Name: Agregacja magnetycznych komórek macierzystych 3D i dojrzewanie bioreaktora w celu regeneracji chrząstki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Poznaj metodę magnetycznej agregacji komórek macierzystych MSC i dynamicznego dojrzewania w bioreaktorze w celu regeneracji chrząstki. Technika ta wspiera produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej i może być zastosowana w inżynierii tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować QuinXell Technologies i CellD, a w szczególności Lotharowi Grannemannowi i Dominique'owi Ghozlanowi za pomoc przy budowie bioreaktora. Dziękujemy Catherine Le Visage, która dostarczyła nam rusztowania z polisacharydu pullulan/dekstran. Prace te były wspierane przez Unię Europejską (projekt ERC-2014-CoG MaTissE 648779) oraz przez AgenceNationalede la Recherche (ANR) z Francji (projekt MagStem ANR-11 SVSE5).

1. Budowa urządzeń magnetycznych
UWAGA: Urządzenia używane do zasiewania komórek różnią się w zależności od zastosowania (Rysunek 1). Aby utworzyć agregaty, liczba komórek jest ograniczona do 2,5×105/agregat, dlatego końcówki magnetyczne muszą być bardzo cienkie (średnica 750 μm). Aby wysadzić rusztowania o grubości 1,8 cm igrubości 2/7 mm, magnesy muszą być większe (3 mm średnicy) i zapewnią migrację komórek przez pory rusztowania.
<ol>
	<li>Budowa urządzenia z mikromagnesami do formowania agregatów (rys. 1A)
	<ol>
		<li>Wykonaj mikrootwory wiertłem 0,8 mm przez aluminiowe płytki (o średnicy 3 cm i grubości 6 mm).</li>
		<li>Włóż końcówkę magnetyczną (o średnicy 750 μm) do każdego otworu płytki.</li>
		<li>Umieść ten dysk na trwałym magnesie neodymowym, który zapewnia namagnesowanie do nasycenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Budowa urządzenia do wysiewu rusztowań (rys. 1B)
	<ol>
		<li>Pokrój twardy polistyren na 2,4 cm2 kwadraty.</li>
		<li>Włóż 9 małych magnesów (o średnicy 3 mm i długości 6 mm) w równej odległości na powierzchni 1,6 cm2.</li>
		<li>Umieść to urządzenie na trwałym magnesie neodymowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Etykietowanie komórek macierzystych
UWAGA: Komórki macierzyste były znakowane nanocząstkami magnetycznymi o wielkości 0,1 mM przez 30 minut (2,6 ± 0,2 pg żelaza/komórkę), tworząc agregaty, podczas gdy były one znakowane nanocząstkami magnetycznymi 0,2 mM przez 30 minut (5 ± 0,4 pg żelaza/komórkę) w celu zasiewu rusztowań. Te stężenia nanocząstek i czasy inkubacji były wcześniej używane i publikowane dla MSC i innych komórek18,19, i ustalono, że nanocząstki nie wpływają ani na żywotność komórek, ani na zdolność różnicowania MSC. Masę żelaza wbudowaną w komórki macierzyste zmierzono za pomocą magnetoforezy pojedynczej komórki19,20.
<ol>
	<li>Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w kompletnym pożywce do wzrostu mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCGM) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do zbliżenia do konfluencji (~90%).</li>
	<li>Przygotuj roztwór do etykietowania magnetycznego, mieszając 0,1 lub 0,2 mM tlenku żelaza pokrytego cytrynianem maghemitu (γFe2O3; rdzeń: średnica 8 nm) w bezsurowicyzowym podłożu McCoy's 5A zmodyfikowanym w Roswell Park Memorial Institute (RMPI) bez glutaminy i zawierającym 5 mM cytrynianu sodu.</li>
	<li>Odrzucić pożywkę, przepłukać komórki pożywką RPMI bez surowicy bez glutaminy i dodać 10 ml roztworu nanocząstek tlenku żelaza na 150-centymetrową 2 kolbę hodowlaną, minimalną objętość wymaganą do pokrycia wszystkich komórek.</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , a następnie wyrzucić roztwór nanocząstek. Płukać przez 5 minut pożywką RPMI bez surowicy bez glutaminy, aby zinternalizować nanocząsteczki nadal przyczepione do błony plazmatycznej.</li>
	<li>Odrzucić pożywkę RPMI i dodać 25 ml pełnej pożywki MSCGM na kolbę. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Magnetyczne zasiewanie komórek
<ol>
	<li>Świeżo przygotuj pożywkę chondrogenną, używając Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy z L-glutaminą, dodając 50 μM 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego, 0,1 μM deksametazonu, 1 mM pirogronianu sodu, 0,35 mM L-proliny, 1% uniwersalnego suplementu hodowlanego zawierającego insulinę, ludzką transferynę i kwas selenowy (ITS-Premix) oraz 10 ng/ml transformującego czynnika wzrostu-beta 3 (TGF-β3).</li>
	<li>Odłączyć komórki magnetyczne za pomocą 8 ml 0,05% trypsyny-EDTA na 150cm2 kolby hodowlanej i odwirować zdysocjowane komórki przy 260 × g przez 5 minut. Odessać pożywkę i policzyć ponownie zawieszone komórki.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego z kulturą komórkową ze szklanym dnem (35 mm) na obu urządzeniach magnetycznych.</li>
	<li>Aby magnetycznie uformować agregaty, dodaj 3 ml pożywki chondrogenicznej do szalki Petriego i delikatnie umieść najmniejszą możliwą objętość (nie więcej niż 8 μl) zawierającą 2,5×105 znakowanych komórek na agregat (można zdeponować do 16 agregatów). Pozostawić szalkę Petriego na 20-30 minut bez jej przesuwania, pozwalając jej uformować sferoidy, a następnie umieścić całe urządzenie, łącznie z szalką Petriego zawierającą 16 agregatów, w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Uformuj agregacje kontrolne zgodnie z tym samym protokołem i zastąp całe podłoże pożywką chondrogenną bez TGF-β3.
