Name: Prosta metoda lizy krwinek czerwonych w celu ustalenia linii komórkowych limfoblastoidów B (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Naucz się prostej metody lizy krwinek czerwonych do ustalania linii komórkowych limfoblastoidów B z wysoką wydajnością. Technika ta wymaga zaledwie 0,5 ml krwi i znacząco skraca czas od inicjacji do krioprezerwacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez kluczowe projekty Chińskiej Akademii Nauk (KFZD-SW-205), systemu wsparcia technologii strategicznych zasobów biologicznych Chińskiej Akademii Nauk (CZBZX-1).

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Instytutu Genetyki i Biologii Rozwoju, a protokół jest zgodny z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu człowieka.
1. Przygotowanie wirusa EB
<ol>
	<li>W pierwszym dniu rozmrozić komórki B95-8 i wyhodować je w 6 ml kompletnej pożywki RPMI 1640, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutaminą i antybiotykami (100 μg/ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny) w kolbie hodowlanej T25. Umieścić kolbę hodowlaną w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W 2 dniu obserwuj morfologię komórki pod mikroskopem. Komórki są w dobrym stanie, gdy są jasne i okrągłe. Dodaj 10 ml kompletnej pożywki RPMI 1640.</li>
	<li>W 4 dniu dodać 10 ml świeżej, kompletnej pożywki RPMI 1640, a następnie przenieść do kolby hodowlanej T75.</li>
	<li>W dniu 8 dodaj 20 ml kompletnej pożywki RPMI 1640.</li>
	<li>Utrzymuj komórki przez 8 dni bez dodawania świeżej pożywki, tj. głodu.</li>
	<li>W 16 dniu obserwuj komórki obserwowane pod mikroskopem. Zebrać komórki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, 12 ml / probówkę.</li>
	<li>Kriokonserwować w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę, a następnie szybko rozmrażać w temperaturze 37 °C. Powtarzać 3 razy, aż cząsteczki wirusa zostaną uwolnione z komórek.</li>
	<li>Wirować przy 240 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przefiltrować supernatant przez filtr 0,22 μm, podwielokrotność, 12 ml/probówkę i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Leczenie krwi pełnej buforem do lizy czerwonych krwinek
<ol>
	<li>Dodać 0,5 ml krwi pełnej antykoagulowanej przez EDTA·K2 do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Umieść 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (przefiltrowanego przez filtr 0,22 μm i rozmrożonego do temperatury pokojowej przed użyciem) do pełnej krwi i dobrze wymieszaj. Umieść mieszaninę w temperaturze pokojowej na 4 minuty. Następnie szybko dodaj 5 - 7 ml 1x PBS do zatrzymania reakcji.</li>
	<li>Wirować przy 240 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Białe krwinki wytrącą się na dnie probówki.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad i przepłukać osad, dodając 7 ml pożywki zasadowej o objętości 1640. Wirować przez 5 minut przy 240 x g w temperaturze pokojowej. Powtórz dwa razy.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w pożywce transformacyjnej o pojemności 300 μl (pożywka RPMI 1640, zawierająca 20% płodowej surowicy bydlęcej i 10 μg/ml fitohemaglutyniny (PHA)).</li>
</ol>
3. Zakażenie EBV
<ol>
	<li>Dodać 60 μl 20 μg/ml cyklosporyny A (CsA) do zawiesiny komórek.</li>
	<li>Szybko rozmrozić podwielokrotność EBV w temperaturze 37 °C. Dodać 240 μl EBV do zawiesiny komórek.</li>
	<li>Dobrze wymieszać i umieścić zawiesinę komórek na 96-dołkowej płytce, 200 μl na studzienkę. Aby uniknąć parowania, dodaj 200 μl 1x PBS do każdego dołka wokół 96-dołkowej płytki. Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
4. Ekspansja i kriokonserwacja B-LCL
<ol>
	<li>Zmieniaj połowę pożywki raz w tygodniu przez pierwszy miesiąc po zakażeniu EBV. Tylko gruba warstwa fragmentów komórek jest widoczna pod mikroskopem w 7 dniu (ryc. 2). Po miesiącu od zakażenia EBV skupiska komórek limfoblastoidalnych są widoczne pod grubą warstwą fragmentów komórek pod mikroskopem (ryc. 2).</li>
	<li>Zmieniaj połowę pożywki co 3 dni, aż skupiska komórek będą wyraźnie widoczne pod mikroskopem (ryc. 2). Zazwyczaj proces ten trwa od 10 do 20 dni.</li>
	<li>Po wymieszaniu odpipetować komórki i przenieść do płytki 24-dołkowej. Podwój objętość pożywki hodowlanej za pomocą pełnego RPMI 1640, gdy zmienia kolor na żółty. Proces ten zależy od tempa wzrostu komórek.</li>
	<li>Następnie przenieść komórki do kolby hodowlanej T25. Podwój objętość pożywki hodowlanej, gdy zmieni kolor na żółty, aż objętość pożywki rozszerzy się do 10 - 15 ml.</li>
	<li>Zmień podłoże 24 godziny przed zamrożeniem. Zawiesinę komórek wirowych przez 5 minut przy 240 x g. Policz komórki za pomocą licznika komórek i zamroź w gęstości 5 - 10 x 106/ml w zamrożonym roztworze podstawowym zawierającym 90% FBS i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). Zamrażać w tempie od 1 °C na minutę do -80 °C, a następnie przenieść bezpośrednio do ciekłego azotu.</li>
</ol>
5. Test bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu (MTT)17
<ol>
	<li>Przygotować zawiesinę jednokomórkową B-LCL z pożywką 1640 zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej. Wysiewaj 3 x 104 komórki na studzienkę na 96-dołkową płytkę, 100 μl na dołek.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C na 12 - 16 godzin.</li>
	<li>Dodać MTT (5 mg/ml) do studzienek, w których rosną komórki, i trzymać z dala od światła przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirować płytkę komórkową przez 10 minut przy 168 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać 100 μl DMSO na dołek. 
	UWAGA: Bądź ostrożny. Nie dotykaj kryształków barwnika w kształcie igieł.</li>
	<li>Potrząsaj płytką przez 10 minut na niskich obrotach, aby całkowicie rozpuścić kryształy.</li>
	<li>Zmierzyć absorpcję przy długości fali 570 nm za pomocą spektrofotometru z mikropłytkami.</li>
</ol>

