Prosta metoda lizy krwinek czerwonych w celu ustalenia linii komórkowych limfoblastoidów B

Ogólnym celem tej prostej metody jest ustanowienie linii komórkowych limfoblastoidów B lub B-LCL o wysokiej skuteczności nieśmiertelności przy użyciu tylko niewielkiej ilości krwi i zaoszczędzeniu czasu między inicjacją a krioprezerwacją. Jest to nowatorska metoda unieśmiertelniania ludzkich limfocytów B z krwi pełnej poprzez lizę czerwonych krwinek. B-LCL stanowi cenne źródło biomateriałów do prowadzenia różnych badań.

Główną zaletą tej metody jest to, że tylko 0,5 mililitra krwi wystarcza do uzyskania B-LCL o skuteczności unieśmiertelnienia i wysokiej żywotności komórek. Ustalenie B-LCL przez wirusa Epsteina-Barr lub EBV, przekształcanie limfocytów B, szeroko stosowana metoda w oddzielne komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub PBMC, przez wirowanie w gradionym gradiencie gęstości Ficoll. Jednakże, gdy próbka jest mniejsza niż jeden mililitr lizy czerwonych krwinek, dodawanie nie powiedzie się.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, kiedy stwierdziliśmy, że wyizolowanie PBMC z małych czerwonych krwinek jest trudne przy użyciu metody separacji gradientu gęstości. Aby przygotować EBV, pierwszego dnia zacznij od rozmrożenia komórek B95-8 i hodowania ich w kolbie hodowlanej T25 w sześciu mililitrach kompletnego podłoża RPMI 1640 uzupełnionego 10% FBS, dwoma milimolami L-glutaminy i antybiotykami. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Drugiego dnia, pod mikroskopem, obserwuj morfologię komórki. Komórki są w dobrym stanie, gdy są jasne i okrągłe. Dodaj 10 mililitrów kompletnego RPMI 1640 Medium do kultury.

Czwartego dnia dodać 10 mililitrów świeżej pożywki i przenieść komórki do kolby hodowlanej T75. Następnie, w ósmym dniu, dodaj 20 mililitrów więcej pożywki i utrzymuj komórki przez osiem dni bez dodawania świeżej pożywki. W 16 dniu sprawdź komórki pod mikroskopem.

Następnie zbierz 12 mililitrów komórek do 15-mililitrowych probówek wirówkowych. Następnie kriokonserwuj komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez godzinę i szybko rozmrażaj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Powtórz rozmrażanie i rozmrażanie, jeszcze trzy razy, aż cząsteczki wirusa zostaną uwolnione z komórek.

Odwirować kultury w temperaturze pokojowej 240 razy g przez 10 minut. Następnie przefiltruj supernatant przez filtr 0,22 mikrona. Podać 12 mililitrów filtratu na probówkę i przechowywać probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Do 50-mililitrowej probówki dodaj 0,5 mililitra krwi pełnej, która została antykoagulowana przez EDTA K2. Dodaj jeden mililitr buforu do lizy czerwonych krwinek do krwi pełnej i dobrze wymieszaj. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Następnie szybko dodaj pięć do siedmiu mililitrów 1x PBS, aby zatrzymać reakcję lizy.

Po dodaniu buforu do lizy czerwonych krwinek do krwi, należy dobrze wymieszać. Odwrócenie zapewnia, że reakcja zostanie zakończona w odpowiednim czasie. Następnie odwiruj probówkę 240 razy g w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Białe krwinki wytrącą się na dnie probówki. Odrzucić supernatant i przepłukać osad, dodając siedem mililitrów pożywki zasadowej 1640. Następnie odwiruj roztwór przed powtórzeniem prania.

Za pomocą 300 mikrolitrów pożywki transformacyjnej ponownie zawiesić osad komórkowy. Następnie, aby przeprowadzić zakażenie EBV, dodaj 60 mikrolitrów po 20 mikrogramów na mililitr cyklosporyny A do zawiesiny komórek. Szybko rozmrozić porcję EBV w temperaturze 37 stopni Celsjusza i dodać 240 mikrolitrów wirusa do komórek.

Dokładnie wymieszaj zawiesinę i przenieś 200 mikrolitrów na dołek na płytkę 96-dołkową. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Przez pierwszy miesiąc po zakażeniu EBV należy raz w tygodniu zmieniać połowę pożywki w hodowli komórkowej.

W siódmym dniu pod mikroskopem widoczna jest tylko gruba warstwa fragmentów komórek. Po miesiącu infekcji skupiska komórek limfoblastoidalnych są widoczne pod grubą warstwą fragmentów komórek. Od tego momentu zmieniaj połowę pożywki co trzy dni, aż skupiska komórek będą wyraźnie widoczne pod mikroskopem.

Po ponownym wywieszeniu komórek przenieść zawiesinę do studzienek płytki 24-dołkowej. Następnie, w zależności od tempa wzrostu komórek, gdy pożywka hodowlana zmieni kolor na żółty, podwój objętość kompletnej pożywki RPMI 1640. Gdy skupiska komórek limfoblastoidalnych są widoczne gołym okiem, przenieś hodowlę do kolby hodowlanej T25.

Gdy pożywka hodowlana zmieni kolor na żółty, podwój objętość pożywki, aż objętość rozszerzy się do 10 do 15 mililitrów. Przed zamrożeniem zmień podłoże 24 godziny wcześniej. Następnie, aby zamrozić komórki, odwiruj zawiesinę komórek i użyj licznika komórek do policzenia komórek.

Z zamrożonym roztworem podstawowym zawierającym 90% FBS i 10% DMSO, dostosuj zawiesinę do gęstości od pięciu do 10 razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Następnie zamrozić zawiesinę w tempie jednego stopnia Celsjusza na minutę do minus 80 stopni Celsjusza przed przeniesieniem zamrożonych komórek bezpośrednio do ciekłego azotu. Podczas procesu przemiany zmiany morfologiczne komórek są widoczne pod mikroskopią świetlną.

Po siedmiu dniach od zakażenia małe skupiska komórek są wyraźnie widoczne przy użyciu metody separacji gradientu gęstości, podczas gdy z metody lizy czerwonych krwinek widoczna jest tylko gruba warstwa fragmentów komórek. 30 dni po zakażeniu pod grubą warstwą fragmentów komórek widoczne są skupiska komórek limfoblastoidalnych. Przy częstszych zmianach pożywki resztki komórek są redukowane, a skupiska komórek są wyraźnie widoczne i wyglądają podobnie do kultury utworzonej przez separację w gradinie gęstości.

Na koniec wykorzystano test MTT do oceny żywotności B-LCL. Przedstawione tutaj wyniki wskazują, że komórki B-LCL hodowane metodą lizy czerwonej krwi były znacznie bardziej żywotne niż hodowla ustalona metodą separacji gradientu gęstości. Po opanowaniu, proces transformacji wirusa EBV można przeprowadzić w ciągu 30 minut, jeśli jest wykonany prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustalić B-LCL za pomocą prostej i oszczędzającej czas metody lizy czerwonych krwinek bez wcześniejszego oczyszczania limfocytów. Po opracowaniu technika ta przyspieszyła postęp badań genomiki, transkryptomiki i proteomiki chorób związanych z EBV oraz jej zastosowania w produkcji przeciwciał jednojądrzastych. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi patogenami, takimi jak EBV, może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy zachować środki ostrożności podczas wykonywania tej procedury.