	<ol>
		<li>Aby wygenerować konstrukcję agregatu 3D, umieść 2 agregaty w kontakcie w dniu 8, aby utworzyć 8 dubletów i zainicjuj fuzję. W dniu 11 połącz 2 dublety, aby utworzyć 4 czworaki. Na koniec połącz 4 czworaczki w dniu 15, aby uzyskać ostateczną strukturę.</li>
		<li>W tym samym czasie tworzą agregaty przez odwirowanie 2,5×105 znakowanych komórek macierzystych w ilości 260 × g przez 5 minut w 15-mililitrowych probówkach z 1,5 ml pożywki chondrogenicznej z lub bez TGF-β3 (odpowiednio dla próbki i kontroli).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby magnetycznie wysiewać rusztowania, umieść każde wysuszone rusztowanie na szalce Petriego. Używaj polisacharydowych porowatych rusztowań wykonanych z pullulan/dextran21. Dla każdego rusztowania rozcieńczyć 2×106 znakowanych komórek macierzystych w 350 μl pożywki chondrogennej bez TGF-β3 i ostrożnie pipetować komórki na rusztowanie.
	<ol>
		<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, aby umożliwić pełną penetrację komórek w rusztowaniu, a następnie delikatnie dodać 3 ml pożywki chondrogennej z TGF-β3 lub bez niej (odpowiednio do próbki lub kontroli) do szalki Petriego.</li>
		<li>Inkubować rusztowanie komórkowe na urządzeniu magnetycznym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 dni, aby umożliwić migrację komórek przez pory rusztowania i uwięzienie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W tym samym czasie, rusztowania nasienne z 2×106 znakowanymi komórkami macierzystymi postępują zgodnie z tą samą metodą i inkubują bez magnesu, aby uzyskać rusztowania o równomiernym wysiewie jako kontrole pozytywne.</li>
</ol>
4. Różnicowanie na chondrocyty
UWAGA: Po 4 dniach inkubacji, usuń magnesy i kontynuuj dojrzewanie chondrogenne na szalce Petriego (warunki statyczne) lub w bioreaktorze (warunki dynamiczne). Próbki kontroli ujemnej dojrzewają w warunkach statycznych z pożywką chondrogenną bez TGF-β3.
<ol>
	<li>W warunkach statycznych należy przechowywać komórkowe rusztowania lub agregaty na tej samej szalce Petriego. Zmieniaj pożywkę chondrogenną dwa razy w tygodniu przez 21 dni.</li>
	<li>W warunkach dynamicznych przygotuj bioreaktor.
	<ol>
		<li>Wytnij silikonową rurkę na odpowiednią długość zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Autoklaw wszystkich materiałów: komory hodowlanej o pojemności 500 ml, rurek, rotatorów 2-drogowych i klatek.</li>
		<li>Umieść części bioreaktora w sterylnej stacji bezpieczeństwa mikrobiologicznego. Podłącz rurkę do rotatorów 2-drogowych i do komory hodowlanej zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Ostrożnie przenieś rusztowania komórkowe do wysterylizowanych klatek za pomocą sterylnej szpatułki. Umieść 2 rusztowania w klatce. Gdy klatki będą gotowe, włóż je do igieł pokrywy, aby nie przesuwały się podczas dalszego obracania. Napełnij komorę hodowlaną pożywką chondrogenną i zamknij ją pokrywą zawierającą klatki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz pompę perystaltyczną, aby napełnić rurkę medium chondrogetycznym i wyeliminować pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Umieść i zabezpiecz napełnioną komorę w silniku bioreaktora i włącz komputer, który steruje obrotami zarówno ramienia, jak i komory.</li>
	<li>Zastosuj prędkość obrotową 5 obrotów na minutę (rpm) zarówno na ramieniu, jak i na komorze. Wyreguluj pompę perystaltyczną na natężenie przepływu 10 obr./min w celu ciągłego zasilania rusztowań komórkowych.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja RNA i analiza ekspresji genów
UWAGA: Przed ekstrakcją RNA, trawić rusztowania roztworem enzymatycznym.
