Name: Mikroskopia fluorescencyjna w polu lokalnym: obrazowanie sygnałów komórkowych w nienaruszonych sercach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Poznaj mikroskopię fluorescencyjną w polu lokalnym do badania sygnałów komórkowych w nienaruszonych sercach. Ta metoda umożliwia pomiar wapnia wewnątrzkomórkowego i potencjałów błonowych w trudno dostępnych regionach serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Alicii Mattiazzi za krytyczną dyskusję na temat prezentowanej pracy. Praca ta została wsparta grantem z NIH (R01 HL-084487) dla ALE.

Ten protokół i sposób postępowania z myszami został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt UC Merced Institutional Animal Care and Use Committee (nr 2008-201). Eksperymenty z papugami przeprowadzono w 1999 r. zgodnie z ogólnymi zasadami dotyczącymi wykorzystywania zwierząt ustanowionymi przez komisję naukową Wenezuelskiego Instytutu Badań Naukowych (IVIC).
1. Langendorff Przygotowanie do konfiguracji
<ol>
	<li>Przygotować roztwór Tyrode zawierający następujące stężenia substancji rozpuszczonej w mM: 140 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 0,33 Na2HPO4, 10 glukozy, 10 HEPES. Dostosować pH roztworu Tyrode do 7,4 za pomocą NaOH i przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm.</li>
	<li>Załaduj roztwór Tyrode do strzykawek o pojemności 60 ml i wszystkich przewodów poziomego zestawu Langendorff 11,12 pokazano na rysunku 4. Upewnij się, że wyeliminowałeś wszystkie pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Zrównoważyć roztwór tyrodu ze 100%O2 za pomocą zanurzonego plastikowego "kamienia napowietrzającego", jak pokazano na rysunku 4.
	<ol>
		<li>Podłącz plastikową rurkę do zbiornikaO2.</li>
		<li>Dodaj plastikowy adapter trójnika, aby opuścić 5-calową rurkę do roztworu Tyrode w strzykawce o pojemności 60 ml.</li>
		<li>Przymocuj plastikowy kamień napowietrzający do końca rurki 5", aby O2 wydostał się do roztworu Tyrode.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść niewchłanialny szew chirurgiczny wokół igły używanej jako kaniula. Igła jest sprzężona z kolektorem (patrz rysunek 4), co umożliwia retroperfuzję z różnymi roztworami. Na koniec aorta serca zostanie kaniulowana do igły.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt i sekcja serca
<ol>
	<li>Zważyć i wstrzyknąć myszy heparynę (np. mysz o wadze 20 g, wstrzyknąć 20 jednostek lub 200 μl) 15 minut przed eutanazją przez zwichnięcie szyjki macicy. Znieczulij papużki nierozłączki zgodnie z przewodnikami użytkowania zwierząt zawartymi w protokole IACUC, a następnie przystąp do zwichnięcia szyjki macicy. 
	UWAGA: Użyj 8-tygodniowych myszy lub 20 g papużek.</li>
	<li>Usuń serce z klatki piersiowej po eutanazji. Wyciągnij serca papug w dokładnie taki sam sposób, jak opisano dla myszy.
	<ol>
		<li>Wyczyść klatkę piersiową myszy etanolem.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj nacięcie w dolnej części brzucha, a następnie przeciąć boki w kierunku szyi.</li>
		<li>Odciągnij przeciętą tkankę i przypnij ją do ziemi.</li>
		<li>Wytnij membranę. Zachowaj ostrożność podczas przecinania membrany, aby uniknąć uszkodzenia serca.</li>
		<li>Usuń płuca i otaczające tkanki.</li>
		<li>Użyj pęsety, aby nabrać serce bez ściskania go. Przetnij aortę tak długo, jak to możliwe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przewieźć serce na małej łodzi wagowej z około 1 ml roztworu tyrodu.</li>
	<li>Za pomocą niewchłanialnego szwu chirurgicznego przymocuj aortę do poziomego aparatu Langendorffa za pomocą igły. Zawiąż aortę serca za pomocą dwóch cienkich pęset. Retroperfuzję należy rozpocząć od otwarcia zaworu umieszczonego szeregowo ze strzykawkami o pojemności 60 ml zawierającymi roztwór Tyrode.</li>
	<li>Pozwól sercu ustabilizować się przez 10 minut. Wykorzystaj ten czas na oczyszczenie krwi i tkanki tłuszczowej otaczającej serce przed załadowaniem barwnika. Pociągnij pęsetą tkankę tłuszczową w pobliżu podstawy serca i przetnij małymi nożyczkami do rozwarstwiania. Pamiętaj, aby zrobić to pod kątem mikroskopu preparacyjnego.</li>
</ol>
3. Pomiary cytozolowego Ca2+: Przygotowanie barwnika Rhod-2AM
<ol>
	<li>Dodaj 20 μl 20% pluronu (niejonowego środka powierzchniowo czynnego) w DMSO do specjalnej zapakowanej plastikowej fiolki dostarczonej przez producenta barwnika, zawierającej 50 μg barwnika.</li>
	<li>Mieszać, pipetując w górę i w dół, unikając pęcherzyków.</li>
	<li>Przenieś zmieszany DMSO z niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym i barwnikiem ze specjalnie zapakowanej plastikowej fiolki do fiolki z przezroczystego szkła. Dodać 1 ml roztworu Tyrode do fiolki z przezroczystego szkła.</li>
	<li>Sonikuj przez 15-20 minut w kąpieli sonikatora.</li>
	<li>Perfuzję barwnika za pomocą pomp perystaltycznych przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Umieść barwnik w komorze farbiarskiej.</li>
		<li>Użyj mechanicznego zacisku, aby ścisnąć wszystkie inne przewody rurowe podłączone do kolektora. Zacisk umieszcza się nad kolektorem. Zapobiegnie to cofaniu się do rurki podłączonej do strzykawek o pojemności 60 ml.</li>
		<li>Włącz pompę perfuzyjną perfuzyjną, aby rozpocząć cyrkulację barwnika. Natychmiast zamknij zawór 3-drogowy poniżej strzykawki o pojemności 60 ml.</li>
		<li>Umieść małą rurkę, która jest podłączona do ssącej pompy perystaltycznej obok serca, aby recyrkulować barwnik, który został przetopiony do serca.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pomiary Intra-SR Ca2+: Przygotowanie barwnika Mag-Fluo4AM
<ol>
	<li>Przygotuj Mag-Fluo4AM w taki sam sposób jak Rhod-2AM. Zapoznaj się z sekcją 3, aby uzyskać instrukcje krok po kroku.</li>
	<li>Po załadowaniu barwnika otwórz zawór umieszczony szeregowo ze strzykawkami o pojemności 60 ml zawierającymi roztwór Tyrode, aby rozpocząć retroperfuzję. Pamiętaj, aby usunąć clamp nad kolektorem.</li>
	<li>Dodać roztwór Tyrode do komory poziomej i ogrzać do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Retroperfuzja roztworem Tyrode przez 45 minut w celu usunięcia barwnika cytozolowego.</li>
</ol>
5. Pomiary potencjału membranowego: Przygotowanie barwnika Di-8-ANEPPS
<ol>
	<li>Dodaj 5 ml 99% etanolu do fiolki z barwnikiem, która zawiera 5 mg barwnika.</li>
	<li>Porcjować 10 μl do 500 pojedynczych fiolek z tworzywa sztucznego o pojemności 1 ml za pomocą pipety powtarzalnej.</li>
	<li>Osuszyć w próżni i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Dodać 20 μl 20% pluronu w DMSO do plastikowej fiolki z 10 μg wysuszonego barwnika.</li>
	<li>Mieszać, pipetując w górę i w dół, unikając pęcherzyków.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę zawierającą DMSO z pluronem i barwnikiem z plastikowej fiolki do cylindra z podziałką (10 ml). Dodać roztwór Tyrode do końcowej objętości 5 ml.</li>
	<li>Sonikuj przez 20-25 minut w sonikatorze do kąpieli.</li>
	<li>Ukrwić do serca przez 30 minut za pomocą pomp perystaltycznych. Zapoznaj się z instrukcjami krok po kroku w sekcji 3.5.</li>
</ol>
6 . Nagrywanie sygnałów nasierdziowych
<ol>
	<li>Po załadowaniu barwnika należy przeprowadzić retro-perfuzję serca roztworem Tyrode, zdejmując zacisk nad kolektorem. Otworzyć zawór umieszczony szeregowo ze strzykawką o pojemności 60 ml zawierającą roztwór Tyrode. Retro-perfuse Tyrode roztwór przez 10 minut w celu ustabilizowania pracy serca.</li>
	<li>Napełnić komorę poziomą roztworem Tyrode'a i włączyć ogniwo peltiera, aby doprowadzić temperaturę kąpieli do 37 °C.</li>
	<li>Umieść światłowód na powierzchni serca.
	<ol>
		<li>Umieść światłowód w pipecie o pojemności 2 ml, a następnie podłącz pipetę do mikromanipulatora.</li>
		<li>Użyj mikromanipulatora, aby lekko docisnąć światłowód do powierzchni niskiego napięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zewnętrznie stymuluj serce za pomocą stymulatora sterowanego przez generator fal.
	<ol>
		<li>Zaprogramuj generator fal tak, aby dostarczał impuls prostokątny o szerokości 1 ms.</li>
		<li>Ustaw stymulator tak, aby był zsynchronizowany zewnętrznie i podłącz zewnętrzne wejście do generatora fal.</li>
		<li>Do każdego wyjścia stymulatora podłącz drut z wlutowaną na końcu igłą do akupunktury.</li>
		<li>Umieść obie igły do akupunktury w wierzchołku serca w odległości około 3 mm od siebie.</li>
		<li>Dopiero po umieszczeniu igieł w tkance włącz wyjście stymulatora, aby zapobiec porażeniu prądem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W oprogramowaniu do akwizycji ustaw częstotliwość akwizycji na 10 kHz.</li>
</ol>
7 . Rejestrowanie sygnałów wsierdziowych
<ol>
	<li>Zapoznaj się z krokami 6.1 i 6.2, aby ustabilizować pracę serca po załadowaniu barwnika.</li>
	<li>Używając ostrego punktu 23Ga o wielkości światłowodu, wykonaj mały otwór w powierzchni serca w lewej części w pobliżu przegrody.</li>
	<li>Umieść adapter do sklerotomii do chirurgii doszklistkowej, aby pomóc w umieszczeniu pierwszego światłowodu w wsierdziu za pomocą mikromanipulatora.</li>
	<li>Zewnętrznie nadaj tempo sercu. Patrz krok 6.4.</li>
	<li>W oprogramowaniu do akwizycji dostosuj częstotliwość akwizycji do 10 kHz.</li>
</ol>

