Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek
10 marca 2017
Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.
Ogólnym celem tego testu limfocytów opartego na florescencji jest zidentyfikowanie nowych immunomodulatorów małocząsteczkowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu immunologii dotyczące mechanizmu aktywacji i hamowania limfocytów. Główną zaletą tej funkcji fenotypowej i testu jest to, że można go dostosować do odkrywania leków.
Procedurę zademonstruje Ahmed Fouda, doktorant z naszego laboratorium. Pod sterylnym kapturem roboczym zdezynfekuj sierść sześcio- do ośmiotygodniowej samicy myszy Nurr77 GFP 70% etanolem i połóż zwierzę na prawym boku. Następnie wykonaj nacięcie w skórze i mięśniach lewego górnego kwadrantu brzucha, a następnie zlokalizuj i usuń śledzionę, umieszczając tkankę w pożywce splenocytowej na lodzie.
Po zebraniu wszystkich śledzion przenieś tkanki do naczynia do hodowli komórek o powierzchni 10 centymetrów kwadratowych zawierającego pięć mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki splenocytowej i użyj sterylnego tłoka strzykawki, aby zmiażdżyć tkanki, aż roztwór będzie mętny. Po intensywnym zacieraniu w pożywce splenocytowej przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko komórkowe o średnicy 70 mikronów do 50-mililitrowej probówki, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia, a następnie odwiruj powstałą zawiesinę jednokomórkową. Ponownie zawiesić osad w dwóch do trzech mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek, zalewając reakcję pięcioma mililitrami RPMI lub innym odpowiednim buforem po 20 do 30 sekundach.
Następnie zbierz komórki za pomocą kolejnego wirowania i ponownie zawieś osad w twp mililitrach pożywki splenocytowej w celu zliczenia komórek. Aby wyizolować limfocyty T, należy ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić osad w pożywce RPMI wolnej od surowicy w stężeniu od jednego razy 10 do siedmiu komórek na mililitr. Przenieś komórki do pięciomililitrowej probówki z polistyrenu i odłóż na bok 100 mikrolitrów podwielokrotności splenocytów do późniejszego wykorzystania do oceny czystości.
Następnie dodaj 50 mikrolitrów na mililitr normalnej surowicy szczura do komórek, a następnie dodaj 50 mikrolitrów na mililitr koktajlu przeciwciał izolujących limfocyty T z delikatnym mieszaniem. Po 10 minutach inkubuj komórki z kulkami magnetycznymi sprzężonymi ze streptawidyną przez dwie i pół minuty. Następnie dodaj do komórek pożywkę wolną od surowicy na końcową objętość dwóch i pół mililitra i umieść probówkę w magnesie do izolacji komórek na trzy minuty.
Pod koniec inkubacji, trzymając rurkę w magnesie, jednym ruchem wlej supernatant do nowej rurki polistyrenowej. Limfocyty T można następnie policzyć. Umieść limfocyty T z nasionami na 96-dołkowej płytce o okrągłym dnie w stężeniu 2,5 razy 10 do piątej komórki na studzienkę, zawierające 200 mikrolitrów świeżej pożywki splenocytowej na studzienkę.
Dodaj rekombinowane kulki magnetyczne interleukiny 7 i CD3/CD28 do odpowiednich studzienek i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. 12 godzin później delikatnie rozetnij zawiesinę komórkową w każdym dołku, aby rozbić wszelkie agregaty komórek perełkowych. Następnie przenieś zawiesiny komórek z każdej studzienki do pojedynczych pięciomililitrowych rurek polistyrenowych.
Po zebraniu wszystkich komórek, umieść każdą probówkę komórek w magnesie rozdzielającym na pięć minut za każdym razem i zdekantuj supernatanty, gdy rurka nadal znajduje się w magnesie, do nowych rurek polistyrenowych na końcu każdej inkubacji. Następnie zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki w świeżym podłożu splenocytowym w stężeniach dwa razy od 10 do szóstych komórek na mililitr. W przypadku wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek należy umieścić 40 mikrolitrów komórek na studzienkę na płytce 384-dołkowej i potraktować odpowiednie studzienki wybranym lekiem lub nośnikiem przez żądany okres leczenia w inkubatorze do hodowli komórkowych.
Na 30 minut przed analizą GFP należy wybarwić komórki roztworem Hoechsta o odpowiednim stężeniu, dokładnie rozprowadzając barwnik za pomocą delikatnego pipetowania. Gdy wszystkie studzienki zostaną zabarwione, odwirować płytki, aby zebrać komórki na dnie studzienek i pozostawić komórki na 15 minut w temperaturze pokojowej. Załaduj płytę zgodnie z instrukcjami producenta.
Następnie ustaw obiektyw na 40X lub więcej. Ustaw kamerę numer cztery dla lampy UV, a następnie ustaw kamerę numer jeden dla lasera 488. Załaduj płytkę do systemu przesiewania o wysokiej zawartości.
Następnie ustaw zautomatyzowany konfokalny system przesiewowy o wysokiej zawartości tak, aby odczytywał od sześciu do 10 pól na studzienkę z dwoma sekwencyjnymi odczytami na pole, przy 488 nanometrach i świetle UV. Limfocyty T CD3-dodatnie stanowią około 30% danej śledziony myszy, wykazując 10% podstawową ekspresję GFP. Po stymulacji kulek receptora limfocytów T CD3 / CD28 obserwuje się pięcio- do sześciokrotnego wzrostu procentowej ekspresji GFP.
Podobnie, limfocyty B CD19-dodatnie stanowią od 50 do 55% wszystkich splenocytów o podstawowej ekspresji GFP podobnej do nieaktywowanych limfocytów T. Co ciekawe, stymulacja receptora limfocytów B za pomocą anty-mysich IgG, IgM i rekombinowanego CD40L powoduje tylko nieznaczny wzrost ekspresji GFP. Po izolacji kulek magnetycznych, jak właśnie pokazano, wyizolowane limfocyty T CD3-dodatnie nadal wykazują 10% podstawową ekspresję GFP.
Stymulacja kulek CD3/CD28 indukuje jednak znaczną regulację w górę odpowiedzi GFP. Podobnie, po izolacji kulek magnetycznych komórek B, oczyszczone aktywowane limfocyty B wykazują wyższą ekspresję GFP w porównaniu z aktywowanymi komórkami B w splenocytach. W tym reprezentatywnym eksperymencie pierwotne wysokoprzepustowe badania przesiewowe 4398 związków ujawniły kilka aktywatorów i inhibitorów aktywacji limfocytów T.
Ale zaobserwowana ekspresja GFP w stymulowanych limfocytach T jest 20 razy wyższa niż mierzona dla niestymulowanych limfocytów T. Pozwala to na wytworzenie strefy działania, w której można łatwo wykryć związki hamujące GFP. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu 36 do 48 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o policzeniu komórek po każdym kroku. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak ELISA lub western blot, aby odpowiedzieć na wszelkie inne dodatkowe pytania. Technika ta utoruje drogę do odkrywania leków immunomodulacyjnych u gryzoni.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i aktywować limfocyty T lub B pochodzące z płytek myszy Nurr77 GFP.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia nowy test oparty na fluorescencji wykorzystujący limfocyty z transgenicznego mysza, mający na celu przesiewowe badanie wysokowydajne małych cząsteczek, które mogą modulować aktywację limfocytów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Odkrywanie leków
- Biologia komórki
Tło
- Test koncentruje się na identyfikacji małych cząsteczek immunomodulujących.
- Porusza kluczowe pytania dotyczące mechanizmów aktywacji limfocytów.
- Metoda jest przystosowana do zastosowań w odkrywaniu leków.
- Demonstracja procedury jest przeprowadzana przez studenta magisterskiego.
Cel badania
- Opracowanie metody przesiewowej wysokiej wydajności dla immunomodulantów.
- Poprawa zrozumienia aktywacji i inhibicji limfocytów.
- Dokuczenie platformy dla przyszłych wysiłków w dziedzinie odkrywania leków.
Stosowane metody
- Opracowanie testu opartego na fluorescencji.
- Izolacja limfocytów z transgenicznych myszy Nurr77 GFP.
- Przesiewowe badanie wysokiej wydajności małych cząsteczek.
- Analiza in vitro aktywacji limfocytów.
Główne wyniki
- Skuteczna identyfikacja małych cząsteczek, które modulują funkcję limfocytów.
- Wykazano przystosowanie testu do odkrywania leków.
- Zapewniono wgląd w mechanizmy aktywacji limfocytów.
- Ustalono niezawodną metodę dla przyszłych badań immunologicznych.
Wnioski
- Test oparty na fluorescencji jest obiecującym narzędziem w badaniach immunologicznych.
- Może ułatwić odkrywanie nowych immunomodulujących leków.
- Badanie przyczynia się do głębszego zrozumienia biologii limfocytów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput phenotypic screening of lymphocyte activation using a fluorescence-based assay enables rapid identification of immunomodulatory small molecules without a predefined target hypothesis. This platform supports early-stage drug discovery in immunology and transplantation by providing quantitative, scalable readouts of T and B cell responses. The assay's adaptability and throughput position it as a critical tool for portfolio triage and mechanistic de-risking in immunomodulator pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immunomodulatory hypotheses in primary lymphocytes using functional readouts.
- Supports biological de-risking by quantifying activation and inhibition across diverse compound libraries.
- Facilitates predictive confidence in target-agnostic screening for novel immune modulators.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative GFP-based outputs for high-throughput compound evaluation.
- Ensures reproducibility and scalability through automated confocal imaging and multi-well formats.
- Prepares validated cellular systems for downstream mechanistic or secondary assays.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant immune pathways by modeling T and B cell activation in vitro.
- Provides continuity from phenotypic screening to in vivo validation of immunomodulatory hits.
- Enables risk-adjusted advancement of candidates based on functional immune modulation profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence-based lymphocyte assay integrates at the early discovery and lead identification stages, bridging phenotypic screening with mechanistic follow-up and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-free screening and pathway clarification in immune cell activation.
- Screening: Offers robust, quantitative readouts for high-throughput evaluation of thousands of compounds.
- Analytics: Provides GFP intensity measurements to compare activation states and identify modulators.
- Translational Research: Facilitates selection of candidates for further in vitro and in vivo immunological studies.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various immune cell types and compound libraries for broad portfolio application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immunomodulator discovery.
- Operational Value: Standardizes and accelerates screening workflows with scalable, reproducible outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early functional triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunomodulatory candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary lymphocyte isolation and high-content fluorescence imaging.
- Needs access to automated confocal screening platforms and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell preparation and assay conditions.
- Adaptable to different immune cell subtypes and compound libraries with protocol optimization.
- Dependent on robust cell viability and activation controls for reliable data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Generation of Splenocyte Cell Suspension from Nur77GFP Mouse Spleens
2:07
T Cell Isolation from the Splenocyte Cell Suspension
3:26
T-cell Activation and the Induction of GFP Expression
4:42
High Throughput Screening of Small Molecule
6:05
Results: T and B Cell Receptors Activation Flowcytometry Results and a Representative T Cell HTS of Smal Molecules
7:56
Conclusion
