Name: Przygotowanie i ocena chelatów trójzębnych znakowanych 99 mTc do wstępnego celowania przy użyciu chemii bioortogonalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Poznaj metodę radiomarkowania tetrazyn technetem-99m do obrazowania pre-targetingowego w chemii bioortogonalnej. Protokół umożliwia tworzenie nowych radiofarmaceutyków do diagnostyki i terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez granty badawcze z Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) z Kanady, Ontario Institute for Cancer Research (OICR, #P.SI.015.8) oraz Canadian Cancer Society (CCS, #703857). Autorzy doceniają wkład dr Denisa Snidera, który udzielił pomocy w przygotowaniu manuskryptu.

Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Badań nad Zwierzętami na Uniwersytecie McMaster zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC).

1. Radioznakowanie ligandów trójzębnych Tz za pomocą 99mTc
UWAGA: Następujące procedury wymagają użycia związków promieniotwórczych. Prace powinny być prowadzone wyłącznie w licencjonowanym laboratorium z zachowaniem przepisów dotyczących bezpieczeństwa i utylizacji. Reakcje w kuchence mikrofalowej należy przeprowadzać w urządzeniu zaprojektowanym specjalnie do syntezy chemicznej.
<ol>
	<li>Synteza [99mTc(CO)3(H2O)3]+ 19,20
	<ol>
		<li>W fiolce do kuchenki mikrofalowej połączyć 8 mg K2[BH3CO2], 15 mg Na2CO3, 20 mg Na2B4O7·10H2O oraz 25 mg KOCO[CH(OH)]2COONa·4H2O. Przepłukać fiolkę argonem przez 10 min.</li>
		<li>Do fiolki dodać 4 mL 99mTcO4- (~1,100 MBq, ~30 mCi) w 0,9% soli fizjologicznej.</li>
		<li>Reakcję ogrzewać w kuchence mikrofalowej przez 3,5 min w temperaturze 110 °C, po uprzednim mieszaniu przez 10 s w celu zapewnienia dokładnego wymieszania reagentów.</li>
		<li>Dostosować pH roztworu do wartości 3,5-4, używając ~400 μL 1 M HCl. Sprawdzić za pomocą papierka wskaźnikowego pH.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Radiomarkowanie ligandów tetrazynowych 1-5
	<ol>
		<li>Rozpuścić 2 mg każdego ligandu (związki 1-5) w 250 μL MeOH21.</li>
		<li>Do każdego roztworu dodać 250 μL [99mTc(CO)3(H2O)3]+ (~74 MBq, ~2 mCi).</li>
		<li>Mieszaninę reakcyjną ogrzewać w kuchence mikrofalowej przez 20 min w temperaturze 60 °C. 
		UWAGA: Krok ten był identyczny dla wszystkich 5 tetrazyn.</li>
		<li>W przypadku związków 2-5 odparować rozpuszczalnik i ponownie rozpuścić otrzymane produkty w 1 mL mieszaniny DCM:TFA w stosunku 1:1 v/v.</li>
		<li>Rozpuszczone produkty reakcji (2-5) ogrzewać w kuchence mikrofalowej w temperaturze 60 °C przez 6 min (2-4) lub 10 min (5).</li>
		<li>Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej odparować rozpuszczalnik za pomocą wirówki odparowującej (36 °C, 8 mbar, 3 min, 6,000 rpm) i rozpuścić wysuszony związek w mieszaninie ACN:H2O 1:1 lub MeOH:H2O 1:1 przed oczyszczaniem metodą HPLC.</li>
		<li>Oczyścić związki znakowane 99mTc (1-5), w tym oddzielić produkt znakowany od nieznakowanego ligandu tetrazynowego, za pomocą HPLC (odwrócona faza C18). Zazwyczaj stosuje się gradient elucji od 30:70 ACN:H2O (oba z 0,1% TFA) do 40:60 ACN:H2O w czasie 20 min (18 min) oraz analityczną kolumnę C18 o wymiarach 4,6 x 100 mm. Należy stosować detekcję UV (254 nm) oraz gamma.
		<ol>
			<li>Pobrać niewielką próbkę każdego produktu znakowanego i porównać jego czas retencji w HPLC z czasem retencji współwstrzykniętego, niepromieniotwórczego standardu znakowanego Re (0,125 mg w 20% metanolu-H2O). Standard znakowany Re jest identyfikowany na chromatogramie UV HPLC i eluje w tym samym czasie co związek znakowany 99mTc na chromatogramie γ-HPLC. Współwstrzyknięcie to wykazuje piki przy porównywalnych czasach retencji, co potwierdza tożsamość związku znakowanego 99mTc.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odparować rozpuszczalnik z frakcji HPLC za pomocą wirówki odparowującej (36 °C, 8 mbar, 3 min, 6,000 rpm).</li>
		<li>Przygotować formułę oczyszczonego związku o stężeniu 7,4 kBq/µL w buforze PBS zawierającym 0,5% BSA i 0,01% Tween-80.</li>
		<li>Aby upewnić się, że związki znakowane są stabilne, przeprowadzić badanie stabilności in vitro. Inkubować przygotowany związek w temperaturze 37 °C przez 1, 4 i 6 h, wstrzykując niewielką ilość (3,7 MBq) mieszaniny do HPLC w każdym punkcie czasowym w celu oceny stabilności.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Badania biodystrybucji z wstępnym targetowaniem
<ol>
	<li>Przygotowanie zwierząt
	<ol>
		<li>U samic myszy Balb/c w wieku 7–9 tygodni (n=3) podać TCO-BP sformułowany w soli fizjologicznej (20 mg/kg) (5 μg/μL) poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej.</li>
		<li>Umieścić mysz w urządzeniu do unieruchomienia fizycznego, zidentyfikować żyły znajdujące się na bocznych powierzchniach ogona i przemyć je gazikiem nasączonym alkoholem. W odległości około 2 cm od końca ogona wprowadzić igłę 30G pod niewielkim kątem, równolegle do żyły. Powoli nacisnąć tłok, aby wstrzyknąć preparat, wyjąć igłę i przyłożyć czysty gazik do miejsca wstrzyknięcia, lekko uciskając do momentu ustąpienia krwawienia.</li>
		<li>1 h po wstrzyknięciu TCO-BP podać ~0,74 MBq (20 μCi) 99mTc-tetrazyny sformułowanej w 100 μL 0,5% BSA i 0,01% Tween-80 w PBS, poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badania biodystrybucji
	<ol>