<ol><li>Fabiato, A., Fabiato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractions+induced+by+a+calcium-triggered+release+of+calcium+from+the+sarcoplasmic+reticulum+of+single+skinned+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells.</a> J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).</li>
<li>Mitra, R., Morad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+uniform+enzymatic+method+for+dissociation+of+myocytes+from+hearts+and+stomachs+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates.</a> Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).</li>
<li>Escobar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+of+intracellular+Ca2%2B+transients+in+beating+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).</li>
<li>Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+Heart+Loose+Patch+Photolysis+Reveals+Ionic+Current+Kinetics+During+Ventricular+Action+Potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials.</a> Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).</li>
<li>Mitra, R., Morad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+uniform+enzymatic+method+for+dissociation+of+myocytes+from+hearts+and+stomachs+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates.</a> Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).</li>
<li>Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channel+currents+during+spontaneous+action+potentials+in+embryonic+chick+heart+cells.+The+action+potential+patch+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp.</a> Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).</li>
<li>Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profile+of+L-type+Ca%282%2B%29+current+and+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+during+cardiac+action+potential+in+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes.</a> Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).</li>
<li>Apkon, M., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+two+distinct+depolarization-activated+K%2B+currents+in+isolated+adult+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes.</a> J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).</li>
<li>Valverde, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Ca2%2B+depletion+of+the+sarcoplasmic+reticulum+at+the+onset+of+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion.</a> Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).</li>
<li>Valverde, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholamban+phosphorylation+sites+enhance+the+recovery+of+intracellular+Ca2%2B+after+perfusion+arrest+in+isolated%2C+perfused+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart.</a> Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).</li>
<li>Escobar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+in+the+regulation+of+ventricular+Ca%282%2B%29+signaling+in+intact+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).</li>
<li>Mejía-Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+local-field+fluorescence+microscopy%3A+a+new+approach+for+measuring+cellular+signals+in+the+beating+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart.</a> Pflügers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).</li>
<li>Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+release+underlies+the+development+of+phase+2+in+mouse+ventricular+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).</li>
<li>Kornyeyev, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3687039/">Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).</li>
<li>Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+Sparks+and+Ca2%2B+waves+are+the+subcellular+events+underlying+Ca2%2B+overload+during+ischemia+and+reperfusion+in+perfused+intact+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts.</a> J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).</li>
<li>Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+Ca%282%2B%29+content+regulates+intracellular+Ca%282%2B%29+release+in+subepicardial+myocytes+of+intact+beating+mouse+hearts%3A+effect+of+exogenous+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).</li>
<li>Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repolarization+differences+between+guinea+pig+atrial+endocardium+and+epicardium%3A+evidence+for+a+role+of+Ito%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito.</a> Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).</li>
<li>Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+bases+for+electrophysiological+distinctions+among+epicardial%2C+midmyocardial%2C+and+endocardial+myocytes+from+the+free+wall+of+the+canine+left+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle.</a> Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).</li>
<li>Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+outward+current+prominent+in+canine+ventricular+epicardium+but+not+endocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium.</a> Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).</li>
<li>Lukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+of+Myocardial+Cells+in+the+Epicardial%2C+Midmyocardial%2C+and+Endocardial+Layers+of+the+Ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle.</a> J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).</li>
<li>Antzelevitch, C., Fish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+heterogeneity+within+the+ventricular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Electrical heterogeneity within the ventricular wall.</a> Basic Res Cardiol. 96 (6), 517-527 (2001).</li>
<li>Gomez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+electrical+heterogeneity+by+compensated+hypertrophy+in+rat+left+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle.</a> Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).</li>
<li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovation+in+optical+imaging%3A+looking+inside+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Innovation in optical imaging: looking inside the heart.</a> Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).</li>
<li>Boukens, B. J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+optocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A century of optocardiography.</a> IEEE Rev Biomed Eng. 7, 115-125 (2014).</li>
<li>Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+membrane+potential+and+epicardial+deformation+in+beating+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+J%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts.</a> Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejsza praca koncentruje się na opisie technik fluorescencji pola lokalnego w celu oceny funkcji miocytów serca ex vivo. Badanie tych komórek w sprzężonym środowisku jest nie tylko bardziej fizjologiczne, ale jest również wysoce odpowiednie do oceny patologii na poziomie narządów. Zdarzenia komórkowe leżące u podstaw sprzężenia pobudzenia-skurczu (ECC) mogą być oceniane na poziomie całego narządu za pomocą sond molekularnych, które monitorują wewnątrzkomórkową dynamikę Ca2 + (Rhod 2 cytozol Ca...

