Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ogólnym celem tej metody jest skierowanie różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kierunku pierwotnego lub ostatecznego programu hematopoetycznego przy użyciu podejścia do manipulacji sygnałem specyficznego dla danego etapu. Metoda ta może odpowiedzieć na wiele kluczowych pytań w tej dziedzinie, takich jak zrozumienie regulatorów sygnału i transkrypcji ludzkiej ostatecznej hematopoezy. Główną zaletą tej techniki jest to, że natychmiast wykorzystuje manipulację specyficzną dla etapu.

Tę procedurę demonstruje Carissa Dege, doktor habilitowany w moim laboratorium. Aby rozpocząć protokół, należy uzyskać wcześniej przygotowane ludzkie pluripotencjalne linie komórek macierzystych lub HPSC wyhodowane na mysich embrionalnych fibrblastach lub MEF do konfluencji od 70% do 80% w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym CO2. Odessać pożywkę HPSC i dodać jeden mililitr 0,25% trypsyny EDTA o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdej studzienki przez jedną minutę.

Po minucie odessaj trypsynę i dodaj jeden mililitr podłoża podstawowego do każdej studzienki. Za pomocą skrobaka do komórek zeskrob komórki z płytki. Następnie dodaj jeden mililitr buforu do płukania do każdej studzienki.

Za pomocą dwumililitrowej pipety serologicznej rozdziel komórki trzy do pięciu razy, aby rozbić duże grudki. I przenieś komórki do 50-mililitrowej stożkowej rurki. Odwirować HPSC przy 330 x G przez pięć minut.

Po wirowaniu dodaj pożywkę HPSC i ponownie zawieś komórki. Następnie dodaj dwa mililitry ponownie zawieszonych HPSC do każdej studzienki plastikowych naczyń oznaczonych MAT i inkubuj komórki przez noc. Po 24 godzinach odessać pożywkę i zastąpić ją 37-stopniową 0,05% trypsyną EDTA na jedną minutę.

Odessać EDTA trypsyny. Dodaj jeden mililitr podłoża podstawowego i energicznie zeskrob komórki za pomocą skrobaka do komórek. Następnie dodaj jeden mililitr środka myjącego.

Za pomocą dwumililitrowej pipety serologicznej trzykrotnie rozcieraj komórki i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Odwirować komórki w temperaturze 220 x G przez pięć minut. Następnie odessać pożywkę, dodać 20 mililitrów pożywki myjącej i użyć pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby delikatnie ponownie zawiesić komórki.

Po odwirowaniu i aspiracji ostrożnie ponownie zawiesić ciała zarodkowe lub EB w pożywce dnia zero. Dozować dwa mililitry pożywki różnicującej zawierającej EB do każdej studzienki sześciodołkowej płytki do hodowli komórkowych o niskiej przyczepności za pomocą dziesięciomililitrowej pipety serologicznej. Umieść EB w inkubatorze wielogazowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza o zawartości pięciu procent CO2 i O2.

Dwadzieścia cztery godziny później dodaj dwa mililitry pożywki Day One. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze wielogazowym. Po 18 godzinach delikatnie zbierz EB pięciomililitrową pipetą serologiczną i obracaj je w temperaturze 100 x G przez pięć minut.

Umyj i połącz całą kulturę z dziesięcioma mililitrami zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove lub IMDM. Po ponownym odwirowaniu kultury w temperaturze 100 X G przez pięć minut w celu usunięcia zanieczyszczeń, odessać pożywkę. Delikatnie ponownie zawiesić EBs za pomocą pożywki Day Two za pomocą pipety P1000.

Następnie dozuj dwa mililitry EB na studzienkę do sześciodołkowych płytek do hodowli komórkowych o niskiej przyczepności. Dodaj trzy CHIR99021 mikromolowe lub IWP2, aby określić odpowiednio ostatecznych lub prymitywnych hermatopoetycznych przodków. Inkubować płytkę w inkubatorze wielogazowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 godzin.

Po 30 godzinach wyizolować EB za pomocą dwumililitrowej pipety serologicznej, przenosząc je do 50-mililitrowej stożkowej probówki i centyfikując je do 330 x G przez pięć minut. Delikatnie ponownie zawieś EB i umyj je 10 mililitrami IMDM. Ponownie zawiesić EB w pożywce dnia trzeciego i dozować dwa mililitry do każdej studzienki sześciodołkowych płytek o niskiej przyczepności.

Inkubuj komórki w inkubatorze wielogazowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Po 72 godzinach inkubacji dodać dwa mililitry pożywki dnia szóstego do każdego dołka. Następnie inkubuj EB w inkubatorze wielogazowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkowe 48 godzin.

Wyizoluj EB potraktowane CHIR99021 w ósmym dniu różnicowania i przejdź do następnej sekcji. Odwirować EB przy sile 330 x G przez pięć minut. Odessać supernatant.

Następnie dodaj dwa mililitry 0,25% trypsyny EDTA do EB. Wiruj EB przez pięć sekund i inkubuj Ebs w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem minut. Następnie dodaj pięć mililitrów roztworu zatrzymującego i odwiruj EBs.

