Name: Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj test limfocytów oparty na fluorescencji do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek. Ta metoda umożliwia identyfikację nowych immunomodulatorów przy użyciu myszy transgenicznej Nurr77 GFP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze Merck Frosst Start-up dostarczone przez Université de Montréal. Chcielibyśmy podziękować doktorom Jean Duchaine i Dominicowi Salois z platformy wysokoprzepustowej w Instytucie Badań nad Immunologią i Rakiem za dyskusję, komentarze i informacje zwrotne. Moutih Rafei posiada nagrodę Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior 1 Award.

Wszystkie protokoły dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Université de Montréal. Myszy były poddawane eutanazji poprzez stopniowe wdychanieCO2, aż do momentu, gdy nie zaobserwowano żadnych parametrów życiowych, po czym nastąpiło zwichnięcie szyjki macicy. Procedura została przeprowadzona przez certyfikowaną osobę, aby zapewnić, że zwierzęta zostały poddane eutanazji w sposób humanitarny i zgodnie z zaleceniami Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.
1. Przygotowanie pożywki splenocytów i buforu cytometrycznego przepływowego
<ol>
	<li>Wykonaj wszystkie czynności pod okapem biologicznym oczyszczonym w 70% etanolem.</li>
	<li>Wyjmij 70 ml wstępnie podgrzanego podłoża Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x (dostępnego w handlu i dostarczanego w przefiltrowanych sterylnych butelkach o objętości 500 ml) i umieść w sterylnej probówce. Usunięte medium zostanie użyte w dalszej części protokołu.</li>
	<li>Uzupełnij pozostałe 430 ml RPMI 1640 1x 50 ml inaktywowanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml HEPES, 5 ml aminokwasów endogennych, 5 ml pirogronianu sodu i 0,05 ml przefiltrowanego (1M) 2-merkaptoetanolu. 
	UWAGA: Wstępnie podgrzej pożywkę splenocytową za pomocą łaźni wodnej ustawionej na 37 ºC, aby uniknąć szoku cieplnego komórek. Jest to ważne, aby uniknąć indukcji apoptozy komórkowej.</li>
	<li>Aby przygotować bufor do cytometrii przepływowej, dodać 2 ml FBS do 98 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i przechowywać w lodówce do czasu użycia (najlepiej w ciągu trzech dni).</li>
</ol>
2. Wytwarzanie zawiesiny komórek splenocytów ze śledziony myszy Nur77GFP
<ol>
	<li>A septycznie odizolować śledzionę od 6-8 tygodniowej samicy myszy Nur77GFP.
	<ol>
		<li>Aby to osiągnąć, pracuj pod sterylnym kapturem. Namocz ofiarowane futro myszy, nożyczki i kleszcze w 70% etanolu.</li>
		<li>Połóż mysz na prawym boku, przetnij skórę i mięśnie w lewym górnym kwadrancie brzucha. Sprawdź obszar nacięcia, aby widocznie zlokalizować śledzionę, a następnie ją wytnij. Trzymaj śledzionę w podłożu splenocytowym na lodzie, aż będzie gotowa do wykonania następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić śledzionę (śledziony) na 10-centymetrowej szalce Petriego z2 kulturami komórkowymi zawierającej 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki ze splenocytów.</li>
	<li>Rozgnieść śledzionę za pomocą sterylnego tłoka strzykawki, aż roztwór stanie się mętny. Macierz kolagenowa śledziony powinna pozostać do końca zabiegu.</li>
	<li>Po intensywnym zacieraniu w pożywce splenocytowej zebrać zawiesinę komórek i przepuścić ją przez sitko o wielkości 70 μm umieszczone na probówce o pojemności 50 ml w celu odfiltrowania wszelkich zanieczyszczeń lub skrzepów.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 min. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w 2-3 ml wyprodukowanego we własnym lub komercyjnym buforze do lizy krwinek czerwonych. Po pipetowaniu (2-3 razy) odstawić zawiesinę na 20-30 sekund.</li>
	<li>Dodać 5 ml PBS lub odpowiedniego wybranego buforu, a następnie odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 500 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant (powinien być koloru czerwonego, ponieważ zawiera lizowane krwinki czerwone) i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki splenocytowej.</li>
	<li>Za pomocą hemocytometru policz liczbę komórek wybarwionych błękitem trypanowym, aby odróżnić komórki żywe od martwych (martwiczych).</li>
</ol>
3. Izolacja limfocytów T z zawiesiny komórek splenocytów
<ol>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut przy 500 x g. Ponownie zawiesić komórki w pożywce RPMI bez surowicy (50 ml od kroku 1.3), aby uzyskać stężenie komórkowe 10 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml i odłożyć na bok 100 μl podwielokrotności splenocytów w celu oceny/porównania czystości na końcu etapu oczyszczania.</li>
	<li>Dodać normalną surowicę szczura do zawiesiny komórkowej w stężeniu 50 μl / ml, a następnie koktajl przeciwciał izolujących limfocyty T (50 μl / ml).</li>
	<li>Wymieszaj zawiesinę komórkową i odstaw na 10 minut. Ten krok pozwala koktajlowi przeciwciał związać wszystkie niechciane komórki.</li>
	<li>Dodaj szybkie kulki streptawidyny (kulki magnetyczne) na 2,5 minuty, a następnie doprowadź objętość do 2,5 ml za pomocą pożywki bez surowicy.</li>
	<li>Umieść rurkę w magnesie izolującym komórki na 3 minuty.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę limfocytów T do nowej rurki polistyrenowej, przytrzymując magnes i wylewając roztwór jednym ruchem. 
	UWAGA: Wyizolowana zawiesina zawiera oczyszczone limfocyty T. Wszystkie niechciane komórki są trzymane z boku rurki związane z magnetycznymi kulkami streptawidyny.</li>
	<li>Policz wyizolowane limfocyty T za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. 
	UWAGA: Na tym etapie czystość wyizolowanych limfocytów T można zweryfikować (opcjonalnie), analizując procent zdarzeń CD3 + przed i po izolacji limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej. 13
	<ol>
		<li>Krótko odwirować 1 ml zawiesiny komórek splenocytu o stężeniu 500 x g. Odrzucić supernatant i zawiesić komórki w buforze cytometrii przepływowej w stężeniu 1 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Dodaj znakowane fluorescencyjnie przeciwciało anty-mysie CD3 w stężeniu 1:100. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Przemyć raz, odwirować i ponownie zawiesić w buforze cytometrii przepływowej (400 μl) w celu analizy metodą cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Izolacja komórek B z zawiesiny komórek splenocytów
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z tym samym protokołem, jak opisano dla limfocytów T (kroki 3.1-3.8), ale przy użyciu zestawu do izolacji komórek B. Do oceny czystości należy użyć przeciwciała CD19 zamiast przeciwciała CD3.13