Serce jest centralnym organem układu sercowo-naczyniowego. Skurcz serca jest inicjowany przez wzrost wewnątrzkomórkowego [Ca2+]. Związek między pobudliwością elektryczną a zmianami w wewnątrzkomórkowym uwalnianiu Ca2+ był historycznie badany w komórkach zdysocjowanych enzymatycznie1,2. Jednak komórki serca są sprzężone elektrycznie, metabolicznie i mechanicznie3,4. Po wyizolowaniu miocyty są nie tylko fizycznie rozłączone, ale miocyty z różnych warstw są mieszane podczas dysocjacji5. Ponadto, pomimo ogromnych korzyści, które wyłoniły się z badania izolowanych komórek w warunkach cęgów napięciowych,6,7,8 wewnętrzna natura serca jako syncytium elektrycznego zawsze stawia pytanie, jak funkcjonalnie różnią się komórki zdysocjowane od tych obecnych w tissue3.
W tym manuskrypcie opisujemy postępy uzyskane w wiedzy o fizjologii serca dzięki zastosowaniu technik lokalnej mikroskopii fluorescencyjnej pola (LFFM) w nienaruszonym sercu. LFFM wykorzystuje wskaźniki fluorescencyjne do pomiaru wielu zmiennych fizjologicznych, takich jak cytozolowy Ca2+, retikulum wewnątrzsarkoplazmatyczne (SR) Ca2+ i potencjał błonowy. Pomiary te można uzyskać jednocześnie i w połączeniu z ciśnieniem komorowym9,10, elektrokardiogramy9, elektryczne potencjały czynnościowe (AP), zapisy prądów jonowych i fotoliza błyskawiczna związków w klatkach4,11. Ponadto pomiary te można uzyskać, stymulując nienaruszone serce z wyższymi częstotliwościami, bliższymi fizjologicznym tempom. Chociaż kilka artykułów9,11,12,13,14 zostało opublikowanych przez naszą grupę przy użyciu technik LFFM, założenie technicznych zawiłości związanych z tą techniką uniemożliwiło jej masowe wykorzystanie w badaniu zjawisk fizjologicznych ex vivo w sercu i innych narządach.
Technika LFFM (Rysunek 1) opiera się na pomiarach epifluorescencji uzyskanych przy użyciu światłowodu wielomodowego w kontakcie z tkanką. Jak każda technika obrazowania fluorescencji kontaktowej, rozdzielczość optyczna zależy od średnicy i apertury numerycznej (NA) światłowodu. Wyższe NA i mniejsza średnica światłowodu zwiększą rozdzielczość przestrzenną pomiarów. NA i średnice włókien mogą wynosić odpowiednio od 0,22 do 0,66 i od 50 μm do 1 mm. Zwiększenie NA poprawi stosunek sygnału do szumu (S/N) poprzez akceptację fotonów docierających z większego kąta bryłowego. Aby działać jako urządzenie epifluorescencyjne, wiązka światła jest skupiana w światłowodzie za pomocą soczewki asferycznej lub obiektywu epifluorescencyjnego, w którym NA soczewki i światłowodu pasują do siebie. To dopasowanie maksymalizuje transfer energii do wzbudzenia i zbierania z powrotem fotonów emitowanych przez fluorofor.
Aby pobudzić egzogeniczne wskaźniki fluorescencyjne załadowane do tkanki, można wykorzystać różne źródła światła i tryby oświetlenia. W naszych pionierskich badaniach z wykorzystaniem pulsacyjnej mikroskopii fluorescencyjnej pola miejscowego3,12 (PLFFM) wykorzystaliśmy tani laser pikosekundowy (Rysunek 1a, PLFFM). Ten typ źródła światła ma ogromną zaletę polegającą na wzbudzaniu dużej frakcji cząsteczek fluoroforu pod obszarem oświetlenia bez znacznego wybielania barwnika ze względu na krótki czas trwania impulsu12. Dodatkowo zastosowanie ultrakrótkich impulsów pozwoliło na ocenę czasu życia fluorescencji barwnika12. Czas życia fluorescencji to właściwość, którą można wykorzystać do ilościowego określenia frakcji cząsteczek barwnika związanych z Ca2+. Niestety, czasowe drganie impulsów i zmiany amplitudy od impulsu do impulsu ograniczają zastosowanie tej eksperymentalnej strategii do przypadków, w których zmiana fluorescencji wytwarzanej przez ligand wiążący się z barwnikiem jest duża.
Lasery o fali ciągłej (CW) są zwykle używane jako główne źródło oświetlenia w LFFM (Rysunek 1b, CLFFM). Wiązka laserowa może w sposób ciągły oświetlać tkankę lub może być modulowana ferroelektrycznie. Modulacja ferroelektryczna wiązki pozwala na generowanie mikrosekundowych impulsów światła. Ta modulacja może być kontrolowana przez zewnętrzny sprzęt. Procedura ta nie tylko radykalnie zmniejsza czasowe drgania impulsów świetlnych, ale także umożliwia mieszanie wiązek o różnych długościach fal. Mieszanie wiązek odbywa się poprzez multipleksowanie promieni z różnych laserów. W konsekwencji wiele barwników o różnych właściwościach widmowych może być wzbudzonych w celu wykonywania pomiarów różnych zmiennych fizjologicznych, na przykład Rhod-2 dla cytozolowego Ca2+, MagFluo4 dla intra-SR Ca2+ i di-8-ANEPPS dla potencjału błonowego.
Chociaż lasery prezentują różne zalety jako źródło światła w LFFM, można stosować inne rodzaje źródeł światła, w tym diody elektroluminescencyjne (LED). W tym przypadku źródłem światła wzbudzającego była dioda LED InGaN (rysunek 1c, PLEDFM). W diodach LED fotony są emitowane spontanicznie, gdy elektrony z pasma przewodnictwa rekombinują z w paśmie walencyjnym. Różnica w stosunku do laserów na ciele stałym polega na tym, że emisja nie jest stymulowana przez inne fotony. Skutkuje to niekoherentną wiązką i szerszą emisją spektralną dla diod LED.
