Mikroskopia fluorescencyjna w polu lokalnym: obrazowanie sygnałów komórkowych w nienaruszonych sercach
8 marca 2017
W sercu, zdarzenia molekularne koordynują funkcję elektryczną i kurczliwą narządu. Zaprezentowany tu zestaw technik mikroskopii fluorescencyjnej pola lokalnego umożliwia rejestrację zmiennych komórkowych w nienaruszonych sercach. Identyfikacja mechanizmów definiujących czynność serca ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak serce działa w sytuacjach patologicznych.
Ogólnym celem tej techniki obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w polu lokalnym jest wykorzystanie sond molekularnych do pomiaru wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia lub potencjałów błonowych z obszarów serca trudno dostępnych na całym poziomie serca. Ta metoda może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania sercowo-naczyniowe związane z zatrzymaniem akcji serca i niedokrwieniem. Główną zaletą tej techniki jest to, że właściwości serca są mierzone na podstawie zdarzeń komórkowych w nienaruszonym narządzie, w którym komórki nadal są sprzężone elektrycznie, mechanicznie i metabolicznie.
Najpierw przygotuj poziomy aparat Langendorffa. Załaduj świeżo przygotowany roztwór Tyrode do 60-mililitrowych strzykawek i dodaj wszystkie powiązane rurki zestawu. Po napełnieniu wyeliminuj wszystkie pęcherzyki powietrza.
Następnie zrównoważyć załadowany roztwór z czystym gazowym tlenem dostarczonym z zanurzonego plastikowego kamienia napowietrzającego. Następnie umieść niewchłanialny szew chirurgiczny wokół igły. Będzie to służyć jako kaniula do retroperfuzji serca po podłączeniu do aparatu.
Następnie zbierz serce po wstrzyknięciu heparyny i eutanazji zwierzęcia. Najpierw oczyść klatkę piersiową etanolem. Demonstracja odbywa się z myszą, ale ta sama procedura działa w przypadku zbierania serc papużek.
Następnie za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj nacięcie w dolnej części brzucha, a następnie przeciąć boki w kierunku szyi. Następnie ostrożnie rozetnij przeponę, omijając serce. Teraz odciągnij przeciętą tkankę i przypnij ją.
Następnie usuń płuca i otaczające tkanki, aby odsłonić serce. Po odsłonięciu użyj pęsety, aby zgarnąć serce bez jego ściskania. Odłącz go od zwierzęcia, przecinając aortę i pozostaw jak najwięcej aorty przyczepionej do serca.
Następnie załaduj serce do małej łodzi wagowej z jednym mililitrem roztworu Tyrode. Pod mikroskopem preparacyjnym szybko usuń krew i tkankę tłuszczową otaczającą serce za pomocą pęsety i nożyczek. Za pomocą niewchłanialnego szwu chirurgicznego i igły przymocuj aortę do poziomego połączenia aparatu Langendorffa.
Zabezpiecz węzeł za pomocą dwóch cienkich pęset. Następnie rozpocznij retroperfuzję, otwierając zawór, aby uwolnić roztwór Tyrode. Oczyść otaczającą tkankę i odessuj zanieczyszczenia, aby utrzymać poziomą komorę w czystości, podczas gdy serce stabilizuje się przez 10 minut.
Spraw, aby barwnik był świeży. W przypadku Rhod-2 AM dodaj 20 mikrolitrów 20% Pluronic i DMSO do 50-mikrogramowego opakowania barwnika producenta. Mieszać pipetując, unikając pęcherzyków.
Następnie przenieś płynny barwnik do przezroczystej szklanej fiolki i dodaj jeden mililitr roztworu Tyrode. Dokładnie rozpuść barwnik w tej mieszaninie, stosując od 15 do 20 minut sonikacji. Następnie perfaktorię przygotowanego barwnika należy wykonać za pomocą pompy perystaltycznej w temperaturze pokojowej.
Najpierw załaduj barwnik do komory barwienia, a następnie zaciśnij wszystkie przewody rurkowe połączone z kolektorem i trzymaj zaciski nad kolektorem, aby zapobiec cofaniu się. Następnie włącz pompę i natychmiast zamknij zawór trójdrogowy poniżej strzykawki o pojemności 60 mililitrów. Umieść małą rurkę przymocowaną do końcówki ssącej pompy obok serca, aby recyrkulować barwnik po jego perfuzji.
Weź małą igłę manometryczną i ściśnij ją przez wierzchołek, aby zmniejszyć ciśnienie. Następnie pozwól sercu przenikać barwnikiem przez 30 minut. W tym czasie bardzo ważne jest, aby ocenić poziom barwnika, aby pęcherzyki nie dostały się do tkanki, co spowodowałoby niedokrwienie i uszkodzenie tkanek.
Po perfuzji barwnika należy przeprowadzić retroperfuzję serca roztworem Tyrode. Zdejmij clamp nad kolektorem. Otwórz zawór, a następnie pozwól sercu ustabilizować się przez 10 minut.
