Name: Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych od zdrowych ochotników i ich potencjał migracyjny pod wpływem próbek surowicy po operacji kardiochirurgicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj metodę izolacji śródbłonkowych komórek progenitorowych z krwi obwodowej i oceny ich migracji w odpowiedzi na surowicę pacjentów po operacjach kardiologicznych. Technika ta pozwala badać neowaskularyzację po niedokrwieniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Krew do izolacji EPC pozyskano od zdrowych ochotników po uzyskaniu świadomej zgody, zgodnie z wytycznymi lokalnego komitetu etyki. Próbki surowicy wykorzystane w testach migracyjnych pobrano od pacjentów poddanych konwencjonalnej operacji kardiochirurgicznej z zastosowaniem krążenia pozaustrojowego (CPB). Kryteria wykluczenia obejmowały operacje w trybie nagłym, stwierdzoną lub podejrzewaną ciążę, wiek pacjenta poniżej 18 lat oraz brak uzyskania świadomej zgody. Próbki surowicy pobierano dodatkowo do rutynowych pomiarów klinicznych (bezpośrednio przed operacją i bezpośrednio po reperfuzji mięśnia sercowego/otwarciu zacisku aorty), a następnie przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu końcowej analizy. Badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną (Komitet Etyki Uniwersytetu RWTH w Akwizgranie). Średni wiek pacjentów wynosił 68,6 lat, a średnia masa ciała 81,7 kg. Choroby współistniejące obejmowały: nadciśnienie tętnicze (65%), przewlekłą chorobę płuc (19%), pozasercową arteriopatię (16%), dysfunkcję mózgu (6%), niestabilną dławicę piersiową (3%), niedawny zawał mięśnia sercowego (28% w ciągu 90 d), przewlekłą chorobę nerek (14%), choroby wątroby (2%) oraz cukrzycę (34%).
1. Powlekanie kolby T75:
<ol>
	<li>Przygotować 5 mL roztworu fibronektyny (1 mg ludzkiej fibronektyny rozpuszczonej w 15 mL wody ultraczystej) na każdą kolbę T75.</li>
	<li>Dodać roztwór do kolby T75 i odczekać do odparowania wody. Aby uniknąć niepotrzebnych przerw w procesie izolacji spowodowanych odparowaniem, należy przeprowadzić ten etap z wyprzedzeniem (np. przez noc) w temperaturze pokojowej. Roztwór ten zapewnia stężenie 4,4 µg fibronektyny/cm2.</li>
	<li>Przygotować pożywkę do wzrostu komórek śródbłonka MV2, uzupełniając podstawową pożywkę MV2 dodatkami czynników wzrostu dostarczonymi przez producenta.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek progenitorowych śródbłonka (EPCs) z 60 mL krwi:
UWAGA: Ponieważ koktajl do selekcji pozytywnej CD34 oraz kulki magnetyczne są dostępne komercyjnie w formie połączonego zestawu do selekcji, producent nie podaje ich stężeń. Jednakże, około 100 µL przeciwciała są wystarczające do przetworzenia do 5 x 108 komórki. Kuleczki magnetyczne są rozcieńczone w wodzie, powleczone dekstranem i około 50 razy mniejsze w porównaniu do innych dostępnych w handlu kuleczek. Dalsze informacje znajdują się w instrukcji producenta.
<ol>
	<li>Zmieszać krew (z przeciwkrzepliwymi lub bez nich) w stosunku 1:1 z PBS wolnym od Ca2+-Mg2+.</li>
	<li>Do każdej probówki 50 mL dodać 15 mL roztworu gradientu gęstości. Więcej informacji znajduje się w instrukcji producenta.</li>
	<li>Powoli nanieść rozcieńczoną krew na powierzchnię roztworu gradientu gęstości.</li>
	<li>Wirować próbki przy 2,50 x g przez 30 min z powolnym przyspieszaniem i bez hamowania.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać warstwę leukocytarną (buffy coat) z każdej probówki (Rysunek 1) za pomocą sterylnej plastikowej pipety i przenieść ją do innej probówki. Należy unikać pobierania roztworu gradientu gęstości. Przewidywana wydajność PBMC wynosi około 3-4 x 106 komórek/mL krwi.</li>
</ol>
<img alt="Schemat izolacji warstwy leukocytarnej (buffy coat) z opisami: plazma, PBMC, Ficoll, granulocyty, erytrocyty." src="/files/ftp_upload/55192/55192fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Wirowanie w gradiencie gęstości warstwy leukocytarnej (buffy coat) na roztworze Ficoll. Przedstawiono wynik wirowania w gradiencie gęstości przy 250 x g przez 30 min w roztworze gradientu gęstości. Widoczne są erytrocyty i granulocyty (kolor czerwony), frakcja mononuklearnych komórek krwi (warstwa biała), osocze (kolor żółty) oraz roztwór gradientu gęstości (kolor białawy). <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55192/55192fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="6">
	<li>Rozcieńczyć frakcję mononuklearnych komórek krwi obwodowej co najmniej 3 objętościami PBS i wymieszać. Odwirować w temperaturze pokojowej przez 15 min przy 20 x g.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.6 dwukrotnie.</li>
	<li>Odssać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 5 mL pożywki MV2.</li>
	<li>Dodać 10 µL przeciwciała anty-CD34 człowieka (ilość wystarczająca do przetworzenia do 5 x 108 komórek) na każdą wykorzystaną warstwę leukocytarną i inkubować w rotatorze przez 15 min w 37 °C przy 5% CO2.</li>
	<li>Dodać 50 µL magnetycznych kulek pokrytych dekstranem na każdą wykorzystaną warstwę leukocytarną i inkubować w rotatorze przez 10 min w 37 °C przy 5% CO2.</li>
	<li>Po inkubacji przenieść zawiesinę do probówek FACS, wlewając maksymalnie 3 mL do każdej probówki. Większe objętości nie będą możliwe do zastosowania z magnesem.</li>
	<li>Włożyć probówki FACS do magnesów i odczekać 5 min.</li>
	<li>Usunąć nadsącz, nie wyjmując probówek FACS z magnesów.</li>
	<li>Resuspender komórki w każdej probówce FACS w 3 mL pożywki MV2 poza magnesem.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 2.12-2.14 dwukrotnie.</li>
	<li>Wyjąć probówki FACS z magnesów i resuspender komórki w 3 mL pożywki MV2.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórkową do uprzednio pokrytych kolb T75 i dodać 17 mL pożywki MV2 na każdą kolbę. 
	UWAGA: Pożywkę należy wymienić po 3 dniach. Po jednym tygodniu komórki wykazują struktury wrzecionowate (Rycina 2) i są gotowe do użycia. Przegląd procesu izolacji przedstawia Rycina 3.</li>
</ol>
<img alt="Obraz mikroskopowy morfologii komórek; pasek skali 40 µm; analiza struktury komórkowej." src="/files/ftp_upload/55192/55192fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Obraz mikroskopowy wyizolowanych EPC. Przedstawiono reprezentatywny obraz izolowanych wczesnych EPC w kolbie T75 przed odczepieniem. Widoczna jest wrzecionowata struktura EPC. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55192/55192fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Schemat procesu frakcjonowania krwi, przedstawiający etapy wirowania i izolacji PBMC w celu uzyskania komórek progenitorowych." src="/files/ftp_upload/55192/55192fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3: Schemat blokowy przedstawiający procedurę izolacji EPC. Przedstawiono schemat obrazujący poszczególne etapy protokołu izolacji EPC. Bardziej szczegółowy protokół znajduje się w sekcji 2 w części dotyczącej protokołu.

