Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ogólnym celem tej metody jest skierowanie różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stronę prymitywnego lub definitywnego programu hematopoetycznego przy użyciu podejścia opartego na manipulacji sygnałami specyficznymi dla danej fazy. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na wiele kluczowych pytań w tej dziedzinie, takich jak zrozumienie regulatorów sygnałowych i transkrypcyjnych ludzkiej definitywnej hematopoezy. Główną zaletą tej techniki jest możliwość natychmiastowej manipulacji specyficznej dla poszczególnych etapów.

Procedurę tę demonstruje Carissa Dege, doktorantka w moim laboratorium. Aby rozpocząć protokół, należy przygotować wcześniej namnożone ludzkie pluripotencjalne linie komórek macierzystych (HPSCs) hodowane na embrionalnych fibroblastach mysich (MEFs) do 70% do 80% konfluencji w inkubatorze w temperaturze 37°C z pięcioprocentową zawartością CO2. Odessać pożywkę HPSC i dodać jeden mililitr 0,25% Trypsyny EDTA o temperaturze 37°C do każdego dołka na jedną minutę.

Po jednej minucie odessać trypsynę i dodać jeden mililitr pożywki macierzystej do każdego dołka. Za pomocą skrobaka do komórek zdjąć komórki z płytki. Następnie dodać jeden mililitr buforu płuczącego do każdego dołka.

Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml przeprowadzić triturację komórek od trzech do pięciu razy w celu rozbicia dużych skupisk. Następnie przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować HPSCs przy 330 x G przez pięć minut.

Po wirowaniu dodać medium do HPSC i ponownie zawiesić komórki. Następnie do każdej dołki tworzywa sztucznego z kodem MAT dodać dwa mililitry ponownej zawiesiny HPSC i inkubować komórki przez noc. Po 24 godzinach odessać medium i zastąpić je 0,05% Trypsin EDTA o temperaturze 37°C na jedną minutę.

Odssać Trypsynę z EDTA. Dodać 1 ml pożywki macierzystej i energicznie zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek. Następnie dodać 1 ml pożywki do przemywania.

Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml trzykrotnie homogenizuj komórki i przenieś je do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Wirowarkuj komórki przy 220 x G przez pięć minut. Następnie odessij pożywkę, dodaj 20 ml pożywki do mycia i za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml delikatnie resuspenduj komórki.

Po wirowaniu i aspiracji ostrożnie ponownie zawiesić ciała embrionoidalne (EBs) w pożywce z dnia zerowego. Za pomocą pipety serologicznej o objętości 10 mL rozdzielić po 2 mL pożywki różnicującej zawierającej EBs do każdego dołka sześciodołkowej niskoadhezyjnej płytki hodowlanej. Umieścić EBs w inkubatorze wielogazowym w temperaturze 37°C, przy zawartości 5% CO2 i 5% O2.

Po dwudziestu czterech godzinach dodać 2 mL medium Day One. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze wielogazowym. Po 18 godzinach ostrożnie zebrać ciała embrioidalne (EB) za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 mL i odwirować je przy 100 x G przez pięć minut.

Przemyć i połączyć całą hodowlę z dziesięcioma mililitrami zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Iscove'a (IMDM). Po ponownym wirowaniu hodowli przy 100 ×g przez pięć minut w celu usunięcia zanieczyszczeń, odessać medium. Delikatnie resuspendować ciała embrionalne (EB) w medium z drugiego dnia, używając pipety P1000.

Następnie rozdziel dwa mililitry EBs na każdą studninkę w sześciostudninkowych płytkach hodowli komórkowej o niskim stopniu przylegania. Dodaj trzy mikromole CHIR99021 lub IWP2, aby odpowiednio wyznaczyć definitywne lub prymitywne progenitorowe komórki krwiotwórcze. Inkubuj płytkę w inkubatorze wielogazowym w temperaturze 37°C przez 30 godzin.

Po 30 godzinach wyizoluj ciała embrionalne (EB) za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml, przenosząc je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wirując przy 330 x G przez pięć minut. Delikatnie resuspenduj EB i przemyj je 10 ml IMDM. Resuspenduj EB w pożywce na trzeci dzień (Day Three Media) i przelej po 2 ml do każdego dołka niskoadhezyjnych płytek 6-dołkowych.

Inkubować komórki w inkubatorze wielogazowym w temperaturze 37°C przez 72 godziny. Po 72 godzinach inkubacji dodać 2 mL Day Six Media do każdej studni. Następnie inkubować ciała embrionalne (EBs) w inkubatorze wielogazowym w temperaturze 37°C przez kolejne 48 godzin.

W ósmym dniu różnicowania wyizoluj ciała embroidalne (EB) traktowane CHIR99021 i przejdź do następnej sekcji. Odwiruj EB przy 330 x G przez pięć minut. Odsaj l supernatant.

Następnie dodaj 2 mL 0,25% Trypsyny EDTA do ciałek embrionalnych (EB). Wymieszaj EB za pomocą wortexa przez 5 s, a następnie inkubuj je w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 8 min. Następnie dodaj 5 mL roztworu zatrzymującego i odwiruj EB.

Następnie odessać supernatant. Ponownie zawiesić EB w pięciu mililitrach Collagenase II. Wirować probówkę w wytrząsarce (vortex) przez pięć sekund, a następnie inkubować EB w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Po 60 minutach wymieszać EB w wytrząsarce przez pięć sekund i dodać pięć mililitrów roztworu zatrzymującego.