		<li>W wyznaczonym punkcie czasowym (t = 6 h) znieczulić myszy mieszaniną gazową 3% izofluranu i 2% tlenu. Wykonać test ucisku palca u znieczczonej myszy, aby upewnić się, że zwierzę znajduje się w chirurgicznej płaszczyźnie znieczulenia.</li>
		<li>Pobrać krew (1 mL) poprzez punkcję serca za pomocą strzykawki wstępnie potraktowanej heparyną. Położyć mysz na plecach z nosem w stożku do znieczulenia i zlokalizować wyrostek mieczykowaty u zwierzęcia.
		<ol>
			<li>Wprowadzić igłę 25 G, lekko na lewo od linii środkowej zwierzęcia pod wyrostkiem mieczykowatym, pod kątem 20°. Wprowadzić igłę całkowicie i powoli odciągnąć tłok; pojawienie się krwi w nasadzie igły świadczy o przebiciu serca. Jeśli to konieczne, delikatnie skorygować położenie igły, trzymając tłok, aby przebić serce. Powoli pobrać krew do strzykawki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uśmiercić zwierzę poprzez zwichnięcie stawów szyjnych podczas znieczulenia.</li>
		<li>Umieścić każde zwierzę w plastikowej torebce i użyć kalibratora dawek (ustawienie 99mTc), aby zmierzyć poziom aktywności całego ciała.</li>
		<li>Zebrać następujące tkanki i płyny do wcześniej zważonych probówek do liczenia: krew, kości (kolano i bark), pęcherzyk żółciowy, nerki, wątrobę, żołądek (z treścią), jelito cienkie (z treścią), jelito grube i kątnicę (z treścią), tarczycę i tchawicę, pęcherz moczowy z moczem oraz ogon.</li>
		<li>Przepłukać odpowiednie tkanki (z wyłączeniem krwi, pęcherzyka żółciowego i pęcherza moczowego) w PBS w celu usunięcia krwi i osuszyć je przed umieszczeniem w odpowiednich probówkach do liczenia.</li>
		<li>Umieścić tułów zwierzęcia w plastikowej torebce i zmierzyć pozostałą aktywność całego ciała za pomocą kalibratora dawek.</li>
		<li>Zważyć każdą probówkę zawierającą próbkę tkanki. Odjąć początkową masę probówki, aby uzyskać masę tkanki.</li>
		<li>Użyć kalibratora dawek (ustawienie 99mTc), aby zmierzyć poziom aktywności w próbce kontrolnej (100 µL) w momencie wstrzyknięcia dla każdej myszy. 
		UWAGA: Próbka kontrolna jest równa objętości wstrzyknięcia, co pozwala określić poziom aktywności w momencie podania.</li>
		<li>W czasie pomiaru tkanek odpiłować 5 µL wcześniej użytej próbki kontrolnej. Użyć gammaspektrometru wielodetektorowego (ustawienie 99mTc) i dokonać pomiaru, aby uzyskać liczbę zliczeń na minutę (CPM) dla próbki kontrolnej 5 µL.</li>
		<li>Wykorzystać dwie wartości uzyskane w punktach 2.2.9 i 2.2.10 do obliczenia zależności między aktywnością a CPM za pomocą równania 1, aby uzyskać współczynnik konwersji (CPM µCi-1). 
		(1) <img alt="Wzór na ilościowe oznaczenie radiotracerów, obejmujący liczbę zliczeń na minutę, kalibrację dawki i licznik gamma." src="/files/ftp_upload/55188/55188eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"></li>
		<li>Użyć gammaspektrometru do zmierzenia ilości radioaktywności w każdej próbce tkanki lub płynu.</li>
		<li>Użyć równania 1 do obliczenia ilości aktywności w każdej tkance lub płynie w momencie pomiaru w stosunku do całkowitej wstrzykniętej dawki. Wartość tę następnie znormalizować przez masę organu i przedstawić jako procent wstrzykniętej dawki na gram (tj. %ID/g) tkanki.</li>
		<li>Postępować zgodnie z krokami od 2.1.2 do 2.2.13 w celu przeprowadzenia eksperymentu z kontrolą negatywną przy użyciu ligandów tetrazyny znakowanych 99mTc wobec braku TCO-BP. Uśmiercić myszy (n = 3) po 0,5, 1, 4 i 6 h od wstrzyknięcia i pobrać tkanki lub płyny zgodnie z powyższym opisem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jurisson, S. S., Lydon, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+Technetium+Small+Molecule+Radiopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Potential Technetium Small Molecule Radiopharmaceuticals.</a> Chem. Rev. 99 (9), 2205-2218 (1999).</li>
<li>Kluba, C. A., Mindt, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-to-chelate%3A+Development+of+Technetium+and+Rhenium-Tricarbonyl+Labeled+Radiopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Click-to-chelate: Development of Technetium and Rhenium-Tricarbonyl Labeled Radiopharmaceuticals.</a> Molecules. 18, 3206-3226 (2013).</li>
<li>Amato, I. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cen-v087n036.p058">Nuclear Medicines Conundrum.</a> Chem. Eng. News. 87 (36), 58-70 (2009).</li>
<li>Hnatowich, D. J., Virzi, F., Rusckowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+of+Avidin+and+Biotin+for+Imaging+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Investigations of Avidin and Biotin for Imaging Applications.</a> J. Nucl. Med. 28 (8), 1294-1302 (1987).</li>
<li>Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine+Ligation%3A+Fast+Bioconjugation+Based+on+Inverse-Electron-Demand+Diels-Alder+Reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactivity.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (41), 13518-13519 (2008).</li>