3. Test migracji
<ol>
	<li>Usunąć medium z EPC w kolbie T75.</li>
	<li>Przemyć 5 mL PBS, ostrożnie wstrząsając kolbą.</li>
	<li>Usunąć PBS i dodać 5 mL komercyjnego roztworu do odrywania komórek. Odczekać do momentu odrycia się komórek (sprawdzić pod mikroskopem). Przyspieszyć proces odrywania, delikatnie opukując dno kolby.</li>
	<li>Po odryciu komórek szybko dodać 5 mL kompletnego medium MV2 i przenieść zawiesinę komórkową do innej probówki.</li>
	<li>Wirować przy 2,0 x g przez 5 min.</li>
	<li>Resuspendować komórki w 5-10 mL PBS i ponownie wirować przy 2,0 x g przez 5 min.</li>
	<li>Powtórzyć krok 3.6.</li>
	<li>Resuspendować osad komórkowy w medium MV2 z ograniczeniem podaży składników odżywczych (wymagane jest 50,0 komórek w 75 µL na studzienkę transmigracyjną). 
	UWAGA: Wybór systemu migracyjnego zależy od typu komórek i rodzaju analizy. Dostępne są różne średnice porów i rozmiary płytek (liczba studzienek). Dla EPC optymalny jest rozmiar porów 5 µm w systemie 96-dołkowym.</li>
	<li>Przygotować płytkę migracyjną, dodając 235 µL próbki surowicy (surowica rozcieńczona 1:5 w medium MV2 z ograniczeniem podaży składników odżywczych) do dolnej komory (Rysunek 4).</li>
</ol>
<img alt="Schemat eksperymentu migracji komórek, symbol Δt, EPC przechodzące przez system filtracyjny, komory górna/dolna." src="/files/ftp_upload/55192/55192fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Test migracji w zmodyfikowanej komorze Boydena. Przedstawiono ogólny schemat zmodyfikowanej komory Boydena. Wkładki do hodowli komórkowej (= komora górna) są zaznaczone kolorem ciemnoniebieskim i zostały umieszczone w komorze dolnej. Dno (ale nie ścianki) tych wkładek stanowi system filtracyjny zawierający pory.a) Przedstawia układ w punkcie czasowym zero. (bPo upływie wybranego punktu czasowego komórki migrują przez filtr w kierunku bodźca. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55192/55192fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="10">
	<li>Włóż wkład krótko przed dodaniem zawiesiny komórkowej.</li>
	<li>Do górnej komory dodaj 75 µL zawiesiny komórkowej (= 50 00 komórek).</li>
	<li>Pozostaw EPC do migracji przez 3 h w temperaturze 37 °C i przy 5 % CO2 (czas migracji zależy od typu komórek i systemu).
	<ol>
		<li>Aby uniknąć artefaktów autofluorescencji surowicy, ilościowo określ zmigrowane komórki, wykonując zdjęcia studni pod mikroskopem, a następnie policz komórki przy użyciu półautomatycznego oprogramowania „ImageJ”.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń górną komorę (zawierającą wszystkie komórki, które nie zmigrowały).</li>
	<li>Dodaj 70 µL 3,6% roztworu paraformaldehydu z dodatkiem barwnika Hoechst (rozcieńczonego 1:1 0). Płytkę można przechowywać przez noc w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.</li>
	<li>Krótko odwiruj płytkę przy 2 0 x g przez 1-2 min, aby wszystkie komórki znalazły się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania.</li>
	<li>Wykonaj 5 zdjęć na studnię (Rysunki 5 oraz 6) przy powiększeniu 10x.</li>
</ol>
<img alt="Schemat szalki Petriego z koloniami bakterii; układ testu wrażliwości na antybiotyki." src="/files/ftp_upload/55192/55192fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Schemat przedstawiający rozmieszczenie wykonanych zdjęć. Schemat przedstawia położenie pięciu wykonanych zdjęć, niezbędnych do oznaczenia komórek migrujących, w odniesieniu do dołka. Zdjęcia wykonuje się w celu policzenia komórek i obliczenia wartości średniej dla każdego dołka. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55192/55192fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego, komórki barwione DAPI, wizualizacja jąder komórkowych, badanie z zakresu biologii komórki." src="/files/ftp_upload/55192/55192fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rysunek 6: Obraz mikroskopowy do ilościowej oceny komórek. Przedstawiono reprezentatywny obraz, który został wykonany w celu kwantyfikacji komórek. Komórki barwiono i utrwalono przy użyciu barwnika Hoechst w 3,6% paraformaldehydzie. Kropki reprezentują utrwalone i zabarwione komórki progenitorowe śródbłonka. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55192/55192fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="17">
	<li>Policz migrujące komórki, korzystając z półautomatycznego oprogramowania „ImageJ” opracowanego przez National Institute of Health.</li>
</ol>

