Name: Profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą FACS i qPCR z wewnętrznymi standardami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Poznaj metodę sortowania pojedynczych komórek ssaków i ilościowego określania ekspresji do 96 genów docelowych w każdej komórce przy użyciu mikrofluidycznego qPCR z wewnętrznymi standardami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować V. Kapoor z CCR ETIB Flow Cytometry Core za pomoc w sortowaniu komórek podczas opracowywania tego protokołu. Dziękujemy również M. Raffeldowi i Jednostce Diagnostyki Molekularnej CCR LP oraz J. Zhu i NHLBI DNA Sequencing and Genomics Core za ich pomoc w przeprowadzeniu qPCR podczas opracowywania tego protokołu. Badania te były wspierane przez Program Stacjonarny NIH.

<ol><li>Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+Robustness+in+T+Cell+Activation+from+Regulated+Heterogeneity+in+Protein+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels.</a> Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).</li>
<li>Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+origins+of+cell-to-cell+variability+in+TRAIL-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis.</a> Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).</li>
<li>Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillations+and+variability+in+the+p53+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oscillations and variability in the p53 system.</a> Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Transcriptional+Bursting+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li>
<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+Synthesis+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309+(2006).</li>
<li>Senecal, A., Munsky, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+Factors+Modulate+c-Fos+Transcriptional+Bursts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li>
<li>Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+control+of+expression+mean+and+variance+by+epigenetic+features+at+different+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci.</a> Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+(2015).</li>
<li>Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+burst+frequency+and+burst+size+are+equally+modulated+across+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).</li>
<li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li>
<li>Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Pulses+Diversify+Target+Gene+Expression+Dynamics+in+an+mRNA+Half-Life-Dependent+Manner+and+Delineate+Co-regulated+Target+Gene+Subnetworks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks.</a> Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).</li>
<li>Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+p53-Mdm2+feedback+loop+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells.</a> Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).</li>
<li>Levine, A. J., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+30+years+of+p53%3A+growing+ever+more+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The first 30 years of p53: growing ever more complex.</a> Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).</li>
<li>Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+human+p53-regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of human p53-regulated genes.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).</li>
<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 134(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/pcr-technologies-guide.pdf">PCR Technologies: A Technical Guide</a>. , Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).</li>
<li>Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+initiation%3A+a+mechanism+for+triggering+p53+pulses+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage.</a> Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Flow+Cytometry%3A+Principles+and+Applications%22">Flow Cytometry: Principles and Applications</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Real-time+PCR%22">Real-time PCR</a>. , Taylor & Francis. (2006).</li>
<li>Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+co-expression+measures%3A+mutual+information%2C+correlation%2C+and+model+based+indices%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 328(2012).</li>
<li>Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARACNE%3A+An+Algorithm+for+the+Reconstruction+of+Gene+Regulatory+Networks+in+a+Mammalian+Cellular+Context%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context.</a> BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).</li>
<li>Haff, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+quantitative+PCR+using+nested+primers%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">Improved quantitative PCR using nested primers.</a> PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).</li>
<li>Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biol. 17, 77(2016).</li>
<li>Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Single-cell+Gene+Transcription+by+RNA+Fluorescent++In+Situ+Hybridization+%28FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. (68), e4073(2012).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li>
<li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiliśmy metodę izolowania pojedynczych komórek ssaków z populacji przylegających komórek hodowanych w kulturze i oznaczania ekspresji około 96 genów w każdej komórce. Dobre wcześniejsze przygotowanie ma kluczowe znaczenie, aby ta metoda działała dobrze. W szczególności projektowanie i testowanie par starterów specyficznych dla interesujących nas transkryptów (kroki 1.2-1.3) jest czasochłonnym, ale ważnym krokiem, ponieważ startery decydują o jakości pomiarów jednokomórkowych. Po uzyskaniu wiarygodnych par starter...