<ol>
	<li>Przygotować 1 ml roztworu enzymatycznego, dodając 100 μl pullulanazy (40 j./ml) i 50 μl dekstranazy (60 mg/ml) do 850 ml pożywki DMEM bez surowicy.</li>
	<li>Przepłukać rusztowania dwukrotnie pożywką DMEM bez surowicy, wyrzucić pożywkę i dodać 800 μl roztworu enzymatycznego na rusztowanie. Inkubować przez 15-30 minut w temperaturze 37 °C pod delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Gdy rusztowanie jest całkowicie rozpuszczone, przenieść roztwór zawierający komórki do probówki o pojemności 1,5 ml, odwirować przy 300 × g przez 10 minut, ostrożnie odessać pożywkę, przepłukać dwukrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1× (PBS), odwirować przy 300 × g przez 10 minut i ponownie zawiesić komórki w roztworze do izolacji RNA.</li>
	<li>Aby wyekstrahować RNA z agregatów, przed wykonaniem ekstrakcji RNA umieść sferoidy w roztworze izolacyjnym RNA i całkowicie je zmiażdż za pomocą homogenizatora.</li>
	<li>Wyizolować RNA za pomocą zestawu do całkowitej ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Zsyntetyzować komplementarne DNA z 400 ng całkowitego RNA za pomocą odwrotnej transkryptazy zgodnie z instrukcjami producenta, używając 250-ngowych starterów losowych, 1 μl mieszanki dNTP (po 10 mM) i 40 U/ml inhibitora RNazy; końcowa objętość reakcji wynosi 20 μL. Pod koniec reakcji dodać 80 μl wody destylowanej, aby uzyskać końcową objętość 100 μl.</li>
	<li>W przypadku ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) należy użyć mieszaniny PCR zawierającej odczynnik fluorescencyjny w celu ilościowego określenia względnej ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania, takich jak agrekan (AGC) i kolagen II (Col II), z 10× rozcieńczonym cDNA. Normalizuj poziomy ekspresji genów za pomocą genu referencyjnego Białko rybosomalne, duże, P0 (RPLP0). Obliczenia należy wykonać ze wzorem 2-ΔΔCT, gdzie ΔΔCT = ΔCT stanu zróżnicowanego - średnia ΔCT stanu kontrolnego, a każdy ΔCT reprezentuje CT genu będącego przedmiotem zainteresowania - CT genu odniesienia (RPLP0).</li>
	<li>Pomiary statystyczne należy określić jako wartości średnie ± błędu standardowego średniej (SEM). Przeprowadź analizę za pomocą n ≥ 2 niezależnych eksperymentów. Użyj testu t Studenta, aby przeanalizować różnice statystyczne między odwirowanymi granulkami a fuzjami magnetycznymi (* p < 0,05). Określ istotność za pomocą testu Kruskala-Wallisa (jednoczynnikowy ANOVA nieparametryczny) do analizy różnic statystycznych między zróżnicowanymi rusztowaniami i rusztowaniem kontrolnym (* p < 0,05).</li>
</ol>
6. Analiza histologiczna
<ol>
	<li>Przepłukać komórkowe rusztowania lub agregaty sterylnym 1× PBS, utrwalić je w 10% roztworze formaliny na 1 godzinę w temperaturze pokojowej i spłukać 1× PBS.</li>
	<li>Usunąć PBS, zanurzyć próbki w związku o optymalnej temperaturze skrawania (OCT) i zamrozić je w kąpieli izopentanowej zanurzonej w ciekłym azocie. Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C. Próbki należy przeciąć kriostatem w celu uzyskania kriosekcji o wielkości 8 μm w przypadku kruszyw lub 12 μm w przypadku rusztowań komórkowych.</li>
	<li>Wybarwić kriosekcje 0,5% roztworem błękitu toluidynowego przez 2 minuty, spłukać w wodzie z kranu, odwodnić 100% etanolem, sklarować za pomocą toluenu i zamontować szkiełka za pomocą podłoża montażowego do mikroskopii świetlnej.</li>
</ol>

<ol><li>Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+imaging+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Clinical imaging in regenerative medicine.</a> Nat Biotechnol. 32 (8), 804-818 (2014).</li>
<li>Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+based+stem+cell+tracking+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine.</a> Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).</li>
<li>Di Corato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+cellular+MRI%3A+gadolinium+and+iron+oxide+nanoparticles+for+in-depth+dual-cell+imaging+of+engineered+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs.</a> ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+magnetic+assembly+of+microscale+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels.</a> Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).</li>
<li>Kito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cell+sheets+created+by+a+novel+magnetite+tissue+engineering+method+for+reparative+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis.</a> Sci Rep. 3, 1418(2013).</li>
<li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+in+vascular+tissue+engineering%3A+from+nanoscaffolding+towards+rapid+vessel+biofabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication.</a> Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).</li>
<li>Mattix, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Janus+magnetic+cellular+spheroids+for+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering.</a> Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).</li>
<li>Henstock, J., El Haj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+mechanotransduction+in+therapeutic+MSCs%3A+can+remotely+controlled+magnetic+nanoparticles+regenerate+bones%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones?</a> Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).</li>
<li>Fayol, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+magnetic+forces+to+promote+stem+cell+aggregation+during+differentiation%2C+and+cartilage+tissue+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling.</a> Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).</li>
<li>Bartlett, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chondrocyte+implantation+versus+matrix-induced+autologous+chondrocyte+implantation+for+osteochondral+defects+of+the+knee%3A+a+prospective%2C+randomised+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Br%22%5BJournal%5D)">Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study.</a> J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).</li>
<li>Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chondrocyte+implantation%3A+an+overview+of+technique+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22ANZ+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes.</a> ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).</li>