<li>Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-Based+Cycloadditions%3A+Application+to+Pretargeted+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-Based Cycloadditions: Application to Pretargeted Live Cell Imaging.</a> Bioconjugate Chem. 19 (12), 2297-2299 (2008).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Chemistry+for+Pretargeted+Tumor+Imaging+in+Live+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">In Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 49 (19), 3375-3378 (2010).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+Pretargeted+Strategy+for+the+PET+Imaging+of+Colorectal+Carcinoma+via+the+Modulation+of+Radioligand+Pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics.</a> Mol. Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Reactive+trans-Cyclooctene+Tags+with+Improved+Stability+for+Diels-Alder+Chemistry+in+Living+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly Reactive trans-Cyclooctene Tags with Improved Stability for Diels-Alder Chemistry in Living Systems.</a> Bioconjugate Chem. 24 (7), 1210-1217 (2013).</li>
<li>Rossin, R., Robillard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretargeted+Imaging+Using+Bioorthogonal+Chemistry+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pretargeted Imaging Using Bioorthogonal Chemistry in Mice.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 21, 161-169 (2014).</li>
<li>Denk, C., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201404277/abstract">Development of a 18F-Labeled Tetrazine with Favorable Pharmacokinetics for Bioorthogonal PET Imaging.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 53 (36), 9655-9659 (2014).</li>
<li>Herth, M. M., Andersen, V. L., Lehel, S., Madsen, J., Knudsen, G. M., Kristensen, J. L. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2013/CC/c3cc41027g#!divAbstract">Development of a 11C-labeled Tetrazine for Rapid Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation.</a> Chem. Commun. 49 (36), 3805-3807 (2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-Trans-Cyclooctene+Ligation+for+the+Rapid+Construction+of+18F+Labeled+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation for the Rapid Construction of 18F Labeled Probes.</a> Chem. Commun. 46 (42), 8043(2010).</li>
<li>Nichols, B., Qin, Z., Yang, J., Vera, D. R., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((68Ga+Chelating+Bioorthogonal+Tetrazine+Polymers+for+the+Multistep+Labeling+of+Cancer+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">68Ga Chelating Bioorthogonal Tetrazine Polymers for the Multistep Labeling of Cancer Biomarkers.</a> Chem. Commun. 50 (40), 5215-5217 (2014).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pretargeted+PET+Imaging+Strategy+Based+on+Bioorthogonal+Diels-Alder+Click+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry.</a> J. Nucl. Med. 54 (8), 1389-1396 (2013).</li>
<li>García, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096808961630061X">99mTc-Bioorthogonal Click Chemistry Reagent for In Vivo Pretargeted Imaging.</a> Bioorg. Med. Chem. 24 (6), 1209-1215 (2016).</li>
<li>Russell, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphosphonates%3A+The+First+40+Years%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Bisphosphonates: The First 40 Years.</a> Bone. 49 (1), 2-19 (2011).</li>
<li>Yazdani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bone-Seeking+Trans-Cyclooctene+for+Pretargeting+and+Bioorthogonal+Chemistry%3A+A+Proof+of+Concept+Study+Using+99mTc+and+177Lu-Labeled+Tetrazines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Bone-Seeking Trans-Cyclooctene for Pretargeting and Bioorthogonal Chemistry: A Proof of Concept Study Using 99mTc and 177Lu-Labeled Tetrazines.</a> J. Med. Chem. , (2016).</li>
<li>Alberto, R., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja980745t">A Novel Organometallic Aqua Complex of Technetium for the Labeling of Biomolecules: Synthesis of [99mTc(OH2)3(CO)3]+ from [99mTcO4]- in Aqueous Solution and its Reaction with a Bifunctional Ligand.</a> J. Am. Chem. Soc. 120 (31), 7987-7988 (1998).</li>
<li>Alberto, R., Ortner, K., Wheatley, N., Schibli, R., Schubiger, A. P. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja003932b">Synthesis and properties of boranocarbonate: A convenient in situ CO source for the aqueous preparation of [99mTc(OH2)3(CO)3.</a> J. Am. Chem. Soc. 123 (13), 3135-3136 (2001).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960894X12011584">Synthesis and SAR of 99mTc/Re-labeled Small Molecule Prostate Specific Membrane Antigen Inhibitors with Novel Polar Chelates.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1557-1563 (2013).</li>
<li>Maresca, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0020169312001764">Small Molecule Inhibitors of PSMA Incorporating Technetium-99m for Imaging Prostate Cancer: Effects of Chelate Design on Pharmacokinetics.</a> Inorg. Chim. Acta. 389, 168-175 (2012).</li>
<li>Bartholomä, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+Mode+of+Action+of+Re%28CO%293+Thymidine+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Insight into the Mode of Action of Re(CO)3 Thymidine Complexes.</a> ChemMedChem. 5 (9), 1513-1529 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przygotowano zbiór chelatów trójzębnych związanych z tetrazyną o różnej polarności i oceniono przydatność ich 99-mkompleksów Tc w reakcji IEDDA z pochodną TCO in vivo . Opracowano skuteczną i powtarzalną metodę znakowania 99 mTc dla pięciu chelatów tetrazynowych, w których stężenie ligandów wynosiło 10-3 M. Po etapie znakowania nastąpiła deprotekcja grup t-butylowych (dla związków 2-5). Wysokie stężenie liganda wykorzystano w celu poprawy wydajności radi...