Poszczególne komórki w populacji mogą wykazywać bardzo różne reakcje na jednolity bodziec fizjologiczny1,2,3,4. Zmienność genetyczna komórek w populacji jest jednym z mechanizmów tej różnorodności reakcji, ale istnieje również kilka czynników niegenetycznych, które mogą zwiększyć zmienność odpowiedzi, nawet w klonalnej populacji komórek. Na przykład poziomy poszczególnych białek i innych ważnych cząsteczek sygnałowych mogą się różnić w zależności od komórki, co powoduje różnice w dalszych profilach ekspresji genów. Dodatkowo, aktywacja genów może zachodzić w krótkotrwałych seriach transkryptów5,6, które mogą być ograniczone do stosunkowo niewielkiej liczby transkryptów na serię7,8,9. Taka stochastyczność w aktywacji genów może w znacznym stopniu przyczynić się do zmienności odpowiedzi biologicznych i może zapewnić selektywną przewagę mikroorganizmom10 oraz w komórkach ssaków1,2 reagujących na bodziec fizjologiczny. Ze względu na zarówno genetyczne, jak i niegenetyczne źródła zmienności, profil ekspresji genów dowolnej komórki w odpowiedzi na bodziec może znacznie różnić się od średniego profilu ekspresji genów uzyskanego z pomiaru odpowiedzi masowej. Określenie zakresu, w jakim poszczególne komórki wykazują zmienność w odpowiedzi na bodziec, wymaga technik izolacji pojedynczych komórek, pomiaru poziomów ekspresji dla interesujących nas transkryptów oraz analizy obliczeniowej uzyskanych danych dotyczących ekspresji.
Istnieje kilka podejść do oznaczania ekspresji genów w pojedynczych komórkach, obejmujących szeroki zakres kosztów, liczbę badanych transkryptów i dokładność kwantyfikacji. Na przykład sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki oferuje szeroką głębokość pokrycia transkryptów i możliwość ilościowego określania tysięcy różnych transkryptów dla genów o najwyższej ekspresji w poszczególnych komórkach; Jednak koszt związany z taką głębokością sekwencjonowania może być zaporowy, chociaż koszty nadal maleją. I odwrotnie, hybrydyzacja in situ fluorescencji jednocząsteczkowego RNA (smRNA FISH) oferuje precyzyjną kwantyfikację transkryptów nawet dla genów o niskiej ekspresji przy rozsądnym koszcie na gen będący przedmiotem zainteresowania; Jednak tylko niewielka liczba genów docelowych może być oznaczona w danej komórce za pomocą tego podejścia. Ilościowe testy oparte na PCR, opisane w niniejszym protokole, zapewniają środek między tymi technikami. Testy te wykorzystują mikroprzepływową maszynę do PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego oznaczania do 96 interesujących transkryptów jednocześnie w maksymalnie 96 komórkach. Chociaż każda z wyżej wymienionych metod wiąże się z wymaganymi kosztami sprzętu, koszt każdego indywidualnego testu qPCR jest stosunkowo niski. Protokół ten jest zaadaptowany z protokołu sugerowanego przez producenta mikroprzepływowej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym (Protokół ADP 41, Fluidigm). Aby umożliwić oszacowanie bezwzględnej liczby każdego transkryptu w podejściu opartym na PCR, rozszerzyliśmy protokół, aby wykorzystać wewnętrzne kontrole przygotowanych amplikonów genów docelowych, które można wykorzystać w wielu eksperymentach.
Jako przykład tej techniki, opisano ilościowe oznaczanie ekspresji genów regulowanych przez supresor guza p53 w ludzkich komórkach raka piersi MCF-711. Komórki są poddawane działaniu środka chemicznego, który indukuje pęknięcia podwójnej nici DNA. Wcześniejsze badania wykazały, że odpowiedź p53 na pęknięcia dwuniciowe DNA wykazuje dużą niejednorodność w poszczególnych komórkach, zarówno pod względem poziomów p5312, jak i aktywacji odrębnych genów docelowych11. Ponadto p53 reguluje ekspresję ponad 100 dobrze scharakteryzowanych genów docelowych zaangażowanych w liczne dalsze szlaki, w tym zatrzymanie cyklu komórkowego, apoptozę i starzenie się13,14. Ponieważ odpowiedź za pośrednictwem p53 w każdej komórce jest zarówno złożona, jak i zmienna, analiza systemu korzysta z podejścia, w którym prawie 100 docelowych genów może być jednocześnie badanych w poszczególnych komórkach, takich jak opisane poniżej. Dzięki niewielkim modyfikacjom (takim jak alternatywne metody izolacji i lizy pojedynczych komórek), protokół można łatwo dostosować do badania szerokiego zakresu typów komórek ssaków, transkryptów i odpowiedzi komórkowych.
Przy odpowiednim przygotowaniu, runda sortowania komórek i pomiaru ekspresji genów może być przeprowadzona zgodnie z tym protokołem przez okres trzech dni. Sugerowany jest następujący czas: z wyprzedzeniem wybierz interesujące Cię transkrypty, zidentyfikuj i zweryfikuj pary starterów, które amplifikują cDNA z tych transkryptów, a następnie przygotuj wzorce i mieszanki starterów przy użyciu tych starterów. W dniu 1, po traktowaniu komórek, zbierz i posortuj komórki, wykonaj odwrotną transkrypcję i specyficzną amplifikację docelową, a następnie potraktuj próbki egzonukleazą w celu usunięcia niewbudowanych starterów. W dniu 2 przeprowadź kontrolę jakości posortowanych komórek za pomocą qPCR. Wreszcie, w dniu 3, zmierz ekspresję genów w posortowanych komórkach za pomocą mikroprzepływowego qPCR. Rysunek 1 podsumowuje wymagane kroki.

