Name: Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w progenitory hematopoetyczne CD34+ poprzez kontrolowaną manipulację sygnałowania WNT. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów krwiotworzenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Wydział Medycyny Wewnętrznej, Oddział Hematologii, Washington University School of Medicine. CD był wspierany przez T32HL007088 z National Heart, Lung, and Blood Institute. CMS został wsparty nagrodą American Society of Hematology Scholar Award.

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li>
<li>Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+of+human+haematopoietic+development+from+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A view of human haematopoietic development from the Petri dish.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).</li>
<li>Chen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythroid%2Fmyeloid+progenitors+and+hematopoietic+stem+cells+originate+from+distinct+populations+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).</li>
<li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Sources+of+Hematopoietic+Progenitors+Emerge+before+HSCs+and+Provide+Functional+Blood+Cells+in+the+Mammalian+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo.</a> Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).</li>
<li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+definitive+erythroid+lineage+with+unique+regulation+of+the+beta-globin+locus+in+the+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo.</a> Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).</li>
<li>Palis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+emergence+of+high+proliferative+potential+hematopoietic+precursors+during+murine+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).</li>
<li>Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+erythroid+and+myeloid+progenitors+in+the+yolk+sac+and+embryo+proper+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse.</a> Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).</li>
<li>Boiers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphomyeloid+contribution+of+an+immune-restricted+progenitor+emerging+prior+to+definitive+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li>
<li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+requirement+for+Notch1+distinguishes+2+phases+of+definitive+hematopoiesis+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development.</a> Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).</li>
<li>Kumano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+but+not+Notch2+is+essential+for+generating+hematopoietic+stem+cells+from+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells.</a> Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).</li>
<li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system%3A+advances+and+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).</li>
<li>Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBPjkappa-dependent+Notch+function+regulates+Gata2+and+is+essential+for+the+formation+of+intra-embryonic+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells.</a> Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).</li>
<li>Chadwick, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+BMP-4+promote+hematopoietic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells.</a> Blood. 102 (3), 906-915 (2003).</li>
<li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+GFP+reporter+gene+to+the+MIXL1+locus+of+human+embryonic+stem+cells+identifies+human+primitive+streak-like+cells+and+enables+isolation+of+primitive+hematopoietic+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors.</a> Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).</li>
<li>Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+colony-forming+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).</li>
<li>Ledran, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+hematopoietic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+on+stromal+cells+derived+from+hematopoietic+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).</li>
<li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primitive+streak+gene+Mixl1+is+required+for+efficient+haematopoiesis+and+BMP4-induced+ventral+mesoderm+patterning+in+differentiating+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells.</a> Development. 132 (5), 873-884 (2005).</li>
<li>Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+in+serum-free+medium+reveals+distinct+roles+for+bone+morphogenetic+protein+4%2C+vascular+endothelial+growth+factor%2C+stem+cell+factor%2C+and+fibroblast+growth+factor+2+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis.</a> Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+CD34%2B+cells%3A+efficient+production+in+the+coculture+with+OP9+stromal+cells+and+analysis+of+lymphohematopoietic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential.</a> Blood. 105 (2), 617-626 (2005).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukosialin+%28CD43%29+defines+hematopoietic+progenitors+in+human+embryonic+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures.</a> Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+enhances+the+generation+of+hematopoietic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cell-derived+hemato-vascular+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors.</a> Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).</li>
<li>Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+progresses+through+sequential+hematoendothelial%2C+primitive%2C+and+definitive+stages+resembling+human+yolk+sac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development.</a> Blood. 106 (3), 860-870 (2005).</li>
<li>Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+Signaling+Controls+the+Specification+of+Definitive+and+Primitive+Hematopoiesis+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).</li>
<li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+hemogenic+endothelial+progenitor+and+its+direct+precursor+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).</li>
<li>Ditadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Definitive+Haemogenic+Endothelium+and+Arterial+Vascular+Endothelium+Represent+Distinct+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages.</a> Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, Unit 23.2 (2001).</li>
<li>La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T-cell+development+from+human+cord+blood+hematopoietic+stem+cells+by+Delta-like+1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro.</a> Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).</li>
<li>Schmitt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+and+establishment+of+T+cell+competence+from+embryonic+stem+cells+differentiated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro.</a> Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).</li>
<li>Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OP9-DL1+system%3A+generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).</li>
<li>Polychronopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+synthesis+of+indirubins+as+potent+and+selective+inhibitors+of+glycogen+synthase+kinase-3+and+cyclin-dependent+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases.</a> J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-mediated+disruption+of+Wnt-dependent+signaling+in+tissue+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer.</a> Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).</li>
<li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li>
<li>Peschle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic----Fetal+Hb+switch+in+humans%3A+studies+on+erythroid+bursts+generated+by+embryonic+progenitors+from+yolk+sac+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Embryonic----Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten opisuje szybką, wolną od surowicy i zrębu metodę różnicowania pierwotnych lub ostatecznych komórek progenitorowych układu krwiotwórczego. Mezodermalna specyfikacja pierwotnych lub ostatecznych hematopoetycznych komórek progenitorowych może być niezawodnie osiągnięta przy użyciu naszego protokołu, który w unikalny sposób wykorzystuje małocząsteczkowe inhibitory kanonicznej sygnalizacji WNT. Specyficzna dla etapu aktywacja WNT przez inhibitor GSK3β CHIR9902133 powoduje powstanie ostatec...