Podczas retroperfuzji należy napełnić komorę poziomą roztworem Tyrode'a i włączyć jednostkę Peltiera, aby doprowadzić temperaturę kąpieli do 37 stopni Celsjusza. Aby przygotować światło światłowodowe do eksperymentu, najpierw umieść światłowód w dwumililitrowej pipecie. A następnie podłącz pipetę do mikromanipulatora.
Za pomocą mikromanipulatora lekko dociśnij światłowód do powierzchni komory bocznej. Następnie zaprogramuj generator fal tak, aby dostarczał impuls prostokątny o szerokości jednej milisekundy. I ustaw stymulator serca tak, aby był zewnętrznie zsynchronizowany i podłączony do generatora fal.
Na każdym z dwóch wyjść stymulatora przymocuj drut z przylutowaną na końcu igłą do akupunktury. Przymocuj dwie igły do akupunktury do wierzchołka serca, w odległości około trzech milimetrów od siebie. Dopiero po umieszczeniu igieł uruchom stymulator, unikając w ten sposób przypadkowych wstrząsów.
Teraz, aby nagrać sygnał nasierdziowy, dostosuj częstotliwość akwizycji w oprogramowaniu do 10 kiloherców. Aby zebrać sygnał wsierdziowy, postępuj zgodnie z tą samą procedurą, ale użyj igły o rozmiarze 23, aby zrobić otwór w komorze bocznej w pobliżu przegrody. A następnie, za pomocą mikromanipulatora, umieść drugi światłowód w wsierdziu.
Aby uzyskać dostęp do funkcji przezściennej, porównano morfologię potencjałów czynnościowych zarejestrowanych z wsierdzia i nasierdzia. Zapisy fluorescencji wykonano po leczeniu serca di-8-ANEPPS techniką CLFFM. Potencjał czynnościowy był wolniejszy w wsierdziu, szczególnie w fazie pierwszej.
Czas trwania potencjału czynnościowego został opisany jako czas potrzebny do repolaryzacji potencjału czynnościowego do pewnego stopnia. Gdy czasy trwania zostały znormalizowane i przesunięte tak, aby nakładały się na siebie w fazie zerowej, można je było porównać. Rzeczywiście, w pierwszej fazie nastąpiła znacząca różnica.
Następnie Rhod-2 AM wykorzystano do monitorowania wewnątrzkomórkowego wapnia. W celu porównania regionalnych różnic w wewnątrzkomórkowym wapniu oceniono kinetykę przejściowości wapnia. Dla porównania, czas do osiągnięcia szczytu przejściowości był o około dwie milisekundy dłuższy w wsierdziu.
Ogólnie rzecz biorąc, przejściowość wapnia z wsierdzia miała znacznie wolniejszą kinetykę niż nasierdzie. Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do rejestrowania wewnątrzkomórkowej przejściowości wapnia i potencjałów czynnościowych w trudno dostępnych obszarach serca. Część zestawu Langendorffa sprawia, że bardzo praktyczne jest perfuzjowanie różnych substancji chemicznych do serca i ocena wpływu na właściwości serca.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia technikę mikroskopii fluorescencyjnej z lokalnym polem do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów wapnia oraz potencjałów błonowych w sercu. Metoda ta umożliwia badanie funkcji serca w nienaruszonych organach, co jest kluczowe dla zrozumienia takich stanów jak zatrzymanie akcji serca i niedokrwienie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fizjologia układu sercowo-naczyniowego
- Mikroskopia fluorescencyjna
- Techniki obrazowania komórkowego
Wprowadzenie
- Zrozumienie funkcji serca jest niezbędne do walki z chorobami układu krążenia.
- Tradycyjne metody mogą nie zapewniać efektywnego dostępu do wszystkich obszarów serca.
- Mikroskopia fluorescencyjna z lokalnym polem oferuje nowatorskie podejście do badania komórek serca.
- Technika ta pozwala zachować integralność sprzężeń komórkowych w sercu.
Cel badania
- Pomiar wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia oraz potencjałów błonowych w sercu.
- Badanie mechanizmów funkcji serca w warunkach patologicznych.
- Zrozumienie zdarzeń sercowo-naczyniowych, takich jak zatrzymanie akcji serca i niedokrwienie.
Zastosowane metody
- Przygotowanie poziomego aparatu Langendorffa.
- Napełnianie strzykawek roztworem Tyrode’a.
- Usuwanie pęcherzyków powietrza z układu.
- Wykorzystanie sond molekularnych do pomiarów.
Główne wyniki
- Skuteczny pomiar zmiennych komórkowych w nienaruszonych sercach.
- Wykazanie efektywności techniki w dostępie do trudnodostępnych obszarów.
- Pozyskanie wiedzy na temat właściwości elektrycznych i mechanicznych komórek serca.
- Potencjalne zastosowania w zrozumieniu patologii serca.
Wnioski
- Technika lokalnej mikroskopii fluorescencyjnej jest cenna w badaniach nad sercem.