	<ol>
		<li>Do oceny czystości (opcjonalnie) należy użyć przeciwciała CD19 zamiast przeciwciała CD3. Odwirować 1 ml zawiesiny komórek splenocytu przy 500 x g. Odrzucić supernatant i zawiesić komórki w buforze cytometrii przepływowej o stężeniu 1 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Dodać znakowane fluorescencyjnie przeciwciało anty-mysie CD19 o stężeniu 1:100 i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Przemyć raz, odwirować i ponownie zawiesić w buforze cytometrii przepływowej (400 μl) w celu analizy za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Aktywacja limfocytów T i indukcja ekspresji GFP
<ol>
	<li>Zasiać limfocyty T w zawiesinie na okrągłodennej 96-dołkowej płytce o stężeniu 2,5 x 105 komórek/dołek.</li>
	<li>Dodaj rekombinowaną interleukinę (IL)-7 w stężeniu 2 ng/ml i kulki magnetyczne CD3/CD28 (25 μl/106 komórek). Utrzymuj część limfocytów T niepotraktowaną kulkami, aby służyła jako kontrola negatywna dla późniejszych pomiarów, które reprezentują nieaktywowane limfocyty T.</li>
	<li>Dwanaście godzin później zbierz limfocyty T z 96-dołkowej płytki, delikatnie pipetując zawiesinę komórek w każdym dołku w górę iw dół, aby rozbić wszelkie kompleksy/agregaty komórek koralikowych. Zebrać zawiesinę ze wszystkich studzienek do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Umieść probówkę zawierającą zawiesinę w tym samym magnesie izolacyjnym komórek, który był wcześniej używany do oczyszczania komórek T lub B i pozwól jej odpocząć przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę limfocytów T do nowej rurki polistyrenowej, przytrzymując magnes i wylewając roztwór jednym ruchem.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w świeżym pożywce splenocytowej, aby uzyskać stężenie 2 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Oceń intensywność ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej (opcjonalnie do kontroli jakości) po 12 do 24 godzinach od stymulacji w porównaniu z nieaktywowanymi limfocytami T. 12 
	UWAGA: Fluorescencja GFP jest nieodłączna od limfocytów TNur77 GFP i objawia się po pomyślnej aktywacji TCR. 12</li>
	<li>W celu oceny żywotności i aktywacji (opcjonalnie) za pomocą mikroskopii, wybarwić aktywowane komórki preparatem Hoechst 30 minut przed analizą w stężeniu 0,2 μg/ml. Dodać odpowiednią objętość zawiesiny komórek do szkiełka nakrywkowego lub do studzienki płaskodennej, czarnościennej płytki 384-dołkowej i zbadać pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu oceny żywych komórek. Martwe komórki nie zachowają barwienia jądrowego. 14</li>
</ol>
6. Aktywacja komórek B i indukcja ekspresji GFP
<ol>
	<li>Używając kolby hodowlanej T-25, ponownie zawiesić wyizolowane limfocyty B w ilości 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Dodać anty-mysie IgG/IgM (H+L) w stężeniu 10 μL/ml i rekombinowany CD40L w stężeniu 200 ng/ml. Utrzymuj część limfocytów B niepoddanych działaniu substancji, aby służyła jako kontrola ujemna do późniejszych pomiarów (reprezentujących nieaktywowane limfocyty B).</li>
	<li>Oceń intensywność ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej po 12 lub 24 godzinach od stymulacji w porównaniu z nieaktywowanymi limfocytami B. 
	UWAGA: Fluorescencja GFP jest nieodłączna od limfocytów BNur77 GFP i objawia się po pomyślnej aktywacji BCR. 12</li>
	<li>W celu oceny żywotności i aktywacji (opcjonalnie) za pomocą mikroskopii, aktywowane komórki należy wybarwić Hoechst 30 minut przed analizą w stężeniu 0,2 μg/ml. Dodać odpowiednią objętość zawiesiny komórek do szkiełka nakrywkowego lub do studzienki płaskodennej, czarnościennej płytki 384-dołkowej i zbadać pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu oceny żywych komórek. Martwe komórki nie zachowają barwienia jądrowego. 14</li>
</ol>
7. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe małych cząsteczek
<ol>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek o stężeniu 2 x 106 komórek/ml aktywowanych limfocytów T lub B (kulki magnetyczne lub przeciwciała/CD40L) lub grup nieaktywowanych.</li>
	<li>Umieść 75 000 komórek/basenik na płytce 384-dołkowej (objętość 40 μl). Użyj płaskodennej, czarnej płytki 384-dołkowej lub szkiełka mikroskopowego do oceny żywotności i aktywacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (opcjonalny etap kontroli jakości przed HTS) przy użyciu barwienia Hoechst (szczegółowe informacje znajdują się w krokach 5.8 i 6.4). 14</li>
	<li>Ręcznie lub za pomocą automatycznego systemu dodaj wybrane leki (rozpuszczone w 0,5% DMSO) do każdej studzienki.</li>
	<li>Dodać nośnik (DMSO) do dodatnich (aktywowanych) i ujemnych (nieaktywowanych) studzienek kontrolnych. Dostosuj stężenie DMSO do maksimum 0,5%.</li>
	<li>Inkubować płytki przez 24 godziny (lub wybrany czas inkubacji) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>W dniu badania przesiewowego rozcieńczyć roztwór barwienia Hoechst 33342 (1:3,333; np. dodać 10 μl do komórek w płytkach 384-dołkowych, aby uzyskać całkowitą objętość do 50 μl). Barwienie 30 minut przed analizą GFP poprzez dodanie roztworu Hoechsta do uzyskania stężenia 0,2 μg/ml.</li>
	<li>Delikatnie pipetować komórki w górę i w dół, aby uzyskać jednorodny rozkład w każdym dołku. 
	UWAGA: Ten krok jest ważny w przypadku dozowania leków (krok 7.3) przy użyciu systemu automatycznego, ponieważ komórki mają tendencję do gromadzenia się po jednej stronie studzienki, przeciwnej do kierunku przepływu.</li>
	<li>Wirować płytki w temperaturze 45 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pozostaw talerze na 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wykonaj odczyt płytki (płytek) za pomocą automatycznego systemu konfokalnego badania przesiewowego o wysokiej zawartości (HCS). 15 Załaduj płytę do maszyny. Ustaw obiektyw na powiększenie 40x lub większe. Użyj kamery #4 dla Hoechst (lampa UV) i kamery #1 dla GFP (laser 488). Ustaw maszynę tak, aby odczytywała 6-10 pól na dołek. Wyreguluj maszynę tak, aby wykonywała dwa sekwencyjne odczyty na pole przy 488 nm (do odczytu GFP) i świetle UV (do odczytu Hoechst). Ustaw obiektyw na powiększenie 40x lub większe. 
	UWAGA: System jest mikroskopem komputerowym, który nie wymaga żadnych regulacji. Odległość ogniskowa, intensywność padającego światła i czas ekspozycji są ustawiane automatycznie przez maszynę.</li>
</ol>