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) są zdefiniowane jako obejmujące zarówno ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC), jak i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) i mają unikalną zdolność nie tylko do samoodnawiania się w odpowiednich warunkach wzrostu, ale także zdolność do różnicowania się na wszystkie typy komórek pochodzących z trzech listków zarodkowych: endodermy, mezodermy i ektodermy1. Ze względu na te unikalne zdolności, hPSC są bardzo obiecujące dla medycyny regeneracyjnej, modelowania chorób i terapii komórkowych2. Chociaż udało się odróżnić wiele typów komórek od hPSC, jednym z istotnych wyzwań jest specyfikacja in vitro wyłącznie dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) pochodzących z hPSC i ostatecznych hematopoetycznych komórek progenitorowych.
Jedną z prawdopodobnych przeszkód dla rozwoju ludzkich HSC z hPSC jest obecność wielu programów krwiotwórczych w ludzkim embrionie3. Pierwszy program, który się pojawia, określany jako "prymitywna hematopoeza", pochodzi z pozaembrionalnej tkanki woreczka żółtkowego i najlepiej charakteryzuje się przejściową produkcją progenitorów erytroblastów (EryP-CFC), makrofagów i megakariocytów. Warto zauważyć, że program ten nie powoduje powstawania HSC, ani nie powoduje powstawania komórek progenitorowych limfoidalnych T i B. Jednak woreczek żółtkowy przejściowo powoduje powstawanie ograniczonych ostatecznych komórek progenitorowych układu krwiotwórczego, takich jak erytro-szpikowy prekursor (EMP4,5,6,7,8) oraz wielosilny progenitor z niedoborem erytroidów (LMPP9). Jednak ani EMP, ani LMPP nie są w pełni multipotencjalne ani zdolne do wszczepienia podobnego do HSC u dorosłych biorców. W przeciwieństwie do tego, w późniejszym okresie rozwoju, klasycznie zdefiniowany "ostateczny" program hematopoetyczny jest określony w regionie aorta-gonad-mesonephros właściwego zarodka, dając początek wszystkim dorosłym liniom krwiotwórczym, w tym HSC. Specyfikacja tych wewnątrzembrionalnych ostatecznych komórek krwiotwórczych zachodzi w sposób zależny od Notch, poprzez przejście śródbłonka do hematopoetycznego ze śródbłonka hemopochodnego (HE)3,10,11,12,13,14. Oprócz zdolności do rekonstytucji, potencjał wieloliniowy i zależność tych komórek od Notch można wykorzystać do odróżnienia tych ostatecznych hematopoetycznych komórek progenitorowych od EMP i LMPP (przegląd w references3,13).
Zrozumienie mechanizmu(ów) rządzącego pierwotną i ostateczną specyfikacją hematopoetyczną z hPSC jest prawdopodobnie kluczowe dla powtarzalnej produkcji ostatecznych komórek progenitorowych hematopoetycznych na różnych liniach hPSC. Do niedawna nie istniały protokoły różnicowania hPSC, które mogłyby oddzielić mnożących pierwotnych i ostatecznych przodków hematopoetycznych15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. Wiele podejść wykorzystujących płodową surowicę bydlęcą (FBS) i/lub kokulturę zrębu najpierw nakreśliło potencjał hematopoetyczny różnicowania hPSC, z mieszaninami pierwotnego i ostatecznego potencjału hematopoetycznego15,16,17,19,22,23,25. Co więcej, wiele protokołów hematopoetycznych bez surowicy opisało wymagania dotyczące sygnału dla specyfikacji mezodermy z hPSC, która zawiera potencjał hematopoetyczny18,20,21,24. Ponieważ jednak metody te nadal prowadziły do powstania heterogenicznych mieszanin obu programów, ich zastosowanie w zastosowaniach klinicznych i zrozumieniu mechanizmów rozwojowych może być ograniczone.
Ostatnio rozbudowaliśmy te badania, przedstawiając wymagania dotyczące sygnału specyficznego dla etapu sygnalizacji ACTIVIN/NODAL i WNT w prymitywnej i ostatecznej specyfikacji hematopoetycznej z mezodermy pochodzącej z hPSC18,26. Ten ostatni był szczególnie wyjątkowy, ponieważ jego zastosowanie specyficznej dla etapu manipulacji sygnałem WNT pozwala na określenie wyłącznie prymitywnych lub wyłącznie ostatecznych komórek progenitorowych układu krwiotwórczego26. Podczas specyfikacji mezodermy hamowanie kanonicznej sygnalizacji WNT za pomocą inhibitora PORCN IWP2 skutkuje specyfikacją CD43 + EryP-CFC i komórek progenitorowych szpiku, bez wykrywalnego potencjału limfatycznego. W przeciwieństwie do tego, stymulacja kanonicznej sygnalizacji WNT za pomocą inhibitora GSK3β, CHIR99021, na tym samym etapie różnicowania spowodowała całkowity brak wykrywalnego CD43 + EryP-CFC, jednocześnie prowadząc do specyfikacji CD34 + CD43-HE. Populacja ta posiadała potencjał mieloidalny, erytroidalny eksprymujący HBG i limfoidalny T. Późniejsze analizy wykazały, że ten HE nie ma wyrażenia CD7327,28 i CD18428, a jego potencjał krwiotwórczy był zależny od NOTCH28. Co więcej, analizy klonalne pojedynczych komórek wykazały, że te ostateczne linie hematopoetyczne mogą pochodzić z multipotencjalnych pojedynczych komórek28. Podsumowując, badania te wskazują, że specyficzna dla etapu manipulacja sygnalizacją WNT może określać albo czysto prymitywnych hematopoetycznych progenitorów, albo multipotencjalnych ostatecznych hematopoetycznych progenitorów zależnych od NOTCH.
Tutaj przedstawiamy naszą strategię różnicowania, która daje wyłącznie prymitywne lub ostateczne hematopoetyczne prekursory, poprzez manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT podczas mezodermalnego wzorca i ich dalsze testy linii hematopoetycznej. Protokół ten ma ogromną wartość dla badaczy, którzy są zainteresowani produkcją pierwotnych lub ostatecznych hematopoetycznych komórek progenitorowych z hPSC do zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

