Mapowanie QTL i edycja CRISPR/Cas9 w celu identyfikacji genu oporności na leki w Toxoplasma gondii

Przedstawiono szczegóły dotyczące sposobu wykorzystania mapowania QTL z mapą genetyczną opartą na całej sekwencji genomu do identyfikacji genu oporności na leki w Toxoplasma gondii i jak można to zweryfikować za pomocą systemu CRISPR/Cas9, który skutecznie edytuje cel genomowy, w tym przypadku gen oporności na leki.

Ogólnym celem tego ilościowego mapowania locus cech i metodologii edycji genomu CRIPR/Cas9 jest identyfikacja, a następnie weryfikacja genu zaangażowanego w oporność na sinusynę w Toxoplasma. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania parazytologiczne, takie jak genetyczne podstawy wariantów, patogeneza i oporność na leki. Główną zaletą tych technik jest wykorzystanie danych sekwencjonowania całego genomu do precyzyjnej analizy QTL i edycji genomu CRISPR/Cas9 w celu efektywnej manipulacji genetycznej w Toxoplasma.

Procedurę zademonstruje dr Robin Powell, pracownik naukowy z mojego laboratorium. Pasożyty Toxoplasma gondii są hodowane w zlewających się ludzkich komórkach fibroblastów napletka lub HFF, wysiewanych do kolb T25 z podłożem D10. Aby przetestować poszczególne klony potomne pod kątem odporności na sinusynę, hoduj każdy klon do wysokiej gęstości pasożytów, aż większość pasożytów zacznie lizować komórki gospodarza.

Po przygotowaniu roztworu pasożyta zgodnie z opisem w protokole tekstowym, za pomocą pipetry przepuścić 2,5 razy 10 do piątego pasożyta do nowej kolby hodowlanej T25 HFF zawierającej pożywkę D10, o stężeniu roboczym 0,3 mikromola leku sinusynowego. Hoduj pasożyty w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez siedem do 10 dni. Obserwuj monowarstwę komórek HFF pod mikroskopem kontrastowym z odwróconymi fazami i oceń potomstwo pod kątem fenotypu wzrostu w leku sinusynowy.

Na przykład wynik zero za brak wzrostu i wynik jeden za wzrost i lizę monowarstwy. Po oznaczeniu całego potomstwa, dane zostaną wykorzystane jako fenotyp binarny do ilościowego locus cechy lub mapowania QTL. Aby zidentyfikować mutację przyczynową, odczyty sekwencjonowania całego genomu potomstwa są dopasowywane do wrażliwego na sinusynę genomu referencyjnego nici van nici, wywoływane są SNP, a locus QTL jest skanowany pod kątem SNP związanego z opornością na sinusynę.

Potwierdzenie, że SNR1 jest genem oporności na sinusynę, zostanie przeprowadzone poprzez inaktywację SNR1 w tle wrażliwym na sinusynę typu dzikiego przy użyciu mutacji indel indukowanych CRISPR/Cas9. Aby skonstruować plazmid CRISPR specyficzny dla SNR1, plazmid UPRT ukierunkowany na CRISPR jest używany jako matryca w mutagenezie ukierunkowanej na miejsce opartej na PCR przy użyciu specjalnie zaprojektowanych starterów. Produkty mutagenezy zawierające plazmidy CRISPR specyficzne dla genu są przekształcane w komórki E.Coli.

Poszczególne klony są następnie wybierane i hodowane na pożywce LB, a wyekstrahowane plazmidy są analizowane za pomocą elektroforezy żelowej DNA w celu sprawdzenia ich wielkości. Plazmidy są następnie sekwencjonowane w celu potwierdzenia docelowej specyficznej dla przewodnika sekwencji RNA. Kiedy specyficzny dla celu plazmid CRISPR jest wprowadzany do komórki Toxoplasma, przewodnik RNA kieruje jądro Cas9 do celu, aby spowodować pęknięcie podwójnej nici DNA z określonego locus w celu.

Pęknięcie DNA jest następnie naprawiane przez podatną na błędy, niehomologiczną i łączącą aktywność, co prowadzi do mutacji indel w genie docelowym. Dwa do trzech dni przed transfekcją pasożytów plazmidem CRISPR specyficznym dla SNR1, dodaj wystarczającą ilość pasożytów do kolby T25 zawierającej zlewającą się monowarstwę komórek HFF, aby osiągnąć 70% do 80% polizy komórek HFF w ciągu dwóch do trzech dni. Zbadaj kulturę pod mikroskopem z kontrastem z odwróconymi fazami, aby potwierdzić, że monowarstwa HFF jest w 70% do 80% lizowana przez pasożyty.

Delikatnie usunąć pożywkę pipetą i zmyć komórki z powierzchni kolby pięcioma mililitrami buforu cytomixowego. Przenieś roztwór pasożyta do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Przepuść roztwór pasożyta przez 10-mililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 22, dwa do trzech razy.

Aby usunąć komórki HFF i zanieczyszczenia komórkowe, przefiltruj roztwór pasożyta przez membranę o wielkości porów trzech mikronów do nowej stożkowej probówki. Przefiltrowane pasożyty należy rozbarwić przez odwirowanie w temperaturze 400 razy G przez 10 minut. Odlej supernatant i ponownie zawieś pasożyty z palety za pomocą 10 mililitrów buforu cytomix.