Następnie odessać supernatant. Ponownie zawiesić EB w pięciu mililitrach kolagenazy II.Wirować probówkę przez pięć sekund, a następnie inkubować EB w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 60 minutach wiruj EB przez pięć sekund i dodaj pięć mililitrów roztworu zatrzymującego.

Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze buforu FACS. Przepuść komórki przez sitko o średnicy 40 mikronów, aby usunąć niezdysocjowane grudki komórek. Kontynuuj znakowanie przeciwciałami i izolację FACS hemogennych komórek progenitorowych śródbłonka CD34-dodatniego.

Po wyizolowaniu FACS ponownie zawiesić komórki w pożywce HE. Rozmieść komórki w 50-mikrolitrowych podwielokrotnościach na 96-dołkowej płytce hodowlanej o niskiej przyczepności, a następnie inkubuj komórki przez noc. Następnego ranka krwiotwórcze komórki progenitorowe powinny zebrać się w grudki od sześciu do dziesięciu komórek.

Delikatnie przenieś 50-mililitrowe objętości ponownie zagregowanych komórek do środka 24-dołkowej płytki kodowanej MAT. Delikatnie umieść płytkę w inkubatorze wielogazowym na cztery do sześciu godzin, aż komórki zostaną połączone. Po czterech do sześciu godzinach, aby umożliwić przyłączenie komórek, powoli dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanej pożywki HE do każdej studzienki.

Inkubować komórki w inkubatorze wielogazowym, aż komórki hematopoetyczne będą widoczne. Następnie zbierz ostateczne hematopoetyczne komórki progenitorowe, delikatnie usuwając pożywkę HE z komórek i przechodząc przez 40-mikronowe sitko komórkowe w celu zebrania przepływu. W przypadku pozostałych przylegających komórek dodaj 0,5 mililitra 0,25% trypsyny EDTA do komórek i inkubuj je w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Po trypsynizacji dodaj 0,5 mililitra roztworu zatrzymującego do każdej studzienki. Przepuść komórki przez ten sam filtr siatkowy o średnicy 40 mikronów, aby zebrać wszystkie przylegające i nieprzylegające komórki razem i obrócić komórki. Dodaj od 2 000 do 10 000 izolowanych komórek FACS do jednej studzienki komórek OP9 DL4 w pożywce OP9.

Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Aby przejść komórki co cztery do pięciu dni, należy je rozcierać za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Przepuść przez filtr 40 mikronów, aby usunąć grudki.

Po odwirowaniu odessać pożywkę. Ponownie zawieś komórki w dwóch mililitrach świeżej pożywki z komórek T i umieść je na świeżych komórkach OP9 DL4. Po co najmniej 21 dniach zimnej hodowli energicznie rozcieraj komórki i przechodź przez filtr o średnicy 40 mikronów, aby usunąć resztki komórek.

Wirować przy stężeniu 330 x G przez pięć minut i odessać supernatant, a następnie kontynuować stosowanie standardowej cytometrii przepływowej. Cytometria przepływowa pokazuje, że kultury różnicujące traktowane IWP2 dają wyraźną populację CD34 dodatnią, CD43 ujemną i CD34 o niskiej zawartości CD43. Podczas gdy kultury różnicujące traktowane CHIR mają mniej niż 1% komórek CD43-dodatnich w ósmym dniu różnicowania.

Prymitywni przodkowie hematopoetyczni wyprowadzeni w warunkach IWP2 wyizolowani w dziewiątym dniu spowodują powstanie głównie prymitywnych progenitorów erytroidalnych i szpikowych w testach metylocelulozy. Populacja CD34 dodatnia CD43 ujemna pochodząca z leczenia CHIR99021 jest populacją niejednorodną zawierającą progenitory śródbłonka, a także śródbłonek hemogenny CD34, CD43 ujemny, CD73 ujemny, CD184 ujemny, który po wyizolowaniu przez FACS początkowo utworzy monowarstwę komórek podobnych do śródbłonka, która następnie przechodzi przejście śródbłonka do hematopoetycznego, w wyniku czego powstaje okrągły, ogniotrwały, nieprzylegające komórki krwiotwórcze. Te komórki krwiotwórcze można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem ekspresji CD34 i CD45.

Krwiotwórcze czynniki progenitorowe wyizolowane z testów EHT mogą być stosowane w testach metylocelulozy i prowadzić do powstania dużych, przypominających pęknięcia, erytroidalnych jednostek tworzących kolonie, małych erytroidalnych jednostek tworzących kolonie i mieloidalnych komórek progenitorowych. Te reprezentatywne analizy cytometryczne cytometrii przepływowej potencjału testów limfocytów T z populacji CD34 dodatnich CHIR99021, CD43 ujemnych, CD73 ujemnych, CD184 ujemnych komórek progenitorowych hematopoetycznych i pochodnych IWP2 CD34 dodatnich, CD43 ujemnych komórek progenitorowych układu krwiotwórczego wykazują obecność CD45 dodatniej, CD56 ujemnej, CD4-dodatniej, CD8 dodatniej w progenitorach pochodzących z CHIR, co wskazuje na potencjał hematopoetyczny w wejściowej populacji CD34-dodatniej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak różnicować ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste w kierunku prymitywnej lub ostatecznej liczby hematopoetycznych komórek progenitorowych.