<ol><li>Emontzpohl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+MIF+in+the+migration+of+endothelial+progenitor+cells+in+patients+during+cardiac+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Key role of MIF in the migration of endothelial progenitor cells in patients during cardiac surgery.</a> Int J Cardiol. 181C, 284-287 (2014).</li>
<li>Smadja, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+8+is+differently+expressed+and+modulated+by+PAR-1+activation+in+early+and+late+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 8 is differently expressed and modulated by PAR-1 activation in early and late endothelial progenitor cells.</a> J Cell Mol Med. 13 (8B), 2534-2546 (2009).</li>
<li>Asahara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275 (5302), 964-967 (1997).</li>
<li>Simons, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+endothelial+secretion+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+and+role+in+endothelial+progenitor+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced endothelial secretion of macrophage migration inhibitory factor and role in endothelial progenitor cell recruitment.</a> J Cell Mol Med. 15 (3), 668-678 (2011).</li>
<li>Dernbach, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidative+stress-associated+genes+in+circulating+progenitor+cells%3A+evidence+for+enhanced+resistance+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress.</a> Blood. 104 (12), 3591-3597 (2004).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+factors+secreted+by+endothelial+progenitor+cells+prevent+oxidative+stress-induced+apoptosis+of+mature+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells.</a> Atherosclerosis. 211 (1), 103-109 (2010).</li>
<li>Asahara, T., Kawamoto, A., Masuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Circulating+endothelial+progenitor+cells+for+vascular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine.</a> Stem Cells. 29 (11), 1650-1655 (2011).</li>
<li>Schmidt-Lucke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+number+of+circulating+endothelial+progenitor+cells+predicts+future+cardiovascular+events%3A+proof+of+concept+for+the+clinical+importance+of+endogenous+vascular+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair.</a> Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Human endothelial progenitor cells.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006692(2012).</li>
<li>Ito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells+as+putative+targets+for+angiostatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin.</a> Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).</li>
<li>Hill, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+endothelial+progenitor+cells%2C+vascular+function%2C+and+cardiovascular+risk%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk.</a> N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).</li>
<li>Yoder, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).</li>
<li>Rohde, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+monocytes+mimic+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 357-367 (2006).</li>
<li>Rohde, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cells+mimic+the+morphology+of+endothelial+progenitor+colonies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immune cells mimic the morphology of endothelial progenitor colonies in vitro.</a> Stem Cells. 25 (7), 1746-1752 (2007).</li>
<li>Prokopi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+reveals+presence+of+platelet+microparticles+in+endothelial+progenitor+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures.</a> Blood. 114 (3), 723-732 (2009).</li>
<li>Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+endothelial+cells+based+on+their+increased+uptake+of+acetylated-low+density+lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein.</a> J Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).</li>
<li>Koch, S., Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+by+vascular+endothelial+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006502(2012).</li>
<li>Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+identity%2C+phenotype%2C+and+fate+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).</li>
<li>Hur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+two+types+of+endothelial+progenitor+cells+and+their+different+contributions+to+neovasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).</li>
<li>Tagawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Early+and+Late+Endothelial+Progenitor+Cells+in+Peripheral+Circulation+and+Their+Clinical++Association+with+Coronary+Artery+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Vasc+Med%22%5BJournal%5D)">Determination of Early and Late Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Circulation and Their Clinical Association with Coronary Artery Disease.</a> Int J Vasc Med. , 2015(2015).</li>
<li>Bernhagen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIF+is+a+noncognate+ligand+of+CXC+chemokine+receptors+in+inflammatory+and+atherogenic+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment.</a> Nat Med. 13 (5), 587-596 (2007).</li>
<li>Stoppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+MIF+Family+Proteins+in+Myocardial+Ischemia%2FReperfusion+Damage+and+Their+Influence+on+Clinical+Outcome+of+Cardiac+Surgery+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Interaction of MIF Family Proteins in Myocardial Ischemia/Reperfusion Damage and Their Influence on Clinical Outcome of Cardiac Surgery Patients.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (11), 865-879 (2015).</li>
<li>Kanzler, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+angiogenic+chemokines+in+endothelial+progenitor+cell-induced+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential roles of angiogenic chemokines in endothelial progenitor cell-induced angiogenesis.</a> Basic Res Cardiol. 108 (1), 310(2013).</li>
<li>Walenta, K. L., Bettink, S., Bohm, M., Friedrich, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+chemokine+receptor+expression+regulates+functional+specialization+of+endothelial+progenitor+cell+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential chemokine receptor expression regulates functional specialization of endothelial progenitor cell subpopulations.</a> Basic Res Cardiol. 106 (2), 299-305 (2011).</li>