<ol><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+were+new+medicines+discovered%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).</li>
<li>Macarron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).</li>
<li>Lokey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+chemical+genetics%3A+progress+and+obstacles+on+the+path+to+a+new+pharmacopoeia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia.</a> Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).</li>
<li>Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoproteomics-driven+drug+discovery%3A+addressing+high+attrition+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates.</a> Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).</li>
<li>Pruss, R. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20942792">Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).</li>
<li>St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+chemical+genetics+in+yeast+for+discovery+of+chemical+probes+targeting+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism.</a> Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).</li>
<li>Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case+study%3A+impact+of+technology+investment+on+lead+discovery+at+Bristol-Myers+Squibb%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb.</a> Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Walters, W. P., Namchuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+screens%3A+how+to+make+your+hits+a+hit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Designing screens: how to make your hits a hit.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).</li>
<li>Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+screens+as+a+renewed+approach+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery.</a> Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).</li>
<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).</li>
<li>Moran, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+signal+strength+in+Treg+and+iNKT+cell+development+demonstrated+by+a+novel+fluorescent+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse.</a> J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).</li>
<li>Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Glycosphingolipid+Expression+in+Mouse+Lymphoid+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues.</a> J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+estimation+of+DNA+and+RNA+content+in+intact+cells+stained+with+hoechst+33342+and+pyronin+Y%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y.</a> Cytometry. 2, 143-150 (1981).</li>
<li>Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening%3A+seeing+is+believing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High content screening: seeing is believing.</a> Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).</li>
<li>An, W. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19347618">Fluorescence-based assays.</a> Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).</li>
<li>Kishimoto, H., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+TCR+ligation+without+costimulation+causes+rapid+onset+of+Fas-dependent+apoptosis+of+naive+murine+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells.</a> J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).</li>
<li>Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-7+mediates+the+homeostasis+of+naive+and+memory+CD8+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo.</a> Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).</li>
<li>Jiang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+IL-7%2C+a+key+lymphotrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).</li>
<li>Koenen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutually+exclusive+regulation+of+T+cell+survival+by+IL-7R+and+antigen+receptor-induced+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals.</a> Nat Commun. 4, 1735(2013).</li>
<li>Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+4+%28IL-4%29+or+IL-7+prevents+the+death+of+resting+T+cells%3A+stat6+is+probably+not+required+for+the+effect+of+IL-4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4.</a> J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).</li>
<li>Hawkins, C. J., Vaux, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+Bcl-2+family+of+apoptosis+regulatory+proteins+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system.</a> Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).</li>
<li>Sumantran, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+chemosensitivity+assays%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular chemosensitivity assays: an overview.</a> Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).</li>
<li>Huh, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18304834">A cell-based system for screening hair growth-promoting agents.</a> Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).</li>
<li>Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR+signal+transduction%3A+opening+the+black+box%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TCR signal transduction: opening the black box.</a> J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).</li>
<li>Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+costimulation+prevents+cell+death+during+primary+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation.</a> J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).</li>
<li>Michels, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+selection+of+small+molecules+to+alter+allele-specific+MHC+class+II+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation.</a> J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wykorzystano kilka metod odczytu w celu opracowania czułych i wiarygodnych testów HTS. Należą do nich metody kolorymetryczne, luminescencyjne czy fluorescencyjne. Chociaż metody kolorymetryczne są proste do skonfigurowania, wymagają wielokrotnego dodawania substancji chemicznych, które mogą zakłócać lub zakłócać działanie badanych komórek. 23 Ponadto nie pozwalają one na dynamiczną ocenę odpowiedzi biologicznej, ponieważ skutek farmakologiczny jest oceniany na podstawie określonego punktu końcoweg...

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS) to sprawdzona strategia powszechnie stosowana do identyfikacji nowych cząsteczek terapeutycznych lub do repozycjonowania leków zatwierdzonych przez FDA w nowych wskazaniach medycznych. 1 Jak dotąd, osiągnięty sukces HTS może być mierzony przez mnogość wcześniej odkrytych leków. Na przykład inhibitor kinazy tyrozynowej lapatynib stosowany w leczeniu raka piersi, sitagliptyna; inhibitor dipeptydylopeptydazy-4 (DPP-4) stosowany jako lek przeciwhiperglikemiczny oraz doustny inhibitor kinazy tyrozynowej Bcr-Abl dazatynib stosowany w leczeniu przewlekłej białaczki szpikowej to tylko kilka przykładów z długiej listy zatwierdzonych leków pierwotnie odkrytych przez HTS. 2 Chociaż produktywność przemysłu farmaceutycznego ostatnio ucierpiała z powodu braku odkryć nowych substancji chemicznych, prawdopodobieństwo udanego odkrycia leku można zwiększyć poprzez zwiększenie liczby kandydatów przedklinicznych wykazujących modulacyjne właściwości biologiczne/biochemiczne. W związku z tym opracowanie nowych testów HTS dostosowanych do fenotypowych badań przesiewowych może potencjalnie dostarczyć ważnych narzędzi farmakologicznych do odkrywania nowych leków. 3,4,5,6 Co więcej, HTS może być teraz wykonywany w szybszym tempie ze względu na znaczące przemiany technologiczne w ostatnich latach, w tym specjalnie zaprojektowane elastyczne instalacje robotyczne, nowatorskie technologie odczytu i rozległą miniaturyzację. 2,7 Jednym z czynników przyczyniających się do rosnącego zainteresowania stosowaniem fenotypowych badań przesiewowych (aka farmakologii przyszłościowej) jest przekonanie, że skupienie się na efektach funkcjonalnych, a nie na nadmiernie uproszczonych redukcjonistycznych założeniach dotyczących celów molekularnych (badania przesiewowe oparte na celu/reakcje biochemiczne) ma większe szanse na wykazanie skuteczności klinicznej. W związku z tym fenotypowe badania przesiewowe dają nadzieję na odkrycie nowych potencjalnie terapeutycznych związków i szlaków molekularnych obecnie nieuleczalnych chorób. 2
Aby poprawnie zidentyfikować inhibitory lub aktywatory dla danego celu molekularnego lub funkcji komórkowej, wymagany jest bardzo czuły i wiarygodny test w celu odróżnienia prawdziwych trafień od wyników fałszywie dodatnich. Co więc sprawia, że test jest dobry? Jakość danego testu musi być najpierw oceniona na podstawie stosunku sygnału do szumu (odzwierciedlonego przez współczynnik Z). 8 Po drugie, docelowy efekt lub cel ekranu powinien być jasno określony. Na przykład funkcjonalne podejścia oparte na komórkach mogą przynieść znaczące korzyści w zakresie badań przesiewowych receptorów w przeciwieństwie do testu zaprojektowanego specjalnie do oceny wiązania liganda z receptorem. Powodem tego jest to, że to drugie podejście nie pozwala na rozróżnienie ligandów agonistycznych i antagonistycznych. 9 W przeciwieństwie do tego, podejście oparte na komórkach może być prawdopodobnie bardziej skuteczne, ponieważ funkcja receptora może być bezpośrednio oceniana w fenotypie biologicznym (proliferacja, zatrzymanie cyklu komórkowego, apoptoza i/lub różnicowanie). Należy jednak zauważyć, że testy biochemiczne mogą zapewnić znaczące korzyści w porównaniu z testami fenotypowymi, ponieważ naruszają określony cel wewnątrzkomórkowy. Dobrze zoptymalizowany test biochemiczny będzie na ogół miał mniejsze rozproszenie danych niż fenotypowe badanie przesiewowe, jednocześnie upraszczając późniejsze badania związane z molekularnym mechanizmem działania leku. Jednak główną wadą testów opartych na celach lub biochemicznych jest szansa na zwiększenie liczby wyników fałszywie dodatnich, które mogą wpływać na cele niespecyficzne podczas testowania w systemie biologicznym (utrata swoistości pierwotnie badanej w teście biochemicznym). 10 Chociaż dobrze ustalony punkt odcięcia między negatywnymi i pozytywnymi trafieniami może zminimalizować liczbę wyników fałszywie dodatnich w pierwotnym badaniu przesiewowym, użycie fizjologicznie odpowiedniego systemu naśladującego natywne środowisko komórkowe, takie jak nienaruszone komórki, cała tkanka lub całe zwierzę, pozostaje rdzeniem wahadła projektu testu. W związku z tym fenotypowe badania przesiewowe umożliwiają odkrycie wiodącego o pożądanych skutkach biologicznych/fenotypowych w przypadku chorób bez zidentyfikowanych celów leków, bez wcześniejszej wiedzy na temat aktywności lub sposobu działania związku.11
Niniejsze badanie dotyczy rozwoju i testowania zoptymalizowanego i powtarzalnego fenotypowego badania przesiewowego opartego na dwóch ważnych komponentach: komercyjnie dostępnym modelu myszy i zgrupowanej podrodzinie związków chemicznych. W odniesieniu do modelu zwierzęcego test opiera się na wykorzystaniu limfocytów pochodzących ze szczepu myszy (Nur77GFP) zawierającego sztuczny chromosom bakteryjny zawierający kasetę, w której ekspresja białka zielonej fluorescencji (GFP) jest sterowana przez promotor Nur77. 12 Cechą charakterystyczną tej stymulacji jest fakt, że Nur77 jest natychmiastowym wczesnym genem, który uległ regulacji w górę po stymulacji receptora limfocytów T (TCR) lub receptora komórek B (BCR). 12 Jeśli chodzi o samą metodę przesiewową, zastosowano podejście, które pomogło uniknąć przesiewania trywialnych analogów, jednocześnie minimalizując czas potrzebny na ocenę dużej biblioteki chemicznej (>105 związków). W tym celu wykorzystano bazę danych związków chemicznych wybranych przez chemików medycznych za pomocą wirtualnych narzędzi przesiewowych w celu zidentyfikowania topologicznie podobnych związków na podstawie znanych aktywnych struktur nasiennych jako punktów odniesienia. Takie podejście pozwoliło nam na przebadanie przesiewowe 4 398 związków reprezentujących ogólną bibliotekę ponad 136 000 jednostek chemicznych.

<table><tbody><tr><td>Myszy Nur77GFP</td><td>Szczep myszy Jackson Laboratory</td><td>nr 016617</td><td>W naszym zakładzie dla zwierząt założono kolonię domową&nbsp;</td></tr><tr><td>96 płytek hodowlanych basen-U, sterylna</td><td>aktywacja limfocytów T</td><td>VWR International</td><td>10062-902</td> za pomocą kulek magnetycznych</tr><tr><td>70 &micro; m sitko komórkowe, sterylne</td><td>Corning Inc.</td><td>352350</td><td>Generacja zawiesiny komórek splenocytów</td></tr><tr><td>5 ml polistyrenowe probówki z okrągłym dnem, sterylne</td><td>Corning Inc.</td><td>352058</td><td>Generacja zawiesiny komórek splenocytów</td></tr><tr><td>50 ml polipropylenowe stożkowe probówki, sterylne</td><td>VWR International</td><td>89039-656&nbsp;</td><td>Wytwarzanie zawiesiny komórkowej splenocytów</td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml bez igły, sterylna</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305482</td><td>Do zacierania kolby hodowlanej śledziony</td></tr><tr><td>T-25</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690 175</td><td>Do inkubacji limfocytów B podczas aktywacji</td></tr><tr><td>5 ml naczynie do hodowli komórkowych, sterylne</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627 160</td><td>Do zacierania śledziony</td></tr><tr><td>Penicylina- Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>WISENT Inc.</td><td>450-200-EL&nbsp; &nbsp;</td><td>Składnik pożywki splenocytów</td></tr><tr><td>RPMI 1600 z wodorowęglanem sodu i L-glutaminą</td><td>WISENT Inc.</td><td>350-002-CL&nbsp;</td><td>Składnik pożywki splenocytów</td></tr><tr><td>MEM aminokwasy endogenne</td><td>WISENT Inc.</td><td>321-010-EL&nbsp;</td><td>Składnik pożywki splenocytów</td></tr><tr><td>Kwas wolny od HEPES 1 M</td><td>WISENT Inc.</td><td>330-050-EL&nbsp;</td><td>Składnik pożywki splenocytów</td></tr><tr><td>Roztwór pirogronianu sodu (100mM)</td><td>WISENT Inc.</td><td>600-110-EL&nbsp;</td><td>Składnik pożywki splenocytów</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)&nbsp;</td><td>WISENT Inc.</td><td>080-910&nbsp;</td><td>Składnik pożywki splenocytowej i buforu cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>WISENT Inc.</td><td>311-010-CL</td><td>Składnik buforu</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanolu (55 mM)</td> do cytometrii <td>przepływowejThermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td> Składnik zestawu do izolacji komórek T <td>splenocytów</td></tr><tr><td></td><td>Stemcell Technologies</td><td>19851</td><td>Do izolacji limfocytów T</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji komórek B</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19854</td><td>Do izolacji limfocytów B</td></tr><tr><td>Mysi aktywator T CD3/CD28 superparamagnetyczny koraliki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11452D</td><td>Do aktywacji limfocytów T&nbsp;</td></tr><tr><td>Magnes do izolacji komórek</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td>Do izolowania limfocytów T i usuwania kulek magnetycznych&nbsp;</td></tr><tr><td>AffiniPure F(ab')2 Fragment kozła anty-mysia IgG + IgM (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>115-006-068</td><td>Do stymulacji limfocytów B</td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17&nbsp;</td><td>Aby wspomóc przeżycie limfocytów T podczas aktywacji</td></tr><tr><td>Rekombinowany CD40L</td><td>R& D Systems</td><td>8230-CL/CF</td><td>Do stymulacji limfocytów B</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD3</td><td>BD Pharmingen</td><td>561799</td><td>Do barwienia limfocytów T do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD19</td><td>BD Pharmingen</td><td>553786</td><td>Do barwienia limfocytów B do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Biomek FXp</td><td>PerkinElmer Inc.</td><td>A31842</td><td>Aby ponownie zawiesić komórki po 24-godzinnej inkubacji</td></tr><tr><td>System badań przesiewowych o wysokiej zawartości Opera Phenix</td><td>PerkinElmer Inc.</td><td>HH14000000</td><td>Do analizy sygnału GFP/Hoechst</td></tr></tbody></table>

test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS) są obecnie podstawą identyfikacji jednostek chemicznych zdolnych do modulowania reakcji biochemicznych lub procesów komórkowych. Wraz z postępem biotechnologii i wysokim potencjałem translacyjnym małych cząsteczek rozwinęło się wiele innowacyjnych podejść do odkrywania leków, co tłumaczy odradzające się zainteresowanie wykorzystaniem HTS. Dziedzina onkologii jest obecnie najbardziej aktywnym obszarem badań przesiewowych leków, przy czym nie dokonano żadnego znaczącego przełomu w identyfikacji nowych związków immunomodulujących ukierunkowanych na powikłania związane z przeszczepem lub dolegliwości autoimmunologiczne. W tym miejscu przedstawiamy nowatorski test limfocytów na bazie mysiej fluorescencji in vitro, który można łatwo dostosować do identyfikacji nowych związków immunomodulujących. Ten test wykorzystuje limfocyty T lub B pochodzące od transgenicznej myszy, w której promotor Nur77 napędza ekspresję GFP po stymulacji receptora komórek T lub B. Ponieważ intensywność GFP odzwierciedla aktywację/aktywność transkrypcyjną komórki docelowej, nasz test definiuje nowe narzędzie do badania wpływu danego związku (związków) na odpowiedzi komórkowe/biologiczne. Na przykład, przeprowadzono pierwotne badanie przesiewowe przy użyciu 4 398 związków przy braku "hipotezy docelowej", co doprowadziło do zidentyfikowania 160 potencjalnych trafień wykazujących aktywność immunomodulacyjną. W związku z tym zastosowanie tego testu jest odpowiednie dla programów odkrywania leków, które badają duże biblioteki chemiczne przed dalszymi badaniami walidacyjnymi in vitro/in vivo.

