Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

Ogólnym celem tego eksperymentu jest porównanie zalet i wad koimmunoprecypitacji lub co-ip oraz testu ligacji zbliżeniowej (pla) w wizualizacji interakcji białek w różnych przedziałach komórkowych. Przedstawione tutaj porównanie dwóch różnych metod może pomóc naukowcom w podjęciu decyzji, która z nich jest lepiej dopasowana do ich konkretnego celu, podczas badania wzorców dystrybucji interakcji białek białkowych w jądrze i cytoplazmie komórki. Główną zaletą co-ip jest wykrywanie autentycznych interakcji białek białkowych.

Natomiast zaletą pla jest szybka analiza interakcji białek instytutu na poziomie pojedynczej komórki. Po wyhodowaniu i zebraniu komórek hex293 zgodnie z protokołem tekstowym, do 3 razy 10 do 6 komórek, dodaj 300 mikrolitrów zimnego roztworu do ekstrakcji cytoplazmatycznej i wiruj komórki z najwyższą prędkością przez 15 sekund. Inkubować ekstrakt na lodzie przez 30 minut, a następnie co 10 minut podczas inkubacji wirować próbkę przez pięć sekund.

Następnie dodaj 16,5 mikrolitra zimnego roztworu do ekstrakcji cytoplazmatycznej, wiruj przez pięć sekund i inkubuj próbkę na lodzie przez pięć minut. Wirować ekstrakt przez pięć sekund i odwirować próbkę w temperaturze 16 000 x g i 4 stopnie Celsjusza przez pięć minut. Przenieść supernatent do nowej, wstępnie schłodzonej probówki i trzymać ją na lodzie do momentu użycia, a następnie użyć jednego mililitra zimnego PBS do trzykrotnego przemycia nierozpuszczalnych granulek, pipetując w górę iw dół i usuwając PBS po każdym praniu.

Następnie dodaj 150 mikrolitrów zimnego roztworu do ekstrakcji jądrowej, wiruj przez 15 sekund i inkubuj na lodzie przez godzinę. Co 10 minut podczas inkubacji należy wirować próbkę przez 15 sekund i użyć końcówki o pojemności 200 mikrolitrów, aby odpipetować roztwór 10 razy. Wirować probówkę przez 15 sekund i odwirować próbkę w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie przenieść supernatent zawierający ekstrakt jądrowy do nowej wstępnie schłodzonej probówki i przechowywać ją na lodzie do czasu użycia.

Usuń 10% każdej objętości ekstraktów jądrowych i cytoplazmatycznych jako wejście, a następnie dodaj zimny PBS do pozostałych ekstraktów do końcowej objętości jednego mililitra. Trzymaj na lodzie do czasu użycia. Po wstępnym oczyszczeniu sprzężonych kulek magnetycznych z białkiem g, jeśli to konieczne, połącz 40 mikrolitrów sprzężonych kulek magnetycznych z białkiem g z czterema mikrogramami szybkiego poliklonalnego przeciwciała anty-RBM3 lub szybkiego IGG jako kontroli ujemnej w 200 mikrolitrach PBST.

Inkubować do temperatury pokojowej na rotorze przez 40 minut. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, a następnie wyjmij i wyrzuć supernatent. Następnie za pomocą 200 mikrolitrów PBST umyj kulki raz.

Dodaj jeden mililitr rozcieńczonych lizianów do kulek i inkubuj na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia umieść probówki na stojaku magnetycznym i zassaj supernatent. Dodaj 0,5 mililitra PBST do kulek i umyj je trzykrotnie na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ze stałą prędkością 20 obr./min przez 10 minut.

Eluować białko z kulek, dodając 40 mikrolitrów buforu do próbki, a następnie podgrzewać próbkę w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po odkręceniu kulek przenieś płyn do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Aby przeprowadzić chemię immunocytową, wysiewaj komórki HEK293 w proporcji 1,5 razy 10 do czterech komórek w komorze w ośmiokomorowym szkiełku pokrytym polidelizyną.

W 0,4 mililitra DMEM uzupełniony o 10% FPS i 100 jednostek na mililitr penstrepu. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin, a następnie odessaj pożywkę i użyj 4% PFA, aby utrwalić komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut w okapie z przepływem laminarnym. Następnie odessaj PFA i użyj 0,5 mililitra PBS na komorę, aby trzykrotnie przemyć komórki.

