluencji i być gotowe do użycia. Odpowiednia gęstość komórek jest kluczowa dla skutecznego i efektywnego znakowania wysokiego odsetka komórek.

Przygotuj jednobieżne roztwory DiO, nanocząsteczek ciekłokrystalicznych DiO oraz nanocząsteczek ciekłokrystalicznych DiO z PEG-cholesterolem w medium dostarczającym, rozcieńczając odpowiednie roztwory zapasowe. Usuń medium wzrostowe z naczyń hodowlanych za pomocą pipety serologicznej, a następnie dwukrotnie przemyj monowarstwy komórek roztworem HEPES DMEM. Przemywanie należy przeprowadzić, delikatnie dodając HEPES DMEM pipetą do krawędzi naczyń, a następnie go usuwając.

Dodaj 0,2 mililitra przygotowanych roztworów dostarczających wolne DiO lub nanocząsteczki ciekłokrystaliczne DiO do środka naczyń hodowlanych. Następnie przenieś naczynia z powrotem do inkubatora na odpowiedni czas. Dłuższy czas inkubacji prowadzi do niespecyficznego znakowania komórkowego obszarów niebłonowych.

Po okresie inkubacji usunąć roztwory dostarczające za pomocą pipety serologicznej. Przemyć monowarstwy komórek dwukrotnie DPBS, używając dwóch mililitrów do każdego przemycia. Utrwalić monowarstwy komórek czteroprocentową paraformaldehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Usuń roztwór paraformaldehydu za pomocą pipety i delikatnie przemyj komórki raz, używając 2 ml DPBS. Obecnie utrwalone komórki są gotowe do obrazowania w celu wykrycia fluorescencyjnego sygnału błonowego przy użyciu konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej. Na stole mikroskopu wyposażonym w podgrzewaną komorę inkubacyjną, wykonaj obrazowanie próbki żywych komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego, aby ocenić znakowanie błony.

Jeśli obrazowanie nie zostanie wykonane natychmiast, należy zastąpić medium DPBS zawierającym 0,05 procent azotku sodu i przechowywać płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W tej metodzie komórki są podwójnie znakowane przy użyciu DiO jako donora FRET oraz DiI jako akceptora FRET. Znakuj komórki sekwencyjnie za pomocą nanocząsteczek ciekłokrystalicznych PEG-cholesterol DiO oraz wolnego DiI, zgodnie z wcześniejszą procedurą.

Po barwieniu przemyj komórki raz za pomocą dwóch mililitrów DPBS, używając pipety serologicznej, a następnie zastąp je dwoma mililitrami roztworu do obrazowania żywych komórek. Na stole mikroskopu wyposażonym w podgrzewaną komorę inkubacyjną wykonaj obrazowanie próbki żywych komórek przy użyciu mikroskopu konfokalnego z obrazowaniem FRET. Skonfiguruj eksperyment w interwałach 30-minutowych przez okres czterech godzin, wzbudzając donor DiO przy 488 nanometrach i zbierając pełne widma emisji zarówno donora DiO, jak i akceptora DiI w zakresie od 490 do 700 nanometrów, przy użyciu 32-kanałowego detektora spektralnego.

Następnie wyznacz czasowo rozdzielczą intensywność emisji zarówno donora DiO, jak i akceptora DiI w komórkach barwionych nanocząsteczkami ciekłokrystalicznymi DiO PEG cholesterol oraz DiI. Na koniec oblicz czasowo rozdzielczy stosunek FRET akceptor-donor dla obrazów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wolne DiO gromadzi się niespecyficznie wewnątrz komórek, a nie w ich błonach plazmatycznych, które zostały przeciwbarwione dwuetykietowanym fosfolipidem błonowym.

Można to zwizualizować za pomocą nałożonych na siebie obrazów. Z kolei nanocząsteczka ciekłokrystaliczna PEG-cholesterol z DiO znakuje specyficznie tylko błonę plazmatyczną komórki, co potwierdza kolokalizacja z podwójnie znakowanym fosfolipidem błonowym. FRET potwierdza partycjonowanie DiO z nanocząsteczki ciekłokrystalicznej do lipidowej dwuwarstwy błony poprzez zaobserwowany wzrost transferu energii z donora DiO do akceptora DiI.

FRET pomiędzy DiO a DiI, a także zmiany w emisji DiO i DiI, potwierdzają zwiększenie FRET z DiO do DiI w funkcji czasu. Nanocząsteczki PEG-cholesterolowe z ciekłokrystalicznymi nanocząsteczkami DiO wykazują minimalną cytotoksyczność przy 90% żywotności, w porównaniu do znacznej toksyczności wolnego DiO przy żywotności wynoszącej około 50%. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak syntetyzować nanocząsteczki ciekłokrystaliczne z załadowanym ładunkiem, biofunkcjonalizować je w celu celowania komórkowego oraz obrazować komórki z załadowanym ładunkiem w celu potwierdzenia skutecznego dostarczania do komórek.

Zazwyczaj osoby po raz pierwszy stosujące tę metodę mogą napotkać trudności, ponieważ precyzyjne dostarczanie DiO z roztworu wodnego do błony plazmatycznej stanowi istotne wyzwanie. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas po wykorzystaniu platformy nanocząsteczek ciekłokrystalicznych do komórkowego dostarczania leku przeciwnowotworowego doksorubicyny, kiedy to zaobserwowaliśmy zdolność tej platformy do modulowania kinetyki wychwytu leku przez komórki. Zgodnie z opisaną procedurą, podejście to można zastosować do komórkowego dostarczania szerokiego spektrum ładunków hydrofobowych, których transport do komórek z mediów wodnych jest szczególnie utrudniony.

Podejście to można wykorzystać do bardziej efektywnego dostarczania leków celowanych w błony komórkowe oraz cząsteczek bioaktywnych, takich jak barwniki napięciowo-czułe do obrazowania mózgu lub leki fotodynamiczne do fotowspomaganej terapii lekowej.