<li>Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-based+cartilage+tissue+engineering%3A+cells%2C+scaffold+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology.</a> Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).</li>
<li>Boeuf, S., Richter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenesis+of+mesenchymal+stem+cells%3A+role+of+tissue+source+and+inducing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors.</a> Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31(2010).</li>
<li>Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+functional+articular+cartilage%3A+the+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status.</a> Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).</li>
<li>Schon, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+high-throughput+microtissue+fabrication+process+for+3D+assembly+of+tissue+engineered+cartilage+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs.</a> Cell Tissue Res. , (2012).</li>
<li>Robert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+micro-manipulations+to+probe+the+local+physical+properties+of+porous+scaffolds+and+to+confine+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells.</a> Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).</li>
<li>Luciani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+chondrogenesis+within+scaffolds%2C+using+magnetic+stem+cell+confinement+and+bioreactor+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation.</a> Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).</li>
<li>Wilhelm, C., Gazeau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+cell+labelling+with+anionic+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles.</a> Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).</li>
<li>Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+magnetic+nanoparticle+aggregation+and+cellular+uptake%3A+a+precondition+for+efficient+stem-cell+differentiation+and+MRI+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking.</a> Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).</li>
<li>Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetophoresis+and+ferromagnetic+resonance+of+magnetically+labeled+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells.</a> Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).</li>
<li>Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+porous+polysaccharide-based+scaffolds+using+a+combined+freeze-drying%2Fcross-linking+process%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process.</a> Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).</li>
<li>Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+toxicity+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+%28SPION%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Reviews%22%5BJournal%5D)">Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION).</a> Nano Reviews. 1, (2010).</li>
<li>Lee, J. H., Hur, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+formation+of+a+millimeter-scale+multicellular+spheroid+with+an+internal+cavity+from+magnetically+levitated+3T3+cells+that+ingested+iron+oxide-containing+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres.</a> Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).</li>
<li>Mattix, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+magnetic+cellular+spheroids+as+building+blocks+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).</li>
<li>Mazuel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+Intracellular+Biodegradation+of+Iron+Oxide+Nanoparticles+Evidenced+Magnetically+at+Single-Endosome+and+Tissue+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels.</a> ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).</li>
<li>Kim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+generation+of+spheroids+using+magnetic+nanoparticles+for+three-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture.</a> Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).</li>
<li>Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+cell-seeding+into+3D+porous+scaffolds+by+use+of+magnetite+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+B+Appl+Biomater%22%5BJournal%5D)">Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).</li>
<li>Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+nanoparticle-based+approaches+to+locally+target+therapy+and+enhance+tissue+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo.</a> Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).</li>
<li>Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-axial+mechanical+stimulation+of+tissue+engineered+cartilage%3A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review.</a> Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).</li>
<li>Takahashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compressive+force+promotes+sox9%2C+type+II+collagen+and+aggrecan+and+inhibits+IL-1beta+expression+resulting+in+chondrogenesis+in+mouse+embryonic+limb+bud+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells.</a> J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).</li>
<li>Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compressive+strain+influences+chondrogenic+gene+expression+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells.</a> Biorheology. 43, 455-470 (2006).</li>
<li>Vunjak-Novakovic, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+cultivation+conditions+modulate+the+composition+and+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage.</a> J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Po pierwsze, ponieważ przedstawione tutaj techniki opierają się na internalizacji nanocząstek magnetycznych, jedną z ważnych kwestii jest wynik nanocząstek po ich zlokalizowaniu w komórkach. Prawdą jest, że nanocząstki żelaza mogą wywoływać potencjalną toksyczność lub upośledzoną zdolność różnicowania w zależności od ich wielkości, powłoki i czasu ekspozycji19,22. Jednak kilka badań nie wykazało wpływu na fizjologię komórkową, gdy zastosowano kapsułkowane nanoczą...