<ol><li>Mohyuddin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instability+in+EBV-transformed+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines.</a> Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).</li>
<li>Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+lymphoblastoid+cell+lines+from+monozygotic+twins+discordant+in+severity+of+autism+reveals+differential+regulation+of+neurologically+relevant+genes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes.</a> BMC Genomics. 7, 118(2006).</li>
<li>Toda, T., Sugimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Epstein-Barr+virus-transformed+B-lymphoblasts+and+the+proteome+database%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).</li>
<li>Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Epstein-Barr+virus-transformed+B+cell+lines+for+the+generation+of+immunoglobulin-producing+human+B+cell+hybridomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas.</a> J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).</li>
<li>Traggiai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells%3A+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).</li>
<li>Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+%26+characterization+of+lymphoblastoid+cell+lines+from+patients+with+multiple+primary+neoplasms+in+the+upper+aero-digestive+tract+%26+healthy+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals.</a> Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).</li>
<li>Neitzel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Routine+Method+for+the+Establishment+of+Permanent+Growing+Lymphoblastoid+Cell-Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines.</a> Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).</li>
<li>Oh, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+the+rapid+establishment+of+Epstein-Barr+virus+immortalization+of+human+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes.</a> Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).</li>
<li>Louie, L. G., King, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel-Approach+to+Establishing+Permanent+Lymphoblastoid+Cell-Lines+-+Epstein-Barr-Virus+Transformation+of+Cryopreserved+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes.</a> Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).</li>
<li>Tremblay, S., Khandjian, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+use+of+long-term+frozen+lymphocytes+for+the+establishment+of+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines.</a> Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).</li>
<li>Reidy, J. A., Wheeler, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+age+and+Epstein-Barr+virus+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).</li>
<li>Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBV+immortalization+of+human+B+lymphocytes+separated+from+small+volumes+of+cryo-preserved+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood.</a> Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).</li>
<li>Lacelle, C., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+lymphoblastoid+cell+lines+from+frozen+blood+of+extremely+old+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals.</a> Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).</li>
<li>Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greatly+simplified+method+of+establishing+B-lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines.</a> Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).</li>
<li>Ventura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Simple+Method+for+the+Epstein-Barr+Virus+Transformation+of+Lymphocytes+from+Members+of+Large+Families+of+Reunion+Island%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Hered%22%5BJournal%5D)">Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island.</a> Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).</li>
<li>Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoblastoid+Cell-Lines+from+Frozen+Whole-Blood+-+a+Quick+and+Economical+Safeguard+for+Linkage+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis.</a> Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).</li>
<li>Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-Examination+and+Further+Development+of+a+Precise+and+Rapid+Dye+Method+for+Measuring+Cell-Growth+Cell+Kill%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill.</a> J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).</li>
<li>Bogoslovsky, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+and+enumeration+of+endothelial+progenitor+and+endothelial+cells+from+peripheral+blood+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials.</a> Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).</li>
<li>Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+flow+cytometric+immuno-staining+of+T-cell+perforin+is+preserved+using+diethylene+glycol+for+erythrocyte-lysis+but+lost+by+the+use+of+ammonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride.</a> Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).</li>
<li>Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes%3A+A+resource+for+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).</li>
<li>Tosato, G., Cohen, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Epstein-Barr+Virus+%28EBV%29-immortalized+B+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22(2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Informujemy o opracowaniu nowatorskiej metody unieśmiertelniania ludzkich limfocytów B z krwi pełnej poprzez lizę czerwonych krwinek, a jej żywotność komórkową ustalonych B-LCL oceniono za pomocą testu MTT. Wyniki wykazały, że żywotność komórek B-LCL ustalona metodą lizy krwinek czerwonych jest znacznie wyższa niż w przypadku metody separacji w gradieniu gęstości. Główną zaletą metody lizy krwinek czerwonych jest to, że jest prosta i wymaga niewielkiej objętości (zaledwie 0,5 ml) krwi w celu ustanowienia trwałej linii ko...