99mTc pozostaje dominującym radioizotopem stosowanym w diagnostyce medycyny nuklearnej, z ponad 50 milionami procedur obrazowania przeprowadzanych rocznie na całym świecie1,2,3. Większość stosowanych klinicznie preparatów 99mTc to radiofarmaceutyki perfuzyjne. Istnieje ograniczona liczba związków ukierunkowanych aktywnie, w których 99mTc jest kierowany do wiązania się ze specyficznym biomarkerem poprzez ligację z konstruktem celującym. Tworzenie celowanych radiofarmaceutyków 99mTc jest często utrudnione przez wpływ kompleksów 99mTc-ligand na zdolność cząsteczki celującej do wiązania się z interesującym biomarkerem, lub okres półtrwania izotopu jest zbyt krótki do zastosowania w przypadku biomolekuł o wyższej masie cząsteczkowej, takich jak przeciwciała. W tym drugim przypadku zazwyczaj wymagane jest kilka dni przed wykonaniem obrazowania, aby biomolekuła mogła zostać usunięta z tkanek niedocelowych. Pretargetowanie oferuje alternatywne podejście pozwalające przezwyciężyć te trudności.
Wykazano, że wstępne celowanie w połączeniu z chemią bioortogonalną jest skutecznym sposobem opracowywania nowych sond do obrazowania molekularnego, zarówno w obrazowaniu fluorescencyjnym, jak i radioobrazowaniu4,5,6,7,8. Reakcja Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronowym (IEDDA) między pochodnymi 1,2,4,5-tetrazyny (Tz) a trans-cyklooktenem (TCO), przedstawiona na Rysunku 1, okazała się szczególnie efektywna6. Reakcja IEDDA z tymi komponentami może charakteryzować się szybką kinetyką w PBS (k2 ≈ 6,000 M-1 s-1) oraz wysoką selektywnością, co czyni ją idealną do zastosowań w wstępnym celowaniu in vivo 9,10.
Najczęściej stosowane podejście polega na podaniu wektora celującego pochodnego TCO, a po odpowiednim odstępie czasu na podanie znakowanej radioaktywnie tetrazyny. Opisano zastosowanie tetrazyn znakowanych 11C, 18F, 64Cu, 89Zr oraz 111In11,12,13,14,15. W przeciwieństwie do nich, istnieje tylko jeden raport dotyczący Tz znakowanej 99mTc, która została przygotowana przy użyciu ligandu typu HYNIC, co wymagało zastosowania koligandów w celu zapobiegania wiązaniu białek i degradacji in vivo16. Jako alternatywę przedstawiamy tutaj syntezę tetrazyn znakowanych 99mTc(I) z wykorzystaniem rodziny ligandów, które tworzą stabilne kompleksy trójzębowe z rdzeniem [99mTc(CO)3]+.
<img alt="Schemat reakcji chemicznej; cykloaddycja azydkowo-alkinowa, uwalnianie azotu." src="/files/ftp_upload/55188/55188fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Bioortogonalna reakcja IEDDA pomiędzy tetrazyną a trans-cyklooktenem. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55188/55188fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Przygotowana rodzina ligandów zawiera chelaty trójzębowe, które różnią się polarnością oraz charakterem grupy łącznikowej między regionem wiążącym metal a Tz (Rycina 2). Celem było zidentyfikowanie 99mKonstrukt Tc-tetrazyny, który mógłby skutecznie lokalizować się i reagować z miejscami znakowanymi TCO in vivo or szybko usuwać się z organizmu, gdy nie są związane, aby uzyskać wysokie stosunki sygnału z celu do sygnału z tkanek niecelowych. W celu przetestowania ligandów zastosowano pochodną TCO bisfosfonianu (TCO-BP)17Wcześniej wykazaliśmy, że TCO-BP lokalizuje się w obszarach aktywnego metabolizmu kostnego i może reagować z radioznaczonymi tetrazynami in vivo18Jest to wygodny odczynnik do testowania nowych tetrazyn, ponieważ można go przygotować w jednym etapie, a eksperymenty można przeprowadzać na normalnych myszach, u których lokalizacja następuje głównie w stawach (kolanowych i barkowych).

