Funkcjonalna manipulacja matczynymi produktami genowymi z wykorzystaniem dojrzewania oocytów in vitro u danio pręgowanego

Ogólnym celem tego protokołu jest przeprowadzenie dojrzewania in vitro oocytów ryb danio pręgowanego oraz, w razie potrzeby, funkcjonalna manipulacja produktami genów matki przed zapłodnieniem. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, dotyczące znaczenia wkładu matki w zarodek. Główną zaletą tej techniki jest hodowla oocytów in vitro, a następnie zapłodnienie i produkcja zdolnych do życia zarodków.

A w razie potrzeby pozwala na funkcjonalną manipulację matczynymi produktami genowymi, które działają we wczesnym zarodku natychmiast po zapłodnieniu. Aby rozpocząć, osiem do 10 dni przed manipulacją kulturą in vitro, użyj siatki rybackiej, aby przenieść wiele zestawów pojedynczego samca i jednej samicy ryby pożądanego szczepu do zbiornika godowego. Zostaw je na noc w zbiorniku współpracującym.

Po umożliwieniu rybom łączenia się w pary następnego popołudnia, użyj siatki rybackiej, aby oddzielić samice, które składają jaja podczas krycia i umieść je w osobnym zbiorniku. Karm te samice dwa razy dziennie mieszanką pokarmową zawierającą w przybliżeniu równą ilość krewetek solankowych i płatków pokarmu dla ryb. W sterylnych warunkach dodaj 20 mililitrów pożywki L-15 firmy Leibovitz z l-glutaminą, PH 7,0, do 50-mililitrowej stożkowej probówki.

Następnie użyj 10 normalnych wodorotlenków sodu, aby doprowadzić go do pH 9,0. Dodaj 9 mililitrów L-15 Medium do dwóch oddzielnych 50-mililitrowych stożkowych probówek. Następnie oznacz jedną rurkę DHP, a drugą DHP.

W probówce DHP dodaj 10 mikrolitrów DHP, 490 mikrolitrów DH2O i 500 mikrolitrów 10% BSA. W probówce DHP dodaj 100 mikrolitrów 10 miligramów na mililitr gentamycyny, 400 mikrolitrów DH2O i 500 mikrolitrów 10% BSA. Aby przeprowadzić sekcję oocytów, należy rozpocząć od przygotowania 0,2% roztworu podstawowego trikainy w DH2O, buforowanego do pH 7,0 z jednym molowym trisem PH 9,0.

Utrzymuj ten roztwór w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Od zera do czterech godzin przed końcem dziennego cyklu świetlnego w obiekcie, w zlewce o pojemności 250 mililitrów dodaj 20 mililitrów 0,2% roztworu podstawowego trikainy o pH 7,0 do 80 mililitrów wody dla ryb i wymieszaj. Bardzo ważne jest, aby rozpocząć procedurę w ciągu czterech godzin od końca cyklu światła dziennego, do którego ryby są przyzwyczajone.

W przeciwnym razie oocyty nie dojrzeją prawidłowo. Za pomocą łyżki zbierz uśpioną rybę z roztworu tricainy i krótko opłucz ją w wodzie dla ryb. Następnie połóż rybę na ręczniku papierowym, aby wchłonąć nadmiar wody.

Użyj czystej żyletki, aby odciąć głowę uśpionej ryby na poziomie płetwy piersiowej. Następnie nożyczkami preparacyjnymi wykonaj podłużne nacięcie po brzusznej stronie ryby, rozciągające się od przedniego końca do okolicy odbytu. Umieść rybę na szalce Petriego pod mikroskopem preparacyjnym przy padającym świetle.

Następnie, za pomocą kleszczy preparacyjnych, wyizoluj części jajnika i przenieś tkankę do naczynia hodowlanego o wymiarach 35 na 10 milimetrów, zawierającego cztery mililitry L-15 Meidum Leibovitz, DHP. Teraz za pomocą kleszczy preparacyjnych delikatnie odłącz oocyty od masy pęcherzykowej. Sortuj cztery oocyty we wczesnym stadium, które są prawie maksymalnego rozmiaru i charakteryzują się ciemną, nieprzezroczystą cytoplazmą oraz łatwo widocznym pęcherzykiem zarodkowym lub GV, umieszczonym asymetrycznie w oocycie.

Odrzuć oocyty na wcześniejszych etapach i półprzezroczyste dojrzałe jaja w stadium 5. Użyj szklanej pipety pastewnej, aby przenieść cztery oocyty we wczesnym stadium do drugiej plastikowej płytki hodowlanej o wymiarach 35 na 10 milimetrów, zawierającej cztery mililitry pożywki L-15 firmy Leibovitz oraz DHP. Przenieść minimalne ilości pożywki minus DHP do naczynia zawierającego plus roztwór DHP.