Spoczynkowe limfocyty B mogą zostać przekształcone przez wirusa Epsteina-Barr (EBV) in vitro w aktywnie proliferujące linie komórkowe limfoblastoidalne B (B-LCL). B-LCL są podobne do komórek rozrodczych pod względem różnicowania i rozwoju, a wskaźnik mutacji somatycznych B-LCL wynosił tylko 0,3%1, przy znikomych zmianach genetycznych i fenotypowych. W związku z tym B-LCL, jako substytuty komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), znacznie przyspieszyły postęp badań genomiki, transkryptomiki i proteomiki chorób związanych z EBV2,3. Co więcej, B-LCL mają również ważne zastosowanie w badaniach przesiewowych przeciwciał monoklonalnych4,5. 
Opracowano kilka metod unieśmiertelniania limfocytów B przez EBV. Do najczęstszych procedur należy izolacja limfocytów B i wykorzystanie linii komórkowych B95-8 do produkcji zakaźnego EBV. Od izolacji do transformacji, metody te dzielą się na trzy strategie. Limfocyty są oddzielane od świeżej krwi przez wirowanie w gradiencie gęstości i transformację EBV bezpośrednio6-8, co w tym badaniu nazywa się metodą separacji gradientu gęstości. Jednak inne techniki pokonują trudności związane z transportem świeżej krwi i wykorzystują procedurę zamrażania oczyszczonych limfocytów, a następnie rozmrażania i zakażenia EBV9-11. Kriokonserwowana krew pełna może być również wykorzystana do izolacji limfocytów B i transformacji12,13. Oprócz wirowania w gradiencie gęstości w celu oddzielenia limfocytów B, niektórzy badacze używają magnetycznego sortera komórek do selekcji limfocytów B12. Jednak separacja magnetyczna jest kosztownym, złożonym i czasochłonnym procesem. Chociaż metody te są przydatne do unieśmiertelniania limfocytów B z wysokim wskaźnikiem sukcesu, konieczność leczenia dużej liczby próbek klinicznych i stosunkowo mała objętość krwi wymagają prostszej metody ustanowienia trwałej linii komórkowej.
Inną rzadziej używaną metodą jest użycie pełnej krwi jako źródła komórek jądrzastych do zakażenia EBV i tworzenia B-LCL. Metody te upraszczają technikę, pomijając procedurę separacji. Tylko niewielka ilość krwi pełnej, zarówno świeżej14, jak i mrożonej15,16, jest wystarczająca do uzyskania linii komórkowych. Niestety, istnieje duża zmienność w sukcesie w porównaniu z dokumentami15, 16 i kilkoma naszymi testami walidacyjnymi. Co więcej, przekształcone kolonie są prawie nie do rozpoznania pod mikroskopem ze względu na duże zanieczyszczenia zanieczyszczające. W związku z tym potrzebna jest bardziej niezawodna metoda transformacji.
Na podstawie powyższych rozważań, opracowaliśmy nową metodę ustalania B-LCL bez uprzedniego oczyszczania limfocytów, nazwaną metodą lizy czerwonych krwinek. Ta metoda jest wygodna, oszczędza czas i ma zastosowanie do dużej liczby próbek. Wystarczyło zaledwie 0,5 ml krwi pełnej, aby uzyskać B-LCL, które są łatwo dostępne u niemowląt i osób starszych bez znaczącego uszczerbku na ich zdrowiu.