<table><tbody><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Dulbecco firmy Iscove (IMD)</td><td>Corning</td><td>10-016</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), ocena komórek ES</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-500</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina, roztwór 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Życie Technologie</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Technologie życia</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Technologie życia</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna, skóra świńska, typ A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Corning</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy nokautującej</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td>"KOSR"</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>b-merkaptoetanol, roztwór 55 mM</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Frakcja V, Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Fisher Naukowy</td><td>suplement BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Corning</td><td>10-080</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B27, bez witaminy A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34 (SP34)</td><td>Life Technologies</td><td>10639011</td> <td>"SP34"</td></tr> <tr><td>Obniżony współczynnik wzrostu Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>"MAT"</td></tr><tr><td>L-kwas absorpcyjny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna w surowicy ludzkiej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10652202001</td><td></td></tr><tr><td>Monotioglicerol (MTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza B</td><td>Roche</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza II</td><td>Life Technologies</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Technologie życia</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>Activin A R</td><td>& D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R& D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>R& D Systems</td><td>255-SC</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1</td><td>R& D Systems</td><td>291-G1</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R& D Systems</td><td>203-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 R</td><td>& D Systems</td><td>206-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-7 R</td><td>& D Systems</td><td>207-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-11</td><td>R& D Systems</td><td>218-1L</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>R& D Systems</td><td>288-TP</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Peprotech</td><td>100-64</td><td></td></tr><tr><td>Ligand Flt-3 (FLT3-L)</td><td>R& D Systems</td><td>308-FK</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>IWP2</td><td>Tocris</td><td>3533</td><td></td></tr><tr><td>Angiotensyna II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9525</td><td></td></tr><tr><td>Losartan Potassium</td><td>Tocris</td><td>3798</td><td></td></tr><tr><td>CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4</td><td>BD Biosciences</td><td>560650</td><td>Rozcieńczenie 1:100; Test limfocytów T</td></tr><tr><td>CD8 PE Klon RPA-T8</td><td>BD Biosciences</td><td>561950</td><td>Rozcieńczenie 1:10; Test limfocytów T</td></tr><tr><td>CD34 APC Klon 8G12</td><td>BD Biosciences</td><td>340441</td><td>Rozcieńczenie 1:100; Test EHT</td></tr><tr><td>CD34 PE-Cy7 Klon 8G12</td><td>BD Biosciences</td><td>348801</td><td>Rozcieńczenie 1:100; Śródbłonek hemogenny</td></tr><tr><td>CD43 FITC Klon 1G10</td><td>BD Biosciences</td><td>555475</td><td>Rozcieńczenie 1:10; Śródbłonek hemogenny</td></tr><tr><td>CD45 APC-Cy7 Klon 2D1</td><td>BD Biosciences</td><td>557833</td><td>Rozcieńczenie 1:50; Test limfocytów T</td></tr><tr><td>CD45 eFluor450 Klon 2D1</td><td>BD Biosciences</td><td>642284</td><td>Rozcieńczenie 1:50; Test EHT</td></tr><tr><td>CD56 APC Klon B159</td><td>BD Biosciences</td><td>555518</td><td>Rozcieńczenie 1:20; Test limfocytów T</td></tr><tr><td>CD73 PE Klon AD2</td><td>BD Biosciences</td><td>550257</td><td>Rozcieńczenie 1:50; Śródbłonek hemopochodny</td></tr><tr><td>CD184 APC Klon 12G5</td><td>BD Biosciences</td><td>555976</td><td>Rozcieńczenie 1:50; Śródbłonek hemogenny</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindolowy (DAPI)</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td>Rozcieńczenie 1:10,000; Test limfocytów T</td></tr><tr>Komórki <td></td><td></td><td>OP9 DL4</td><td>Holmes, R. i J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156</td></tr><tr><td>MethoCult H4034 Stemcell</td><td>Technologies</td><td>4034</td> <td>"MeC"</td></tr> <tr><td>Milli-Q system oczyszczania wody</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% CO2 inkubator</td><td></td><td></td><td>Zestaw na 37 C</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td> wielogazowy <td>Zestaw na 37 C, 5% CO2, 5% O2</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Corning</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej o niskiej przyczepności</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej o niskiej przyczepności</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szalki do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Igła z końcem,</td><td></td><td></td> strzykawki Corning 305198 <td></td>3 cm3 o średnicy 16 mm</tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>309657</td><td></td></tr> 5 <tr><td>ml probówka polipropylenowa</td><td>Corning</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówka z polistyrenu</td><td>Corning</td><td>352058</td> 15 ml polipropylenu stożkowa Corning 430791 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml polipropylenowa stożkowa</td><td>Corning</td><td>430921</td><td></td></tr> 2 <tr><td>ml pipeta serologiczna</td><td>Corning</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 5 ml</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 10 ml</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 25 ml</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Skrobaki</td> komórkowe <td>Corning</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml Kriowiale</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówka z 40 &mikro; Filtr siatkowy M</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>40 & mikro; Filtr siatkowy do komórek</td><td>M Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do hodowli komórkowych Kaptur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>bezpieczeństwa biologicznego</td></tr><tr><td>FACS AriaII lub równoważny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSRii lub równoważny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlowJo</td><td>TreeStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel</td><td></td><td></td> wodna <td>Zestaw w temperaturze 37 C</td></tr><tr><td>0,22 &mikro; System filtracji M</td><td>Autoklaw</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Corning <tr><td>Lodówka 4 C-Zamrażarka</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>20</td></tr> <tr><td>C-Zamrażarka</td><td></td><td></td><td></td> 80 C</tr></tbody></table>

ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Jednym z głównych celów medycyny regeneracyjnej jest wytwarzanie i utrzymywanie hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Do niedawna wysiłki zmierzające do różnicowania hPSC w HSC generowały głównie hematopoetyczne komórki progenitorowe, które nie mają potencjału HSC, a zamiast tego przypominają hematopoezę woreczka żółtkowego. Te powstałe hematopoetyczne czynniki progenitorowe mogą mieć ograniczoną użyteczność w modelowaniu in vitro różnych zaburzeń układu krwiotwórczego u dorosłych, szczególnie tych z linii limfoidalnych. Jednak niedawno opisaliśmy metody generowania erytro-mielo-limfoidalnych wieloliniowych ostatecznych hematopoetycznych komórek progenitorowych z hPSC przy użyciu specyficznego dla etapu protokołu ukierunkowanego różnicowania, który opisujemy tutaj. Poprzez enzymatyczną dysocjację hPSC na tworzywach z tworzywa sztucznego pokrytych matrycą błony podstawnej, powstają ciała zarodkowe (EB). EB są różnicowane do mezodermy przez rekombinowany BMP4, który jest następnie określany do ostatecznego programu krwiotwórczego przez inhibitor GSK3β, CHIR99021. Alternatywnie, pierwotna hematopoeza jest określana przez inhibitor PORCN, IWP2. Hematopoeza jest dodatkowo napędzana przez dodanie rekombinowanego VEGF i wspierających cytokin krwiotwórczych. Uzyskane hematopoetyczne komórki progenitorowe wygenerowane tą metodą mają potencjał do wykorzystania w modelowaniu chorób i rozwoju in vitro.