<li>Rassaf, T., Weber, C., Bernhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+migration+inhibitory+factor+in+myocardial+ischaemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischaemia/reperfusion injury.</a> Cardiovasc Res. 102 (2), 321-328 (2014).</li>
<li>Stoppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+postoperative+blood+levels+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+are+associated+with+less+organ+dysfunction+in+patients+after+cardiac+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">High postoperative blood levels of macrophage migration inhibitory factor are associated with less organ dysfunction in patients after cardiac surgery.</a> Mol Med. 18, 843-850 (2012).</li>
<li>Amin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+inhibitory+factor+mediates+angiogenesis+via+mitogen-activated+protein+kinase+and+phosphatidylinositol+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Migration inhibitory factor mediates angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol kinase.</a> Circ Res. 93 (4), 321-329 (2003).</li>
<li>Kupatt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+endothelial+progenitor+cells+expressing+a+broad+range+of+proangiogenic+and+remodeling+factors+enhance+vascularization+and+tissue+recovery+in+acute+and+chronic+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia.</a> FASEB J. 19 (11), 1576-1578 (2005).</li>
<li>Colotta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+monocyte+chemotactic+cytokine+by+human+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expression of a monocyte chemotactic cytokine by human mononuclear phagocytes.</a> J Immunol. 148 (3), 760-765 (1992).</li>
<li>Casale, T. B., Kaliner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+isolation+of+human+mononuclear+cells+free+of+significant+platelet+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid method for isolation of human mononuclear cells free of significant platelet contamination.</a> J Immunol Methods. 55 (3), 347-353 (1982).</li>
<li>Lewandowska, K., Kaplan, D., Husel, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12745450">CD34 expression on platelets.</a> Platelets. 14 (2), 83-87 (2003).</li>
<li>Stellos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+stromal+cell-derived+factor-1+regulates+adhesion+and+promotes+differentiation+of+human+CD34%2B+cells+to+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells.</a> Circulation. 117 (2), 206-215 (2008).</li>
<li>Thornton, M. A., Poncz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+megakaryocytes+from+peripheral+blood+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of megakaryocytes from peripheral blood hematopoietic progenitors.</a> Methods Mol Med. 31, 337-345 (1999).</li>
<li>Ivetic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Producing+megakaryocytes+from+a+human+peripheral+blood+source%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Producing megakaryocytes from a human peripheral blood source.</a> Transfusion. 56 (5), 1066-1074 (2016).</li>
<li>Friedrich, E. B., Walenta, K., Scharlau, J., Nickenig, G., Werner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34-%2FCD133%2B%2FVEGFR-2%2B+endothelial+progenitor+cell+subpopulation+with+potent+vasoregenerative+capacities%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities.</a> Circ Res. 98 (3), e20-e25 (2006).</li>
<li>Wijelath, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+vascular+endothelial+growth+factor+binding+domains+of+fibronectin+enhance+vascular+endothelial+growth+factor+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Novel vascular endothelial growth factor binding domains of fibronectin enhance vascular endothelial growth factor biological activity.</a> Circ Res. 91 (1), 25-31 (2002).</li>
<li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li>
<li>Yao, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+antioxidative+beta-blocker+celiprolol+on+endothelial+progenitor+cells+in+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Effects of the antioxidative beta-blocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats.</a> Am J Hypertens. 21 (9), 1062-1068 (2008).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-+and+cytokine-induced+mobilization+of+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells+for+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization.</a> Nat Med. 5 (4), 434-438 (1999).</li>
<li>Kawamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+ex+vivo+expanded+endothelial+progenitor+cells+for+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia.</a> Circulation. 103 (5), 634-637 (2001).</li>
<li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Ischemia+Induces+SDF-1alpha+Release+in+Cardiac+Surgery+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients.</a> J Cardiovasc Transl Res. 9 (3), 230-238 (2016).</li>
<li>Frangogiannis, N. G., Smith, C. W., Entman, M. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11744011">The inflammatory response in myocardial infarction.</a> Cardiovasc Res. 53 (1), 31-47 (2002).</li>
<li>Zernecke, A., Bernhagen, J., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+migration+inhibitory+factor+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease.</a> Circulation. 117 (12), 1594-1602 (2008).</li>
<li>White, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+action+of+MIF+in+acute+myocardial+infarction+via+activation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory action of MIF in acute myocardial infarction via activation of peripheral blood mononuclear cells.</a> PLoS One. 8 (10), e76206(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pierwsza część tego badania obejmowała izolację ludzkich EPC z krwi obwodowej zdrowych ochotników, aby umożliwić kompleksową ocenę krwi pacjentów po operacjach kardiochirurgicznych. W związku z tym przeprowadzono wirowanie w gradiencie gęstości w celu oddzielenia frakcji PBMC od osocza, granulocytów i erytrocytów. Aby usunąć większość zanieczyszczających płytek krwi, tę frakcję komórkową poddano krótkim i powolnym etapom płukania 29,30. Następnie komórki CD34 <su...