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności z inhibitorem RNazy</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT</td> <td>o wysokiej czułościThermoFisher</td><td>Q33120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml probówki wirówkowe do mikrowirówek o niskiej przyczepności USA</td><td>Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>Bufor zawiesinowy DNA</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0,2 ml Cienkościenne probówki PCR Maxymum Recovery</td><td>Corning</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>GE 96.96 Dynamiczna próbka barwnika wiążącego DNA i Test Ładowanie zestawu odczynników</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 media</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, certyfikowana (USA)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Neokarzinostatyna</td><td>Sigma</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINaza</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca ThermalSeal, sterylna</td><td>Excel</td><td>Scientific STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0,05%</td> <td>GE Opieka zdrowotna Nauki przyrodnicze</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &mikro; m Sitko komórkowe</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Egzonukleaza I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix z niskim ROX</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC do ekspresji genów (mikroprzepływowy chip qPCR)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler IFC HX (maszyna ładująca)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy PCR w czasie rzeczywistym BioMark lub BioMark HD (mikroprzepływowa maszyna qPCR)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Oprogramowanie Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą facs i qpcr z wewnętrznymi standardami

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Pomiary ekspresji genów z dużych populacji komórek mogą przesłonić znaczną zmienność transkryptomiczną poszczególnych komórek w tych populacjach. Pomiary ekspresji genów w pojedynczej komórce mogą pomóc w ocenie roli szumu w ekspresji genów, zidentyfikować korelacje w ekspresji par genów i ujawnić subpopulacje komórek, które inaczej reagują na bodziec. W tym miejscu opisujemy procedurę pomiaru ekspresji do 96 genów w pojedynczych komórkach ssaków wyizolowanych z populacji rosnącej w hodowli tkankowej. Komórki są sortowane do buforu lizy przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a interesujące nas gatunki mRNA są poddawane odwrotnej transkrypcji i amplifikacji. Ekspresja genów jest następnie mierzona za pomocą mikroprzepływowej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym, która wykonuje do 96 testów qPCR na maksymalnie 96 próbkach jednocześnie. Opisujemy również generowanie i stosowanie wzorców amplikonów PCR, aby umożliwić oszacowanie bezwzględnej liczby każdego transkryptu. W porównaniu z innymi metodami pomiaru ekspresji genów w pojedynczych komórkach, podejście to pozwala na ilościowe określenie bardziej odrębnych transkryptów niż RNA FISH przy niższych kosztach niż RNA-Seq.

Ogólny przegląd protokołu przedstawiono na Rysunku 1, obejmujący etapy traktowania komórek, izolacji pojedynczych komórek metodą FACS, generowania i preamplifikacji bibliotek cDNA z lizatów pojedynczych komórek, potwierdzenia obecności bibliotek cDNA pojedynczych komórek w posortowanych studzienkach oraz pomiaru ekspresji genów za pomocą qPCR.
W ramach przygotowań do izolacji pojedynczych komórek i analizy ekspr...

Opisujemy metodę sortowania pojedynczych komórek ssaków i ilościowego określania ekspresji do 96 docelowych genów w każdej komórce. Metoda ta obejmuje wykorzystanie wewnętrznych wzorców qPCR w celu umożliwienia oszacowania bezwzględnej liczby transkryptów.

Profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą FACS i qPCR z wewnętrznymi standardami

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe oznaczenie poziomów mRNA w poszczególnych komórkach przy użyciu mikrofluidycznego qPCR ze standardami wewnętrznymi. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii pojedynczych komórek, takie jak to, czy populacje komórek reagują na bodziec w charakterystycznie odmienny sposób. Główną zaletą tej techniki jest możliwość pomiaru ekspresji większej liczby genów niż w przypadku RNA FISH, przy niższym koszcie niż w przypadku RNA-Seq w pojedynczych komórkach.Pomysł na tę metodę pojawił się podczas badania protokołów służących do pomiaru ekspresji genów w pojedynczych komórkach za pomocą mikrofluidycznej qPCR. Chcieliśmy zmodyfikować istniejące metody, aby dokładniej szacować absolutną liczbę różnych transkrypcji w pojedynczych komórkach. Procedurę sortowania komórek zaprezentuje William Telford, kierownik laboratorium cytometrii przepływowej wykorzystywanego przez mój zespół.Po wygenerowaniu i oczyszczeniu amplikonów z genów zainteresowania zgodnie z protokołem tekstowym, połączyć 18 µL każdego oczyszczonego amplikonu w probówce do mikrocentryfugi o niskim wiązaniu o pojemności 2,0 mL, a następnie dodać bufor do zawiesiny DNA do objętości 1 800 µL, tak aby stężenie każdego amplikonu wynosiło 5 × 10⁶ cząsteczek na µL. Dokładnie wymieszać standard 5e6 na wirówce vortex i podzielić go na aliquoty po 20 µL w probówkach PCR o niskim wiązaniu. Po wysianiu komórek MCF7 p53-Venus zgodnie z protokołem tekstowym, dodać do komórek 400 ng/mL neokarzinostatyny i inkubować je przez 3, 8,5, 14 lub 24 godziny.Aby przygotować bufor do lizy, należy połączyć odczynniki wymienione w poniższej tabeli. Przenieś 92,4 µL buforu do oddzielnej probówki, aby służył on jako bufor do lizy dla standardów amplikonów. Pozostała część buforu do lizy zostanie wykorzystana do komórek.Przygotować i dodać DNA E.coli do buforu lizującego komórki, zgodnie z protokołem tekstowym. Aby przygotować standardy, należy opisać sześć probówek do wirowania o niskim stopniu wiązania. Do probówki 5e5 dodać 90 µl buforu do zawiesiny DNA.Do pozostałych pięciu probówek dodaj 90 µL buforu zawierającego 6,2 pg/µL DNA E.coli i utrzymuj wszystkie probówki w lodzie. Po wyjęciu z przechowywania alikwotu standardu 5e6, krótko wymieszaj zawartość probówki w wiruromieszalce, a następnie odwiruj ją, aby upewnić się, że ciecz znajduje się na dnie probówki. Następnie, używając końcówki do pipety o niskim stopniu wiązania, dodaj 10 µL standardu 5e6 do probówki 5e5. Wymieszaj w wiruromieszalce, odwiruj i ponownie umieść probówkę w lodzie.Następnie pipetujemy 10 µL z probówki 5e5 do probówki 5e4, po czym krótko mieszamy zawartość w wirówce typu vortex, wirujemy probówkę i ponownie umieszczamy ją w lodzie. Powtarzamy rozcieńczenia seryjne dla każdej kolejnej probówki, przenosząc 10 µL z poprzedniej probówki, aż wszystkie probówki osiągną odpowiednie rozcieńczenie standardu. Po przygotowaniu probówek do PCR z buforem lizującym, za pomocą pipety 12-kanałowej, nanosimy 9 µL buforu do lizy komórek z rzędu probówek do PCR do każdego dołka w pierwszych siedmiu rzędach płytki PCR.Do każdej studzienki ostatniego rzędu płytki należy nanieść 7 µL standardowego buforu lizującego, a następnie, używając końcówek do pipet o niskim wiązaniu, dodać 2 µL standardu do każdej studzienki dolnego rzędu zgodnie z mapą płytki. Do studzienek z 10 komórkami i 100 komórkami należy dodać 2 µL DNA E.coli o stężeniu 3,1 pg/µL, a do studzienek bez komórek dodać 2 µL DNA E.coli o stężeniu 6,2 pg/µL. Po zaprogramowaniu sortera komórkowego aktywowanego fluorescencją do sortowania do płytki 96-dołkowej zgodnie z mapą płytki, w celu skalibrowania urządzenia, należy zamknąć pustą płytkę PCR i użyć strumienia testowego do sortowania kropli i PBS na uszczelnienie pustej płytki.Jeśli krople nie trafiają w odpowiednie miejsce, należy je usunąć z powierzchni uszczelki, skalibrować sorter komórek zgodnie z instrukcjami producenta urządzenia i powtarzać czynność do momentu, aż krople w strumieniu sortowania będą osadzane prawidłowo. Komórki należy zebrać poprzez trypsynizację i ponownie zawiesić w 0,5 ml PBS z 2% FBS, a następnie przenieść do probówki do cytometrii przepływowej. Aby przeprowadzić sortowanie, należy włożyć probówkę z zawiesiną komórkową do sortera komórek, otworzyć uszczelkę na płytce z buforem lizującym i ostrożnie posortować interesujące komórki do płytki zgodnie z mapą płytki.Aby zapewnić sortowanie pojedynczych komórek z maksymalną czystością, należy uruchomić urządzenie w trybie pojedynczych komórek i zastosować standardowe bramkowanie cytometrii przepływowej w oparciu o rozproszenie przednie i boczne. Po zakończeniu procesu należy użyć nowej sterylnej folii termicznej do uszczelnienia płytki, a następnie odwirować ją z prędkością 400 ×g w temperaturze 4 °C przez jedną minutę, po czym umieścić płytkę w termocyklerze i uruchomić wcześniej przygotowany program RT-STA. Po odwirowaniu ukończonej płytki RT-STA należy za pomocą pipety 12-kanałowej rozdzielić 3,6 µL rozcieńczonej egzonukleazy I do każdego dołka płytki.Uszczelnij płytkę i krótko ją odwiruj, a następnie umieść ją w termocyklerze i uruchom program exo I. Aby zmierzyć ekspresję genu referencyjnego w każdej próbce, przygotuj 900 µL master mixu do qPCR z barwnikiem wiążącym DNA na 96 reakcji, używając starterów dla jednego z wybranych genów referencyjnych. Rozdziel dziewięć µL master mixu do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR, a następnie dodaj jeden µL próbki z płytki z próbkami do odpowiadającego jej dołka płytki PCR.Uruchom płytkę w urządzeniu do real-time PCR, stosując protokół cykli termicznych sugerowany przez producenta master mixu lub zgodnie ze standardowym protokołem, a następnie przeanalizuj próbki i sporządź mapę płytki z mieszaninami próbek zgodnie z protokołem tekstowym. Oznacz płytkę jako mieszaniny próbek, a następnie, używając pipety ośmiokanałowej, rozdziel 3,3 µL mieszaniny reagentu ładującego próbki z master mixem do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR. Każdą płytkę PCR z próbkami wymieszaj w wortexie przez 10 sekund i wiruj przy 500 ×g przez 10 sekund.Zdejmij pokrywkę i przenieś 2,7 µl każdej pozytywnej próbki pojedynczej komórki do odpowiadającej jej studzienki na płytce z mieszaninami próbek, zgodnie z oznaczeniami studzienek dla pojedynczych komórek na mapie płytki. Odklej naklejkę z dna nowego mikroprzepływowego chipa qPCR, a następnie, używając strzykawki z płynem linii kontrolnej z pozostawioną zatyczką, naciśnij każdą sprężynę akumulatora, aby ją poluzować, i wstrzyknij do każdego akumulatora od 100 do 200 µl płynu linii kontrolnej. Włóż chip do urządzenia ładującego i uruchom skrypt przygotowujący (prime script), a następnie za pomocą pipety ośmiokanałowej przenieś 4,5 µl każdej mieszaniny testowej do lewej strony mikroprzepływowego chipa qPCR.Kluczowe jest unikanie tworzenia pęcherzyków powietrza na dnie studni, ponieważ może to spowodować problemy z nakładaniem próbek. Aby temu zapobiec, należy dotknąć końcówką pipety ścianki studni, a następnie pobrać ciecz tylko do pierwszego stopnia.Przenieś 4,5 µL każdej mieszaniny próbek na prawą stronę mikrofluidycznego chipa do qPCR, następnie włóż chip do urządzenia do ładowania i uruchom skrypt ładowania mieszaniny. Po zakończeniu działania skryptu ładowania mieszaniny upewnij się, że na chipie nie ma linii, które mogłyby wskazywać na problem z ładowaniem, następnie za pomocą taśmy ostrożnie usuń wszelkie cząsteczki kurzu z chipa, po czym włóż chip do mikrofluidycznego urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym i uruchom skrypt zbierania danych. Na koniec przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym.Rycina ta przedstawia poziomy ekspresji genu referencyjnego zmierzone za pomocą qPCR w celu określenia, które studzienki otrzymały pojedynczą komórkę. Próbki, w których znalazła się komórka, mają niskie wartości CT. Próbki bez komórki mają znacznie wyższe wartości CT.Dołki dla standardu amplikonu powinny wykazywać równomiernie rozłożone krzywe amplifikacji. Powinno również występować wyraźne rozdzielenie krzywych dla dołków bez komórek, z 10 komórkami i ze 100 komórkami. Próbki DNA nasion reprezentujące rzeczywiste komórki są wybiórczo pobierane z wielu posortowanych płytek 96-dołkowych i łączone na jednej płytce w celu przygotowania do mikroprzepływowego qPCR.Ta mapa ciepła podsumowuje wyniki mikrofluidycznej qPCR. Zróżnicowanie kolorów w każdej kolumnie obrazuje zmienność ekspresji każdego genu pomiędzy poszczególnymi komórkami. Dwa rzędy, które są znacznie ciemniejsze od pozostałych, najprawdopodobniej reprezentują wadliwe próbki.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby obszar roboczy był wolny od RNaz i DNA, zwłaszcza podczas przygotowywania standardów i buforu do lizy. Etapy protokołu poprzedzające reakcję PCR są podatne na kontaminację. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić kwantyfikację ekspresji wielu wybranych genów w pojedynczych komórkach.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak RNA FISH pojedynczych cząsteczek, w celu walidacji pomiarów poziomu mRNA w pojedynczych komórkach.

single-cell-gene-expression-profiling-using-facs-qpcr-with-internal

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Profilowanie ekspresji pojedynczych komórek umożliwia szczegółową analizę ekspresji genów w poszczególnych komórkach. Opisujemy metody izolacji kardiomiocytów oraz przygotowania otrzymanych lizatów do analizy całego transkryptomu za pomocą mikromacierzy lub qPCR specyficznych celów.

Profilowanie transkrypcyjne pojedynczych komórek kardiomiocytów dorosłej myszy

Opisano metodę izolacji pojedynczych komórek siatkówki oraz następującej po niej amplifikacji ich cDNA. Transkryptomika pojedynczych komórek pozwala określić stopień heterogeniczności komórkowej występującej w tkance oraz odkryć nowe geny markerowe dla rzadkich populacji komórek. Dołączony protokół można dostosować do wielu różnych typów komórek.

Profilowanie pojedynczych komórek rozwijających się i dojrzałych neuronów siatkówki

Opisujemy protokół PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Z wyjątkiem protokołów ekstrakcji RNA, procedura może zostać rozszerzona na RNA wyekstrahowane z innych płynów ustrojowych, hodowanych komórek lub próbek tkanek.

Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

Designerskie chromosomy projektu Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, można odróżnić od swoich natywnych odpowiedników za pomocą testu genotypowania opartego na PCR zwanego PCRTagging, który ma punkt końcowy obecności/braku. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę wykrywania PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania PCRTag.

Analiza qPCRTag - Wysokoprzepustowy test PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania Sc2.0

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Ten protokół opisuje, jak ocenić ekspresję dużej liczby genów na poziomie klonalnym. Jednokomórkowy RT-qPCR daje wysoce wiarygodne wyniki z dużą czułością dla setek próbek i genów.

Ekspresja genów w pojedynczej komórce za pomocą multipleksu RT-qPCR w celu scharakteryzowania heterogeniczności rzadkich populacji limfoidalnych

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Ta metoda opisuje kroki mające na celu poprawę jakości i ilości danych sekwencyjnych, które można uzyskać z próbek RNA zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Opisujemy metodologię dokładniejszej oceny jakości próbek FFPE-RNA, przygotowania bibliotek sekwencjonowania i analizy danych z próbek FFPE-RNA.

Optymalizacja sekwencjonowania i analizy zdegradowanych próbek FFPE-RNA

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) to metoda dokładnego ilościowego określania poziomów i lokalizacji określonych RNA na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy nasze zatwierdzone protokoły laboratoryjne dotyczące przetwarzania na mokrym stole, obrazowania i analizy obrazu w celu ilościowego oznaczania pojedynczych komórek określonych RNA.

Analiza pojedynczych komórek alleli aktywnych transkrypcyjnie za pomocą pojedynczej cząsteczki FISH

Poznaj metodę sortowania pojedynczych komórek ssaków i ilościowego określania ekspresji do 96 genów docelowych w każdej komórce przy użyciu mikrofluidycznego qPCR z wewnętrznymi standardami.

Profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą FACS i qPCR z wewnętrznymi standardami

Przeglądaj więcej filmów