Schemat przedstawiający indukcję prymitywnych i definitywnych progenitorów krwiotwórczych z hPSC zilustrowano na Rysunku 1. Wzorowanie mezodermy poprzez kanoniczne sygnalizowanie WNT zachodzi w dniach 2–3 różnicowania, po czym następuje specyfikacja progenitorów krwiotwórczych.
Reprezentatywna analiza cytometryczna oraz testy tworzenia kolonii w metylocelulozie dla kultur różnicowania hematopoetyczn...

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Ogólnym celem tej metody jest skierowanie różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stronę prymitywnego lub definitywnego programu hematopoetycznego przy użyciu podejścia opartego na manipulacji sygnałami specyficznymi dla danej fazy. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na wiele kluczowych pytań w tej dziedzinie, takich jak zrozumienie regulatorów sygnałowych i transkrypcyjnych ludzkiej definitywnej hematopoezy. Główną zaletą tej techniki jest możliwość natychmiastowej manipulacji specyficznej dla poszczególnych etapów.Procedurę tę demonstruje Carissa Dege, doktorantka w moim laboratorium. Aby rozpocząć protokół, należy przygotować wcześniej namnożone ludzkie pluripotencjalne linie komórek macierzystych (HPSCs) hodowane na embrionalnych fibroblastach mysich (MEFs) do 70% do 80% konfluencji w inkubatorze w temperaturze 37°C z pięcioprocentową zawartością CO2. Odessać pożywkę HPSC i dodać jeden mililitr 0,25% Trypsyny EDTA o temperaturze 37°C do każdego dołka na jedną minutę.Po jednej minucie odessać trypsynę i dodać jeden mililitr pożywki macierzystej do każdego dołka. Za pomocą skrobaka do komórek zdjąć komórki z płytki. Następnie dodać jeden mililitr buforu płucz

directed-differentiation-primitive-definitive-hematopoietic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

My, opierając się na wiedzy z biologii rozwojowej i opublikowanych badaniach, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół do efektywnego generowania neuronów dopaminergicznych A9 śródmózgowia zarówno z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co byłoby przydatne do modelowania chorób i terapii zastępczej w chorobie Parkinsona.

Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje efektywną indukcję hemogennego śródbłonka i wielopotencjalnych hematopoetycznych komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Bezpośrednia indukcja hemogennego śródbłonka i krwi przez nadekspresję czynników transkrypcyjnych w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje indukcję programu hemogennego w mysich fibroblastach embrionalnych poprzez nadekspresję minimalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. Technologia ta może zostać przełożona na system ludzki, aby zapewnić platformy do przyszłych badań nad hematopoezą, chorobami hematologicznymi i przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych.

Przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy za pomocą czynników transkrypcyjnych w celu wywołania programu hemogennego

Tutaj prezentujemy protokół precyzyjnego tworzenia hemogennego śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stanie wolnym od karmów i kseno. Metoda ta będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki immunofenotypowej i indukowanego cytokinami różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej do czterech linii szpikowych. Zastosowania tego protokołu obejmują badania nad wpływem mutacji choroby szpikowej lub małych cząsteczek na różnicowanie szpiku komórek CD34+.

Różnicowanie szpikowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej

Ten protokół demonstruje indukcję programu hemogennego w ludzkich fibroblastach skóry poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych GATA2, GFI1B i FOS w celu wytworzenia hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Hemogenne przeprogramowanie ludzkich fibroblastów poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych

Celem tego artykułu jest dostarczenie ustandaryzowanego podejścia do indukowania różnicowania ludzkich komórek progenitorowych wątroby od pluripotencjalnych komórek macierzystych. Opracowanie tej procedury z gotowymi do użycia preparatami pożywek oferuje użytkownikowi łatwy system do generowania ludzkich komórek wątroby do badań biomedycznych i translacji.

Specyfikacja progenitorów wątroby z pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu różnicowania

Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.

Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół przedstawia różnicowanie ludzkich osteoklastów od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i opisuje metody charakterystyki osteoklastów i prekursorów osteoklastów.

Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w progenitory hematopoetyczne CD34+ poprzez kontrolowaną manipulację sygnałowania WNT. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów krwiotworzenia.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów