Name: Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj metody koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej do wizualizacji interakcji białko-białko w jądrze i cytoplazmie komórek HEX293. Dowiedz się, która technika lepiej odpowiada Twoim celom badawczym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (SNSF, 31003A_163305).

1. Koimmunoprecypitacja
<ol>
	<li>Nasiona komórek HEK293 w 2 x 10 5 komórek na studzienkę w jednej 6-dołkowej płytce w 2 ml suplementu Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny (Pen-Strep).</li>
	<li>Hoduj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Umyj komórki zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) trzykrotnie. Zbierać komórki przez odwirowanie w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj frakcje jądrowe i cytoplazmatyczne przy użyciu komercyjnych odczynników do ekstrakcji jądrowej i cytoplazmatycznej. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta z pewnymi modyfikacjami.
	<ol>
		<li>Użyj 3 x 106 komórek do jednego eksperymentu z koimmunoprecypitacją (w przybliżeniu z 90% konfluencją z 3 dołków jednej 6-dołkowej płytki). Dodać 300 μl zimnego roztworu do ekstrakcji cytoplazmatycznej (CER I) i wirować przez 15 sekund z najwyższą prędkością.</li>
		<li>Inkubować przez 30 minut na lodzie. Podczas inkubacji wirować przez 5 s co 10 minut.</li>
		<li>Dodać 16,5 μl zimnego roztworu do ekstrakcji cytoplazmatycznej II (CER II), wirować przez 5 sekund i inkubować przez 5 minut na lodzie.</li>
		<li>Wirować przez 5 sekund i wirować przy 16 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść supernatant (ekstrakt cytoplazmatyczny) do nowej, wstępnie schłodzonej probówki i przechowywać na lodzie do momentu użycia.</li>
		<li>Przemyć nierozpuszczalne granulki (zawierające jądra) trzykrotnie 1 ml zimnego PBS za każdym razem, pipetując w górę i w dół pięć razy. Usuń PBS po umyciu.</li>
		<li>Dodać 150 μl zimnego roztworu do ekstrakcji jądrowej (NER), wirować przez 15 sekund i inkubować przez 1 godzinę na lodzie. Podczas inkubacji wirować przez 15 sekund i pipetować 10 razy końcówką o pojemności 200 μl co 10 minut.</li>
		<li>Wirować przez 15 s i wirować przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść supernatant (ekstrakt jądrowy) do nowej, wstępnie schłodzonej probówki, przechowywać na lodzie do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń 10% objętości ekstraktów jądrowych i cytoplazmatycznych jako dane wejściowe.</li>
	<li>Dodać zimny PBS do pozostałych ekstraktów do końcowej objętości 1 ml. Przechowywać na lodzie do czasu użycia. 
	UWAGA: Wstępne oczyszczanie nie jest konieczne w przypadku stosowania kulek magnetycznych sprzężonych z białkiem G. Jeśli jednak tło jest wysokie, należy przeprowadzić wstępne oczyszczanie przez inkubację 40 μl kulek magnetycznych sprzężonych z białkiem G (50% zawiesiny) i 1 ml rozcieńczonego lizatu z tego etapu w temperaturze 4 °C przez 30 minut na rotatorze. Oddzielić supernatant (wstępnie oczyszczony lizat) od kulek za pomocą stojaka magnetycznego. Wyrzuć koraliki.</li>
	<li>Aby połączyć przeciwciało pierwszorzędowe z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G, inkubuj 40 μl kulek magnetycznych sprzężonych z białkiem G (50% zawiesiny) z 4 μg poliklonalnego przeciwciała anty-RBM3 królika lub króliczej IgG (kontrola ujemna) w 200 μl PBS plus bufor Tween 20 (PBST, 0,02% Tween 20) w temperaturze pokojowej (RT) przez 40 minut na rotatorze.</li>
	<li>Oddzielić kulki sprzężone z przeciwciałami i supernatant za pomocą stojaka magnetycznego i odrzucić supernatant. Umyj kulki raz 200 μl PBST (0,02%).</li>
	<li>Dodać 1 ml rozcieńczonych lizatów (lub, jeśli to konieczne, wstępnie oczyszczonych lizatów) do kulek i inkubować na rotatorze w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia oddziel koraliki i supernatant za pomocą stojaka magnetycznego i wyrzuć supernatant. Przemyć 3 x 10 minut 0,5 ml PBST (0,02%) dla każdej probówki w temperaturze 4 °C na rotatorze o stałej prędkości 20 obr./min.</li>
	<li>Elutować białka z kulek, dodając 40 μl buforu do próbek (1x komercyjny bufor do próbek i 50 mM 1,4-ditiotreitol (DTT)). Podgrzewać w temperaturze 70 °C przez 10 min. Zakręć i przenieś płyny do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Rozcieńczyć wejściowe lizaty w buforze próbki (stężenie końcowe: 1x komercyjny bufor próbki i 50 mM DTT) i ogrzewać w temperaturze 70 °C przez 10 min. Załaduj dane wejściowe i immunoprecypitowane białka z ostatniego etapu do prefabrykowanego 4-12% żelu bis-Tris. Objętość załadunku każdej studzienki nie powinna przekraczać 20 μl. Wykonaj elektroforezę w 1x komercyjnym buforze do biegania na lodzie przez 35 min. 
	UWAGA: Załaduj ekstrakty jądrowe i cytoplazmatyczne w stosunku 1:2 (V/V), który odzwierciedla tę samą początkową ilość komórek.</li>
