Name: Profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą FACS i qPCR z wewnętrznymi standardami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Poznaj metodę sortowania pojedynczych komórek ssaków i ilościowego określania ekspresji do 96 genów docelowych w każdej komórce przy użyciu mikrofluidycznego qPCR z wewnętrznymi standardami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować V. Kapoor z CCR ETIB Flow Cytometry Core za pomoc w sortowaniu komórek podczas opracowywania tego protokołu. Dziękujemy również M. Raffeldowi i Jednostce Diagnostyki Molekularnej CCR LP oraz J. Zhu i NHLBI DNA Sequencing and Genomics Core za ich pomoc w przeprowadzeniu qPCR podczas opracowywania tego protokołu. Badania te były wspierane przez Program Stacjonarny NIH.

<ol><li>Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+Robustness+in+T+Cell+Activation+from+Regulated+Heterogeneity+in+Protein+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels.</a> Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).</li>
<li>Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+origins+of+cell-to-cell+variability+in+TRAIL-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis.</a> Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).</li>
<li>Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillations+and+variability+in+the+p53+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oscillations and variability in the p53 system.</a> Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Transcriptional+Bursting+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li>
<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+Synthesis+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309+(2006).</li>
<li>Senecal, A., Munsky, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+Factors+Modulate+c-Fos+Transcriptional+Bursts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li>
<li>Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+control+of+expression+mean+and+variance+by+epigenetic+features+at+different+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci.</a> Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+(2015).</li>
<li>Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+burst+frequency+and+burst+size+are+equally+modulated+across+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).</li>
<li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li>
<li>Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Pulses+Diversify+Target+Gene+Expression+Dynamics+in+an+mRNA+Half-Life-Dependent+Manner+and+Delineate+Co-regulated+Target+Gene+Subnetworks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks.</a> Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).</li>
<li>Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+p53-Mdm2+feedback+loop+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells.</a> Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).</li>
<li>Levine, A. J., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+30+years+of+p53%3A+growing+ever+more+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The first 30 years of p53: growing ever more complex.</a> Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).</li>
<li>Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+human+p53-regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of human p53-regulated genes.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).</li>
<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 134(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/pcr-technologies-guide.pdf">PCR Technologies: A Technical Guide</a>. , Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).</li>
<li>Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+initiation%3A+a+mechanism+for+triggering+p53+pulses+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage.</a> Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Flow+Cytometry%3A+Principles+and+Applications%22">Flow Cytometry: Principles and Applications</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Real-time+PCR%22">Real-time PCR</a>. , Taylor & Francis. (2006).</li>
<li>Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+co-expression+measures%3A+mutual+information%2C+correlation%2C+and+model+based+indices%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 328(2012).</li>
<li>Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARACNE%3A+An+Algorithm+for+the+Reconstruction+of+Gene+Regulatory+Networks+in+a+Mammalian+Cellular+Context%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context.</a> BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).</li>
<li>Haff, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+quantitative+PCR+using+nested+primers%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">Improved quantitative PCR using nested primers.</a> PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).</li>
<li>Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biol. 17, 77(2016).</li>
<li>Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Single-cell+Gene+Transcription+by+RNA+Fluorescent++In+Situ+Hybridization+%28FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. (68), e4073(2012).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li>
<li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiliśmy metodę izolowania pojedynczych komórek ssaków z populacji przylegających komórek hodowanych w kulturze i oznaczania ekspresji około 96 genów w każdej komórce. Dobre wcześniejsze przygotowanie ma kluczowe znaczenie, aby ta metoda działała dobrze. W szczególności projektowanie i testowanie par starterów specyficznych dla interesujących nas transkryptów (kroki 1.2-1.3) jest czasochłonnym, ale ważnym krokiem, ponieważ startery decydują o jakości pomiarów jednokomórkowych. Po uzyskaniu wiarygodnych par starter...

