Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych od zdrowych ochotników i ich potencjał migracyjny pod wpływem próbek surowicy po operacji kardiochirurgicznej

Ogólnym celem tej procedury izolacji komórek i protokołu migracji jest pokazanie wiarygodnego sposobu izolowania komórek progenitorowych śródbłonka i ich potencjału migracyjnego w kierunku próbek surowicy pacjentów kardiochirurgicznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące regeneracji błony śluzowej śródbłonka i naczyń krwionośnych, która jest potrzebna po operacjach serca z powodu niedokrwienia i urazów związanych z reperfuzją. Główną zaletą tej techniki jest stosunkowo prosty sposób izolacji komórek progenitorowych, w tym wstępna izolacja komórek CD-34 dodatnich.

Oprócz zgonów, poważne powikłania kardiochirurgiczne pozostają zbyt częste. Podkreślenie potrzeby identyfikacji ryzyka wiązania i mechanizmów ochronnych podczas operacji kardiochirurgicznej. Śródbłonkowe komórki progenitorowe są kluczowo zaangażowane w neowaskularyzację niedokrwionych tkanek i wiadomo, że zapewniają właściwości kardiopropcyjne.

Aby rozpocząć eksperyment, wymieszaj krew jeden do jednego z PBS bez wapnia i magnezu. Dodaj 15 mililitrów roztworu gradientu gęstości do 50-mililitrowej probówki. I powoli ułóż rozcieńczoną krew na wierzchu roztworu gradientu gęstości.

Następnie odwirować próbki. Za pomocą sterylnej plastikowej pipety ostrożnie zbierz warstwę kożucha z każdej probówki i umieść ją w innej probówce, unikając roztworu gradientu gęstości. Rozcieńczyć jednojądrzastą komórkę krwi obwodowej lub frakcję PBMC co najmniej trzema objętościami PBS i wymieszać roztwór przez pipetowanie.

Odwirować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 minut w temperaturze 200 razy G. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki do wzrostu komórek śródbłonka, MV-2. Po ponownym zawieszeniu komórek dodaj 100 mikrolitrów ludzkiego przeciwciała CD-34 na użyty płaszcz buffy i obróć komórki. Dodaj 50 mikrolitrów kulek magnetycznych pokrytych dekstranem na użyty płaszcz buffy i obróć komórki.

Po inkubacji przenieść zawiesinę do probówek faksowych o maksymalnej ilości trzech mililitrów do każdej probówki. Następnie włóż rurki faksu do magnesów i odczekaj pięć minut. Wyrzuć nadosad bez wyciągania rurek faksu z magnesu.

Następnie, na zewnątrz magnesów, ponownie zawiesić ogniwa w każdej lampie faksowej za pomocą trzech mililitrów nośnika MV-2. Przenieść zawiesinę komórek do wstępnie powlekanych kolb T-75. Dodać 17 mililitrów pożywki MV-2 do każdej kolby.

Aby przygotować test migracji, należy użyć pipety w celu usunięcia pożywki z komórek progenitorowych śródbłonka lub EPC z kolby T-75. Przemyć komórki pięcioma mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS i ostrożnie wstrząsnąć kolbą. Następnie usuń PBS i dodaj pięć mililitrów komercyjnego roztworu do odrywania komórek.

Następnie poczekaj, aż komórki zostaną odłączone pod mikroskopem świetlnym. Przyspiesz odłączanie, ostrożnie stukając w dno kolby. Po odłączeniu komórek szybko dodaj pięć mililitrów kompletnej pożywki MV-2 i przenieś zawiesinę komórek do innej probówki.

Odwirować komórki przy sile 2 000 x G przez pięć minut. Po granulowaniu komórek zawieś je ponownie w pięciu do dziesięciu mililitrach PBS. I odwiruj je ponownie.

Ponownie zawiesić komórki w pięciu do dziesięciu mililitrach PBS, a następnie odwirować. Zawiesić osad komórkowy w podłożu z niedoborem MV-2. Następnie rozcieńczyć próbkę surowicy od jednego do pięciu w pożywce pozbawionej MV-2.

Przygotować płytkę migracyjną, dodając 235 mikrolitrów próbki surowicy do dolnej komory. Dodaj wkładkę na krótko przed dodaniem roztworu komórkowego. Następnie dodaj 75 mikrolitrów roztworu komórkowego do górnej komory.

Zezwól na migrację świadectw charakterystyki energetycznej. Usuń górną komorę zawierającą wszystkie niemigrowane komórki. Dodaj 75 mikrolitrów 3,6-procentowego roztworu paraformaldehydu, w tym barwnika hoechst rozcieńczonego w ilości od 1 do 1 000.

Krótko odwirować płytkę, aby wszystkie komórki znalazły się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej przy 2 000 x G przez jedną do dwóch minut. Aby uniknąć artefaktów autofluorescencji surowicy, należy określić ilościowo migrowane komórki, wykonując pięć zdjęć na studzienkę ze 100-krotnym powiększeniem pod mikroskopem. Na koniec policz migrowane komórki za pomocą półautomatycznego oprogramowania.

Faksowa analiza EPC weryfikuje wychwyt acLDL, a także ekspresję CD-31 na powierzchni izolowanej populacji komórek. Wyizolowanie analizy acLDL i CD-31 ujawnia jednorodny rozkład każdego markera. Elyso w celu zidentyfikowania wpływu operacji kardiochirurgicznej po uszkodzeniu reperfuzyjnym mięśnia sercowego na stężenia krążących w surowicy poziomów MIF, CXCL12, CXCL8 i VEGF.

Próbki surowicy pobrano przed i śródoperacyjnie. Stężenia MIF, CXCL12 i CXCL8 w surowicy wykazały znaczny wzrost śródoperacyjny w porównaniu z wartościami wyjściowymi. Natomiast stężenia VEGF nie wykazały istotnych zmian.

Test migracji ex vivo, przy użyciu próbek surowicy pobranych przed i w trakcie operacji, przeprowadzono przy użyciu EPC wyizolowanych od zdrowych ochotników i ujawnił znacznie zwiększony wskaźnik migracji w kierunku próbek pobranych śródoperacyjnie. Dzięki tej technice można łatwo wyizolować komórki jednojądrzaste krwi obwodowej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane ze stanem zapalnym.