Przygotowanie i ocena chelatów trójzębnych ^{znakowanych 99 m}Tc do wstępnego celowania przy użyciu chemii bioortogonalnej

Ogólnym celem tej procedury jest wyprodukowanie tetrazyn znakowanych technetem-99m do wstępnie ukierunkowanego obrazowania przy użyciu chemii bioortogonalnej z biomolekułami modyfikowanymi transcyklooktenem jako wektorami docelowymi. Metoda ta stanowi nową, ważną platformę do opracowywania nowatorskich radiofarmaceutyków. Poprzez wstępne celowanie, opisane tutaj kompleksy technetu mogą być wykorzystywane do obrazowania szerokiej gamy narządów, tkanek i biomarkerów.

Technika ta jest korzystna, ponieważ zapewnia solidną metodę krok po kroku do produkcji tetrazin znakowanych radioaktywnie technetem-99m, najczęściej stosowanym izotopem medycznym w medycynie diagnostycznej. Technika ta może być stosowana z różnymi wektorami docelowymi, w tym małymi cząsteczkami i przeciwciałami. Może być również stosowany w radioterapii poprzez wymianę technetu na emitujące beta izotopy renu.

Część procedur na zwierzętach zademonstruje Nancy Janzen, technik biologiczny w naszym laboratorium. Aby rozpocząć procedurę znakowania radioaktywnego, w fiolce mikrofalowej wymieszaj osiem miligramów boranokabonianu potasu, 15 miligramów węglanu sodu, 20 miligramów dekahydratu tetraboranu sodu i 25 miligramów czterowodnego winianu potasu sodu. Przeczyć fiolkę argonem przez 10 minut.

Następnie dodać do fiolki cztery mililitry nadtechnetianu technetu-99m w 0,9% soli fizjologicznej o aktywności 1 110 megabekereli. Załaduj mieszaninę reakcyjną do reaktora mikrofalowego i mieszaj przez 10 sekund. Następnie podgrzej mieszaninę w temperaturze 110 stopni Celsjusza przez 3,5 minuty, aby uzyskać kation triaqua tricarbonyl technetium-99m.

Dodaj około 400 mikrolitrów jednego molowego kwasu solnego, aby dostosować pH roztworu do 3,5 do czterech. Następnie dla każdego liganda tetrazyny rozpuść dwa miligramy ligandu w 250 mikrolitrach metanolu. Do każdego roztworu liganda dodać 250 mikrolitrów kompleksu technet-99m o aktywności 74 megabekereli.

Podgrzewaj mieszaninę w reaktorze mikrofalowym w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 20 minut. W przypadku ligandów tetrazynowych z grupami ochronnymi t-butylu przenieść roztwór z fiolki mikrofalowej do 20-mililitrowej fiolki scyntylacyjnej, a następnie odparować rozpuszczalnik i ponownie rozpuścić każdy kompleks w jednym mililitrze objętościowego roztworu dichlorometanu i kwasu trifluorooctowego jeden do jednego. Następnie przenieś roztwór do fiolki mikrofalowej i podgrzej te kompleksy w reaktorze mikrofalowym w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez sześć do 10 minut, aby usunąć ochronę ligandów.

Schłodzić kompleksy do temperatury pokojowej, a następnie odparować rozpuszczalnik. Ponownie rozpuścić pozostałości w 500 mikrolitrach wodnego roztworu acetonitrylu lub metanolu i wody w proporcji jeden do jednego przed przystąpieniem do oczyszczania metodą HPLC. Użyj HPLC z odwróconymi fazami C18 do oczyszczenia każdego znakowanego radioaktywnie kompleksu tetrazyny o gradiencie elucji od 30 do 70 do 40 do 60 acetonitrylu do wody w ciągu 20 minut z 0,1% kwasem trifluorooctowym obecnym w eluencie przez cały czas.

Zebrać oczyszczony produkt, gdy wymyka się na śladzie gamma. Następnie wstrzyknąć każdy znakowany kompleks z roztworem 0,125 miligrama odpowiedniego kompleksu rad-tetrazyna w 20% metanolu w wodzie. Porównaj czasy retencji piku kompleksu renu w śladzie UV i piku kompleksu technetu w śladzie gamma, aby zweryfikować tożsamość piku gamma.

Usunąć rozpuszczalnik z każdego oczyszczonego kompleksu technet-tetrazyna. Sformułować każdy kompleks do stężenia 7,4 kilobekereli na mikrolitr w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej i 0,01% polisorbatem 80. Dla każdej myszy należy pobrać do strzykawki 100 mikrolitrów roztworu pochodnej TCOPB w soli fizjologicznej o stężeniu pięciu mikrogramów na mikrolitr, aby przygotować dawkę 20 miligramów na kilogram.

Podłączyć igłę o rozmiarze 30 do strzykawki dozującej. Umieść obiekt myszy w fizycznym urządzeniu przytrzymującym. Zidentyfikuj żyły na bocznej powierzchni ogona około dwóch centymetrów od końca ogona i przetrzyj ten obszar wacikiem nasączonym alkoholem.

Wprowadzić igłę strzykawki pod płytkim kątem równoległym do żyły. Powoli wstrzykiwać pochodną TCOBP. Wyjąć igłę i przyłożyć czystą gąbkę z gazy lekko uciskając do miejsca wstrzyknięcia, aż do ustania krwawienia.

