Profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą FACS i qPCR z wewnętrznymi standardami

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie poziomów mRNA w poszczególnych komórkach za pomocą mikroprzepływowego qPCR z wewnętrznymi wzorcami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii pojedynczej komórki, takie jak to, czy populacje komórkowe komórek reagują na bodziec w charakterystyczny dla siebie sposób. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona mierzyć ekspresję większej liczby genów niż RNA FISH przy niższych kosztach niż RNA-Seq w pojedynczych komórkach.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy badaliśmy protokoły pomiaru ekspresji genów w pojedynczych komórkach za pomocą mikroprzepływowego qPCR. Chcieliśmy zmodyfikować istniejące metody, aby dokładniej oszacować bezwzględną liczbę różnych transkryptów w pojedynczych komórkach. Procedurę sortowania komórek zademonstruje William Telford, kierownik zakładu cytometrii przepływowej używanego przez moje laboratorium.

Po wygenerowaniu i oczyszczeniu amplikonów z interesujących genów zgodnie z protokołem tekstowym, połącz 18 mikrolitrów każdego oczyszczonego amplikonu w 2,0-mililitrowej probówce wirówkowej o niskim poziomie wiązania, a następnie dodaj bufor zawiesiny DNA do 1 800 mikrolitrów, tak aby stężenie każdego amplikonu było pięć razy 10 do szóstej cząsteczki na mikrolitr. Dokładnie zwiruj wzorzec 5e6 i podziel go na 20 mikrolitrowych porcji w probówkach PCR o niskim poziomie wiązania. Po posianiu komórek MCF7 p53-Venus zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj 400 nanogramów na mililitr neokarzynotatyny do komórek i traktuj je przez trzy, 8,5, 14 lub 24 godziny.

Aby zrobić bufor do lizy, połącz odczynniki wymienione w tej tabeli. Przenieść 92,4 mikrolitra buforu do oddzielnej probówki, która posłuży jako bufor do lizy dla wzorców amplikonów. Pozostały bufor do lizy będzie przeznaczony dla komórek.

Przygotuj i dodaj DNA E. coli do buforu do lizy komórek, zgodnie z protokołem tekstowym. Aby przygotować standardy, oznacz sześć probówek wirówkowych o niskim poziomie wiązania. Dodaj 90 mikrolitrów buforu zawiesiny DNA do probówki 5e5.

Dodaj 90 mikrolitrów buforu zawierającego 6,2 pikogramów na mikrolitr DNA E. coli do każdej z pozostałych pięciu probówek i trzymaj wszystkie probówki na lodzie. Po wyjęciu podwielokrotności wzorca 5e6 z magazynu, krótko zawirować probówkę, a następnie obrócić ją, aby upewnić się, że ciecz znajduje się na dnie probówki, a następnie za pomocą nisko wiążącej końcówki pipety dodać 10 mikrolitrów wzorca 5e6 do probówki 5e5. Odwiruj, zakręć i odłóż rurkę z powrotem na lód.

Następnie odpipetuj 10 mikrolitrów z probówki 5e5 do probówki 5e4, a następnie krótko zawiruj probówkę, obróć ją i umieść probówkę z powrotem na lodzie. Powtórz seryjne rozcieńczenia z każdą probówką, otrzymując 10 mikrolitrów z poprzedniej probówki, aż wszystkie probówki będą miały rozcieńczony wzorzec. Po przygotowaniu probówek PCR z buforem do lizy, za pomocą 12-kanałowej pipety, rozprowadź dziewięć mikrolitrów buforu do lizy komórek z rzędu probówek do PCR do każdej studzienki pierwszych siedmiu rzędów płytki PCR.

Rozprowadzić siedem mikrolitrów standardowego buforu do lizy do każdej studzienki ostatniego rzędu płytki, a następnie za pomocą nisko wiążących końcówek pipet dodać dwa mikrolitry wzorca do każdego dołka dolnego rzędu zgodnie z mapą płytki. Dodaj dwa mikrolitry po 3,1 pikograma na mikrolitr DNA E. coli do studzienek 10 komórek i 100 komórek, a następnie dodaj dwa mikrolitry po 6,2 pikograma na mikrolitr DNA E. coli do studzienek bez komórek. Po zaprogramowaniu aktywowanego fluorescencją sortownika komórek do sortowania na płytkę 96-dołkową zgodnie z mapą płytki, aby wycelować maszynę, uszczelnić pustą płytkę PCR i użyć strumienia testowego do sortowania kropelek i PBS na uszczelnieniu pustej płytki.

Jeśli kropelki nie wylądują we właściwej pozycji, zetrzyj je z powierzchni uszczelki, ponownie skalibruj sortownik komórek zgodnie z instrukcjami producenta maszyny i powtarzaj, aż kropelki w strumieniu sortowania zostaną prawidłowo osadzone. Zbierz komórki przez trypsynizację i ponownie zawiesij je w 0,5 mililitra PBS z 2% FBS, a następnie przenieś do probówki do cytometrii przepływowej. Aby posortować komórki, włóż probówkę z zawiesiną komórek do sortownika komórek, otwórz uszczelkę na płytce buforu do lizy i ostrożnie posortuj interesujące komórki na płytce zgodnie z mapą płytki.