Nanocząstki magnetyczne są już używane w klinice jako środki kontrastowe do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI), a ich zastosowania terapeutyczne stale się rozszerzają. Na przykład niedawno wykazano, że znakowane komórki mogą być manipulowane in vivo za pomocą zewnętrznego pola magnetycznego i mogą być kierowane i/lub utrzymywane w określonym miejscu implantacji1,2,3. W medycynie regeneracyjnej mogą być używane do inżynierii zorganizowanych tkanek in vitro4, w tym tkanki naczyniowej5,6,7, bone8, and cartilage9.
Chrząstka stawowa jest zanurzona w środowisku beznaczynnościowym, co sprawia, że naprawa elementów macierzy zewnątrzkomórkowej jest bardzo ograniczona, gdy dochodzi do uszkodzeń. Z tego powodu badania koncentrują się obecnie na inżynierii zamienników chrząstki szklistej, które można wszczepić w miejscu ubytku. W celu uzyskania autologicznego zamiennika, niektóre grupy badawcze badają wykorzystanie autologicznych chondrocytów jako źródła komórek10,11, podczas gdy inne podkreślają zdolność mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) do różnicowania się w chondrocyty12,13. W poprzednich badaniach, które podsumowaliśmy tutaj, wybraliśmy MSC, ponieważ pobieranie próbek szpiku kostnego jest dość proste i nie wymaga poświęcenia zdrowych chondrocytów, które ryzykują utratę fenotypu14.
Wczesnym krokiem niezbędnym do zainicjowania chondrogennego różnicowania komórek macierzystych jest ich kondensacja. Agregacje komórkowe są zwykle tworzone przy użyciu wirowania lub hodowli mikromasy15; Jednak te metody kondensacji nie wykazują ani potencjału do tworzenia klastrów komórek w grubych rusztowaniach, ani potencjału do kontrolowania fuzji agregatów. W artykule opisano innowacyjne podejście do kondensacji komórek macierzystych z wykorzystaniem znakowania magnetycznego MSC i przyciągania magnetycznego. Udowodniono, że technika ta tworzy konstrukcje 3D bez rusztowań poprzez łączenie agregatów ze sobą w celu uzyskania tkanki chrzęstnej w skali milimetrowej9. Magnetyczne wysiewanie grubych i dużych rusztowań umożliwiło również zwiększenie rozmiaru zmodyfikowanej tkanki, zaprojektowanie kształtu bardziej użytecznego do implantacji oraz zróżnicowanie potencjału zastosowań klinicznych w naprawie chrząstki. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół magnetycznego wysiewu MSC do porowatych rusztowań składających się z naturalnych polisacharydów, pullulanu i dekstranu, rusztowań wcześniej używanych do uwięzienia komórek macierzystych16,17. Różnicowanie chondrogenne przeprowadzono ostatecznie w bioreaktorze, aby zapewnić ciągłą dyfuzję składników odżywczych i gazów do rdzenia matrycy rusztowań obsianych dużą gęstością komórek. Oprócz dostarczania do komórek składników odżywczych, chondrogennych czynników wzrostu i gazu, bioreaktor oferował stymulację mechaniczną. Ogólnie rzecz biorąc, technologia magnetyczna stosowana do uwięzienia komórek macierzystych, w połączeniu z dynamicznym dojrzewaniem w bioreaktorze, może znacznie poprawić różnicowanie chondrogenne.

<table><tbody><tr><td>Nanocząsteczki tlenku żelaza (maghemitu) (&gamma;-Fe2O3)</td><td>PHENIX - Uniwersytet Paris 6</td><td>Wykonane i podane przez C. M&eacute; nager</td><td>Średnia średnica 8,1 nm i ujemny ładunek powierzchniowy</td></tr><tr><td>Rusztowania polisacharydowe Pullulan/Dextran</td><td>LIOAD - University Nantes</td><td>Wykonane i podane przez C. Le Visage</td><td>Sporządzono z mieszaniny pullulanu i dekstranu w proporcji 75:25 w warunkach zasadowych (10&nbsp; M NaOH). Porowatość: 185-205&nbsp; &mikro; m; Grubość: 7&nbsp; Mm; Powierzchnia: 1,8&nbsp; cm2.</td></tr><tr><td>System regeneracji TisXell</td><td>QuinXell Technologies</td><td>QX900-002</td><td>Bioreaktor dwuosiowy z komorą hodowlaną 500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Klatka na rusztowania: Histosette II M492&nbsp;</td><td>VWR</td><td>720-0909</td><td></td></tr><tr><td>Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC)</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>Użyto trzech niezależnych partii</td></tr><tr><td>MSCGM BulletKit medium</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>Aby uzyskać pełną pożywkę, dodaj dostarczony zestaw BulletKit (zawierający surowicę, glutaminę i antybiotyki) do pożywki MSCGM</td></tr><tr><td>DMEM z Glutamax I</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>Bez pirogronianu sodu, bez HEPES</td></tr><tr><td>RPMI medium 1640, bez glutaminy</td><td>Life Technologies</td><td>31870-025</td><td>Bez pirogronianu sodu, bez HEPES</td></tr><tr><td>PBS bez CaCl2 bez MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina (10 000&nbsp; U/ml) / Streptomycyna (10 000&nbsp; &mikro; g/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ITS Premix Uniwersalny suplement do hodowli (20x)</td><td>Corning</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór pirogronianu sodu 100 mM</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy 2-fosforan</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>Przygotować stężony roztwór (25 mM) w wodzie destylowanej bezpośrednio</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td>Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 175 mM rozcieńczony w wodzie destylowanej i przechowywać w temperaturze 4&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Przygotować 1 mM roztwór podstawowy rozcieńczony w etanolu 100% i przechowywać w temperaturze -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>TGF-beta 3 białko 10&nbsp; &mikro; g</td><td>Interchim</td><td>30R-AT028</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trójsodowy</td><td>VWR</td><td>33615.268</td><td>Przygotuj 1&nbsp; M roztwór podstawowy rozcieńczyć w wodzie destylowanej i przechowywać w temperaturze 4&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Pullulanaza z Bacillus acidopullulyticus</td><td>Sigma</td><td>P2986</td><td></td></tr><tr><td>Dekstranaza z Chaetomium erraticum</td><td>Sigma</td><td>D0443</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji RNA NucleoSpin</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.5</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Odwrotna transkryptaza</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Losowy Podkład - Hexamer&nbsp;</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td>500 &micro; g/ml: Użyj rozcieńczonej 1/2 i umieść 1 &mikro; L na próbkę</td></tr><tr><td>Rekombinowane RNA w inhibitorze rybonukleazy</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>40 U/&micro; L: umieść 1 i mikro; L na próbkę</td></tr><tr><td>mieszaniny nukleotydów dNTP do PCR (10&nbsp; mM każdy)</td><td>Roche</td><td>10842321</td><td></td></tr><tr><td>SyBr Green PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4368708</td><td></td></tr><tr><td>Step One Plus Real-Time PCR System</td><td>Life Technologies</td><td>4381792</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny 10% neutralnie buforowany</td> roztwór <td>Sigma</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>VWR</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Błękit toluidynowy O</td><td>VWR</td><td>1.15930.0025</td><td></td></tr><tr><td>Absolut etanolu</td><td>VWR</td><td>20821.310</td><td></td></tr><tr><td>Toluen</td><td>VWR</td><td>1.08323.1000</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe Pertex</td><td>Histolab</td><td>840</td><td></td></tr><tr><td>RPLP0 Podkład do qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'Agrecan</td></tr> <tr><td>Primer do qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'Podkład</td></tr> <tr><td>kolagenowy II do qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'</td></tr></tbody></table>

agregacja magnetycznych komórek macierzystych 3d i dojrzewanie bioreaktora w celu regeneracji chrząstki

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Inżynieria chrząstki pozostaje wyzwaniem ze względu na trudności w stworzeniu funkcjonalnego implantu in vitro podobnego do tkanki rodzimej. Niedawno zbadane podejście do rozwoju autologicznych zamienników obejmuje różnicowanie komórek macierzystych w chondrocyty. Aby zainicjować tę chondrogenezę, wymagany jest pewien stopień zagęszczenia komórek macierzystych; W związku z tym wykazaliśmy możliwość magnetycznie kondensującego ogniwa, zarówno w grubych rusztowaniach, jak i bez rusztowań, przy użyciu zminiaturyzowanych źródeł pola magnetycznego jako atraktorów komórek. To magnetyczne podejście zostało również wykorzystane do kierowania fuzją agregatów i do budowy pozbawionych rusztowań, zorganizowanych, trójwymiarowych (3D) tkanek o rozmiarach kilku milimetrów. Oprócz zwiększonego rozmiaru, tkanka utworzona przez fuzję magnetyczną wykazywała znaczny wzrost ekspresji kolagenu II, a podobny trend zaobserwowano w przypadku ekspresji agrekanów. Ponieważ rodzima chrząstka została poddana działaniu sił, które wpłynęły na jej strukturę 3D, przeprowadzono również dojrzewanie dynamiczne. Bioreaktor, który dostarcza bodźców mechanicznych, został wykorzystany do hodowli rusztowań osadzonych magnetycznie przez okres 21 dni. Dojrzewanie bioreaktora znacznie poprawiło chondrogenezę w komórkowe rusztowania; uzyskana w tych warunkach macierz zewnątrzkomórkowa była bogata w kolagen II i aggrekan. Prace te nakreślają innowacyjny potencjał magnetycznej kondensacji znakowanych komórek macierzystych i dynamicznego dojrzewania w bioreaktorze w celu poprawy różnicowania chondrogennego, zarówno bez rusztowań, jak i w rusztowaniach polisacharydowych.

W pierwszej kolejności agregaty można formować indywidualnie przy użyciu mikromagnesów poprzez osadzanie 2,5×105 znakowanych komórek macierzystych (Rysunek 2A). Te pojedyncze agregaty (o rozmiarze ~0,8 mm) mogą być następnie łączone w większe struktury dzięki sekwencyjnej fuzji indukowanej magnetycznie. Przykładowo, w 8. dniu dojrzewania chondrogennego agregaty zestawiano w pary w celu utworzenia dubletów; w 11. dniu utworzono kwartety poprzez połączenie 2 dubl...

Chondrogeneza z komórek macierzystych wymaga precyzyjnego dostrojenia warunków hodowli. W tym miejscu przedstawiamy magnetyczne podejście do kondensacji komórek, które jest niezbędnym krokiem do zainicjowania chondrogenezy. Ponadto wykazaliśmy, że dynamiczne dojrzewanie w bioreaktorze stosuje mechaniczną stymulację konstruktów komórkowych i zwiększa produkcję chrzęstnej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Agregacja magnetycznych komórek macierzystych 3D i dojrzewanie bioreaktora w celu regeneracji chrząstki

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Ogólnym celem tej metody magnetycznej agregacji komórek i dynamicznego dojrzewania jest usprawnienie chondrogenezy in vitro mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). Magnetyczna agregacja komórek macierzystych, zastępująca kondensację komórkową w procesie chondrogenezy, stanowi wczesny, kluczowy etap procesu regeneracji chrząstki. Po zamknięciu komórek macierzystych w rusztowaniach, mogą one zostać przeniesione do bioreaktora komórkowego w celu oceny dynamicznego dojrzewania komórek.Ważną metodę dynamiki można zastosować do innych biosystemów, takich jak regeneracja mięśni, serca lub naczyń krwionośnych. Jednak, jak zostanie pokazane, jest ona bardzo odpowiednia do regeneracji chrząstki. Wizualna demonstracja magnetycznego zasiewania komórek oraz dynamicznego dojrzewania komórek z użyciem rzeczywistego bioreaktora jest kluczowa, ponieważ obie te techniki są trudne do opanowania wyłącznie na podstawie instrukcji tekstowych.Aby zbudować urządzenie z mikromagnesów do formowania agregatów, należy najpierw włożyć końcówkę magnetyczną o średnicy 750 µm do każdego otworu o długości 3 cm w płycie aluminiowej o grubości 6 mm, a następnie umieścić płytę nad trwałym magnesem neodymowym. Aby zbudować urządzenie do zasiewania rusztowań, należy najpierw wyciąć z twardego polistyrenu kwadraty o powierzchni 2,4 cm², a następnie wstawić magnesy o średnicy 3 mm i długości 6 mm w równych odstępach na powierzchni 1,6 cm². Następnie urządzenie należy umieścić nad trwałym magnesem neodymowym.Aby oznakować ludzkie MSC, najpierw hoduj komórki macierzyste w pełnej pożywce wzrostowej dla MSC w temperaturze 37°C przy 5% CO2 aż do osiągnięcia 90% konfluencji. Odessaj pożywkę, a następnie przepłucz komórki pożywką RPMI z surowicą 3 bez glutaminy i dodaj 10 ml roztworu nanocząsteczek tlenku żelaza na kolbę hodowlaną o powierzchni 150 cm²; inkubuj przez 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po zakończeniu inkubacji przepłucz komórki przez pięć minut pożywką RPMI z surowicą 3 bez glutaminy, aby zinternalizować nanocząsteczki wciąż przytwierdzone do błony plazmatycznej.Następnie należy zastąpić medium RPMI w każdej kolbie 25 mililitrami kompletnego medium wzrostowego dla MSC i przenieść komórki do inkubatora do hodowli komórkowych na noc. Następnego ranka należy odlepić komórki magnetyczne za pomocą ośmiu mililitrów 0,25% Trypsyny-EDTA na kolbę. Następnie należy zebrać dysocjowane komórki poprzez wirowanie.Resuspendujemy osady w celu ich przeliczenia, a na każde urządzenie magnetyczne kładziemy szalkę Petriego do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm z szklanym dnem. Aby magnetycznie sformować agregaty, dodajemy 3 mL pożywki chondrogennej do każdej szalki Petriego i ostrożnie