<table><tbody><tr><td>Gaz argonowy</td><td>Alphagaz</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>EMD Millipore</td><td>106395</td><td>---</td></tr><tr><td>Na2B4O7&#183; 10H2O</td><td>Anachemia</td><td>S9640</td><td>---</td></tr><tr><td>KNaC4H4O6&#183; 4H2O</td><td>Anachemia</td><td>217255</td><td>---</td></tr><tr><td>Technelite 99mTc generator</td><td>obrazowania medycznego Lantheus</td><td>---</td><td>Źródło 99mTcO4-</td></tr><tr><td>0,9% Obrazowanie</td><td>medyczne Saline Lantheus</td><td>---</td><td>Do generatora elucji</td></tr><tr><td>1 M HCl</td><td>Lab Chem</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Caledon</td><td></td><td>------</td></tr><tr><td>ACN</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Millipore H2O</td><td>Thermo</td><td>Fisher Scientific Barnstead Nanopure</td><td>---</td></tr><tr><td>DCM</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7,4 1x</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>---</td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8047</td><td>---</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>CDMV</td><td>108737</td><td>Dostawca: Fresenius Kabi Animal Health</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters</td><td>1525 Pompa binarna, 2998 Detektor fotodiodowy, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (pozycja # 15590)</td><td>---</td></tr><tr><td>Kolumna HPLC do analizy i oczyszczania związków 2-4</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4435-E0</td><td>Bliźnięta&reg; 5 & mikro; m C18 110&nbsp; &Aring;, LC Column 250 x 4,6 mm</td></tr><tr><td>Kolumna HPLC do analizy i oczyszczania związków 1 i 5</td><td>Wody&nbsp;</td><td>186003115</td><td>XBridge BEH C18 Kolumna, 130 & kąt;, 5 &mikro; m, 4,6 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>Reaktor mikrofalowy&nbsp;</td><td>Biologia&nbsp;</td><td>Inicjator 8</td><td>---</td></tr><tr><td>Biotage V10 Parownik</td><td>Biotage&nbsp;</td><td>Numer seryjny # V1041</td><td>---</td></tr><tr><td>Kalibrator dawki</td><td>Capintec, Inc.&nbsp;</td><td>CRC-25R</td><td>---</td></tr><tr><td>Gamma Licznik</td><td>Perkin Elmer Wizard</td><td>1470 Automatyczny licznik gamma</td><td>---</td></tr><tr><td>Waga do pomieszczeń dla zwierząt&nbsp;</td><td>Gama --- mikrofalowych METTLER TOLEDO</td><td>XP105</td><td></td></tr> <tr><td>Delta&nbsp&nbsp;</td><td>Biologia&nbsp;</td><td>355629</td><td>0,5-2 ml&nbsp;</td></tr></tbody></table>