Dodaj 0,5% tritonX100 z 5% NGS i PBS, aby przeniknąć i zablokować komórki i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie, po rozcieńczeniu poliklonalnych przeciwciał pierwszorzędowych anty NF90 i anty RBM3 w stosunku jeden do 100, dodaj przeciwciała pierwszorzędowe do studzienek i inkubuj na wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia użyj 0,5 mililitra PBS do trzykrotnego umycia komór po 10 minut każda.

Aby przeprowadzić chemię immunocytową, dodaj do komórek rozcieńczenie od jednego do 500 przeciwciał przeciw myszom sprzężonym z zielonym barwnikiem fluorescencyjnym i czerwonych barwników fluorescencyjnych sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Dodać rozcieńczenie DAPHE NBPS w proporcji jeden do 5 000 w celu wybarwienia jąder i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie przepłukać próbki PBS jak poprzednio. Wyjmij komory ze szkiełka i wysusz je, Przed użyciem 250 mikrolitrów medium montażowego na szkiełko do ich zamontowania.

Aby przygotować probówki do ligacji zbliżeniowej, po inkubacji komórek i przeciwciał pierwszorzędowych oraz umyciu, jak właśnie pokazano, rozcieńczyć gotowe sondy od jednego do 5 w 0,1% tritonx100 i 5% NGS i PBS, w łącznej objętości 320 mikorlitrów na jedno ośmiokomorowe szkiełko. Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Wyjmij komory od strony szklanej i dodaj rozcieńczone sondy, a następnie inkubuj komory w inkubatorze wilgotności w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Przygotuj roztwór do ligacji, mieszając osiem mikrolitrów ligazy, 64 mikrolitry 5-krotnego bulionu do podwiązania i 248 mikrolitrów wody. Strzepnij płyn ze szkiełka i użyj onex buforu do płukania A, aby umyć próbki dwukrotnie przez pięć minut każda. Dodać roztwór do ligacji do próbek i inkubować je w inkubatorze wilgotnościowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Przygotuj roztwór do amplifikacji, mieszając cztery mikrolitry polimerazy, 64 mikrolitry 5-krotnego bulionu wzmacniającego i 252 mikrolitry wody i zawiń probówkę w folię, aby chronić ją przed światłem. Następnie strzepnąć płyn ze szkiełka i użyć jednego x bufor płuczący A, aby umyć próbki dwukrotnie po dwie minuty każda. Dodać roztwór amplifikacyjny do próbek i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemnym, wilgotnym inkubatorze przez 100 minut.

Następnie, po spuszczeniu cieczy jak poprzednio, umyj próbki dwukrotnie przez 10 minut każda w buforze do płukania B, a następnie umyj je raz w 0,1 x buforze do płukania B. Na koniec wysusz szkiełko i zamontuj próbki za pomocą 250 mikrolitrów komercyjnego medium montażowego z DAPHE, zbadaj fluorescencję pod mikroskopem i uzyskaj obrazy za pomocą kamery CCD. Eksperymenty z koimmunoprecypitacją z RBM3 jako białkiem przynęty wykazały, że interakcje NF90-RBM3 są głównie obecne w jądrze, a mniejszość znajduje się w cytoplazmie. W tym eksperymencie immunofluorescencyjnym NF90 i RBM3 są widoczne w jądrze.

Oba białka znajdują się również w cytoplazmie w C2 i oba białka wykazują doskonałą kolokalizację w każdym przedziale. Jak widać na tych obrazach, test ligacji zbliżeniowej ujawnił wzorzec interakcji NF90-RBM3, który jest bardzo podobny do konwencjonalnej chemii immunocytarnej, która większość interakcji w jądrze w większości komórek. Tylko niewielka część komórek wykazywała głównie cytoplazmatyczną dystrybucję interakcji NF90-RBM3.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że chociaż jest to wygodniejsze, PLA nie odzwierciedla bezpośrednio interakcji białek białkowych. Zamiast tego co-ip wykrywa ukierunkowaną interakcję. Ponadto swoistość przeciwciała pierwszorzędowego decyduje o jakości wyniku.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wybrać odpowiednią metodę badania interakcji białek białkowych w różnych przedziałach komórkowych zgodnie z własnym celem eksperymentalnym.