Projektowanie testu HTS
Podczas projektowania opisanego tutaj testu fluorescencyjnego wzięto pod uwagę dwa istotne czynniki. Po pierwsze, konieczne było odtworzenie warunków fizjologicznych, w których aktywacja limfocytów T lub B reprezentowałaby stan chorobowy (np. choroba przeszczep przeciw gospodarzowi). Po drugie, ocena aktywacji komórkowej powinna zostać przeprowadzona przy użyciu czułej i ilościowej metody. Obecnie f...

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Ogólnym celem tego fluorescencyjnego testu limfocytów jest zidentyfikowanie nowych małocząsteczkowych immunomodulatorów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii dotyczące mechanizmu aktywacji i inhibicji limfocytów. Główną zaletą tego testu funkcji fenotypowej jest możliwość jego adaptacji na potrzeby odkrywania leków.Procedurę zademonstruje Ahmed Fouda, doktorant z naszego laboratorium. Pod sterylną komorą z przepływem laminarnym należy zdezynfekować futro samicy myszy Nurr77 GFP w wieku od sześciu do ośmiu tygodni za pomocą 70% ethanol, a następnie położyć zwierzę na prawym boku. Następnie należy wykonać nacięcie skóry i mięśni w górnym lewym kwadrancie jamy brzusznej, zlokalizować i wyciąć śledzionę, a tkankę umieścić w pożywce do splenocytów na lodzie.Po pobraniu wszystkich śledzion uchyla tkanki do naczynia hodowlanego o wymiarach 10 cm², zawierającego 5 mL podgrzanego medium do splenocytów, a następnie za pomocą sterylnego tłoka strzykawki rozetrzyj tkanki do momentu, aż roztwór stanie się mętny. Po dokładnym rozcieraniu w medium do splenocytów przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm do probówki o pojemności 50 mL w celu usunięcia zanieczyszczeń, a następnie odwiruj otrzymaną zawiesinę pojedynczych komórek. Osad resuspenduj w 2–3 mL buforu do lizy erytrocytów, zatrzymując reakcję poprzez dodanie 5 mL RPMI lub innego odpowiedniego buforu po 20–30 sekundach.Następnie zebrać komórki poprzez ponowną wirowkę i zawiesić osad w 2 ml medium dla splenocytów w celu policzenia komórek. Aby wyizolować limfocyty T, ponownie odwirować komórki i zawiesić osad w medium RPMI bez surowicy w stężeniu 1 × 10⁷ komórek/ml. Przenieść komórki do polistyrenowej probówki o pojemności 5 ml i odłożyć alikwot 100 µl splenocytów do późniejszej oceny czystości.Następnie do komórek należy dodać 50 µL na ml normalnej surowicy szczura, a potem 50 µL na ml koktajlu przeciwciał do izolacji limfocytów T, delikatnie mieszając. Po 10 minutach inkubować komórki z magnetycznymi kuleczkami sprzężonymi ze streptawidyną przez dwie i pół minuty. Następnie dodać do komórek pożywkę bezzsypkową do uzyskania końcowej objętości 2,5 ml i umieścić probówkę w magnesie do izolacji komórek na trzy minuty.Po zakończeniu inkubacji, trzymając probówkę w magnesie, jednym ruchem przelej nadsącz do nowej probówki polistyrenowej. Następnie można przystąpić do policzenia limfocytów T. Wysiej limfocyty T do płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem w stężeniu 2,5 × 10⁵ komórek na dołek, zawierający 200 µL świeżej pożywki do splenocytów na dołek.Dodaj rekombinowaną interleukinę 7 oraz magnetyczne kuleczki CD3/CD28 do odpowiednich dołków i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 12 godzinach delikatnie zhomogenizuj zawiesinę komórkową w każdym dołku, aby rozbić wszelkie agregaty komórkowo-kuleczkowe. Następnie przenieś zawiesiny komórkowe z każdego dołka do oddzielnych pięciomililitrowych probówek polistyrenowych.Po zebraniu wszystkich komórek każdą probówkę z komórkami należy umieścić w magnesie separacyjnym na pięć minut, a następnie, gdy probówka wciąż znajduje się w magnesie, zlać naddatki do nowych probówek polistyrenowych po każdym etapie inkubacji. Następnie komórki należy zebrać poprzez wirowanie i resuspendować osady w świeżej pożywce do splenocytów do stężenia 2 × 10⁶ komórek/ml. W przypadku wysokoprzepustowego przesiewania małych cząsteczek należy nanieść 40 µL komórek na dołek na płytkę 384-dołkową, a następnie traktować odpowiednie dołki wybranym lekiem lub kontrolą (vehicle) przez wymagany czas inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych.Na 30 minut przed analizą GFP zabarw komórki odpowiednim stężeniem roztworu Hoechst, dokładnie rozprowadzając barwnik poprzez delikatne pipetowanie. Po zabarwieniu wszystkich studni odwiruj płytki, aby zebrać komórki na dnie studni, i pozostaw je na 15 minut w temperaturze pokojowej. Załaduj płytkę zgodnie z instrukcją producenta.Następnie ustaw obiektyw na powiększenie 40X lub wyższe. Skonfiguruj kamerę numer cztery dla lampy UV, a następnie kamerę numer jeden dla lasera 488. Włóż płytkę do systemu wysokoprzepustowego screeningu (HCS).Następnie należy ustawić zautomatyzowany konfokalny system wysokoprzepustowego screeningu (high content screening) na odczyt od sześciu do 10 pól na studzienkę, przy dwóch sekwencyjnych odczytach na pole, przy 488 nanometrach oraz świetle UV. Limfocyty T dodatnie pod kątem CD3 stanowią około 30% danej śledziony mysiej, wykazując 10% podstawowej ekspresji GFP. Po stymulacji receptorów limfocytów T za pomocą kulek CD3/CD28 obserwuje się pięcio- do sześciokrotny wzrost procentowego udziału ekspresji GFP.Podobnie komórki B wykazujące ekspresję CD19 stanowią od 50 do 55% wszystkich splenocytów, przy czym podstawowa ekspresja GFP jest podobna do tej obserwowanej w nieaktywowanych komórkach T. Co ciekawe, stymulacja receptorów komórek B przy użyciu przeciwciał przeciw mysiej IgG, IgM oraz rekombinowanego CD40L wywołuje jedynie niewielki wzrost ekspresji GFP. Po izolacji za pomocą kulek magnetycznych, zgodnie z zaprezentowaną metodą, wyizolowane komórki T wykazujące ekspresję CD3 nadal wykazują 10% podstawowej ekspresji GFP.Stymulacja kuleczkami CD3/CD28 indukuje jednak znaczną upregulację odpowiedzi GFP. Podobnie, po izolacji limfocytów B za pomocą kuleczek magnetycznych, oczyszczone aktywowane limfocyty B wykazują wyższą ekspresję GFP w porównaniu do aktywowanych limfocytów B w splenocytach. W tym reprezentatywnym eksperymencie pierwotny wysokoprzepustowy screening 4398 związków ujawnił kilka aktywatorów i inhibitorów aktywacji limfocytów T.Jednak zaobserwowana ekspresja GFP w stymulowanych limfocytach T była 20-krotnie wyższa niż w limfocytach T niestymulowanych. Pozwala to na stworzenie okna strefy działania, w której związki hamujące GFP mogą zostać łatwo wykryte. Po opanowaniu ta technika może zostać zrealizowana w ciągu 36 do 48 godzin, pod warunkiem jej prawidłowego przeprowadzenia.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o przeliczeniu komórek po każdym etapie. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak ELISA lub western blotting, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania. Technika ta utoruje drogę do odkrywania leków do immunomodulacji u gryzoni.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak izolować i aktywować limfocyty T lub B pochodzące z myszy Nurr77 GFP.