przygotowanie i ocena chelatów trójzębnych znakowanych 99 mtc do wstępnego celowania przy użyciu chemii bioortogonalnej

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Wstępne celowanie w połączeniu z chemią bioortogonalną staje się skutecznym sposobem tworzenia nowych radiofarmaceutyków. Spośród dostępnych metod, cykloaddycja Dielsa-Aldera (IEDDA) z odwróconym zapotrzebowaniem elektronowym między znakowanymi radioaktywnie tetrazynami a transcyklooktenem (TCO) połączonym z biomolekułą okazała się wysoce skutecznym podejściem bioortogonalnym do obrazowania określonych celów biologicznych. Pomimo faktu, że technet-99m pozostaje najczęściej stosowanym izotopem w diagnostyce medycyny nuklearnej, brakuje metod otrzymywania tetrazyn znakowanych 99mTc. W niniejszym artykule przedstawiono preparat rodziny pochodnych trydentu-chelatu-tetrazyny i ich kompleksów Tc(I). Te nieznane dotąd związki znakowano radioaktywnie 99 mTc metodą wspomaganą mikrofalami z wydajnością radiochemiczną od 31% do 83%. Produkty są stabilne w soli fizjologicznej i PBS i szybko reagują z pochodnymi TCO in vitro. Ich zdolność do wstępnego celowania in vivo wykazano przy użyciu pochodnej TCO-bisfosfonianu (TCO-BP), która lokalizuje się w regionach aktywnego metabolizmu kości lub urazu. W badaniach na myszach 99mTc-tetrazyny wykazywały wysokie stężenia aktywności w stawach kolanowych i barkowych, czego nie obserwowano, gdy eksperymenty prowadzono przy braku TCO-BP. Ogólny wychwyt w narządach innych niż docelowe i farmakokinetyka różniły się znacznie w zależności od charakteru łącznika i polarności chelatu.

Ligandy zsyntetyzowano przy użyciu różnych łączników i chelatów za pomocą prostej strategii aminowania redukcyjnego (Rysunek 2), a następnie produkt sprzężono z komercyjnie dostępną tetrazyną22,23. Radiomarkowanie przeprowadzono tą samą metodą dla wszystkich związków, a wyniki były wysoce powtarzalne. Proces zoptymalizowano poprzez zmianę pH, ilości liganda, czasu oraz temperatury reakcji, w wyniku czego otrzymano...

Tutaj opisujemy protokół znakowania radioaktywnego i testowania in vivo pochodnych chelatu tetrazyny tridentate 99mTc(I) do wstępnego celowania i chemii bioortogonalnej.

Przygotowanie i ocena chelatów trójzębnych znakowanych 99 mTc do wstępnego celowania przy użyciu chemii bioortogonalnej

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest otrzymanie tetrazyn znakowanych technetem-99m do obrazowania z wstępnym celowaniem, z wykorzystaniem chemii bioortogonalnej i biomolekuł zmodyfikowanych trans-cyklooktenem jako wektorów celujących. Metoda ta stanowi ważną nową platformę dla rozwoju nowoczesnych radiofarmaceutyków. Dzięki wstępnemu celowaniu opisane tutaj kompleksy technetu mogą być wykorzystywane do obrazowania szerokiego spektrum organów, tkanek i biomarkerów.Technika ta jest korzystna, ponieważ zapewnia solidną metodę krok po kroku pozwalającą na otrzymywanie tetrazyn znakowanych radioaktywnie technetem-99m, najszerzej stosowanym izotopem medycznym w diagnostyce obrazowej. Metodę tę można zastosować z różnymi wektorami celującymi, w tym z małymi cząsteczkami i przeciwciałami. Może być ona również wykorzystywana w radioterapii poprzez zastąpienie technetu izotopami renu emitującymi promieniowanie beta.Część procedur na zwierzętach zaprezentuje Nancy Janzen, technik biologii w naszym laboratorium. Aby rozpocząć procedurę znakowania radioaktywnego, w fiolce do mikrofali połączyć 8 mg boranowęglanu potasu, 15 mg węglanu sodu, 20 mg decahydratu tetraboranu sodu oraz 25 mg tetrah

preparation-evaluation-99mtc-labeled-tridentate-chelates-for-pre

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Ten film opisuje technikę precelowanej radioimmunoterapii lub PRIT, w której do leczenia nowotworów podaje się immunokoniugaty, a następnie radioligandy. Ta radioimmunoterapia zmniejsza dawki promieniowania do zdrowych tkanek i wykorzystuje radionuklidy o bardzo krótkim okresie półtrwania, niezgodne z wektorami opartymi na przeciwciałach.

Radioimmunoterapia pretargetowana: metoda celowanego dostarczania terapeutycznych radionuklidów do nowotworów

Aby zademonstrować obrazowanie molekularne raka MR za pomocą środka kontrastowego MRI z małym peptydem specyficznym dla skrzepłych białek osocza w zrębie guza w modelu raka prostaty u myszy.

Obrazowanie molekularne MR raka prostaty z drobnocząsteczkowym środkiem kontrastowym ukierunkowanym na peptyd CLT1

Prezentujemy metodę szybkiego, odwracalnego unieruchamiania małych cząsteczek i funkcjonalizowanych zespołów nanocząstek do badań powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR), wykorzystując sekwencyjną bioortogonalną chemię cykloaddycji na chipie i wychwytywanie przeciwciała-antygen.

Mikroprzepływowa reakcja wychwytywania-cykloaddycji w układzie scalonym w celu odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek lub struktur wieloskładnikowych do zastosowań w biosensorach

Bioortogonalna cykloaddycja Dielsa-Aldera została wykorzystana do stworzenia skutecznej i modułowej, pretargetowanej strategii obrazowania PET dla raka. W niniejszym protokole etapy tej metodologii są opisane w kontekście systemu modelowego wykorzystującego przeciwciało ukierunkowane na raka jelita grubego huA33 i radioligand znakowany 64Cu.