Śródbłonkowe komórki progenitorowe (EPC) krążą w ludzkiej krwi i mają zdolność różnicowania się w komórki śródbłonka2. Uczestniczą w unaczynieniu i są w stanie zminimalizować uszkodzenia spowodowane stanem zapalnym i urazami niedokrwiennymi/reperfuzyjnymi (I/R) na różne sposoby3,4. Na przykład EPC wykazują podwyższony poziom wewnątrzkomórkowych enzymów przeciwutleniających, takich jak katalaza, peroksydaza glutationowa lub dysmutazy ponadtlenkowe manganu (MnSOD)5. Podwyższona odporność na stres oksydacyjny pozwala EPC funkcjonować w mikrośrodowiskach z podwyższonymi reaktywnymi formami tlenu (ROS) po urazie niedokrwiennym6. Wcześniejsze badania wykazały również, że liczba EPC może być skorelowana z naprawą naczyń krwionośnych i że zmniejszona liczba krążących EPC przewiduje wystąpienie zdarzeń sercowo-naczyniowych7,8. Nie znaleziono jednak jeszcze jasnej definicji świadectwa charakterystyki energetycznej. Do tej pory nie ma specyficznego markera powierzchni komórki ani spójnego fenotypu dla EPC, a komórki te są bardzo rzadkie w krwi obwodowej 9. Ludzkie EPC należy traktować jako krążącą komórkę posiadającą zdolność do przyczyniania się do odbudowy uszkodzonego śródbłonka i nowych struktur naczyniowych.
Jednym ze sposobów izolowania i charakteryzowania EPC jest adhezja do fibronektyny. W ten sposób pojemność tych komórek jest wykorzystywana do wykazywania lepszej przyczepności do naczyń pokrytych fibronektyną w porównaniu z kolagenem typu 1, na przykład3,10,11. Jednak inni odkryli, że posiewanie komórek jednojądrzastych na naczyniach pokrytych fibronektyną bez wcześniejszego lub dalszego etapu oczyszczania prowadzi do powstania kolonii, w tym mieloidalnych komórek progenitorowych, monocytów i limfocytów T12,13,14. Co więcej, w tym przypadku płytki krwi mogą zanieczyścić frakcję komórki jednojądrzastej (MNC), a tym samym przenieść białka błony komórkowej do dowolnych przylegających komórek15.
Oprócz charakterystyki za pomocą testów adhezyjnych in vitro, kombinacja różnych markerów powierzchni komórki jest używana do opisania typu komórki uważanego za EPC. W tym przypadku, po adhezji za pośrednictwem fibronektyny, komórki są analizowane pod kątem ich cech podobnych do śródbłonka. W tym procesie rolę odgrywają dwa markery związane z komórkami śródbłonka, lipoproteina acetylowana o niskiej gęstości (acLDL) i receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego 2 (VEGFR-2, KDR). Wykazano, że komórki śródbłonka i makrofagi specyficznie pobierają acLDL w procesie zwanym "szlakiem komórek zmiatających"16. Innym białkiem markerowym jest KDR jako główny receptor VEGF na komórkach śródbłonka17. Jednakże, ponieważ EPC na ogół są hodowane w pożywkach uzupełnionych śródbłonkowymi czynnikami wzrostu i płodową surowicą cielęcą, możliwe jest, że makrofagi, które również mogły zostać błędnie wyizolowane, wykazują profil markerowy podobny do śródbłonka. Jak wykazano wcześniej, makrofagi hodowane w pożywce kondycjonowanej śródbłonkiem wykazują ekspresję białek "specyficznych dla śródbłonka"18.
Ogólnie rzecz biorąc, istnieją dwie kategorie EPC w ramach większej liczby podtypów, które można znaleźć we krwi lub hodować in vitro. Późne EPC (późne EPC) pojawiają się po 2-3 tygodniach hodowli. Komórki te są szybciej integrowane z monowarstwą ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej i mogą tworzyć rurki kapilarne19. Poza tym tak zwane "wczesne EPC" krążą we krwi przez około tydzień i działają w bardziej pasywny sposób poprzez dostarczanie cząsteczek angiogennych, takich jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) lub CXCL819. Pacjenci z chorobą wieńcową (CAD) wykazywali znacznie mniejszą ilość wczesnych EPC w porównaniu z grupą kontrolną bez CAD20. Co ciekawe, ta sama grupa wykazała większą ilość późnych EPC w porównaniu z grupą kontrolną. Inne badanie wykazało, że wczesne EPC chronią zróżnicowane EPC przed apoptozą w warunkach utleniania w sposób parakrynny6. W związku z tym wczesne EPC mogą zapewniać odpowiednie efekty ochronne poprzez migrację innych komórek w sposób auto- lub parakrynny we krwi obwodowej.
Ten protokół opisuje metodę oczyszczania wczesnych EPC poprzez najpierw izolację frakcji PBMC z ludzkiej krwi obwodowej, a następnie izolację komórek CD34+ od frakcji PBMC, aby usunąć tę zawiesinę komórek z niechcianych komórek. CD34 jest markerem, który jest używany do izolacji ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych9. Następnie komórki CD34 + są hodowane na powierzchniach hodowli tkankowych pokrytych fibronektyną. Po trzech dniach podłoże jest zmieniane, tracąc w ten sposób wszystkie nieprzylegające komórki. Na koniec izolowane EPC są barwione w celu zweryfikowania wychwytu acLDL i obecności KDR jako markera komórek śródbłonka za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Jako dodatkowy marker przeanalizowaliśmy cząsteczkę adhezji komórek śródbłonka płytek krwi (PECAM-1, CD31), która występuje również na komórkach śródbłonka.
Odbudowa uszkodzonej lub zawałowej tkanki mięśnia sercowego poprzez zwiększoną rekrutację EPC należy do intensywnie badanych strategii leczenia chorób sercowo-naczyniowych. Jednak przełożenie wyników eksperymentalnych na praktykę kliniczną jest nadal trudne, biorąc pod uwagę złożone interakcje komórkowe w ludzkim ciele w różnych stanach patofizjologicznych. Co więcej, urazy I/R mięśnia sercowego wywołują nadmierne wydzielanie różnych cytokin, hormonów i czynników wzrostu, które kontrolują naprowadzanie EPC do regionów tworzenia naczyń krwionośnych13. Jak już pokazano, CXCL8, czynnik 1α pochodzący z komórek zrębu (SDF-1α, CXCL12), VEGF i czynnik hamujący migrację makrofagów (MIF) są znacznie zwiększone w próbkach surowicy po uszkodzeniu mięśnia sercowego I/R1. Wśród tych czynników MIF jest plejotropową cytokiną podobną do chemokiny o przeważających cechach prozapalnych. W przeciwieństwie do swojej historycznej nazwy, MIF pełni funkcje promigracyjne, działając jak prawdziwa chemokina na różne typy komórek1,21,22. Procesy rekrutacji komórek za pośrednictwem MIF zostały powiązane z receptorami chemokiny CXCR2 i CXCR4, z którymi MIF wiąże się i aktywuje w sposób niepokrewny21. Warto zauważyć, że EPC wyrażają oba te receptory na swojej powierzchni, które dodatkowo stają się regulowane w górę w warunkach niedotlenienia23,24. Co więcej, coraz więcej dowodów sugeruje, że MIF ma ogólne działanie kardioprotekcyjne podczas uszkodzenia I/R serca22,25,26. W tym kontekście wykazano ponadto, że MIF może wspierać neowaskularyzację podczas stresu hipoksyjnego, co ma szczególne znaczenie, biorąc pod uwagę ograniczone mechanizmy rekonwalescencji uszkodzonego mięśnia sercowego27. Wcześniejsze badania in vitro i eksperymenty na przedklinicznych modelach mysich dostarczyły pierwszych dowodów na rolę MIF w rekrutacji EPCs4. Warto zauważyć, że MIF jest również znaczącym białkiem ładunkowym EPC, które może być uwalniane podczas rekrutacji EPC w miejscach niedokrwiennych28. Jednak badania w warunkach klinicznych, w szczególności w porównaniu z innymi (angiogennymi) cytokinami surowicy, pozostają nieuchwytne.