	<li>Przenieś białka do membrany PVDF w 1x komercyjnym buforze transferowym przy 30 V przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zablokuj membranę 5% odtłuszczonym mlekiem w PBST (0,1% Tween 20) w temperaturze pokojowej przez 40 minut na shakerze.</li>
	<li>Inkubować błonę z pierwszorzędowymi przeciwciałami (oba rozcieńczone w stosunku 1:1 000) w PBST (0,1%) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Myć 3 x 10 min PBST (0,1%) w temperaturze pokojowej na shakerze.</li>
	<li>Inkubować błonę z sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) przeciwciałami drugorzędowymi przeciwko mysim lub królikom (oba rozcieńczone w stosunku 1:5 000) w PBST (0,1%) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Myć 3 x 10 min PBST (0,1%) w temperaturze pokojowej na shakerze.</li>
	<li>Użyć 0,2 ml mieszaniny substratów ze wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) na cm2 membrany, inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Od tego kroku należy unikać wszelkiego światła z wyjątkiem czerwonych świateł.</li>
	<li>Wylej płyn i wystaw na kliszę rentgenowską w kasecie z filmem. Wywołaj film za pomocą automatycznej maszyny do obróbki filmu.</li>
</ol>
2. Immunocytochemia i test ligacji zbliżeniowej
<ol>
	<li>Nasiona komórek HEK293 o wymiarach 1,5 x 104 komórki na komorę w jednym 8-komorowym szkiełku pokrytym poli-D-lizyną w 0,4 ml DMEM uzupełnionym 10% FBS i 100 U/ml Pen-Strep.</li>
	<li>Hoduj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Odessać pożywkę i utrwalić komórki 4% paraformaldehydem (PFA) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać PFA i przemyć 3 x 10 min 0,5 ml PBS na komorę.</li>
	<li>Przepuszczalność i blokowanie komórek za pomocą 0,5% Triton X-100 i 5% normalnej surowicy koziej (NGS) w PBS w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi w 0,1% Triton X-100 i 5% NGS w PBS na wytrząsarce w temperaturze 4 °C przez noc. Rozcieńczyć mysie przeciwciało monoklonalne anty-NF90 i poliklonalne przeciwciało anty-RBM3 królika 1:100 w PBS do podwójnego barwienia. W przypadku kontroli ujemnej należy pominąć niezależnie jedno z dwóch przeciwciał pierwszorzędowych i pominąć oba przeciwciała w trzeciej kontroli. 
	UWAGA: Nie używaj komercyjnych odczynników blokujących i rozcieńczających.</li>
	<li>Myć 3 x 10 min po 0,5 ml PBS na komorę.</li>
	<li>Podlega protokołom immunocytochemii lub testu ligacji zbliżeniowej
	<ol>
		<li>Immunocytochemia
		<ol>
			<li>Inkubować z rozcieńczonymi w stosunku 1:500 przeciwciałami drugorzędowymi przeciwko myszom sprzężonym z zielonym barwnikiem i czerwonymi przeciwciałami drugorzędowymi przeciwko królikom sprzężonym z barwnikiem czerwonym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Unikaj światła od tego etapu.</li>
			<li>Jądra barwnika przeciwstawnego 4′, 6-diamidyn-2-fenylindoldolem (DAPI) rozcieńczone w stosunku 1:5 000 w PBS w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
			<li>Myć 3 x 10 min po 0,5 ml PBS na komorę.</li>
			<li>Wyjmij komory ze szkiełka i wysusz. Montaż z 250 μ, średni montaż na prowadnicę.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Test ligacji zbliżeniowej
		<ol>
			<li>Przygotuj sondy do oznaczania ligacji zbliżeniowej. Wymieszaj i rozcieńcz dwie sondy do ligacji zbliżeniowej (przeciwciała drugorzędowe przeciwko myszom i królikom przyłączone do różnych oligonukleotydów, które mogą ligować poprzez dodanie dwóch innych oligonukleotydów w roztworze ligacji) zarówno 1:5 w 0,1% Triton X-100, jak i 5% NGS w PBS, o całkowitej objętości 320 μl dla jednego szkiełka 8-komorowego (około 40 μl nacm2). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
			<li>Wyjmij komory ze szkiełka i dodaj rozcieńczone sondy. Inkubować w inkubatorze wilgotnościowym w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
			<li>Przygotuj roztwór do podwiązywania. Zmieszać 8 μl ligazy, 64 μl 5 x podwiązanie i 248 μl H2O.</li>
			<li>Strzepnij płyn ze szkiełka i umyj 2 x 5 minut w 1x buforze myjącym A (dostarczonym z zestawem).</li>
			<li>Dodać roztwór do ligacji i inkubować w inkubatorze wilgotnościowym w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
			<li>Przygotować roztwór do amplifikacji. Zmieszaj 4 μl polimerazy, 64 μl 5x bulion wzmacniający i 252 μl H2O. Od tego kroku unikaj światła.</li>
			<li>Strzepnąć płyn ze szkiełka i umyć 2 x 2 minuty w 1x buforze do płukania A.</li>
			<li>Dodać roztwór do amplifikacji i inkubować w inkubatorze o ciemnej wilgotności w temperaturze 37 °C przez 100 minut.</li>
			<li>Strzepnij płyn ze szkiełka i umyj 2 x 10 minut w 1x buforze do płukania B (dostarczonym z zestawem). Myć przez 1 minutę w 0,01x buforze do płukania B.</li>
			<li>Osusz szkiełko i zamontuj za pomocą 250 μl dostępnego w handlu medium montażowego (z DAPI) na szkiełko.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbadaj sygnały fluorescencyjne pod mikroskopem za pomocą soczewki okularowej 10X i soczewki obiektywowej 20X. Rejestruj obrazy za pomocą kamery CCD.</li>
</ol>