Poszczególne komórki w populacji mogą wykazywać bardzo różne reakcje na jednolity bodziec fizjologiczny1,2,3,4. Zmienność genetyczna komórek w populacji jest jednym z mechanizmów tej różnorodności reakcji, ale istnieje również kilka czynników niegenetycznych, które mogą zwiększyć zmienność odpowiedzi, nawet w klonalnej populacji komórek. Na przykład poziomy poszczególnych białek i innych ważnych cząsteczek sygnałowych mogą się różnić w zależności od komórki, co powoduje różnice w dalszych profilach ekspresji genów. Dodatkowo, aktywacja genów może zachodzić w krótkotrwałych seriach transkryptów5,6, które mogą być ograniczone do stosunkowo niewielkiej liczby transkryptów na serię7,8,9. Taka stochastyczność w aktywacji genów może w znacznym stopniu przyczynić się do zmienności odpowiedzi biologicznych i może zapewnić selektywną przewagę mikroorganizmom10 oraz w komórkach ssaków1,2 reagujących na bodziec fizjologiczny. Ze względu na zarówno genetyczne, jak i niegenetyczne źródła zmienności, profil ekspresji genów dowolnej komórki w odpowiedzi na bodziec może znacznie różnić się od średniego profilu ekspresji genów uzyskanego z pomiaru odpowiedzi masowej. Określenie zakresu, w jakim poszczególne komórki wykazują zmienność w odpowiedzi na bodziec, wymaga technik izolacji pojedynczych komórek, pomiaru poziomów ekspresji dla interesujących nas transkryptów oraz analizy obliczeniowej uzyskanych danych dotyczących ekspresji.
Istnieje kilka podejść do oznaczania ekspresji genów w pojedynczych komórkach, obejmujących szeroki zakres kosztów, liczbę badanych transkryptów i dokładność kwantyfikacji. Na przykład sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki oferuje szeroką głębokość pokrycia transkryptów i możliwość ilościowego określania tysięcy różnych transkryptów dla genów o najwyższej ekspresji w poszczególnych komórkach; Jednak koszt związany z taką głębokością sekwencjonowania może być zaporowy, chociaż koszty nadal maleją. I odwrotnie, hybrydyzacja in situ fluorescencji jednocząsteczkowego RNA (smRNA FISH) oferuje precyzyjną kwantyfikację transkryptów nawet dla genów o niskiej ekspresji przy rozsądnym koszcie na gen będący przedmiotem zainteresowania; Jednak tylko niewielka liczba genów docelowych może być oznaczona w danej komórce za pomocą tego podejścia. Ilościowe testy oparte na PCR, opisane w niniejszym protokole, zapewniają środek między tymi technikami. Testy te wykorzystują mikroprzepływową maszynę do PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego oznaczania do 96 interesujących transkryptów jednocześnie w maksymalnie 96 komórkach. Chociaż każda z wyżej wymienionych metod wiąże się z wymaganymi kosztami sprzętu, koszt każdego indywidualnego testu qPCR jest stosunkowo niski. Protokół ten jest zaadaptowany z protokołu sugerowanego przez producenta mikroprzepływowej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym (Protokół ADP 41, Fluidigm). Aby umożliwić oszacowanie bezwzględnej liczby każdego transkryptu w podejściu opartym na PCR, rozszerzyliśmy protokół, aby wykorzystać wewnętrzne kontrole przygotowanych amplikonów genów docelowych, które można wykorzystać w wielu eksperymentach.
Jako przykład tej techniki, opisano ilościowe oznaczanie ekspresji genów regulowanych przez supresor guza p53 w ludzkich komórkach raka piersi MCF-711. Komórki są poddawane działaniu środka chemicznego, który indukuje pęknięcia podwójnej nici DNA. Wcześniejsze badania wykazały, że odpowiedź p53 na pęknięcia dwuniciowe DNA wykazuje dużą niejednorodność w poszczególnych komórkach, zarówno pod względem poziomów p5312, jak i aktywacji odrębnych genów docelowych11. Ponadto p53 reguluje ekspresję ponad 100 dobrze scharakteryzowanych genów docelowych zaangażowanych w liczne dalsze szlaki, w tym zatrzymanie cyklu komórkowego, apoptozę i starzenie się13,14. Ponieważ odpowiedź za pośrednictwem p53 w każdej komórce jest zarówno złożona, jak i zmienna, analiza systemu korzysta z podejścia, w którym prawie 100 docelowych genów może być jednocześnie badanych w poszczególnych komórkach, takich jak opisane poniżej. Dzięki niewielkim modyfikacjom (takim jak alternatywne metody izolacji i lizy pojedynczych komórek), protokół można łatwo dostosować do badania szerokiego zakresu typów komórek ssaków, transkryptów i odpowiedzi komórkowych.
Przy odpowiednim przygotowaniu, runda sortowania komórek i pomiaru ekspresji genów może być przeprowadzona zgodnie z tym protokołem przez okres trzech dni. Sugerowany jest następujący czas: z wyprzedzeniem wybierz interesujące Cię transkrypty, zidentyfikuj i zweryfikuj pary starterów, które amplifikują cDNA z tych transkryptów, a następnie przygotuj wzorce i mieszanki starterów przy użyciu tych starterów. W dniu 1, po traktowaniu komórek, zbierz i posortuj komórki, wykonaj odwrotną transkrypcję i specyficzną amplifikację docelową, a następnie potraktuj próbki egzonukleazą w celu usunięcia niewbudowanych starterów. W dniu 2 przeprowadź kontrolę jakości posortowanych komórek za pomocą qPCR. Wreszcie, w dniu 3, zmierz ekspresję genów w posortowanych komórkach za pomocą mikroprzepływowego qPCR. Rysunek 1 podsumowuje wymagane kroki.