<table><tbody><tr><td>Fibronektyna</td><td>Biochrom AG</td><td>L7117</td><td>Powłoka kolb T-75</td></tr><tr><td>Aqua ad iniectabilia</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV2</td><td>Promo Cell</td><td>C-22221</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV2 SupplementMix</td><td>Promo Cell</td><td>C-39226</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Wirowanie gęstości</td></tr><tr><td>EasySep ludzki CD34 dodatni zestaw selekcyjny</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18056</td><td>Izolacja komórek CD34+</td></tr><tr><td>Magnes EasySep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td>Odwarstwienie komórek</td></tr><tr><td>Corning HTS transwell 96 dobrze przepuszczalne podpory</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3387-8EA</td><td>System migracji</td></tr><tr><td>Rozwiązanie Hoechst</td><td>ThermoFisher</td><td>33342</td><td>Barwienie migrowanych komórek</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Narodowe instytuty zdrowia</td><td>xxx</td><td>Liczenie migrowanych komórek</td></tr></tbody></table>

izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych od zdrowych ochotników i ich potencjał migracyjny pod wpływem próbek surowicy po operacji kardiochirurgicznej

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Komórki progenitorowe śródbłonka (EPC) są rekrutowane ze szpiku kostnego w warunkach patologicznych, takich jak niedotlenienie, i są kluczowe w neowaskularyzacji niedokrwionych tkanek. Pochodzenie, klasyfikacja i charakterystyka świadectw charakterystyki energetycznej są złożone; niezależnie od tego ustanowiono dwa główne podtypy świadectw charakterystyki energetycznej: tak zwane "wczesne" świadectwa charakterystyki charakterystyki energetycznej (zwane później wczesnymi świadectwami charakterystyki energetycznej) i późne świadectwa charakterystyki charakterystyki energetycznej (późne świadectwa charakterystyki energetycznej). Można je sklasyfikować ze względu na właściwości biologiczne, a także ze względu na ich pojawienie się podczas hodowli in vitro. Podczas gdy "wczesne" EPC pojawiają się w czasie krótszym niż tydzień po posiewie komórek jednojądrzastych pochodzących z krwi obwodowej w pożywkach specyficznych dla EC, późne EPC wzrostu można znaleźć po 2-3 tygodniach. Uznano, że EPC późnego wzrostu są bezpośrednio zaangażowane w neowaskularyzację, głównie poprzez ich zdolność do różnicowania się w dojrzałe komórki śródbłonka, podczas gdy "wczesne" EPC wyrażają różne czynniki angiogenne jako ładunek endogenny w celu promowania angiogenezy w sposób parakrynny. Podczas niedokrwienia/reperfuzji mięśnia sercowego (I/R) różne czynniki kontrolują naprowadzanie EPC do regionów tworzenia naczyń krwionośnych.
Czynnik hamujący migrację makrofagów (MIF) jest chemokiną prozapalną i powszechnie eksprymowaną cytokiną, a ostatnio opisano ją jako kluczowy regulator migracji EPC w stężeniach fizjologicznych1. Co ciekawe, MIF jest przechowywany w pulach wewnątrzkomórkowych i może być szybko uwalniany do krwiobiegu po kilku bodźcach (np. zawale mięśnia sercowego). 
Protokół ten opisuje metodę wiarygodnej izolacji i hodowli wczesnych EPC z krwi obwodowej dorosłego człowieka w oparciu o selekcję CD34-dodatnią z późniejszą hodowlą w pożywce zawierającej śródbłonkowe czynniki wzrostu na płytkach pokrytych fibronektyną do stosowania w testach migracji in vitro przeciwko próbkom surowicy pacjentów kardiochirurgicznych. Ponadto wykazano migracyjny wpływ MIF na chemotaksję EPC w porównaniu z innymi dobrze znanymi cytokinami stymulującymi angiogenezę.

Charakterystyka wyizolowanych komórek progenitorowych śródbłonka
Najpierw zweryfikowano wchłanianie acLDL oraz ekspresję KDR i CD31 na powierzchni wyizolowanej populacji komórek. Jak pokazano na ryc. 7a, 85,1% wyizolowanych EPC wykazywało wchłanianie acLDL i ekspresję CD31. Ryc. 7b i 7c dodatkowo przedstawiają jednorodny rozkład obu markerów, choć istnieje mniejsza populacja ujemna...

Śródbłonkowe komórki progenitorowe (EPC) są kluczowe w neowaskularyzacji niedokrwionych tkanek. Metoda ta opisuje izolację ludzkich EPC z krwi obwodowej, a także identyfikację ich potencjału migracyjnego w próbkach surowicy pacjentów kardiochirurgicznych.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych od zdrowych ochotników i ich potencjał migracyjny pod wpływem próbek surowicy po operacji kardiochirurgicznej

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury izolacji komórek oraz protokołu migracji jest zaprezentowanie niezawodnej metody izolacji komórek progenitorowych śródbłonka oraz oceny ich potencjału migracyjnego w kierunku próbek surowicy pacjentów po operacjach kardiochirurgicznych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące regeneracji wyściółki śródbłonka i naczyń krwionośnych, która jest niezbędna po operacjach serca ze względu na uszkodzenia związane z niedokrwieniem i reperfuzją. Główną zaletą tej techniki jest stosunkowo prosty sposób izolacji komórek progenitorowych, obejmujący wstępną izolację komórek CD-34 dodatnich.Oprócz zgonów, poważne powikłania po operacjach kardiochirurgicznych wciąż występują zbyt często, co podkreśla potrzebę zidentyfikowania mechanizmów ryzyka oraz czynników ochronnych podczas zabiegów kardiochirurgicznych. Komórki progenitorowe śródbłonka odgrywają kluczową rolę w neowaskularyzacji tkanek niedokrwiennych i wiadomo, że wykazują właściwości kardioprotekcyjne.Aby rozpocząć eksperyment, wymieszaj krew w stosunku jeden do jednego z PBS pozbawionym wapnia i magnezu. Do probówki o pojemności 50 ml dodaj 15 ml roztworu gradientu gęstości. Następnie powoli nanieś rozcieńczoną krew na powierzchnię roztworu gradientu gęstości.Następnie należy odwirować próbki. Za pomocą sterylnej plastikowej pipety ostrożnie zebrać warstwę białej krwi (buffy coat) z każdej probówki i przenieść ją do innej probówki, unikając kontaktu z roztworem gradientu gęstości. Frakcję mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) rozcieńczyć co najmniej trzykrotną objętością PBS i wymieszać roztwór poprzez pipetowanie.Odwiruj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 minut przy 200 ×g. Następnie odessaj nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki do wzrostu komórek śródbłonka, MV-2. Po resuspensji komórek dodaj 100 µL przeciwciała przeciwko ludzkim CD-34 na każdą użytą warstwę leukocytarną (buffy coat) i wymieszaj komórki przez obracanie. Dodaj 50 µL magnetycznych kulek pokrytych dekstranem na każdą użytą warstwę leukocytarną i wymieszaj komórki przez obracanie.Po inkubacji przenieść zawiesinę do probówek typu fax, wlewając maksymalnie 3 mL do każdej probówki. Następnie umieścić probówki w magnesach i odczekać pięć minut. Odpiłować supernatant, nie wyjmując probówek z magnesów.Następnie, poza polem magnetycznym magnesów, resuspenduj komórki w każdej probówce do cytometrii w 3 ml pożywki MV-2. Przenieś zawiesinę komórkową do wcześniej powlekanych kolb T-75. Do każdej kolby dodaj 17 ml pożywki MV-2.Aby przygotować test migracji, należy za pomocą pipety usunąć medium z komórek progenitorowych śródbłonka lub EPC w kolbie T-75. Przemyć komórki pięcioma mililitrami soli fizjologicznej w buforze fosforanowym lub PBS, a następnie ostrożnie potrząsnąć kolbą. Następnie usunąć PBS i dodać pięć mililitrów komercyjnego roztworu do odrywania komórek.Następnie należy czekać, aż komórki oddzielą się od powierzchni, obserwując je pod mikroskopem świetlnym. Proces odrywania można przyspieszyć, ostrożnie stukując w dno kolby. Po oddzieleniu komórek należy szybko dodać 5 mL kompletnego medium MV-2 i przenieść zawiesinę komórkową do drugiej probówki.Odwirować komórki przy 2 000 x G przez pięć minut. Po osadzeniu komórek zawiesić je ponownie w 5–10 ml PBS. Następnie odwirować je ponownie.Ponownie zawiesić komórki w pięciu do dziesięciu mililitrów PBS, a następnie poddać je wirowaniu. Osad komórkowy zawiesić w medium MV-2 z ograniczeniem dostępu do składników odżywczych. Następnie rozcieńczyć próbkę surowicy w stosunku jeden do pięciu w medium MV-2 z ograniczeniem dostępu do składników odżywczych.Przygotuj płytkę do migracji, dodając 235 µL próbki surowicy do dolnej komory. Włóż wkład krótko przed dodaniem zawiesiny komórkowej. Następnie dodaj 75 µL zawiesiny komórkowej do górnej komory.Pozostaw EPC do migracji. Usuń górną komorę zawierającą wszystkie komórki, które nie migrowały. Dodaj 75 µL 3,6% roztworu paraformaldehydu z dodatkiem barwnika Hoechst rozcieńczonego w stosunku 1:1 000.Krótko odwiruj płytkę przy 2 000 x G przez jedną do dwóch minut, aby wszystkie komórki znalazły się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania. Aby uniknąć artefaktów autofluorescencji surowicy, przeprowadź ilościowe oznaczenie migrowanych komórek, wykonując pięć zdjęć na każdą studzienkę przy powiększeniu 100x pod mikroskopem. Na koniec policz migrowane komórki, korzystając z oprogramowania półautomatycznego.Analiza FACS komórek EPC potwierdza wychwyt acLDL, a także ekspresję CD-31 na powierzchni wyizolowanej populacji komórek. Analiza acLDL i CD-31 wykazuje jednorodny rozkład każdego z markerów. Celem jest zidentyfikowanie wpływu operacji kardiochirurgicznej po niedokrwieniu i reperfuzji mięśnia sercowego na stężenia krążących poziomów surowiczych MIF, CXCL12, CXCL8 oraz VEGF.Próbki surowicy pobrano przed operacją oraz w trakcie jej przebiegu. Poziomy MIF, CXCL12 i CXCL8 w surowicy wykazały istotny wzrost śródoperacyjny w porównaniu z wartościami wyjściowymi. Z kolei stężenia VEGF nie wykazały żadnych istotnych zmian.Przeprowadzono test migracji ex vivo z wykorzystaniem próbek surowicy pobranych przed i w trakcie operacji, przy użyciu EPC wyizolowanych od zdrowych ochotników, co wykazało istotnie zwiększoną szybkość migracji w kierunku próbek pobranych podczas operacji. Zastosowanie tej techniki pozwala na łatwą izolację mononuklearnych komórek krwi obwodowej w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące procesów zapalnych.