<ol><li>Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF90+isoforms%2C+a+new+family+of+cellular+proteins+involved+in+viral+replication%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication?</a> Biochimie. 108, 20-24 (2015).</li>
<li>Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+of+NF90+is+required+for+interleukin-2+mRNA+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization.</a> Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).</li>
<li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NF90-NF45+complex+functions+as+a+negative+regulator+in+the+microRNA+processing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway.</a> Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).</li>
<li>Dresios, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+stress-induced+protein+Rbm3+binds+60S+ribosomal+subunits%2C+alters+microRNA+levels%2C+and+enhances+global+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).</li>
<li>Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+expression+of+mouse+Rbm3%2C+a+cold-shock+protein%2C+in+Sertoli+cells+of+cryptorchid+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis.</a> Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).</li>
<li>Wellmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-regulated+expression+of+the+RNA-binding+proteins+RBM3+and+CIRP+by+a+HIF-1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).</li>
<li>Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-inducible+RBM3+inhibits+PERK+phosphorylation+through+cooperation+with+NF90+to+protect+cells+from+endoplasmic+reticulum+stress%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress.</a> FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitation+of+the+Mouse+Mx1+Protein+with+the+Influenza+A+Virus+Nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).</li>
<li>Jarvius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+phosphorylated+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta+using+a+generalized+proximity+ligation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein-protein+interactions+in+cross-talk+pathways+reveals+CRKL+protein+as+a+novel+prognostic+marker+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obie metody mają wiele zalet, ale także wad. Jako stosunkowo nowa technika, oczywistą zaletą testu ligacji zbliżeniowej jest możliwość wyjaśnienia interakcji białko-białko na poziomie pojedynczej komórki, a nie partii heterogenicznych komórek. Obrazy o dużej jasności i rozdzielczości (np. za pomocą mikroskopu konfokalnego) dają możliwość kwantyfikacji poprzez zliczanie pojedynczych plamek fluorescencyjnych. W przeciwieństwie do tego, konwencjonalne połączenie techniki koimmunoprecypitacji z Western blot może tyl...

Czynnik jądrowy 90 (NF90) to białko wieloizoformowe o wielu funkcjach, w tym odpowiedzi na infekcję wirusową, regulacji interleukiny-2 po transkrypcji i regulacji biogenezy miRNA 1-3. RBM3 jest białkiem wiążącym RNA, zaangażowanym w translację i biogenezę miRNA i może być indukowany przez różne czynniki stresogenne, w tym hipotermię i niedotlenienie 4-6. Niedawno znaleźliśmy NF90 i RBM3 w kompleksie białkowym 7. Interakcja NF90 i RBM3 jest niezbędna do modulowania aktywności kinazy białkowej RNA podobnej do kinazy białkowej (PERK) w niesfałdowanej odpowiedzi białkowej 7. Zarówno NF90, jak i RBM3 znajdują się głównie w jądrze, ale niewielka część NF90 i RBM3 przemieszcza się do cytoplazmy i wiąże się tam ze sobą w określonych funkcjach, np. w celu regulacji aktywności PINK. Dlatego ważne jest, aby zobrazować rozkład oddziaływań NF90-RBM3 w przedziale subkomórkowym, co może wskazywać na ich różne role w danym przedziale.
Dekady temu, drożdże dwie hybrydy (Y2H) zostały opracowane do wykrywania interakcji między dwoma białkami 8. Jednak ze względu na sztuczną konstrukcję skondensowanych białek, wyniki fałszywie dodatnie ograniczyły zastosowanie tej metody. Przez długi czas koimmunoprecypitacja była główną techniką analizy oddziaływań białko-białko, zwłaszcza w warunkach endogennych 9. Do analizy koimmunoprecypitowanego kompleksu białkowego najwygodniejszą techniką jest Western blot, podczas gdy spektrometria mas jest stosowana, gdy pożądana jest super czułość i dokładność. W ostatnich latach opracowano test ligacji zbliżeniowej jako nową metodę wykrywania interakcji białko-białko zarówno w komórkach, jak i tkankach in situ 10,11.
Tutaj porównaliśmy najpopularniejszą metodę koimmunoprecypitacji i stosunkowo nowatorską metodę ligacji zbliżeniowej w wychwytywaniu interakcji NF90-RBM3 we frakcjach subkomórkowych. Omówiliśmy również zalety i ograniczenia obu technik.

<table><tbody><tr><td>Zmodyfikowany orzeł Dulbecco" s Medium (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>Wysoka zawartość glukozy 4,500 mg/L</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (PenStrep)</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>NE-PER Odczynniki do ekstrakcji jądrowej i cytoplazmatycznej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>1,4-ditiotreitol (DTT)</td><td>Carl Roth</td><td>6908.3</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>DRBP76 (NF90/NF110)</td><td>przeciwciało BD Transduction Laboratories</td><td>612154</td><td>używać 1:1,000 dla WB i 1:100 dla przeciwciała ICC/PLA</td></tr><tr><td>RBM3</td><td>ProteinTech</td><td>14363-1-AP</td><td>używa 1:1,000 dla WB i 1:100 dla ICC/PLA</td></tr><tr><td>Przeciwciało A/C</td><td>Technologia</td> <td>sygnalizacji komórkowej#2032</td><td>użyj 1:1,000 dla WB&nbsp;</td></tr>przeciwciało <tr><td>anty-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td>użyj 1:1,000 dla WB&nbsp;</td></tr><tr><td>normalny królik IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2027</td><td></td></tr><tr><td>anty-królicze IgG, wtórne przeciwciało sprzężone z HRP</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td>#<td>7074</td><td>użyj 1:5,000 dla WB&nbsp;</td></tr><tr><td>przeciwciało drugorzędowe przeciw mysim HRP</td><td>Carl Roth</td><td>4759.1</td><td>zastosowanie 1:5,000 dla WB&nbsp;</td></tr><tr><td>Klarowny Western Podłoże do bibułowania ECL</td><td>Bio-Rad</td><td>#1705060</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Bufor do próbek (4x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>Bufor transferowy NuPAGE (20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hypond P 0,2 Membrana PVDF</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide Corning</td><td>BioCoat</td><td>354632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia (NGS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG (przeciwciało H+L), koniugat Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG (przeciwciało H+L), koniugat Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific A-11011</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;, 6-Diamidin-2-fenylindol (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Duolink PLA sonda Anti-mouse PLUS</td><td>Sigma DUO92001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duolink PLA&nbsp; sonda Anti-rabbit MINUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92005</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do wykrywania Duolink Czerwone</td> <td>myjące Sigma</td><td>DUO92008</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Fluorescencja</td><td>Sigma</td><td>DUO82049</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Podłoże montażowe z DAPI</td><td>Sigma</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Charakterystyka 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>AX-70</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>SPOT</td><td>Insight 2MP Firewire</td><td></td></tr><tr><td>Film Xray Fujifilm</td><td></td><td>Super RX</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do przetwarzania filmów</td><td>Fujifilm</td><td>FPM-100A</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Interakcje białko-białko są zaangażowane w tysiące procesów komórkowych i występują w różnych kontekstach przestrzennych. Tradycyjnie, koimmunoprecypitacja jest popularną techniką wykrywania interakcji białko-białko. Późniejsza analiza Western blot jest najpowszechniejszą metodą wizualizacji białek współimmunoprecypitowanych. Ostatnio test ligacji zbliżeniowej stał się potężnym narzędziem do wizualizacji interakcji białko-białko in situ i daje możliwość ilościowego określenia interakcji białko-białko za pomocą tej metody. Podobnie jak konwencjonalna immunocytochemia, technika ligacji zbliżeniowej również opiera się na dostępności pierwotnych przeciwciał przeciwko antygenom, ale w przeciwieństwie do tego, test ligacji zbliżeniowej wykrywa interakcje białko-białko za pomocą unikalnej techniki obejmującej PCR w okręgu tocznym, podczas gdy konwencjonalna immunocytochemia wykazuje tylko kolokalizację białek.
Czynnik jądrowy 90 (NF90) i białko motywu wiążącego RNA 3 (RBM3) zostały wcześniej wykazane jako partnerzy oddziałujący na siebie. Są one zlokalizowane głównie w jądrze, ale również migrują do cytoplazmy i regulują szlaki sygnałowe w przedziale cytoplazmatycznym. Tutaj porównaliśmy interakcję NF90-RBM3 zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie za pomocą testu koimmunoprecypitacji i ligacji zbliżeniowej. Ponadto omówiliśmy zalety i ograniczenia tych dwóch technik w wizualizacji interakcji białko-białko w odniesieniu do rozkładu przestrzennego i właściwości oddziaływań białko-białko.

Rysunek 1 wykazuje, że NF90 i RBM3 są białkami jądrowymi i tylko niewielka ich część znajduje się w cytoplazmie. Co istotne, widoczne są trzy różne prążki wybarwione dodatnio dla RBM3. Najmniejszy z nich, znajdujący się tuż poniżej 20 kDa, odpowiada prawidłowej wielkości RBM3 (przewidywana masa cząsteczkowa RBM3 wynosi 17 kDa). Pochodzenie dwóch pozostałych prążków pozostaje do zbadania. Eksperymenty koimmunoprecypitacji z zastosowaniem białka RBM3 jako białka przynęty uj...

Interakcje białko-białko mogą zachodzić zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie komórki. Aby zbadać te interakcje, stosuje się tradycyjną koimmunoprecypitację i nowoczesny test ligacji zbliżeniowej. W tym badaniu porównujemy te dwie metody wizualizacji rozkładu oddziaływań NF90-RBM3 w jądrze i cytoplazmie.

Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest porównanie zalet i wad ko-immunoprecypitacji (co-ip) oraz testu ligacji w pobliżu (pla) w wizualizacji oddziaływań białko-białko w różnych przedziałach komórkowych. Przedstawione tutaj porównanie dwóch różnych metod może pomóc naukowcom zdecydować, która z nich jest lepiej dostosowana do ich konkretnego celu podczas badania wzorców rozmieszczenia oddziaływań białko-białko w jądrze i cytoplazmie komórki. Główną zaletą metody co-ip jest możliwość wykrycia autentycznych oddziaływań białko-białko.Z kolei zaletą metody PLA jest możliwość szybkiej analizy in situ oddziaływań białko-białko na poziomie pojedynczej komórki. Po wyhodowaniu i zebraniu komórek Hex293 zgodnie z protokołem tekstowym, do 3 × 10⁶ komórek należy dodać 300 µL zimnego roztworu do ekstrakcji cytoplazmatycznej, a następnie mieszać komórki w wirówce typu vortex z maksymalną prędkością przez 15 sekund. Ekstrakt należy inkubować na lodzie przez 30 minut, mieszając próbkę w wirówce typu vortex przez pięć sekund co 10 minut podczas inkubacji.Następnie dodać 16,5 µl zimnego roztworu do ekstrakcji cytoplazmatycznej, wymieszać w wstrząsarku wierzchowej (vortex) przez pięć sekund i inkubować próbkę na lodzie przez pięć minut. Ponownie wymieszać ekstrakt w wstrząsarku przez pięć sekund, a następnie odwirować próbkę przy 16 000 ×g w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Przenieść nadsącz do nowej, schłodzonej wcześniej probówki i przechowywać na lodzie do momentu użycia, a następnie wykorzystać 1 ml zimnego PBS do trzykrotnego przemycia nierozpuszczalnego osadu poprzez pipetowanie w górę i w dół oraz usuwanie PBS po każdym przemyciu.Następnie dodaj 150 µL zimnego roztworu do ekstrakcji jąder komórkowych, wymieszaj w wirówce wortex przez 15 sekund i inkubuj na lodzie przez jedną godzinę. Co 10 minut podczas inkubacji mieszaj próbkę w wortexie przez 15 sekund i za pomocą końcówki 200 µL pipetuj roztwór 10 razy. Wymieszaj probówkę w wortexie przez 15 sekund, a następnie odwirowuj próbkę przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut; następnie przenieś nadlodową ciecz zawierającą ekstrakt jądrowy do nowej, schłodzonej wcześniej probówki i przechowuj na lodzie do momentu użycia.Odbierz po 10% objętości ekstraktów jądrowych i cytoplazmatycznych jako próbki wejściowe, a następnie dodaj zimny PBS do pozostałych ekstraktów do uzyskania objętości końcowej jednego mililitra. Przechowuj na lodzie do czasu użycia. Po ewentualnym uprzednim oczyszczeniu kulek magnetycznych sprzężonych z białkiem G, połącz 40 µl kulek magnetycznych sprzężonych z białkiem G z czterema µg szybkich poliklonalnych przeciwciał anty-RBM3 lub szybkich IgG jako kontroli negatywnej w 200 µl PBST.Inkubować w temperaturze pokojowej na rotatorze przez 40 minut. Umieścić probówki na statywie magnetycznym, następnie usunąć i odrzucić nadsącz. Następnie przemyć kuleczki raz, używając 200 µL PBST.Dodaj 1 ml rozcieńczonych lizatów do kulek i inkubuj na rotatorze w temperaturze 4°C przez noc. Następnego dnia umieść probówki na statywie magnetycznym i odessać nadsącz. Dodaj 0,5 ml PBST do kulek i przemyj je trzykrotnie na rotatorze w temperaturze 4°C, przy stałej prędkości 20 rpm przez 10 minut.Wymyj białko z kulek, dodając 40 µL buforu do próbek, a następnie podgrzewaj próbkę w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Po odwirowaniu kulek przenieś ciecz do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Aby przeprowadzić chemię immunocytochemiczną, wysiej komórki HEK293 w zagęszczeniu 1,5 × 10⁴ komórek na komorę na szkiełku z ośmioma komorami powleczonym polilizyną.W 0,4 ml DMEM uzupełnionego o 10% FPS i 100 jednostek na ml penstrepu. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez 48 godzin, następnie odessać pożywkę i użyć 4% PFA do utrwalenia komórek w temperaturze pokojowej przez 10 minut w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie odessać PFA i użyć 0,5 ml PBS na komorę, aby trzykrotnie przemyć komórki.Dodaj 0,5% tritonX100 z 5% NGS i PBS, aby przeprowadzić permeabilizację i blokowanie komórek, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie, po rozcieńczeniu przeciwciał pierwszorzędowych — monoklonalnych przeciwko NF90 oraz poliklonalnych przeciwko RBM3 — w stosunku 1:100, dodaj przeciwciała pierwszorzędowe do dołków i inkubuj na wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia użyj 0,5 ml PBS, aby trzykrotnie przemyć komory, każdorazowo przez 10 minut.Aby przeprowadzić immunocytochemię, dodać do komórek przeciwciała antymysie sprzężone z zielonym fluorochromem oraz przeciwciała antykrólicze sprzężone z czerwonym fluorochromem w rozcieńczeniu 1:500 i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Dodać DAPHE NBPS w rozcieńczeniu 1:5 000 w celu barwienia jąder komórkowych i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie przemyć próbki PBS w sposób opisany wcześniej. Zdjąć komory ze szkiełka przedmiotowego i osuszyć je przed nałożeniem 250 µL medium montażowego na każde szkiełko w celu ich zamontowania.Aby przygotować sondy do testu ligacji w pobliżu (proximity ligation assay) w probówkach, po inkubacji komórek i przeciwciał pierwszorzędowych oraz przeprowadzeniu płukania w sposób przedstawiony powyżej, należy rozcieńczyć gotowe sondy w stosunku 1:5 w 0,1% tritonx100, 5% NGS i PBS, do całkowitej objętości 320 µl na jeden szkiełko z ośmioma komorami. Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Zdjąć komory z szklanej podstawki i dodać rozcieńczone sondy, a następnie inkubować komory w inkubatorze wilgotnościowym w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.Przygotuj roztwór do ligacji, mieszając 8 µL ligazy, 64 µL 5x zapasu do ligacji oraz 248 µL wody. Odlej ciecz z preparatu, a następnie dwukrotnie przemyj próbki buforem do płukania onex wash buffer A przez pięć minut w każdym cyklu. Dodaj roztwór do ligacji do próbek i inkubuj je w inkubatorze wilgotnościowym w temperaturze 37 °C przez 30 minut.Przygotuj roztwór do amplifikacji, mieszając 4 µL polimerazy, 64 µL 5x zapasu do amplifikacji oraz 252 µL wody, a następnie owiń probówkę folią, aby chronić ją przed światłem. Następnie odlej ciecz z preparatu i użyj 1x buforu do przemywania A, aby przemyć próbki dwukrotnie przez dwie minuty każdorazowo. Dodaj roztwór do amplifikacji do próbek i inkubuj w temperaturze 37 °C w ciemnym, wilgotnym inkubatorze przez 100 minut.Następnie po zlaniu cieczy jak poprzednio, przemyj próbki dwukrotnie przez 10 minut każdorazowo w buforze do mycia B, a następnie jednokrotnie w 0,1 x buforze do mycia B. Na koniec wysusz preparat i zamontuj próbki przy użyciu 250 µL komercyjnego medium montującego z DAPHE, zbadaj fluorescencję pod mikroskopem i wykonaj zdjęcia za pomocą kamery CCD. Eksperymenty koimmunoprecypitacji z wykorzystaniem białka RBM3 jako białka przynęty wykazały, że oddziaływania NF90-RBM3 występują głównie w jądrze komórkowym, a niewielka ich część znajduje się w cytoplazmie. W tym eksperymencie immunofluorescencyjnym zarówno NF90, jak i RBM3 są widoczne w jądrze.Oba białka występują również w cytoplazmie w C2 i oba wykazują pełną kolokalizację w każdym z przedziałów. Jak widać na tych obrazach, test przybliżonej ligacji (proximity ligation assay) ujawnił wzór oddziaływań NF90-RBM3, który jest bardzo podobny do konwencjonalnej immunohistochemii komórkowej, gdzie większość oddziaływań w większości komórek zachodzi w jądrze. Tylko niewielka część komórek wykazała przeważnie cytoplazmatyczną dystrybucję oddziaływań NF90-RBM3.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że mimo swojej wygody, metoda PLA nie odzwierciedla bezpośrednio oddziaływań białko-białko. Zamiast tego, co-ip wykrywa oddziaływanie ukierunkowane. Ponadto jakość wyniku zależy od swoistości przeciwciała pierwszorzędowego.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, w jaki sposób wybrać odpowiednią metodę badania oddziaływań białko-białko w różnych przedziałach komórkowych, w zależności od celu Twojego eksperymentu.