a-fluorescence-based-lymphocyte-assay-suitable-for-high-throughput

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie opisujemy metodę podkreślającą użyteczność testu bioluminescencyjnego do czułych i szybkich badań przesiewowych leków. Leki te mogą być testowane samodzielnie lub w połączeniu w celu oceny synergizmu w ich sposobie działania.

Test oparty na bioluminescencji komórkowej: wysokoprzepustowa metoda kombinatorycznych badań przesiewowych leków

Ten film pokazuje badanie przesiewowe związków immunomodulujących za pomocą testu fluorescencyjnego. Transgeniczne limfocyty T pochodzące od myszy z kasetami ekspresji białek zielonej fluorescencji są traktowane tymi związkami. Wzmocnione i zredukowane sygnały GFP umożliwiają identyfikację odpowiednio stymulującego i hamującego działania związków.

Test oparty na fluorescencji z wykorzystaniem zmodyfikowanych limfocytów do badań przesiewowych związków immunomodulujących

Prezentujemy szybką i tanią metodę przesiewową do identyfikacji regulatorów transkrypcji za pomocą wysokoprzepustowych transfekcji robotycznych i domowego testu lucyferazy o podwójnym świeceniu.  Protokół ten szybko generuje bezpośrednie dane funkcjonalne dla tysięcy genów i można go łatwo modyfikować w celu ukierunkowania na dowolny gen będący przedmiotem zainteresowania.

Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Ten artykuł wykorzystuje test oparty na cytometrii przepływowej do badania bibliotek chemicznych inhibitorów w celu identyfikacji inhibitorów i ich celów, które wpływają na sygnalizację receptora limfocytów T. Opisane tutaj metody można również rozszerzyć o badania przesiewowe o wysokiej przepustowości.

Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

To badanie opracowało test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych przeciwko Mycobacterium abscessus z niedawno stworzonym podwójnym szczepem reporterowym, wykorzystując fluorescencję i luminescencję do szybkiej oceny żywotności bakterii. Protokół ten będzie istotny dla naukowców dążących do badań przesiewowych nowych leków przeciwko tej lekoopornej bakterii.

Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Poznaj test limfocytów oparty na fluorescencji do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek. Ta metoda umożliwia identyfikację nowych immunomodulatorów przy użyciu myszy transgenicznej Nurr77 GFP.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Przeglądaj więcej filmów