Usunąć podwielokrotność 10 mikrolitrów, aby określić stężenie pasożyta za pomocą hemocytometru. Resztę zawiesiny ponownie rozbarwić przez odwirowanie w ilości 400 razy G przez 10 minut. Usuń supernatant i ponownie zawiesić paletę w buforze mieszającym, aby uzyskać gęstość cztery razy 10 do siódmych pasożytów na mililitr.

W kuwecie z czteromililitrową szczeliną wymieszaj od 250 do 300 mikrolitrów roztworu pasożyta z 7,5 mikrograma plazmidu CRISPR, sześcioma mikrolitrami ATP i sześcioma mikrolitrami glutationu. Elektroporować pasożyty, postępując zgodnie ze standardową procedurą transwekcji T gondii. Uwzględnij oddzielną elektroporację jako kontrolę negatywną, w której plazmid CRISPR jest ukierunkowany na inne miejsce.

Hoduj elektroporowane pasożyty w kolbie T25, wysiewanej ogniwami HFF w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa dni. Aby rozpocząć procedurę badania indukowanych mutacji, najpierw zastąp pożywkę w kolbie pięcioma mililitrami D10, zawierającymi 0,3 mikromola sinusyny. Utrzymuj pasożyty i pożywkę selekcyjną przez co najmniej trzy przejścia, aż odporna kałuża stanie się stabilna.

Wskazuje na to brak wzrostu pasożyta w grupie kontroli ujemnej, ale silny wzrost pasożyta w grupie eksperymentalnej. Subklonuj pulę odporną na sinusynę, aby uzyskać nici kolonialne. Zebrać świeżo wydostające się pasożyty, oczyścić je przez trzymikronową filtrację membranową i subklonować do 96 dołków, wysianych zbiegającymi się komórkami HFF w 150 mikrolitrach pożywki D10.

Hoduj kultury subklonujące w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem do 10 dni, nie naruszając płytek. Po siedmiu do 10 dniach sprawdź 96-dołkowe płytki pod mikroskopem z kontrastem z odwróconymi fazami. Szukaj studni, które zawierają tylko jedną tabliczkę i zaznacz takie studnie.

Przenieś komórki z każdej studzienki na 24-dołkowe płytki, wysiane komórkami HFF. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Kiedy pasożyty zaczną lizować monowarstwę, przelej 50 mikrolitrów roztworu pasożyta do nowej studzienki, aby utrzymać szczep, a resztę zbierz w celu izolacji genomowego DNA.

Paletę pozostałej części roztworu pasożyta w proporcji 1000 razy G przez 10 minut. Umyj pasożyty z palety PBS i ponownie je paletuj. Wyizoluj genomowe DNA z komórek paletowych za pomocą komercyjnego zestawu lub przez gotowanie i ponownie zawiesić pasożyty w 50 do 100 mikrolitrach PBS.

Na koniec wykonaj PCR zgodnie z opisem w protokole tekstowym, aby uzyskać fragment genu SNR1 do sekwencjonowania. Uzyskano dostęp do potomstwa krzyżówek, przy użyciu rodzicielskich szczepów van opornych na FUDR i sinusoidalnych, pod kątem oporności na lek, sinusynę, na co wskazuje wzrost i liza monowarstwy HFF. Skan QTL spowodował jeden znaczący pik na chromosomie dziewiątym, obejmujący około jednego MBP.

Mutacja przyczynowa znajduje się w tym regionie. Sekwencjonowanie całego genomu doprowadziło do identyfikacji mutacji. SNP potomstwa w locus QTL zaimportowano do arkusza kalkulacyjnego i zeskanowano w poszukiwaniu wzorca, w którym potomstwo odporne na sinusynę pokazane na żółto ma SNP, a potomstwo wrażliwe na sinusynę, pokazane na zielono, nie.

Tylko jeden SNP zaznaczony na czerwono, dopasowany do tego wzorca, który powoduje wczesny kodon stop w przypuszczalnym genie transportera aminokwasów o nazwie SNR1. Kiedy plazmid SNR1 ukierunkowany na CRISPR w przypadku dziewiątym został poddany elektroporacji w wrażliwy na sinusynę szczep pasożyta typu dzikiego, uzyskano oporne mutanty podczas hodowli w sinusynie. W przeciwieństwie do tego, nie uzyskano pasożytów odpornych na sinusyny za pomocą plazmidu CRISPR, który byłby ukierunkowany na inne miejsce.

Kilka mutantów CRISPR odpornych na sinusyny sklonowano w regionie wokół sekwencjonowania docelowego RNA przewodnika SNR1. Reprezentatywne wyniki ze szczepu RH typu dzikiego oraz mutantów odpornych na sinusynę C5 i C6 pokazują, że każdy mutant miał indel, który zakłócił sekwencję kodującą genu SNR1. Nie zapominaj, że praca z Toxoplasma gondii może być niebezpieczna, ponieważ jest zakaźna dla ludzi.

Podczas tej procedury należy zachować środki ostrożności, takie jak właściwe obchodzenie się z ostrymi narzędziami, które mogą mieć kontakt z pasożytem. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak insercja egzogennego genu za pośrednictwem CRISPR/Cas9, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak komplementacja genetyczna lub budowa pasożyta transgenicznego. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się parazytologią molekularną do zbadania złożonej biologii i mechanizmów patogenezy Toxoplasma gondii.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić analizę QTL przy użyciu danych sekwencjonowania genomu. A także metabulacja genetyczna Toxoplasma gondii przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9.