visualization-protein-protein-interaction-nuclear-cytoplasmic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Ten film opisuje test ligacji zbliżeniowej do badania in situ interakcji białko-białko w komórkach nicieni. Bliskie sąsiedztwo badanych białek generuje kolistą matrycę DNA za pomocą sondy PLA dołączonej do przeciwciała wtórnego. Sonda jest dalej amplifikowana za pomocą roztworu do amplifikacji, który wytwarza długie, jednoniciowe DNA, a następnie hybrydyzuje sondę detektora, umożliwiając lokalizację interakcji białko-białko w komórkach.

Test ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ

Ustaliliśmy metodę oczyszczania białek interakcji koregulacyjnych za pomocą systemu LC-MS/MS.

Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj prezentujemy protokół techniki trawienia na błonie do przygotowania próbek do spektrometrii mas. Technika ta ułatwia wygodną analizę oddziaływań białko-białko.

Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

Ilościowe Multiplex Immunoprecipitation (QMI) wykorzystuje cytometrię przepływową do czułego wykrywania różnic w obfitości docelowych interakcji białko-białko między dwiema próbkami. QMI można wykonać przy użyciu niewielkiej ilości biomateriału, nie wymaga genetycznie modyfikowanych znaczników i może być dostosowany do dowolnej wcześniej zdefiniowanej sieci interakcji białek.

Kwantyfikacja dynamiki sieci interakcji białek za pomocą multipleksowanej koimmunoprecypitacji

Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.

Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Potrzeba nowych podejść do badania miejsc kontaktu z błoną (MCS) wzrosła ze względu na rosnące zainteresowanie badaniem tych struktur komórkowych i ich składników. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który integruje wcześniej dostępne technologie mikroskopowe w celu identyfikacji i ilościowego określenia kompleksów białkowych wewnątrz organelli i między organellami, które znajdują się w MCS.

Wizualizacja i kwantyfikacja endogennych interakcji białek wewnątrz organelli w miejscach kontaktu ER-mitochondria za pomocą testów ligacji zbliżeniowej

Interakcje białko-białko są ważne dla wyjaśnienia funkcji docelowych białek, a koimmunoprecypitacja (co-IP) może łatwo potwierdzić IPP. Przejściowo transfekowaliśmy plazmid kodujący białko znakowane epitopem do komórek HEK-293 i opracowaliśmy metodę immunoprecypitacji, aby łatwo potwierdzić wiązanie dwóch białek docelowych.

Immunoprecypitacja za pomocą żelu powinowactwa do znaczników antyepitopowych w celu zbadania interakcji białko-białko

Poznaj metody koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej do wizualizacji interakcji białko-białko w jądrze i cytoplazmie komórek HEX293. Dowiedz się, która technika lepiej odpowiada Twoim celom badawczym.

Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

Przeglądaj więcej filmów