Przygotowanie i obserwacja grubych próbek biologicznych metodą skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie trójwymiarowej rekonstrukcji z odzyskiem głębi ostrości grubej próbki biologicznej za pomocą skaningowej tomografii elektronowej ze skaningiem konwergentnym. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii strukturalnej dotyczące tomografii elektronowej grubych próbek biologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że obrazy mogą być pozyskiwane w trybie bitów konwergentnych, a przetwarzanie danych może odbywać się na większości programów dedykowanych do tomografii.

Aby rozpocząć przygotowywanie próbki do hodowli komórkowej, należy odwirować próbkę o masie 5000 x g przez pięć minut. Używaj tych parametrów wirowania podczas przygotowywania próbki. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze PBS wzbogaconym o 4% paraformaldehyd i 2% aldehyd gluterowy.

Inkubować zawiesinę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować mieszaninę, wyrzucić supernatant i przemyć osad trzykrotnie jednomililitrowymi porcjami PBS. Stosując te same warunki inkubacji i procedurę mycia, inkubować osad w jednym mililitrze PBS, wzbogaconym 1% tetratlenkiem osmu, oraz w jednym mililitrze PBS wzbogaconym 2% octanem uranylu.

Następnie schłodzić próbkę do czterech stopni Celsjusza. Odwodnić osad przez kolejne inkubacje w coraz bardziej skoncentrowanych roztworach etanolu. Utrzymanie temperatury próbki wynoszącej cztery stopnie Celsjusza przez cały czas inkubacji, wirowania i mycia.

Ponownie zawiesić odwodniony osad w jednym mililitrze czystego etanolu i inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie pozwól próbce ogrzać się do temperatury pokojowej i odwiruj próbkę. Inkubować osad w coraz bardziej skoncentrowanych roztworach żywicy epoksydowej w temperaturze pokojowej.

Po ostatnim umyciu ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze czystej żywicy epoksydowej i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. Odwirować próbkę i usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach żywicy epoksydowej i utwardzacza. Przenieść zawiesinę do kapsułki.

Inkubuj plastikową kapsułkę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 48 godzin, aby spolimeryzować żywicę. Wyjąć kapsułkę z inkubatora i sprawdzić polimeryzację żywicy. Dodać warstwę żywicy epoksydowej i utwardzacza na osadzoną próbkę i ponownie inkubować kapsułkę w tych samych warunkach.

Zamontuj próbkę osadzoną w żywicy do góry nogami w uchwycie na próbkę. Bezpiecznie zamocuj próbkę na bloku przycinania ultramikrotomu. Odetnij plastikową kapsułkę od próbki w żywicy.

Uformuj odsłoniętą żywicę w piramidę. Następnie przenieś kapsułkę i uchwyt próbki do ruchomego ramienia ultramikrotomu. Zainstaluj nóż do przycinania i prowadzony przez mikroskop popraw kształt piramidy.

Zastąp nóż do przycinania nożem histologicznym. Pod mikroskopem wyreguluj kąt nachylenia kapsuły tak, aby piramida była prostopadła do krawędzi noża. Ustawić prędkość skrawania i podzielić próbkę na sekcje.

Po podziale próbki na sekcje przenieś wybrany fragment do poddanej obróbce siatki miedzianej na bibule filtracyjnej. Pozostaw próbkę do wyschnięcia, a następnie załaduj ją do mikroskopu elektronowego. Aby zaprojektować serię przelotowego pochylenia, najpierw oblicz głębię ostrości wiązki elektronów i maksymalną pozorną grubość próbki.

Na podstawie tych wartości wybierz interwał ostrości i określ liczbę kroków ogniskowej potrzebnych do zobrazowania całej próbki przy maksymalnej grubości pozornej. Następnie, przy małym powiększeniu, zlokalizuj obszar zainteresowania w próbce. Dostosuj wysokość eucentryczną tak, aby zwrot akcji nie wydawał się przesuwać podczas obracania próbki.

Sprawdź, czy zwrot z inwestycji pozostaje widoczny w całym zakresie nachylenia. Wypełnij parametry serii pochylenia przez ogniskową, aby automatycznie zbierać obrazy i rejestrować obrazy. Zaimportuj serię obrazów do programu do przetwarzania obrazów i wyrównaj zebrane obrazy pod tym samym kątem nachylenia w hierarchii piramidalnej.

Znajdź wyrównanie pod każdym kątem nachylenia, układając wyrównane obrazy w stos. Przeglądaj stos, aby upewnić się, że tylko obszar fokusu przesuwa się z obrazu na obraz, i wyrównaj obrazy zgodnie z potrzebami. Po zweryfikowaniu wyrównania w całej próbce połącz informacje o ostrości przy wysokich ustawieniach, aby uzyskać serię z pojedynczym obrazem na kąt nachylenia.

Wykonaj wyszukiwanie wyrównania serii pochylenia na podstawie lokalnych minimów lub znaczników odniesienia. Wykonaj rekonstrukcję 3D i sprawdź uzyskany obraz. Jeśli rekonstrukcja wydaje się rozmyta lub zdeformowana, ponownie wyrównaj oryginalną serię obrazów.

Próbka t. brucei została zobrazowana i przeanalizowana przy użyciu tej metody. Przy kącie nachylenia zera stopni widocznych jest kilka szczegółów kieszeni wiciowej.

Przy wyższym kącie nachylenia wynoszącym 70 stopni ostrość jest wyostrzona tylko część każdego obrazu zebranego w serii przelotowej. Pozycja ta zmienia się w całej serii. Scalając sekcje ostrości, tworzony jest pojedynczy obraz z większą strefą ostrości.

Efekt ten jest jeszcze wyraźniejszy, gdy podkreślone są obszary wysokich częstotliwości z serii Through Focal Tilt. Informacje o wysokiej częstotliwości obejmują większość połączonego obrazu, co wskazuje, że seria pochylenia przez ogniskową została dobrze przetworzona. Po opanowaniu część przetwarzania obrazu można wykonać w ciągu około trzech do czterech godzin, w zależności od wybranych parametrów wyrównania i rekonstrukcji.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że jakość końcowej rekonstrukcji w dużej mierze zależy od jakości poprzednich testów wyrównania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać zbieranie i przetwarzanie obrazu serii przez ogniskową.