Po wirowaniu odessaj supernatant i resuspenduj komórki w jednym mililitrze buforu FACS. Przepuść komórki przez sitko do komórek o oczkach 40 µm, aby usunąć niezdysocjowane skupiska komórek. Przejdź do znakowania przeciwciałami i izolacji progenitorów endotelialnych hemogennych CD34-dodatnich za pomocą FACS.

Po izolacji metodą FACS resuspenduj komórki w medium HE. Rozdziel komórki w aliquotach po 50 µL na 96-dołkową płytkę hodowlaną o niskim stopniu adhezji, a następnie inkubuj komórki przez noc. Następnego ranka progenitorzy hematopoetyczne powinni zagregować w skupiska od sześciu do dziesięciu komórek.

Ostrożnie przenieś 50-µL objętości reagregowanych komórek do środka płytki 24-dołkowej z kodowaniem MAT. Ostrożnie umieść płytkę w inkubatorze wielogazowym na cztery do sześciu godzin, aż komórki przywrą do podłoża. Po upływie czterech do sześciu godzin, aby umożliwić przyleganie komórek, powoli dodaj 1 mL świeżo przygotowanego medium HE do każdego dołka.

Inkubuj komórki w inkubatorze wielogazowym, aż pojawią się komórki hematopoetyczne. Następnie zbierz definitywne progenitory hematopoetyczne, delikatnie usuwając pożywkę HE z komórek i przepuszczając zawiesinę przez sito komórkowe o oczkach 40 µm w celu zebrania frakcji przepływowej. Do pozostałych komórek przylegających dodaj 0,5 ml 0,25% Trypsyny EDTA i inkubuj je w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez pięć minut.

Po trypsynizacji dodaj 0,5 mililitra roztworu zatrzymującego do każdej studni. Przepuść komórki przez ten sam sitko komórkowe o oczkach 40 µm, aby połączyć wszystkie komórki przylegające i nieprzylegające, a następnie odwiruj komórki. Dodaj od 2 000 do 10 000 komórek wyizolowanych metodą FACS do jednej studni zawierającej komórki OP9 DL4 w pożywce OP9.

Inkubować w inkubatorze przy 37°C i 5% CO2. Aby przeprowadzić pasażowanie komórek co cztery lub pięć dni, poddać komórki trituracji za pomocą pipety o pojemności 1 mL. Przefiltrować przez filtr 40 µm w celu usunięcia skupisk.

Po wirowaniu odessać pożywkę. Ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach świeżej pożywki do limfocytów T i nanieść je na świeże komórki OP9 DL4. Po co najmniej 21 dniach hodowli w niskiej temperaturze, energicznie rozbić komórki poprzez triturację i przefiltrować przez filtr 40 µm w celu usunięcia szczątków komórkowych.

Wirować przy 330 x G przez pięć minut, odessać nadsącz, a następnie kontynuować standardową analizę cytometryczną. Cytometria przepływowa wykazuje, że kultury różnicowania traktowane IWP2 dają odrębną populację CD34 dodatnią, CD43 ujemną oraz CD34 niską i CD43 dodatnią. Natomiast w kulturach różnicowania traktowanych CHIR ósmego dnia różnicowania odsetek komórek CD43 dodatnich wynosi mniej niż 1%.

Prymitywne progenitory hematopoetyczne uzyskane w warunkach IWP2 i izolowane w dziewiątym dniu dadzą początek głównie prymitywnym progenitorom erytroidalnym i mieloidalnym w testach na podłożu z metylocelulozy. Populacja CD34-dodatnia i CD43-ujemna pochodząca z traktowania CHIR99021 jest populacją heterogenną, zawierającą progenitory śródbłonkowe, a także hemogenne śródbłonkowe komórki CD34-dodatnie, CD43-ujemne, CD73-ujemne i CD184-ujemne, które po izolacji metodą FACS początkowo tworzą monowarstwę komórek przypominających śródbłonek, a następnie przechodzą przejście z fenotypu śródbłonkowego na hematopoetyczny, w wyniku czego powstają okrągłe, refrakcyjne, nieprzylegające komórki hematopoetyczne. Ekspresję CD34 i CD45 w tych komórkach hematopoetycznych można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej.

Progenitory krwiotwórcze wyizolowane z testów EHT mogą być wykorzystane w testach z metylocelulozą, dając początek dużym, przypominającym wybuchy (burst-like) jednostkom tworzącym kolonie erytroidalne, małym jednostkom tworzącym kolonie erytroidalne oraz progenitorom mieloidalnym. Te reprezentatywne analizy cytometryczne potencjału testów limfocytów T z progenitorów krwiotwórczych CD34 pozytywnych, CD43 negatywnych, CD73 negatywnych i CD184 negatywnych pochodzących z CHIR99021 oraz progenitorów krwiotwórczych CD34 pozytywnych i CD43 negatywnych pochodzących z IWP2 wykazują obecność populacji CD45 pozytywnej, CD56 negatywnej, CD4 pozytywnej i CD8 pozytywnej w progenitorach pochodzących z CHIR, co wskazuje na potencjał krwiotwórczy w początkowej populacji CD34 pozytywnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak różnicować ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste w kierunku prymitywnych lub definitywnych progenitorów krwiotwórczych.