Godzinę po wstrzyknięciu pochodnej TCOBP należy podać 100-mikrolitrową dawkę pożądanego kompleksu tetrazynowego technet-99m o aktywności około 0,74 megabekerela przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. Użyć kalibratora dawki, aby zmierzyć aktywność 100-mikrolitrowej próbki testowej kompleksu technetu w momencie wstrzyknięcia. Zapisz próbkę testową do późniejszych pomiarów.

Znieczulij mysz mieszaniną 3% izofluranu i 2% tlenu gazowego sześć godzin po wstrzyknięciu. Umieść mysz na plecach z nosem w stożku nosowym, aby kontynuować znieczulenie, i zlokalizuj wyrostek mieczykowaty. Podłączyć igłę o rozmiarze 25 do strzykawki wstępnie potraktowanej heparyną.

Włóż igłę pod kątem 20 stopni pod wyrostkiem mieczykowatym, nieco na lewo od linii środkowej. Po całkowitym wprowadzeniu igły należy powoli wycofać tłok, aby sprawdzić, czy w piaście igły nie ma krwi, potwierdzając pomyślne nakłucie serca. W razie potrzeby wyreguluj igłę.

Po nakłuciu serca powoli wciągnij jeden mililitr krwi do strzykawki. Przenieść próbkę krwi do wstępnie zważonej probówki liczącej. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu.

Umieść uśpione zwierzę w plastikowej torbie i zmierz aktywność całego ciała za pomocą kalibratora dawki. Następnie zbierz kości kolanowe i barkowe, woreczek żółciowy, nerki, wątrobę, tarczycę i tchawicę oraz ogon. Wraz z ich zawartością zbierz żołądek, jelito cienkie, jelito grube i jelito ślepe oraz pęcherz moczowy.

Spłucz krew ze wszystkich pobranych tkanek z wyjątkiem pęcherza żółciowego i moczowego w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami. Osusz chusteczki i umieść każdą tkankę w wstępnie zważonej probówce do liczenia. Zmierzyć pozostałą aktywność tuszy.

Zważyć każdą próbkę tkanki i obliczyć masę samej tkanki. Użyj wielodetektorowego licznika gamma do pomiaru aktywności pięciomikrolitrowej podwielokrotności próbki testowej kompleksu technetu. Korzystając z uzyskanej wartości w liczbach na minutę i aktywności zmierzonej w momencie wstrzyknięcia, oblicz współczynnik konwersji.

Zmierz aktywność każdej próbki tkanki i płynu za pomocą detektora gamma. Przelicz wartości na mikrocurie i znormalizuj każdą wartość według masy narządu, aby określić procent wstrzykniętych łań na gram tkanki. Powtórz ten proces z dodatkowymi myszami bez wstrzykiwania pochodnej TCOPB jako serii kontroli ujemnej.

Za pomocą tej metody pięć kompleksów tetrazynowych różniących się kombinacjami łącznika i klucza-lidera oznaczono technetem-99m. Pochodna TCOBB, która lokalizuje się w regionach o wysokim obrocie wapnia w kościach, została użyta do wstępnego celowania w stawy barkowe i kolanowe myszy. Dla każdego związku tetrazyny obliczono stosunek procentowej dawki wstrzykniętej na gram tkanki dla kości do krwi.

Wszystkie pięć związków szybko oczyściło krew i skierowało się do kości, co wskazuje, że selektywna reakcja sprzężenia bioortogonalnego między związkami tetrazyny a pochodną TCOBP zaszła in vivo. Związek trzeci wykazał najlepszą kombinację celowania i klirensu z krwi. Eksperymenty z kontrolą ujemną wykazały, że znakowane radioaktywnie kompleksy tetrazyny nie lokalizowały się znacząco w kości przy braku pochodnej TCOBP.

Na przykład, gdy pochodna TCOBP nie była podawana, związek drugi miał wysoki poziom w woreczku żółciowym i jelitach, ale bardzo mały w kościach. Zaobserwowano dużą zmienność lokalizacji tkanek u myszy otrzymujących pochodną TCOBP wśród pięciu badanych związków. Na przykład, bardzo mało związku trzy zaobserwowano w jelicie grubym, wątrobie lub moczu i pęcherzu moczowym w porównaniu z innymi kompleksami, podczas gdy znacznie więcej związku trzy zaobserwowano w kościach.

Po opanowaniu, opisana tutaj technika etykietowania może być wykonana od początku do końca w mniej niż dwie godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas prób tej techniki ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki są dokładnie zważone, a sole są przedmuchiwane argonem przed dodaniem do roztworu technetu. Bardzo ważne jest również, aby pH roztworu technetu zostało dostosowane do 3,5 do 4 przed dodaniem ligandu tetrazynowego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować i oczyścić tetrazyny znakowane technetem oraz jak można je wykorzystać do tworzenia nowych radiofarmaceutyków przy użyciu wstępnego celowania i chemii bioortogonalnej. Nie zapomnij podjąć odpowiednich środków ostrożności podczas pracy z radioaktywnością, takich jak zrozumienie rodzaju emitowanego promieniowania oraz najlepszego sposobu ochrony i obchodzenia się z próbkami.