Ostre i przewlekłe modele hiperglikemii u danio pręgowanego: metoda oceny wpływu hiperglikemii na neurogenezę i biodystrybucję cząsteczek znakowanych radioaktywnie

Ogólnym celem poniższej procedury jest ocena przebudowy mózgu w warunkach hiperglikemii oraz śledzenie znakowanych radioaktywnie cząsteczek u danio pręgowanego. Hiperglikemia charakteryzuje się nadmiernym stężeniem glukozy we krwi. Przewlekła hiperglikemia może być spowodowana stanami cukrzycowymi i powoduje różne dysfunkcje naczyń krwionośnych, które z kolei mogą wywołać powikłania kliniczne, takie jak zawał mięśnia sercowego, udar mózgu lub owrzodzenia stopy cukrzycowej.

Również ostra hiperglikemia spowodowana stresem może sprzyjać powikłaniom krwotocznym w udarze niedokrwiennym. Danio pręgowany jest interesującym modelem do zrozumienia chorób człowieka i ich wpływu na ośrodkowy układ nerwowy. Jest to szczególnie prawdziwe, biorąc pod uwagę, że mózg dorosłych ryb wykazuje intensywną zdolność neurogenną i wyjątkową zdolność do mechanizmów naprawy mózgu w porównaniu ze ssakami, dlatego danio pręgowany stanowi dobry model do badania przebudowy mózgu po stresie w warunkach ostrych i hiperglikemicznych.

Pozwala również na badanie biodystrybucji cząsteczek znakowanych radioaktywnie i potencjalnych środków terapeutycznych. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Wspólnoty Francuskiej i Europejskiej dotyczącymi wykorzystywania zwierząt w badaniach naukowych i zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną ds. eksperymentów na zwierzętach. Złap rybę delikatnie siatką rybacką.

Umieść rybę w niewielkiej objętości środka znieczulającego tricaine, rozcieńczonego w końcowym stężeniu 0,02% w wodzie. Poczekaj, aż ryba przestanie się poruszać. Wyjmij rybę za pomocą przeciętej pipety i delikatnie połóż ją na chłonnej bibułce, aby usunąć maksimum wody.

Zważyć rybę w celu przygotowania strzykawki z d-glukozą do wstrzykiwań o objętości 50 mikrolitrów po 2,5 grama na kilogram masy ciała. Na przykład ryba o wadze 0,6 grama otrzyma 50 mikrolitrów roztworu PBS o stężeniu 3% d-glukozy. Połóż rybę na plecach i utrzymuj ją jedną ręką.

Drugą ręką wprowadzić igłę strzykawki do jamy dootrzewnowej i powoli wstrzyknąć roztwór PBS d-glukozy. Wyjmij igłę i włóż rybę z powrotem do wody. Sprawdzaj rybę, aż całkowicie wyzdrowieje.

Ich poziom glukozy we krwi jest zwykle mierzony po 1 1/2 godziny. Aby naśladować przewlekłą hiperglikemię, przygotuj dwulitrowy zbiornik d-glukozy o końcowym stężeniu 111 milimolów. W tym celu zważ 40 gramów d-glukozy i umieść ją w pustym zbiorniku.

Napełnij zbiornik dwoma litrami wody dla ryb i umieść w nim do siedmiu ryb. Zmieniaj roztwór glukozy co dwa dni, aby uniknąć rozwoju bakterii lub innych mikroorganizmów. Przewlekłą hiperglikemię uzyskuje się przez 14-dniową kurację d-glukozą.

Złap rybę w sieć rybacką i połóż ją na lodzie. Przykryj rybę lodem, aby uzyskać szybką eutanazję. Weź rybę i wytrzyj ją, aby usunąć wszelkie krople wody, które mogłyby rozcieńczyć próbki krwi.

Usuń oko kleszczami preparacyjnymi i poczekaj, aż jama oka wypełni się krwią. Umieść pasek testowy na glukometrze i włóż pasek do jamy oka. Zanotuj wartość stężenia glukozy we krwi.

W przypadku ostrej hiperglikemii dootrzewnowe wstrzyknięcie d-glukozy powoduje znaczny wzrost poziomu glukozy we krwi, jak pokazano, 1 1/2 godziny po wstrzyknięciu. W przypadku przewlekłej hiperglikemii zanurzenie ryb w roztworze d-glukozy powoduje znaczny wzrost poziomu glukozy we krwi, co wykazano po 14 dniach leczenia. Pod koniec zabiegu oddziel ciało od głowy nożyczkami preparacyjnymi i umieść głowę w 4% paraformaldehydu, rozcieńczonym w PBS do eksperymentów immunohistochemicznych.

Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Alternatywnie, mózg może być bezpośrednio wyekstrahowany i zamrożony do innych eksperymentów, takich jak ekstrakcja mRNA. Następnego dnia stałe głowice są płukane PBS i utrzymywane za pomocą igły pod mikroskopem preparacyjnym.

Pozostałe oko jest usuwane, a górna część czaszki jest delikatnie otwierana kleszczami. Mózg jest następnie ostrożnie ekstrahowany i umieszczany w 1x PBS. Utrwalone mózgi są odwadniane stopniowo, w serii rosnących stężeń etanolu, po których następują dwie 30-minutowe kąpiele toluenu.