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności z inhibitorem RNazy</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT</td> <td>o wysokiej czułościThermoFisher</td><td>Q33120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml probówki wirówkowe do mikrowirówek o niskiej przyczepności USA</td><td>Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>Bufor zawiesinowy DNA</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0,2 ml Cienkościenne probówki PCR Maxymum Recovery</td><td>Corning</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>GE 96.96 Dynamiczna próbka barwnika wiążącego DNA i Test Ładowanie zestawu odczynników</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 media</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, certyfikowana (USA)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Neokarzinostatyna</td><td>Sigma</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINaza</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca ThermalSeal, sterylna</td><td>Excel</td><td>Scientific STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0,05%</td> <td>GE Opieka zdrowotna Nauki przyrodnicze</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &mikro; m Sitko komórkowe</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Egzonukleaza I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix z niskim ROX</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC do ekspresji genów (mikroprzepływowy chip qPCR)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler IFC HX (maszyna ładująca)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy PCR w czasie rzeczywistym BioMark lub BioMark HD (mikroprzepływowa maszyna qPCR)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Oprogramowanie Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą facs i qpcr z wewnętrznymi standardami

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Pomiary ekspresji genów z dużych populacji komórek mogą przesłonić znaczną zmienność transkryptomiczną poszczególnych komórek w tych populacjach. Pomiary ekspresji genów w pojedynczej komórce mogą pomóc w ocenie roli szumu w ekspresji genów, zidentyfikować korelacje w ekspresji par genów i ujawnić subpopulacje komórek, które inaczej reagują na bodziec. W tym miejscu opisujemy procedurę pomiaru ekspresji do 96 genów w pojedynczych komórkach ssaków wyizolowanych z populacji rosnącej w hodowli tkankowej. Komórki są sortowane do buforu lizy przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a interesujące nas gatunki mRNA są poddawane odwrotnej transkrypcji i amplifikacji. Ekspresja genów jest następnie mierzona za pomocą mikroprzepływowej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym, która wykonuje do 96 testów qPCR na maksymalnie 96 próbkach jednocześnie. Opisujemy również generowanie i stosowanie wzorców amplikonów PCR, aby umożliwić oszacowanie bezwzględnej liczby każdego transkryptu. W porównaniu z innymi metodami pomiaru ekspresji genów w pojedynczych komórkach, podejście to pozwala na ilościowe określenie bardziej odrębnych transkryptów niż RNA FISH przy niższych kosztach niż RNA-Seq.

Ogólny przegląd protokołu przedstawiono na Rysunku 1, obejmujący etapy traktowania komórek, izolacji pojedynczych komórek metodą FACS, generowania i preamplifikacji bibliotek cDNA z lizatów pojedynczych komórek, potwierdzenia obecności bibliotek cDNA pojedynczych komórek w posortowanych studzienkach oraz pomiaru ekspresji genów metodą qPCR.
W ramach przygotowań do izolacji pojedynczych komórek i analizy ekspresj...

Opisujemy metodę sortowania pojedynczych komórek ssaków i ilościowego określania ekspresji do 96 docelowych genów w każdej komórce. Metoda ta obejmuje wykorzystanie wewnętrznych wzorców qPCR w celu umożliwienia oszacowania bezwzględnej liczby transkryptów.

Profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą FACS i qPCR z wewnętrznymi standardami

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe oznaczenie poziomów mRNA w poszczególnych komórkach przy użyciu mikrofluidycznego qPCR ze standardami wewnętrznymi. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii pojedynczych komórek, takie jak to, czy populacje komórek reagują na bodziec w charakterystycznie odmienny sposób. Główną zaletą tej techniki jest możliwość pomiaru ekspresji większej liczby genów niż w przypadku RNA FISH, przy niższym koszcie niż w przypadku RNA-Seq w pojedynczych komórkach.Pomysł na tę metodę pojawił się podczas badania protokołów służących do pomiaru ekspresji genów w pojedynczych komórkach za pomocą mikrofluidycznej qPCR. Chcieliśmy zmodyfikować istniejące metody, aby dokładniej szacować absolutną liczbę różnych transkrypcji w pojedynczych komórkach. Procedurę sortowania komórek zaprezentuje William Telford, kierownik laboratorium cytometrii przepływowej wykorzystywanego przez mój zespół.Po wygenerowaniu i oczyszczeniu amplikonów z genów zainteresowania zgodnie z protokołem tekstowym, połączyć 18 µL każdego oczyszczonego amplikonu w probówce do mikrocentryfugi o niskim wiązaniu o pojemności 2,0 mL, a następnie dodać bufor d

single-cell-gene-expression-profiling-using-facs-qpcr-with-internal

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Profilowanie ekspresji pojedynczych komórek umożliwia szczegółową analizę ekspresji genów w poszczególnych komórkach. Opisujemy metody izolacji kardiomiocytów oraz przygotowania otrzymanych lizatów do analizy całego transkryptomu za pomocą mikromacierzy lub qPCR specyficznych celów.

Profilowanie transkrypcyjne pojedynczych komórek kardiomiocytów dorosłej myszy

Opisano metodę izolacji pojedynczych komórek siatkówki oraz następującej po niej amplifikacji ich cDNA. Transkryptomika pojedynczych komórek pozwala określić stopień heterogeniczności komórkowej występującej w tkance oraz odkryć nowe geny markerowe dla rzadkich populacji komórek. Dołączony protokół można dostosować do wielu różnych typów komórek.

Profilowanie pojedynczych komórek rozwijających się i dojrzałych neuronów siatkówki

Opisujemy protokół PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Z wyjątkiem protokołów ekstrakcji RNA, procedura może zostać rozszerzona na RNA wyekstrahowane z innych płynów ustrojowych, hodowanych komórek lub próbek tkanek.

Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

Designerskie chromosomy projektu Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, można odróżnić od swoich natywnych odpowiedników za pomocą testu genotypowania opartego na PCR zwanego PCRTagging, który ma punkt końcowy obecności/braku. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę wykrywania PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania PCRTag.

Analiza qPCRTag - Wysokoprzepustowy test PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania Sc2.0

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Ten protokół opisuje, jak ocenić ekspresję dużej liczby genów na poziomie klonalnym. Jednokomórkowy RT-qPCR daje wysoce wiarygodne wyniki z dużą czułością dla setek próbek i genów.

Ekspresja genów w pojedynczej komórce za pomocą multipleksu RT-qPCR w celu scharakteryzowania heterogeniczności rzadkich populacji limfoidalnych

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Ta metoda opisuje kroki mające na celu poprawę jakości i ilości danych sekwencyjnych, które można uzyskać z próbek RNA zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Opisujemy metodologię dokładniejszej oceny jakości próbek FFPE-RNA, przygotowania bibliotek sekwencjonowania i analizy danych z próbek FFPE-RNA.

Optymalizacja sekwencjonowania i analizy zdegradowanych próbek FFPE-RNA

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) to metoda dokładnego ilościowego określania poziomów i lokalizacji określonych RNA na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy nasze zatwierdzone protokoły laboratoryjne dotyczące przetwarzania na mokrym stole, obrazowania i analizy obrazu w celu ilościowego oznaczania pojedynczych komórek określonych RNA.

Analiza pojedynczych komórek alleli aktywnych transkrypcyjnie za pomocą pojedynczej cząsteczki FISH

Poznaj metodę sortowania pojedynczych komórek ssaków i ilościowego określania ekspresji do 96 genów docelowych w każdej komórce przy użyciu mikrofluidycznego qPCR z wewnętrznymi standardami.

Profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą FACS i qPCR z wewnętrznymi standardami

Przeglądaj więcej filmów