isolation-endothelial-progenitor-cells-from-healthy-volunteers-their

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Endotelialne komórki progenitorowe tworzące kolonie (ECFCs) stanowią obiecujące narzędzie do badania homeostazy i regeneracji naczyń krwionośnych.1,2 Niniejsza praca przedstawia nową metodę izolacji i ekspansji ECFC z heparynowanej krwi obwodowej dorosłego człowieka bez użycia surowicy zwierzęcej, z wykorzystaniem puli lizatu płytek krwi człowieka (pHPL), co zmniejsza ryzyko immunizacji przeciwko białkom bydlęcym.

Izolacja i wielkoskalowa ekspansja dorosłych ludzkich endotelialnych komórek progenitorowych zdolnych do tworzenia kolonii

Niniejszy protokół opisuje izolację i następującą ekspansję mezenchymalnych komórek macierzystych oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie bez użycia surowicy zwierzęcej, w celu wygenerowania autologicznych par do celów eksperymentalnej transplantacji.

Izolacja i ekspansja w warunkach wolnych od surowicy zwierzęcej mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) oraz endotelialnych komórek progenitorowych tworzących kolonie (ECFC) pochodzących z ludzkiej pępowiny

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniom ścinającym w przepływie laminarnym w sterylnym obwodzie przepływu ciągłego. Poprzez przezroczystą komorę można badać adhezję i morfologię komórek, a z obwodu można pobierać próbki do analizy metabolitów oraz zbierać komórki po ekspozycji na siły ścinające do dalszych eksperymentów lub hodowli.

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Komórki endotelialne tworzące kolonie (ECFCs) to krążące komórki endotelialne o silnym potencjale proliferacyjnym klonalnym, które wykazują wrodzone in vivo zdolność do tworzenia naczyń. Fenotypowa i funkcjonalna charakterystyka komórek śródbłonka wyhodowanych z krwi pępowinowej jest istotna dla ich identyfikacji i izolacji bona fide ECFCy do potencjalnych zastosowań klinicznych w naprawie uszkodzonych tkanek.

Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek endotelialnych tworzących kolonie pochodzących z krwi pępowinowej człowieka

Ludzka tkanka serca zawiera multipotencjalne okołonaczyniowe populacje komórek prekursorowych, które mogą być odpowiednie do regeneracji mięśnia sercowego. Opisana technika pozwala na jednoczesną izolację i oczyszczenie dwóch multipotencjalnych populacji komórek zrębu związanych z natywnymi naczyniami krwionośnymi, tj. perycytów CD146+CD34- i komórek przybyszowych CD34+CD146-, z ludzkiego mięśnia sercowego.

Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Ten protokół opisuje technikę różnicowania śródbłonka dla komórek progenitorowych serca. W szczególności koncentruje się na tym, jak stężenie surowicy i gęstość wysiewu komórek wpływają na potencjał różnicowania śródbłonka.

Indukcja różnicowania śródbłonka w komórkach progenitorowych serca w warunkach niskiej surowicy

Na rozwój poważnych niekorzystnych zdarzeń sercowo-naczyniowych, które wpływają na rokowanie sercowo-naczyniowe po angioplastyce wieńcowej, wpływa zakres uszkodzenia naczyń wieńcowych i naprawy naczyń krwionośnych. Zastosowanie nowych biomarkerów wieńcowych i rozpuszczalnych, reagujących na uszkodzenia i naprawę naczyń krwionośnych, jest przydatne do przewidywania rozwoju MACE i rokowania.

Komórki progenitorowe naczyń wieńcowych i rozpuszczalne biomarkery w rokowaniu sercowo-naczyniowym po angioplastyce wieńcowej

Amputacja kończyny dolnej może wystąpić nawet po angioplastyce niedrożnych naczyń w krytycznym niedokrwieniu kończyn (CLI). Jednojądrzaste komórki progenitorowe (MPC) odzwierciedlają naprawę naczyń krwionośnych. Niniejszy protokół opisuje kwantyfikację MPC z krążenia zbliżonego do angioplastyki oraz jej związek z dysfunkcją śródbłonka i przewidywaniem amputacji kończyny dolnej.

Przewidywanie amputacji przy użyciu miejscowo krążących jednojądrzastych komórek progenitorowych u pacjentów leczonych angioplastyką z krytycznym niedokrwieniem kończyn

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Poznaj metodę izolacji śródbłonkowych komórek progenitorowych z krwi obwodowej i oceny ich migracji w odpowiedzi na surowicę pacjentów po operacjach kardiologicznych. Technika ta pozwala badać neowaskularyzację po niedokrwieniu.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych od zdrowych ochotników i ich potencjał migracyjny pod wpływem próbek surowicy po operacji kardiochirurgicznej (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych od zdrowych ochotników i ich potencjał migracyjny pod wpływem próbek surowicy po operacji kardiochirurgicznej

Przeglądaj więcej filmów