Mózgi są następnie umieszczane w kasecie do zatapiania, a pokrywa jest ostrożnie zamykana. Umieść kasetę w stopionej parafinie w temperaturze od 58 do 60 stopni Celsjusza. Podczas osadzania parafiny w mózgu włącz kleszcze rozgrzewające.

Włóż kasetę do czystej kąpieli parafinowej. Na koniec kąpieli parafinowych wyjmij kasetę. Wlej trochę płynnej parafiny do formy.

Otwórz kasetę i umieść mózg w stopionej parafinie w formie. Zorientuj mózg za pomocą rozgrzewających kleszczy inkluzyjnych. Napełnij formę stopioną parafiną i pozwól jej stwardnieć na chłodzącej części maszyny do zatapiania.

Ze względów technicznych mózg powinien być ustawiony zgodnie z osią przednio-tylną. Po rozformowaniu bloku parafinowego należy go przyciąć i zamocować na kasecie z roztopioną parafiną, w odpowiedniej orientacji, aby umożliwić przekrojenie poprzeczne. Umieść blok parafiny w ramieniu mikrotomu i wytnij 50 mikrometrycznych odcinków, aż osiągniesz poziom próbki mózgu.

Następnie przyciąć blok parafinowy, aby uzyskać trapez, i dostosować grubość przekroju do siedmiu mikrometrów. Zbierz wstążki parafinowe cienkim pędzlem i połóż je na czarnym papierze. Przecinaj wstęgi parafinowe co trzy do czterech sekcji.

Połóż szkiełko na rozgrzewającym talerzu i zalej go wodą destylowaną. Delikatnie ułóż sekcje na wodzie na zjeżdżalni i rozgrzej do 40 stopni Celsjusza. Gdy wstęgi parafinowe są wystarczająco rozprowadzone, usuń wodę z chłonną tkanką.

Ostatnie krople są usuwane mechanicznie, jak pokazano. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na co najmniej dwie godziny przed wykonaniem procedury immunohistochemicznej opisanej w protokole. Po immunohistochemii preparaty są analizowane pod mikroskopem epifluorescencyjnym lub konfokalnym w celu zbadania wpływu hiperglikemii na proliferację komórek mózgowych.

Kwantyfikacja komórek mózgowych odbywa się na co najmniej trzech kolejnych odcinkach lub obszarze zainteresowania. Tutaj komórki proliferacyjne odpowiadające komórkom dodatnim PCNA pojawiają się na zielono. Jak widać, przewlekła hiperglikemia powoduje zmniejszenie liczby komórek proliferacyjnych, oznaczonych na zielono przeciwciałem PCNA, w kresomózgowiu brzusznym, kresomózgowiu grzbietowym i podwzgórzu ogonowym, wokół bocznego i tylnego zachyłka.

Alternatywnie, w celu zbadania wpływu hiperglikemii na neurogenezę wywołaną urazem, podczas przewlekłego leczenia hiperglikemii można wykonać uraz rany kłutej kresomózgowia. W tym celu znieczul rybę leczoną przez siedem dni i umieść ją pod mikroskopem preparacyjnym. Przetrzymkaj strzykawkę o rozmiarze 30 pionowo przez czaszkę, do środka prawej półkuli kresomózgowia.

Po tej procedurze ryba powinna zostać zwrócona do zbiornika na wymagany czas. W tym przypadku rybom pozwolono przeżyć siedem dni w wodzie z d-glukozą, zanim zostały złożone w ofierze. Rana kłuta kresomózgowia silnie zwiększa proliferację w uszkodzonej półkuli, siedem dni po zmianie.

Nasze dane pokazują, że przewlekła hiperglikemia indukuje znaczne spowolnienie procesów gojenia mózgu, poprzez zmniejszenie proliferacji komórek po zranieniu raną kłutą kresomózgowia. Danio pręgowany może być również wykorzystywany do badania biodystrybucji cząsteczek znakowanych radioaktywnie. Tutaj postanowiliśmy zbadać metabolizm glukozy w organizmie danio pręgowanego.

Rybę należy najpierw znieczulić i umieścić na tkance nasączonej środkami znieczulającymi. Ryba jest następnie umieszczana za oknem ochrony radiowej. Przygotowuje się strzykawkę zawierającą 50 mikrolitrów fluorodeoksyglukozy.

Rybę umieszcza się na plecach i wstrzykuje dootrzewnowo 50 mikrolitrów FDG o stężeniu 20 megabekereli. Rybę umieszcza się następnie na innej tkance nasączonej środkami znieczulającymi. Jest delikatnie owinięty i umieszczony na ramieniu skanera PET.

Ramię jest wprowadzane do skanu PET i wykonywana jest procedura obrazowania. Tutaj można zauważyć, że FDG jest wykrywany nie tylko w miejscu wstrzyknięcia, ale także w głowie ryby, zwłaszcza w mózgu i wzdłuż rdzenia kręgowego. W tym badaniu przedstawiamy dwie różne metody ustalania ostrej i przewlekłej hiperglikemii u danio pręgowanego i pokazujemy, że hiperglikemia upośledza proliferację komórek mózgowych w normalnych warunkach i warunkach wywołanych urazem.

Podsumowując, danio pręgowany może być wykorzystany jako odpowiedni model do badania szkodliwych skutków hiperglikemii w ośrodkowym układzie nerwowym. Umożliwia również ocenę biodystrybucji cząsteczek znakowanych radioaktywnie za pomocą skanu PET.