Można stosować różne rodzaje diod LED dużej mocy. Do nagrań AP przy użyciu Di-8-ANEPPS i dla stanów przejściowych Ca2+ zarejestrowanych przy użyciu Fluo-4 lub Mag-Fluo-4 użyliśmy diody LED, która ma typową emisję szczytową przy 485 nm (niebieska) i połowie szerokości 20 nm (rysunek 1d). Dla stanów nieustalonych Ca2+ zarejestrowanych za pomocą Rhod-2, dioda LED miała typową emisję szczytową przy 540 nm (kolor zielony) i połowie szerokości 35 nm (rysunek 1d). Diody LED emitują światło w paśmie o długości fali i dlatego wymagają filtrów w celu zawężenia ich emisji widmowej. Ponadto światło pulsacyjne może być generowane z częstotliwością 1,6 kHz i czasem trwania 20 μs. Diody LED były impulsowane za pomocą szybkiego tranzystora polowego MOSFET mocy. Jednoczesne nagrania z różnymi wskaźnikami mogą być wykonywane poprzez multipleksowanie czasowe diod LED. Niestety, światło emitowane przez diody LED jest trudniejsze do skupienia na światłowodzie w porównaniu z wiązką laserową. Tak więc główną wadą stosowania diod LED jest to, że ich profile emisji mają przemieszczenia kątowe (± 15°) od osi głównej, a do tego należy zastosować optykę pomocniczą.
We wszystkich wcześniej opisanych konfiguracjach optycznych, światło wzbudzenia jest odbijane za pomocą dichroicznego zwierciadła. Wiązka jest następnie skupiana przez soczewkę asferyczną i obiektyw mikroskopowy na światłowodzie wielomodowym, który jest umieszczony na tkance. Jak w każdym układzie epifluorescencyjnym, zwierciadło dichroiczne służy również do oddzielenia wzbudzenia od emitowanego światła. Emitowane widmo światła przechodzi z powrotem przez filtr barierowy, aby usunąć wszelkie odbite wzbudzenia. Na koniec emitowane światło jest skupiane za pomocą obiektywu na fotodetektorze (rysunek 1).
Przejście od światła do prądu elektrycznego odbywa się za pomocą krzemowych fotodiod lawinowych. Diody te charakteryzują się szybką reakcją i wysoką czułością, co pozwala na wykrywanie słabego oświetlenia. Fotoprąd wytwarzany przez fotodiody lawinowe może być wzmacniany na dwa sposoby: za pomocą wzmacniacza transimpedancyjnego z rezystancyjnym elementem sprzężenia zwrotnego (ilustracja 1e) lub za pomocą układu całkującego w celu zamiany prądu na napięcie (ilustracja 1f). Przy pierwszym podejściu napięcie wyjściowe jest proporcjonalne do fotoprądu i rezystora sprzężenia zwrotnego. Typowy przykład rezystancyjnej detekcji pikosekundowych impulsów laserowych pokazano na rysunkach 2a, 2b i 2c. Panel 2a ilustruje wyjście wzmacniacza transimpedancyjnego, a panel 2b pokazuje rozszerzenie czasowe interwału oznaczonego gwiazdką (*). Zaimplementowano algorytm śledzenia pików w celu wykrycia piku (czerwony) i zasady (zielony) dla odpowiedzi fluorescencyjnych12. Pomiar fluorescencji bazowej dostarcza informacji zarówno o ciemnym prądzie fotodiody lawinowej, jak i o zakłóceniach wprowadzanych przez światło otoczenia i sprzężenie elektromagnetyczne. Reprezentacja szczytów i zasad jest pokazana na rysunku 2c. Rysunek ten ilustruje fluorescencję emitowaną przez barwnik (Rhod-2) związany z Ca2+ podczas cyklu serca bijącego serca papużki.
W drugiej metodzie, napięcie wyjściowe integratora jest funkcją prądu i pojemnościowego sprzężenia zwrotnego (Rysunki 2d, 2e i 2f). Rysunek 2f przedstawia dwa następujące po sobie cykle integracji: pierwszy bez zewnętrznego oświetlenia, a drugi z przyłożonymi impulsami świetlnymi z pulsacyjnej diody LED. Szczegółowy opis przedstawiono na rysunkach 2g i 2h. Takie podejście, choć bardziej pracochłonne, zapewnia większy S/N ze względu na brak szumu termicznego w kondensatorze sprzężenia zwrotnego. Przyrząd zawiera stopień czasowy, który generuje całą kontrolę i multipleksowanie światła wzbudzenia oraz zarządza okresami integracji i resetowania stopnia czołowego. Jest to zwykle wykonywane za pomocą cyfrowego obwodu przetwarzania sygnału, który wykonuje również cyfrowe różnicowanie zintegrowanego sygnału wyjściowego poprzez obliczanie regresji danych w trybie on-line. W przypadku zastosowania rezystancyjnego sprzężenia zwrotnego można zastosować dowolną płytkę akwizycji A/C.
Na koniec, nasza technika LFFM jest bardzo wszechstronna i może być dostosowana do nagrywania z więcej niż jednego regionu. Dodanie rozdzielacza wiązki w ścieżce światła pozwala nam na rozszczepienie światła na dwa włókna światłowodowe. Każde światłowód można następnie umieścić w różnych obszarach tkanki, aby niezależnie wzbudzić i zarejestrować emisję z egzogennych sond fluorescencyjnych. Modyfikacja ta pozwala nam ocenić, w jaki sposób anatomiczne różnice regionalne wpływają na zmienne fizjologiczne. Rysunek 3 przedstawia rozdzielacz wiązki stosowany do rozdzielania światła wzbudzenia CW w taki sposób, że dwa światłowody są używane do pomiaru przezściennych poziomów elektrycznych lub wewnątrzkomórkowych [Ca2+] o niewielkiej inwazyjności. Sygnały transścienne można rejestrować, umieszczając jedno włókno na wsierdziu, a drugie na warstwie nasierdzia ściany komory. Dlatego technika LFFM ma zdolność pomiaru przebiegu w czasie sygnałów komórkowych w różnych regionach i może być używana do testowania, czy zmiany regionalne występują w sytuacjach patologicznych.