<table><tbody><tr><td>Wirówka</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td>Wirowanie</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek&nbsp;</td><td>Hrabia</td><td>&nbsp; IC 1000&nbsp;</td><td>Do zliczania komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>Spektrofotometr Epoch</td><td>Microplate BioTek Instruments</td><td>SN263839</td><td>Do pomiaru absorbancji</td></tr><tr><td>96-dołkowy klaster kultur komórkowych</td><td>Corning Incorporated</td><td>3599</td><td>Płytki polistyrenowe</td></tr><tr><td>24-dołkowy klaster kultur komórkowych</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>Płytki polistyrenowe</td></tr><tr><td>25 cm2 kolba do hodowli komórkowych</td><td>Gniazdo</td><td>707001</td><td>Polistyren& nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Składnik B-LCL medium</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>31800-022</td><td>Dla B-LCL medium</td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp; &nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0374</td><td>Składnik pożywki B-LCL</td></tr><tr><td>100x streptomycyna roztwór penicyliny BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>Składnik B-LCL medium</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td><td>GE&nbsp; Opieka zdrowotna</td><td>17-1440-03</td><td>Do izolacji in vitro limfocytów</td></tr><tr><td>PHA-M</td><td>Sigma</td><td>L8902</td><td>Do stymulacji proliferacji limfocytów</td></tr><tr><td>Cyklosporyna A</td><td>Cayman&nbsp; Chemiczny</td><td>12088</td><td>Do hamowania efektu cytotoksyczności limfocytów T</td></tr><tr><td>Bufor do lizy krwinek czerwonych</td><td>Tiangen</td><td>RT122-01</td><td>Do lizy czerwonych krwinek</td></tr><tr><td>MTT</td><td>Amresco</td><td>0793</td><td>Do wykrywania żywotności komórek</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Do zamrażania komórek</td></tr></tbody></table>

prosta metoda lizy krwinek czerwonych w celu ustalenia linii komórkowych limfoblastoidów b

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

Istnieje wiele metod przekształcania limfocytów B przez wirusa Epsteina-Barra in vitro w unieśmiertelnione linie komórkowe. Opracowaliśmy nową metodę z potężną i prostą strategią tworzenia B-LCL, metody lizy czerwonych krwinek. Metoda ta uprościła procedurę separacji PBMC z usunięciem czerwonych krwinek i wykorzystała zaledwie 0,5 ml krwi pełnej do ustanowienia linii komórkowych unieśmiertelnionych przez EBV, które mogą rozmnażać się do dużej liczby komórek w stosunkowo krótkim czasie ze 100% skutecznością. Metoda jest prosta, niezawodna, oszczędza czas i ma zastosowanie do leczenia dużej liczby próbek klinicznych.