- Metoda ta pogłębia nasze zrozumienie funkcji serca w stanie zdrowia i choroby.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę do uzyskania głębszego wglądu w zdrowie układu sercowo-naczyniowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Lokalna mikroskopia fluorescencyjna pozwala na pomiar stężeń wapnia wewnątrzkomórkowego oraz potencjałów błonowych w nienaruszonych sercach, zachowując sprzężenie komórkowe kluczowe dla zrozumienia niedokrwienia i arytmii. Podejście to wspiera walidację celów terapeutycznych poprzez dostarczanie istotnych fizjologicznie danych z tkanki sprzężonej elektrycznie i mechanicznie, co zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych. Technika ta ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie sygnałów molekularnych z funkcją całego organu w badaniach nad chorobami układu sercowo-naczyniowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar przejściowych zmian stężenia wapnia oraz potencjałów czynnościowych w nienaruszonym mięśniu sercowym w warunkach sprzężenia fizjologicznego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów w systemach istotnych dla przebiegu choroby, w których modele z izolowanych komórek nie oddają dynamiki na poziomie tkankowym.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję związków w portfolio poprzez identyfikację substancji normalizujących kinetykę wapnia wewnątrzkomórkowego w obszarach wsierdziowych i epikardialnych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego screeningu poprzez ustalenie bazowych sygnałów fluorescencji w perfundowanych sercach.
- Wyniki ilościowe: Generuje powtarzalne pomiary kinetyki przejściowych stężeń wapnia oraz czasu trwania potencjału czynnościowego w celu oceny efektu działania związków.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Wspiera skalowalność w modelach gryzoni poprzez perfuzję metodą Langendorffa, umożliwiając spójną akwizycję sygnałów w kaskadach screeningu sercowo-naczyniowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście chorób: Modeluje mechanizmy niedokrwienia i arytmii poprzez monitorowanie regionalnych różnic w gospodarce wapniowej i repolaryzacji w nienaruszonych sercach.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, zachowując sprzężenie elektrotoniczne i metaboliczne podczas interwencji farmakologicznej.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Określa kryteria dalszego rozwoju na podstawie mierzalnych zmian w morfologii potencjału czynnościowego i przejściowym stężeniu wapnia w tkance chorobowej w porównaniu z leczoną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesami badawczymi w obszarze układu sercowo-naczyniowego, od wczesnej analizy celów terapeutycznych po walidację przedkliniczną, wspierając identyfikację związków wiodących poprzez dostarczanie danych o sygnalizacji w kontekście fizjologicznym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez pomiar stężenia wapnia w poszczególnych przedziałach (cytozol przeciwko siateczce sarkoplazmatycznej) oraz potencjału błonowego w nienaruszonej tkance.
- Screening: Dostarcza preparatów gotowych do analizy ze stabilnymi odczytami fluorescencji w celu oceny wpływu związków na elektrofizjologię serca i gospodarkę wapniową.
- Analityka: Zapewnia ilościowe zmienne zależne, w tym czas do osiągnięcia szczytu przejściowego stężenia wapnia, czas trwania potencjału czynnościowego oraz wskaźniki repolaryzacji specyficzne dla danej fazy, co umożliwia porównania międzygrupowe.
- Badania translacyjne: Łączy pomiary molekularne z funkcją całego organu, umożliwiając dopasowanie biomarkerów w przedklinicznych modelach dysfunkcji serca.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny ryzyka sercowo-naczyniowego w różnych obszarach terapeutycznych poprzez standaryzowaną detekcję fluorescencji w układzie Langendorffa.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność w zakresie mechanizmów poprzez korelację sygnałów podkomórkowych z fizjologią całego narządu w modelach chorób układu sercowo-naczyniowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji wprowadzania barwnika, perfuzji oraz pozycjonowania światłowodów w układzie Langendorffa.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez identyfikację wczesnych deficytów elektrofizjologicznych i w gospodarce wapniem przed kosztownymi niepowodzeniami w późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka na podstawie znormalizowanej kinetyki potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercach chorych w porównaniu z sercami poddanymi terapii naprawczej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w zakresie preparowania serca, perfuzji w układzie Langendorffa oraz przygotowywania barwników fluorescencyjnych (np. Rhod-2 AM, di-8-ANEPPS).
- Metoda jest zależna od konfiguracji mikroskopii światłowodowej, generatorów fal do stymulacji oraz systemów akwizycji o wysokiej częstotliwości (10 kHz).
- Konieczna jest międzyfunkcyjna standaryzacja między zespołami fizjologii, obrazowania i farmakologii w celu zapewnienia spójności sygnału.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji dla różnych gatunków (mysz, papuga) oraz obszarów komór (wsierdzie, wsierdzia) podczas pomiaru gradientów transmuralnych.
- Ograniczeniem jest efektywność ładowania barwnika oraz artefakty ruchowe podczas perfuzji, które muszą być kontrolowane, aby uniknąć niedokrwienia lub zakłócenia sygnału.