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Sigma</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku wapnia</td><td>Sigma</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku magnezu</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>S-8045</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu; m Filtr membranowy</td><td>nylonowy Whatman</td><td>7402-004</td><td></td></tr><tr><td>Rozdzielacz MPP</td><td>Warner</td><td>64-0216&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5 Precyzyjna igła ślizgowa</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>pleciony jedwabny sznurek (niewchłanialny szew chirurgiczny)</td><td>AllMech Tech</td><td>LOOK-SP105</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa do wstrzykiwań 1000USP/mL</td><td>AllMech Tech</td><td>NDC63323-540-11</td><td></td></tr><tr><td>DMSO D8779</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>856925-71-8</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 20% roztwór</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna Materflex C/L</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-26</td><td></td></tr><tr><td>Stymulator izostymu</td><td>World Precision Instruments</td><td>A320RC</td><td></td></tr><tr><td>Generator przebiegów</td><td>Teledyne Lecroy</td><td>WaveStation 2012</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa FS20</td><td>Fisher Scientific</td><td>1533530</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Tygon ID: 1/32 " OD: 3/32 " Ściana 1/32 "</td><td>Zasilanie komponentów</td><td>TET-031A Średnica wewnętrzna rurki</td><td></td></tr><tr><td>Tygon: 3/32 " OD: 5/32 " Ściana 1/32 "</td><td>Dostawa komponentów</td><td>TET-094A</td><td></td></tr><tr><td>Adapter luer lock do zaworu 3-drogowego</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-31200-80</td><td></td></tr><tr><td>Adaptery trójnikowe i złączki z tworzywa sztucznego</td><td>Cole-Parmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk plastikowy</td><td>WaterZoo</td><td>2465</td><td></td></tr><tr><td>Peltier</td><td>TE Technology</td><td>TE-127-2.0-2.5</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1245MP</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Fluo-4AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M14206</td><td></td></tr><tr><td>Igły do akupunktury</td><td>LHASA</td><td>TC1.20x13</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 60 ml BD z luer-lok</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speed vacuum Eppendorf Vagufuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy obwód przetwarzania sygnału DSP TMS 320</td><td>Texas Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Longpass Lustro dichroiczne 567 nm</td><td>ThorLabs</td><td>DMLP567L</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 10X NA 0,25 DIN AchromatycznyFinite Intl Standard Obiektyw</td><td>Edmund Optics</td><td>Stock# 33-437</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 20X NA 0,40 DIN Achromatyczny skończony Intl Standard Objective</td><td>Edmund Optics</td><td>Stock# 33-438</td><td></td></tr><tr><td>Longpass kolorowy filtr szklany 590 nm&nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>FGL590</td><td></td></tr><tr><td>Zielony laser Nd-YAG 532 nm, 500 mW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator do lasera</td><td>Siskiyou</td><td>MX130R</td><td></td></tr><tr><td>Światłowód wielomodowy 200 &micro; m NA 0.39</td><td>ThorLabs</td><td>FT200UMT</td><td></td></tr><tr><td>LED niebieskie</td><td>Lumileds</td><td>L135-B475003500000</td><td></td></tr><tr><td>Diody LED zielone</td><td>Lumileds</td><td>L135-G525003500000</td><td></td></tr><tr><td>Rozdzielacz wiązki Cube niepolaryzacyjny</td><td>ThorLabs</td><td>BS007</td><td></td></tr><tr><td>36" Długość, jaskółczy ogon Szyna optyczna</td><td>Edmund Optics</td><td>54-402</td><td></td></tr><tr><td>2.5" Szerokość, Nośnik na jaskółczy ogon</td><td>Edmund Optics</td><td>54-404</td><td></td></tr><tr><td>0,75" Podróż, stolik mikrometryczny</td><td>Edmund Optics</td><td>37-983</td><td></td></tr><tr><td>Szyna optyczna na jaskółczy ogon 3"</td><td>ThorLabs</td><td>RLA075/M</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt szyny na jaskółczy ogon 1"</td><td>ThorLabs</td><td>RC1</td><td></td></tr><tr><td>Fotodioda lawinowa Helix 902</td><td>Digi-Key</td><td>HELIX-902-200</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt obiektywu XY Translator& nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>ST1XY-S</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowa płytka stykowa 6" x 6"</td> <td>ThorLabs</td><td>MB6</td><td></td></tr><tr><td>Nexus stół otwarty 4' x</td> <td>6'ThorLabs</td><td>T46HK</td><td></td></tr><tr><td>z walcowym ze stali nierdzewnej</td><td>ThorLabs</td><td>HW-KIT5/M</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz akrylowy</td><td>Home Depot/Lowes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Żel epoksydowy&nbsp;</td><td>Walmart / Home Depot</td><td>2-częściowy 5 min clr 1oz</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5 Precyzyjna igła ślizgowa</td><td>B-D</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>23G Precyzyjna igła ślizgowa</td><td>B-D</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa montażowa, 25 mm x 75 mm x 10 mm</td><td>ThorLabs</td><td>BA1/M</td><td></td></tr><tr><td>Półki druciane 36"</td><td>Alera</td><td>AALESW59PO36SR</td><td></td></tr><tr><td>Półki druciane</td><td>Alera</td><td>ALESW582424SR</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk słupkowy i kątowy</td><td>ThorLabs</td><td>SWC/M-P5</td><td></td></tr><tr><td>Szklana strzykawka do komory barwienia</td><td>Wheaton</td><td>W851020</td><td></td></tr><tr><td>Gumowy korek</td><td>Strona główna Narzędzia naukowe</td><td>CE-STOP01C</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia fluorescencyjna w polu lokalnym: obrazowanie sygnałów komórkowych w nienaruszonych sercach