W trakcie procesu transformacji zmiany morfologiczne komórek są wizualizowane za pomocą mikroskopii świetlnej (Rycina 2). Po 7 dniach infekcji, przy zastosowaniu metody separacji w gradiencie gęstości, wyraźnie widoczne były małe skupiska komórek, podczas gdy w metodzie lizy erytrocytów widoczna jest jedynie gruba warstwa fragmentów komórkowych. Jednakże 30 dni po infekcji, pod grubą warstwą fragmentów komórek, widoczne są skupiska komórek limfoblastoidalnych. Przy częsts...

Prosta metoda lizy czerwonych krwinek do tworzenia B-LCL została opracowana z wysoką efektywnością nieśmiertelności, wymagając niewielkiej ilości krwi i oszczędzając czas od inicjacji do krioprezerwacji.

Prosta metoda lizy krwinek czerwonych w celu ustalenia linii komórkowych limfoblastoidów B

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Ogólnym celem tej prostej metody jest tworzenie linii limfoblastoidalnych B, lub B-LCL, o wysokiej wydajności unieśmiertelniania, przy użyciu niewielkiej ilości krwi oraz skróceniu czasu między inicjacją a kriokonserwacją. Jest to nowatorska metoda unieśmiertelniania ludzkich limfocytów B z krwi pełnej poprzez lizę erytrocytów. Linie B-LCL stanowią cenne źródło biomateriałów do prowadzenia różnorodnych badań.Główną zaletą tej metody jest to, że do uzyskania B-LCL z wysoką wydajnością immortalizacji i wysoką żywotnością komórek wystarczy zaledwie 0,5 mililitra krwi. W celu wytworzenia B-LCL poprzez transformację limfocytów B wirusem Epsteina-Barr (EBV) powszechnie stosuje się metodę wyodrębniania mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości Ficoll. Jednakże, gdy objętość próbki po lizie erytrocytów jest mniejsza niż jeden mililitr, proces ten nie powiodzie się.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy, że izolacja PBMC z małych objętości krwi obwodowej za pomocą metody separacji gradientem gęstości jest trudna. Aby przygotować EBV, w pierwszym dniu należy rozmrozić komórki B95-8 i hodować je w kolbie T25 w sześciu mililitrach kompletnego medium RPMI 1640 uzupełnionego o 10% FBS, 2 mM L-glutaminy oraz antybiotyki. Hodowlę inkubować w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.Drugiego dnia pod mikroskopem należy ocenić morfologię komórek. Komórki są w dobrym stanie, gdy są jasne i okrągłe. Do hodowli należy dodać 10 ml kompletnej pożywki RPMI 1640.W czwartym dniu dodać 10 mililitrów świeżej pożywki i przenieść komórki do kolby hodowlanej T75. Następnie, w ósmym dniu, dodać kolejne 20 mililitrów pożywki i utrzymywać komórki przez osiem dni bez dodawania świeżej pożywki. W 16. dniu sprawdzić komórki pod mikroskopem.Następnie należy zebrać 12 mililitrów komórek do probówek wirówek o pojemności 15 mililitrów. Potem komórki należy kriozachować w temperaturze -80 °C przez jedną godzinę, a następnie szybko rozmrozić hodowle w temperaturze 37 °C. Cykl zamrażania i rozmrażania należy powtórzyć jeszcze trzy razy, aż do momentu uwolnienia cząsteczek wirusa z komórek.Odwiruj kultury przy 240 ×g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie przefiltruj nadsącz przez filtr 0,22 µm. Odmierz 12 ml filtratu do każdej probówki i przechowuj probówki w temperaturze -80 °C.Do probówki o pojemności 50 ml należy dodać 0,5 ml krwi pełnej przeciwzakrzepłej EDTA K2. Do krwi pełnej należy dodać 1 ml buforu do lizy erytrocytów i dokładnie wymieszać. Mieszaninę inkubować w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Następnie szybko dodać od 5 do 7 ml 1x PBS, aby zatrzymać reakcję lizy.Po dodaniu buforu do lizy erytrocytów do krwi należy upewnić się, że próbka została dobrze wymieszana. Odwracanie probówki zapewnia terminowe zakończenie reakcji. Następnie odwiruj próbkę w wirówce przy 240 ×g w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Leukocyty opadną na dno probówki. Odlej nadsącz i przemyj osad, dodając 7 ml Basic Medium 1640. Następnie