Aby upewnić się, że pojedyncze komórki są sortowane z maksymalną czystością, uruchom maszynę w trybie pojedynczej komórki i użyj standardowego bramkowania cytometrii przepływowej opartego na rozproszeniu do przodu i na bok. Po zakończeniu pracy należy za pomocą nowego sterylnego uszczelnienia termicznego uszczelnić płytkę i odwirować ją w temperaturze 400 razy g przez cztery stopnie Celsjusza przez jedną minutę, a następnie umieścić płytkę w termocyklerze i uruchomić wcześniej przygotowany program RT-STA. Po odwirowaniu gotowej płytki RT-STA za pomocą 12-kanałowej pipety rozprowadzić 3,6 mikrolitra rozcieńczonej egzonukleazy I do każdego dołka płytki.

Uszczelnij i krótko obróć płytkę, a następnie umieść płytkę w termocyklerze i uruchom program exo I. Aby zmierzyć ekspresję genów porządkowych w każdej próbce, przygotuj 900 mikrolitrów barwnika wiążącego DNA qPCR master mix dla 96 reakcji przy użyciu starterów z jednego z wybranych genów porządkowych. Rozprowadzić dziewięć mikrolitrów mieszanki wzorcowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR, a następnie dodać jeden mikrolitr próbki z płytki do próbki do odpowiedniego dołka płytki PCR.

Uruchom płytkę na maszynie do PCR w czasie rzeczywistym, korzystając z protokołu cykli termicznych sugerowanego przez producenta mieszanki głównej lub zgodnie ze standardowym protokołem, a następnie przeanalizuj próbki i wykonaj mapę płytek z mieszankami próbek zgodnie z protokołem tekstowym. Oznaczyć mieszaninę próbek na płytce, a następnie, za pomocą ośmiokanałowej pipety, rozprowadzić 3,3 mikrolitra mieszaniny odczynnika do próbki mieszanki wzorcowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR. Dla każdej płytki PCR z próbkami należy wirować płytkę przez 10 sekund i obracać ją z prędkością 500 razy g przez 10 sekund.

Zdjąć pokrywę i przenieść 2,7 mikrolitra każdej dodatniej próbki jednokomórkowej do odpowiadającego jej dołka na płytce do mieszania próbek dla studzienek jednokomórkowych wskazanych na mapie płytki. Odklej naklejkę od spodu nowego mikroprzepływowego chipa qPCR, a następnie za pomocą strzykawki z płynem z przewodu kontrolnego z nadal założoną nasadką, naciśnij każdą sprężynę akumulatora, aby ją poluzować i wstrzyknij do każdego akumulatora od 100 do 200 mikrolitrów płynu z przewodu kontrolnego. Włóż chip do maszyny ładującej i uruchom główny skrypt, a następnie za pomocą ośmiokanałowej pipety przenieś 4,5 mikrolitra każdej mieszanki testowej na lewą stronę mikroprzepływowego chipa qPCR.

Bardzo ważne jest, aby nie tworzyć pęcherzyków powietrza na dnie studni. Spowoduje to problemy z ładowaniem. Aby temu zapobiec, należy dotknąć końcówkami pipet z boku studzienki, a następnie pipetować tylko do pierwszego oporu.

Przenieś 4,5 mikrolitra każdej mieszanki próbek na prawą stronę mikroprzepływowego chipa qPCR, a następnie włóż chip do maszyny ładującej i uruchom skrypt mieszania obciążenia. Po zakończeniu skryptu mieszania obciążenia sprawdź, czy w poprzek chipa nie ma linii, które wskazywałyby na problem z ładowaniem, a następnie użyj taśmy, aby ostrożnie usunąć wszelkie cząsteczki kurzu z chipa, a następnie włóż chip do mikroprzepływowej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym i uruchom skrypt zbierania danych. Na koniec przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym.

Rysunek ten przedstawia poziomy ekspresji genu porządkowego mierzone za pomocą qPCR w celu określenia, które studzienki otrzymały pojedynczą komórkę. Próbki, które otrzymały komórkę, mają niskie wartości CT. Próbki bez komórki mają znacznie wyższe wartości CT.

Studzienki dla wzorca amplikonu powinny wykazywać równomiernie rozmieszczone krzywe wzmocnienia. Powinna być również wyraźna separacja krzywych dla studzienek bez komórki, 10 komórek i 100 komórek. Próbki DNA nasion reprezentujące rzeczywiste komórki są wybierane z wielu posortowanych płytek 96-dołkowych i łączone na jednej płytce w celu przygotowania do mikroprzepływowego qPCR.

Powyższa mapa cieplna podsumowuje wyniki mikroprzepływowego qPCR. Zmienność koloru w każdej kolumnie pokazuje zmienność ekspresji każdego genu między różnymi komórkami. Dwa rzędy, które są znacznie ciemniejsze niż reszta, najprawdopodobniej reprezentują złe próbki.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby w miejscu pracy nie było RNazy i DNA, zwłaszcza podczas tworzenia wzorców i buforu do lizy. Części tego protokołu przed PCR są wrażliwe na zanieczyszczenie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo ekspresję wielu interesujących genów w poszczególnych komórkach.

Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak jednocząsteczkowe RNA FISH, w celu walidacji pomiarów obfitości mRNA w pojedynczych komórkach.