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

W sercu, badania sygnalizacji molekularnej są zwykle wykonywane w izolowanych miocytach. Jednak wiele patologicznych sytuacji, takich jak niedokrwienie i arytmie, można w pełni zrozumieć tylko na poziomie całego narządu. W tym miejscu przedstawiamy technikę spektroskopową mikroskopii fluorescencyjnej pola lokalnego (LFFM), która pozwala na pomiar sygnałów komórkowych w nienaruszonym sercu. Technika ta opiera się na połączeniu perfundowanego serca Langendorffa i światłowodów do rejestrowania sygnałów fluorescencyjnych. LFFM ma różne zastosowania w dziedzinie fizjologii układu krążenia do badania serca w normalnych i patologicznych warunkach. Wiele zmiennych sercowych może być monitorowanych za pomocą różnych wskaźników fluorescencyjnych. Należą do nich cytozolowy [Ca2+], retikulum wewnątrzsarkoplazmatyczne [Ca2+] i potencjały błonowe. Egzogenne sondy fluorescencyjne są wzbudzane, a emitowana fluorescencja wykrywana za pomocą trzech różnych układów technik epifluorescencji LFFM przedstawionych w tym artykule. Główne różnice między tymi technikami to rodzaj źródła światła używanego do wzbudzenia oraz sposób modulacji światła wzbudzenia. Impulsowy LFFM (PLFFM) wykorzystuje impulsy światła laserowego, podczas gdy LFFM o fali ciągłej (CLFFM) wykorzystuje ciągłe światło laserowe do wzbudzenia. Wreszcie jako trzecie źródło światła zastosowano diody elektroluminescencyjne (LED). Ten niekoherentny układ nazywa się pulsacyjną mikroskopią fluorescencyjną LED (PLEDFM).

Przebiegi przejściowe AP i Ca2+ w endokardium i epikardium
Aby porównać sygnały w obrębie ściany komory, jedno światłowody umieszcza się w endokardium, a drugie w epikardium. Porównanie morfologii potencjału czynnościowego (AP) zarejestrowanego z endokardium z potencjałem z epikardium jest najlepszym sposobem oceny funkcji transmuralnej. Ściana komory jest wysoce heterog...

W sercu, zdarzenia molekularne koordynują funkcję elektryczną i kurczliwą narządu. Zaprezentowany tu zestaw technik mikroskopii fluorescencyjnej pola lokalnego umożliwia rejestrację zmiennych komórkowych w nienaruszonych sercach. Identyfikacja mechanizmów definiujących czynność serca ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak serce działa w sytuacjach patologicznych.