odwiruj roztwór przed powtórzeniem etapu płukania.Osad komórkowy resuspendować w 300 µL medium do transformacji. Następnie, aby przeprowadzić infekcję EBV, dodać do zawiesiny komórkowej 60 µL cyklosporyny A o stężeniu 20 µg/mL. Alikwot EBV szybko rozmrozić w temperaturze 37 °C, a następnie dodać 240 µL wirusa do komórek.Dokładnie wymieszać zawiesinę i przenieść po 200 µL na dołek płytki 96-dołkowej. Następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Przez pierwszy miesiąc po infekcji EBV wymieniać połowę pożywki w hodowli komórkowej raz w tygodniu.W siódmym dniu pod mikroskopem widoczna jest jedynie gruba warstwa fragmentów komórek. Po miesiącu od zakażenia pod grubą warstwą fragmentów komórek widoczne są skupiska komórek limfoblastoidalnych. Od tego momentu wymieniać połowę pożywki co trzy dni, aż skupiska komórek będą wyraźnie widoczne pod mikroskopem.Po resuspensji komórek przenieś zawiesinę do dołków płytki 24-dołkowej. Następnie, w zależności od szybkości wzrostu komórek, gdy pożywka hodowlana zmieni kolor na żółty, podwaj objętość pełnej pożywki RPMI 1640. Gdy skupiska komórek limfoblastoidalnych staną się widoczne gołym okiem, przenieś hodowlę do kolby T25.Gdy pożywka zmieni kolor na żółty, należy dwukrotnie zwiększyć jej objętość, aż osiągnie ona 10 do 15 ml. Na 24 godziny przed zamrażaniem należy wymienić pożywkę. Następnie, aby zamrozić komórki, należy odwirować zawiesinę komórkową i policzyć komórki za pomocą licznika komórek.Wykorzystując zamrożony roztwór zapasowy zawierający 90% FBS i 10% DMSO, dostosuj gęstość zawiesiny do poziomu od 5 do 10 × 10⁶ komórek na ml. Następnie zamrażaj zawiesinę w tempie 1 °C na minutę do osiągnięcia temperatury -80 °C, po czym przenieś zamrożone komórki bezpośrednio do ciekłego azotu. W procesie transformacji zmiany morfologiczne komórek są widoczne w mikroskopie świetlnym.Po siedmiu dniach od zakażenia, stosując metodę separacji gradientem gęstości, wyraźnie widoczne są małe skupiska komórek, podczas gdy w metodzie lizy erytrocytów widoczna jest jedynie gruba warstwa fragmentów komórkowych. 30 dni po zakażeniu, pod grubą warstwą fragmentów komórkowych widoczne są skupiska komórek limfoblastoidalnych. Przy częstszych zmianach medium ilość resztek komórkowych jest zredukowana, a skupiska komórek są wyraźnie widoczne i wyglądają podobnie do hodowli założonej metodą separacji gradientem gęstości.Na koniec zastosowano test MTT w celu oceny żywotności B-LCL. Przedstawione tutaj wyniki wskazują, że komórki B-LCL hodowane metodą lizy czerwonych krwinek wykazywały znacznie wyższą żywotność niż hodowle ustanowione metodą separacji w gradiencie gęstości. Po opanowaniu techniki proces transformacji wirusem EBV może zostać przeprowadzony w 30 minut, jeśli jest wykonywany prawidłowo.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć linie B-LCL za pomocą prostej i oszczędzającej czas metody lizy erytrocytów, bez wcześniejszego oczyszczania limfocytów. Po opracowaniu technika ten przyspieszył postępy w badaniach genomiki, transkryptomiki i proteomiki chorób związanych z EBV oraz jego zastosowanie w produkcji przeciwciał monoklonalnych. Pamiętaj, że praca z ludzkimi patogenami, takimi jak EBV, może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować odpowiednie środki ostrożności.

a-simple-red-blood-cell-lysis-method-for-establishment-b

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano wydajny system analizy struktury i funkcji genu w kulturze ex vivo limfocytów B śledziony. Metoda ta wykorzystuje produkcję rekombinowanych retrowirusów w wolnej od komórek pomocniczych (helper-free), ekotropowej linii komórkowej pakującej. Osiągnięto stabilną, dziedziczną ekspresję badanego genu w pierwotnych limfocytach, co prowadzi do generowania przeciwciał powierzchniowych na komórkach B przechodzących rekombinację zmiany klasy.