W przypadku wstrzykiwania mRNA, bezpośrednio przed wstrzyknięciem, należy użyć wody z odwróconej osmozy klasy RNA i 0,2 molowego chlorku potasu, aby rozcieńczyć MRNA do końcowego roztworu 0,1 molowego chlorku potasu. W przypadku wstrzykiwania Morfolinosów lub MO bezpośrednio przed wstrzyknięciem, należy rozcieńczyć MO do pożądanego stężenia za pomocą wody z odwróconej osmozy klasy RNA i 0,2 molowego chlorku potasu, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,1 molowego chlorku potasu. Następnie, aby przeprowadzić wstrzyknięcie, ręcznie przytrzymaj oocyty cienkimi kleszczami i za pomocą igły wykonanej za pomocą ciągniętej szklanej pipety kapilarnej wstrzyknij około jednego nanolitra do oocytów typu dzikiego w czwartym stadium.

Kontynuuj inkubację niedojrzałych i wstrzykniętych oocytów w pożywce DHP w temperaturze 26,5 stopni Celsjusza. Sprawdzaj mniej więcej co 30 minut, aby upewnić się, że oocyty pozostają nienaruszone i przechodzą prawidłowe dojrzewanie, stając się stopniowo przezroczyste. Użyj pipety pastwiskowej, aby usunąć wszelkie lizy jajowe.

I wyrzuć je do zlewki na odpady laboratoryjne, aby zachować jakość podłoża. Mając około połowy objętości świeżej pożywki DHP, wymień pożywkę hodowlaną, aby utrzymać klarowny roztwór, w zależności od ilości lizy oocytów. Kiedy większość oocytów stanie się przezroczysta i ma GV, który nie jest już widoczny, użyj bardzo cienkich kleszczyków, aby zrobić rozdarcie błony pęcherzykowej, w obszarze o zwiększonej przestrzeni między oocytem a błoną.

Oderwij część błony i przytrzymując obraną część, wytocz oocyt z błony. Kolejnym krytycznym krokiem jest usunięcie błony mieszkowej. Jeśli ta warstwa nie zostanie całkowicie usunięta, nawożenie i rozszerzanie się kosmówki będzie utrudnione.

Przenieść zdeflkulowane oocyty w minimalnej objętości pożywki na szalkę Petriego z kilkoma kroplami pożywki hodowlanej DHP i przystąpić do zapłodnienia. Pod koniec etapu dojrzewania oocytów, a przed defokulacją, przygotuj roztwór nasienia, używając jąder od pięciu samców w 500 mikrolitrach roztworu Hanka. Dodać od 10 do 50 mikrolitrów roztworu plemników do zdeflkulowanych oocytów w pożywce hodowlanej DHP.

Następnie odczekaj 10 sekund. Za pomocą pipety dodaj kilka kropli pożywki E3 do oocytów. Odczekaj minutę, a następnie użyj podłoża E3, aby zalać płytkę.

Po umożliwieniu rozwoju zapłodnionych zarodków należy użyć mikroskopu preparacyjnego z optyką światła przechodzącego, aby obserwować postęp przez etapy rozszczepienia, aby zapewnić pomyślne zapłodnienie, jak opisano wcześniej dla zapłodnienia i etapu. Jak widać po ekspresji GFP, oocyty z hodowli in vitro są w stanie wytwarzać białko z egzogennego mRNA przez cały okres rozwoju oocytów w ciągu zaledwie dwóch godzin. Jednak tylko oocyty, które zainicjują warunki hodowli na czwartym etapie oogenezy, mogą przekształcić się w dojrzałe oocyty w piątym etapie.

W tym eksperymencie wstrzyknięte mRNA zorzy polarnej typu dzikiego ratuje fenotypowe skutki mutacji w odpowiadającym jej genie, wyspie komórkowej. Zarodki z grupy kontrolnej mogą również rozwijać się, aby wykazać odpowiedni zmutowany fenotyp. Wstrzyknięcie Morpholino blokującego translację może z powodzeniem fenokopiować znany zmutowany fenotyp, jak pokazano przez wstrzyknięcie lrmp-MO do oocytów, co naśladuje zmutowany fenotyp odpowiedniego daremnego cyklu mutacji.

Kodowanie mRNA można również wstrzykiwać do oocytów typu dzikiego lub zmutowanego, aby uwidocznić odpowiednie produkty we wczesnym zarodku. Na przykład, jak widać tutaj, białko Sass6-mCherry lokalizuje się w ogniskach znakowanych markerem centrosomów tubuliną Gamma. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około 5 do 6 godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Przystępując do tego zabiegu, należy pamiętać o tym, aby nie spieszyć się z zabiegiem, a pozwolić na prawidłowe dojrzewanie oocytów przed defolkulacją i zapłodnieniem. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak utrwalanie zarodków, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Takich jak uratowanie interesującego Cię genu lub lokalizacja RNA lub białka.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się wczesną genezą zarodków do zbadania wpływu produktów genów matczynych na danio pręgowanego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak funkcjonalnie manipulować produktami genów matki poprzez dojrzewanie in vitro oocytów zebry.