Mikroskopia fluorescencyjna w polu lokalnym: obrazowanie sygnałów komórkowych w nienaruszonych sercach

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

Ogólnym celem tej techniki obrazowania z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej lokalnego pola jest użycie sond molekularnych do pomiaru wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia lub potencjałów błonowych w obszarach serca, które są trudnodostępne na poziomie całego organu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu kardiologii związane z zatrzymaniem krążenia i niedokrwieniem. Główną zaletą tej techniki jest możliwość pomiaru właściwości serca na podstawie zdarzeń komórkowych w nienaruszonym organie, w którym komórki pozostają sprzężone elektrycznie, mechanicznie i metabolicznie.W pierwszej kolejności należy przygotować poziomy aparat Langendorffa. Do strzykawek o pojemności 60 ml należy nalać świeżo przygotowany roztwór Tyrode'a, a następnie podłączyć wszystkie powiązane z układem rurki. Po napełnieniu należy usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.Następnie nasyć roztwór czystym tlenem gazowym doprowadzanym za pomocą zanurzonego plastikowego kamienia napowietrzającego. Potem nałóż niewchłanialną nici chirurgiczną na igłę. Będzie ona służyć jako kaniula do retroperfuzji serca po podłączeniu do aparatury.Następnie należy pobrać serce po wstrzyknięciu heparyny i uśmierceniu zwierzęcia. Najpierw klatkę piersiową należy oczyścić etanolem. Demonstracja została przeprowadzona na myszy, jednak ta sama procedura ma zastosowanie do pobierania serca papużki.Następnie, używając nożyczek sekcyjnych, wykonaj nacięcie w dolnej części brzucha, a potem przetnij boki w kierunku szyi. Następnie ostrożnie przetnij przeponę, unikając uszkodzenia serca. Teraz odsunie przeciętą tkankę i przypnij ją.Następnie należy usunąć płuca i otaczające je tkanki, aby odsłonić serce. Po odsłonięciu, za pomocą pęsety, ostrożnie wyjmij serce, unikając jego uciskania. Oddziel je od organizmu zwierzęcia, przecinając aortę, pozostawiając przy sercu jak największy fragment aorty.Następnie umieść serce w małej łódce wagowej z jednym mililitrem roztworu Tyrode'a. Pod mikroskopem stereoskopowym szybko usuń krew oraz tkankę tłuszczową otaczającą serce, używając pęsety i nożyczek. Za pomocą niewchłanialnej nici chirurgicznej i igły przymocuj aortę do poziomego złącza aparatu Langendorffa.Zaciśnij węzeł za pomocą dwóch precyzyjnych pęset. Następnie rozpocznij retroperfuzję, otwierając zawór w celu podania roztworu Tyrode'a. Oczyść otaczające tkanki i odessaj zanieczyszczenia, aby utrzymać czystość komory poziomej podczas 10-minutowej stabilizacji serca.Przygotuj świeży roztwór barwnika. W przypadku Rhod-2 AM dodaj 20 µL 20% Pluronic i DMSO do opakowania 50 µg barwnika od producenta. Wymieszaj za pomocą pipety, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.Następnie przenieś upłynniony barwnik do przezroczystej szklanej fiolki i dodaj 1 ml roztworu Tyrode'a. Dokładnie rozpuść barwnik w tej mieszaninie, sonikując go przez 15 do 20 minut. Następnie przeprowadź perfuzję przygotowanego barwnika za pomocą pompy perystaltycznej w temperaturze pokojowej.Najpierw należy wprowadzić barwnik do komory z barwnikiem, a następnie zacisnąć wszystkie przewody podłączone do rozdzielacza, umieszczając zaciski powyżej rozdzielacza, aby zapobiec cofaniu się cieczy. Następnie należy włączyć pompę i niezwłocznie zamknąć zawór trójdrożny znajdujący się poniżej strzykawki o pojemności 60 ml. Małą rurkę przymocowaną do końcówki ssącej pompy należy umieścić obok serca, aby umożliwić recyrkulację barwnika po zakończeniu perfuzji.Użyj igły o małym rozmiarze i przebij szczyt serca, aby wyrównać ciśnienie. Następnie pozwól, aby serce było perfundowane barwnikiem przez 30 minut. W tym czasie bardzo ważne jest monitorowanie poziomu barwnika, aby do tkanki nie dostały się pęcherzyki powietrza, co mogłoby spowodować niedokrwienie i uszkodzenie tkanki.Po perfuzji barwnikiem przeprowadź retroperfuzję serca roztworem Tyrode'a. Zdejmij zacisk znajdujący się powyżej rozdzielacza. Otwórz zawór, a następnie pozostaw serce do stabilizacji na 10 minut.Podczas retroperfuzji należy napełnić komorę poziomą roztworem Tyrode'a i włączyć moduł Peltiera, aby doprowadzić temperaturę kąpieli do 37 °C. Aby przygotować światłowód do eksperymentu, najpierw należy umieścić go w pipecie o pojemności 2 ml, a następnie przymocować pipetę do mikromanipulatora.Za pomocą mikromanipulatora delikatnie dociśnij światłowód do powierzchni komory bocznej. Następnie zaprogramuj generator fal tak, aby generował impuls prostokątny o szerokości 1 ms. Stymulator serca ustaw w tryb synchronizacji zewnętrznej i podłącz do generatora fal.Do każdego z dwóch wyjść stymulatora podłącz przewód z przylutowaną na końcu igłą do akupunktury. Przymocuj dwie igły do akupunktury do wierzchołka serca, w odstępie około trzech milimetrów. Stymulator należy uruchomić dopiero po umieszczeniu igieł, aby uniknąć przypadkowych wyładowań.Aby zarejestrować sygnał nadsercowy, należy ustawić częstotliwość akwizycji w oprogramowaniu na 10 kHz. W celu zebrania sygnału wsierdziowego należy postępować w ten sam sposób, lecz użyć igły o rozmiarze 23 G, aby wykonać otwór w komorze bocznej w pobliżu przegrody. Następnie, za pomocą mikromanipulatora, należy wprowadzić drugie światłowód do wsierdzia.Aby ocenić funkcję transmuralną, porównano morfologię potencjałów czynnościowych zarejestrowanych z endokardium i epikardium. Rejestracje fluorescencyjne wykonano po potraktowaniu serca barwnikiem di-8-ANEPPS z wykorzystaniem techniki CLFFM. Potencjał czynnościowy był wolniejszy w endokardium, szczególnie w fazie pierwszej.Czas trwania potencjału czynnościowego określono jako czas potrzebny na repolaryzację potencjału czynnościowego do określonego stopnia. Po normalizacji czasów trwania i przesunięciu ich tak, aby pokrywały się w fazie zero, można było je porównać. Rzeczywiście odnotowano istotną różnicę w fazie pierwszej.Następnie do monitorowania wewnątrzkomórkowego wapnia wykorzystano Rhod-2 AM. W celu porównania regionalnych różnic w stężeniu wapnia wewnątrzkomórkowego oceniono kinetykę przejściowych zmian stężenia wapnia. W porównaniu z innymi obszarami, czas do osiągnięcia szczytu tych zmian był w endokardium o około dwie milisekundy dłuższy.Ogólnie rzecz biorąc, kinetyka przejściowych zmian stężenia wapnia w endokardium była znacznie wolniejsza niż w epikardium. Po opanowaniu technika ta może być wykorzystywana do rejestracji wewnątrzkomórkowych zmian stężenia wapnia oraz potencjałów czynnościowych w trudno dostępnych obszarach serca. Zastosowanie układu Langendorffa sprawia, że metoda ta jest bardzo praktyczna do perfuzji różnych substancji chemicznych do serca i oceny ich wpływu na właściwości kardiologiczne.