Produkcja rekombinowanych retrowirusów i infekcja limfocytów B

Opisujemy metodę generowania przekształconych linii komórek B z wykorzystaniem wirusa Epstein-Barr. Przedstawiamy również nowatorski test, który pozwala zidentyfikować komórki B przeznaczone do transformacji już trzy dni po infekcji.

Tworzenie linii limfoblastoidalnych przekształconych przez wirusa Epsteina-Barr

W tym filmie opisujemy metodę badania dynamiki organelli w limfocytach B po ich aktywacji za pomocą mikrogranulek pokrytych antygenem.

Dynamika organelli w limfocytach B po aktywacji kulkami pokrytymi antygenem

Ten film demonstruje technikę in vitro do stymulacji limfocytów za pomocą nietypizowanego Haemophilus influenzae (NTHi) i oceny odpowiedzi immunologicznej. Inkubacja izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z NTHi powoduje, że komórki bakteryjne stymulują limfocyty T, co prowadzi do produkcji cytokin. Po zahamowaniu wydzielania cytokin przeprowadza się barwienie immunofluorescencyjne w celu wykrycia nagromadzonych cytokin wewnątrzkomórkowych w stymulowanych limfocytach T.

Technika in vitro do stymulacji limfocytów przez bakterie chorobotwórcze

Ten film pokazuje test badający rolę komórek podobnych do neutrofili w ochronie komórek chłoniaka przed cytotoksycznością środków chemioterapeutycznych. Powstaje kokultura 3D, składająca się z chłoniaka i komórek podobnych do neutrofili, i wystawia się ją na działanie winkrystyny - leku stosowanego w chemioterapii. Bezpośredni kontakt z komórkami podobnymi do neutrofili indukuje regulację w górę białek antyapoptotycznych w komórkach chłoniaka, sprzyjając w ten sposób ich przetrwaniu w obecności...

Określanie roli komórek neutrofilopodobnych we wrażliwości komórek chłoniaka na badany lek

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Mitogeneza limfocytów T towarzyszy transformacji blastogennej, po której objętość komórki zwiększa się przed podziałem komórki. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego określania blastogenezy w limfocytach T przy użyciu automatycznego licznika komórek z możliwością pomiaru średnic komórek.

Szybka kwantyfikacja blastogenezy indukowanej mitogenem w limfocytach T w celu identyfikacji leków immunomodulujących

Prosta metoda pozyskiwania klonów komórek NK i T od pacjentów z CAEBV została opracowana z wysoką wydajnością, niewielką ilością krwi obwodowej i niską dawką IL-2.

Skuteczna i prosta metoda tworzenia linii komórkowych NK i T od pacjentów z przewlekłym aktywnym zakażeniem wirusem Epsteina-Barr

Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) jest najczęstszą białaczką w zachodnim świecie. Czynniki transkrypcyjne NFAT są ważnymi regulatorami rozwoju i aktywacji w wielu typach komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) w ludzkich komórkach PBL w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2.

Test immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Tutaj opisujemy nową metodę, która pomaga wyjaśnić mechanizmy odporności komórkowej na Plasmodium podczas fazy infekcji krwi. Jest to test in vitro, który mierzy zabijanie zakażonych krwinek czerwonych przez limfocyty cytotoksyczne.

In vitro Test zabijania krwinek czerwonych zakażonych zarodźcem przez limfocyty cytotoksyczne

Naucz się prostej metody lizy krwinek czerwonych do ustalania linii komórkowych limfoblastoidów B z wysoką wydajnością. Technika ta wymaga zaledwie 0,5 ml krwi i znacząco skraca czas od inicjacji do krioprezerwacji.

Prosta metoda lizy krwinek czerwonych w celu ustalenia linii komórkowych limfoblastoidów B

Przeglądaj więcej filmów