Wykorzystanie bioortogonalnej cykloaddycji Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronów do wstępnie ukierunkowanego obrazowania PET

Ze względu na swój wielodniowy okres półtrwania radioaktywnego i korzystne właściwości rozpadu, emitujący pozytony radiometal 89Zr doskonale nadaje się do stosowania w radiofarmaceutykach opartych na przeciwciałach do obrazowania PET. W tym protokole opisana zostanie biokoniugacja, radiosynteza i przedkliniczne zastosowanie przeciwciał znakowanych 89Zr.

Biokoniugacja i radiosynteza 89przeciwciał znakowanych Zr-DFO

Opisano szczegółową procedurę syntezy azydku znakowanego 125I oraz znakowania radioaktywnego nanocząstek złota o wielkości 13 nm sprzężonych z grupą dibenzocyklooktynu (DBCO) przy użyciu reakcji kliknięcia bez miedzi.

Zoptymalizowany protokół skutecznego znakowania radioaktywnego nanocząstek złota przy użyciu azydkowej grupy protetycznej znakowanej 125I

Po przygotowaniu zmodyfikowanego 64Cu przeciwciała monoklonalnego wiążącego się z transgenicznym receptorem mysich limfocytów T, limfocyty T są znakowane radioaktywnie in vivo, analizowane pod kątem żywotności, funkcjonalności, stabilności znakowania i apoptozy, a następnie adoptycyjnie przenoszone do myszy z reakcją nadwrażliwości typu opóźnionego w drogach oddechowych do nieinwazyjnego obrazowania za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej (PET/CT).

Znakowanie mysich limfocytów za pomocą receptora przeciwciał Cu 64w celu transportu komórek in vivo za pomocą PET / CT

Peptydy pochodzenia wirusowego sprzężone z koniugatami przeciwciał (AC) to podejście, które nabiera rozpędu ze względu na potencjał dostarczania ładunków molekularnych ze zwiększoną akumulacją komórek nowotworowych. Wykorzystując powszechne metody oceny koniugacji peptydów, akumulacji wewnątrzkomórkowej AC i ładunku oraz celowania w guz, protokół ten pomaga naukowcom w kluczowych początkowych fazach rozwoju.

Wstępna ocena koniugatów przeciwciał zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusów w celu zwiększenia akumulacji komórkowej i poprawy celowania w guz

Ten protokół opisuje syntezę i charakterystykę przeciwciała modyfikowanego trans-cyklooctenem (TCO) oraz 177znakowanego Lu radioligandu tetrazyny (Tz) do radioterapii pretargetowanej (PRIT). Ponadto szczegółowo opisano zastosowanie tych dwóch konstruktów w badaniach biodystrybucji in vivo i terapii podłużnej w mysim modelu raka jelita grubego.

Precelowana radioimmunoterapia oparta na odwróconej reakcji Dielsa-Aldera na odwrócone zapotrzebowanie elektronowe

W tym protokole opiszemy syntezę PODS, odczynnika na bazie fenyoksadiazolylu metylosulfonu do selektywnego przyłączania ładunków do tioli biomolekuł, szczególnie przeciwciał. Ponadto opiszemy syntezę i charakterystykę dwufunkcyjnego chelatora nośnego POD oraz jego koniugację z modelowym przeciwciałem.

Synteza i biokoniugacja odczynników tiolowo-reaktywnych do tworzenia immunokoniugatów modyfikowanych selektywnie

Przedstawiono tutaj protokół znakowania radioizotopowego komórek za pomocą radioizotopu pozytonowej tomografii emisyjnej (PET), 89Zr (t1/2 78.4 h), przy użyciu gotowego do użycia syntonu radioznakującego, [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). Znakowanie radioizotopowane komórek za pomocą [89Zr]Zr-DBN umożliwia nieinwazyjne śledzenie i obrazowanie podanych komórek znakowanych radioaktywnie w organizmie za pomocą PET przez okres do 7 dni po podaniu.

Obrazowanie transportu komórek za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej: metoda znakowania radioaktywnego komórek

Poznaj metodę radiomarkowania tetrazyn technetem-99m do obrazowania pre-targetingowego w chemii bioortogonalnej. Protokół umożliwia tworzenie nowych radiofarmaceutyków do diagnostyki i terapii.

Przygotowanie i ocena chelatów trójzębnych ^{znakowanych 99 m}Tc do wstępnego celowania przy użyciu chemii bioortogonalnej

Przeglądaj więcej filmów