local-field-fluorescence-microscopy-imaging-cellular-signals-intact

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje technikę o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej do obrazowania optycznego przemieszczania się potencjału czynnościowego na powierzchni serca szczura perfundowanego metodą Langendorffa z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego (di-8-ANEPPS).

Mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą Langendorffa

Konfokalna mikroskopia skaningowa jest stosowana do obrazowania pojedynczych zdarzeń mitochondrialnych w perfundowanych mięśniach serca lub szkieletowych u żywych zwierząt. Monitorowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych procesów mitochondrialnych, takich jak błyski ponadtlenkowe i wahania potencjału błonowego, umożliwia ocenę funkcji mitochondriów w fizjologicznie istotnym kontekście i podczas patologicznych perturbacji.

Obrazowanie konfokalne pojedynczych mitochondrialnych błysków ponadtlenkowych w nienaruszonym sercu lub in vivo

Opisujemy protokół do wolumetrycznego obrazowania komórek znakowanych białkiem fluorescencyjnym głęboko w nienaruszonych sercach embrionalnych i pourodzeniowych. Wykorzystując metody oczyszczania tkanek w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca, pojedyncze komórki znakowane białkiem fluorescencyjnym wewnątrz serca embrionalnego lub pourodzeniowego mogą być wyraźnie i dokładnie zobrazowane.

Obrazowanie oczyszczonych serc embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki

Tutaj opisujemy podejście do mikroskopii świetlnej w celu wizualizacji nacieku leukocytów CD45+ w mysim modelu aseptycznego, piorunującego zapalenia mięśnia sercowego, które jest indukowane przez leczenie myszami CD11c.DTR toksyną dyfterytową dotchawiczą.

Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

To badanie wykorzystuje technikę mikroskopii fluorescencyjnej z dwustronnym oświetleniem (LSFM) w połączeniu z oczyszczaniem optycznym do badania mysiego serca.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca

Tutaj przedstawiamy metodę użycia wewnątrzkomorowego cewnika optycznego w perfundowanych sercach do wykonywania spektroskopii absorbancji przez ścianę serca. Uzyskane dane dostarczają solidnych informacji na temat napięcia tlenu w tkankach, a także wykorzystania substratu i potencjału błonowego jednocześnie z pomiarami wydolności serca w tym wszechobecnym preparacie.

Wewnątrzsercowy cewnik świetlny do bocznego zapłonu do monitorowania metabolizmu komórkowego za pomocą przezściennej spektroskopii absorpcji perfundowanych serc ssaków

Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.

Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Tutaj opisujemy optyczne pozyskiwanie i charakterystykę potencjałów czynnościowych z indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą szybkiego modułowego systemu fotometrycznego.

Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

Protokół wykorzystuje zaawansowaną mikroskopię świetlną wraz z dostosowanymi metodami oczyszczania tkanek do badania skomplikowanych struktur serca w sercach gryzoni, co ma ogromny potencjał dla zrozumienia morfogenezy i przebudowy serca.

Obrazowanie w arkuszach świetlnych w celu ujawnienia struktury serca w sercach gryzoni

Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja uszkodzenia serca w reperfuzji ostrego zawału mięśnia sercowego (repAMI) umożliwia wierną kwantyfikację i kolokalizację powiązanych wzorców wpływających na chorobę. W tym przypadku zapewniono zautomatyzowane obrazowanie sterowane arkuszem świetlnym do jednoczesnego pomiaru uszkodzenia serca, obszaru ryzyka i odpowiedzi komórek odpornościowych.

Jednoczesna analiza 3D uszkodzenia serca i odpowiedzi immunologicznej w ostrym zawale mięśnia sercowego z reperfuzją przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Poznaj mikroskopię fluorescencyjną w polu lokalnym do badania sygnałów komórkowych w nienaruszonych sercach. Ta metoda umożliwia pomiar wapnia wewnątrzkomórkowego i potencjałów błonowych w trudno dostępnych regionach serca.

Mikroskopia fluorescencyjna w polu lokalnym: obrazowanie sygnałów komórkowych w nienaruszonych sercach

Przeglądaj więcej filmów