nanosimy nie więcej niż 8 µL zawiesiny zawierającej 2,5 × 10⁵ oznakowanych komórek na agregat. Kluczowe jest, aby komórki nanosić z umiarkowaną prędkością – ani zbyt wolno, ani zbyt szybko.Ani zbyt blisko, ani zbyt daleko od magnesu. Po rozmieszczeniu wszystkich agregatów należy pozwolić sferoidom formować się przez 20-30 minut, nie zakłócając tego procesu. Następnie należy przenieść agregaty do inkubatora do hodowli komórkowej.Tego samego dnia utworzyć agregaty poprzez odwirowanie 2,5 × 10⁵ znakowanych komórek macierzystych w probówkach stożkowych o pojemności 15 ml z dodatkiem 1,5 ml medium chondrogennego. Aby wysiać komórki na rusztowania z wykorzystaniem magnesów, umieścić jedno wysuszone porowate rusztowanie polisacharydowe z pullulanu/dekstranu na jednej płytce Petriego i rozcieńczyć 2 × 10⁶ znakowanych komórek w 350 µl medium chondrogennego bez TGFbeta3. Ostrożnie nanieść komórki pipetą na rusztowania i inkubować struktury w temperaturze 37 °C, aby umożliwić pełną penetrację komórek.Po pięciu minutach delikatnie dodaj trzy mililitry medium chondrogennego do szalki Petriego i przenieś rusztowania z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na cztery dni, aby umożliwić komórkom migrację przez pory rusztowania. Tego samego dnia zasiać również inny zestaw rusztowań z 2 × 10⁶ oznakowanych komórkami macierzystymi, zgodnie z demonstracją, i inkubować komórki bez użycia magnesu, aby uzyskać równomiernie obsiane rusztowania jako kontrole pozytywne. W celu przeprowadzenia chondrogenezy w rusztowaniach, w piątym dniu usuń urządzenie magnetyczne ze wszystkich rusztowań i przenieś statyczne rusztowania z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych aż do 25. dnia, wymieniając medium dwa razy w tygodniu.W przypadku dynamicznej hodowli komórkowej, w piątym dniu należy również przyciąć rurki silikonowe do odpowiedniej długości zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie umieścić rurki, 500-mililitrową komorę hodowlaną, rotatory dwukierunkowe oraz klatki w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Zgodnie z instrukcjami producenta należy połączyć rurki z rotatorami dwukierunkowymi w komorze hodowlanej. Następnie, używając sterylnej szpatułki, należy ostrożnie przenieść po dwa zasiedlone komórkami rusztowania do każdej klatki.Po przeniesieniu wszystkich rusztowań włóż klatki przez igły w pokrywce, aby zapobiec ich przemieszczaniu się podczas rotacji. Następnie wypełnij komorę hodowlaną medium chondrogennym. Podczas przygotowywania komór stosuj sterylną technikę antyseptyczną, aby uniknąć kontaminacji narzędzi lub rusztowań.Następnie włóż klatki do komory, zamknij komorę i uruchom pompę perystaltyczną, aby napełnić rurki medium chondrogennym i usunąć pęcherzyki powietrza. Umieść i zabezpiecz napełnioną komorę w silniku bioreaktora, a następnie uruchom komputer sterujący obrotami ramienia i komory. Następnie ustaw prędkość obrotową ramienia i komory na 5 obr./min oraz dostosuj pompę perystaltyczną do prędkości 10 obr./min w celu zapewnienia ciągłego odżywiania zcellularyzowanych rusztowań.Aby wytworzyć bezrusztowianową konstrukcję agregatu 3D, w ósmym dniu należy zainicjować fuzję, umieszczając dwa agregaty w kontakcie w medium chondrogennym, aby utworzyć osiem dubletów. Następnie w 11. dniu należy połączyć dwa dublety w celu utworzenia czterech kwadrupletów, a finalną strukturę uformować w 15. dniu poprzez fuzję czterech kwadrupletów. Tkanki uformowane za pomocą fuzji magnetycznej wykazują znaczący wzrost ekspresji kolagenu II w porównaniu do peletów uzyskanych metodą wirowania.Z rosnącą tendencją ekspresji aggrecanu. W przypadku zewnątrzkomórkowych rusztowań statycznych obserwuje się wzrost ekspresji aggrecanu oraz kolagenu II przy zastosowaniu zasiewania magnetycznego, w porównaniu do rusztowań zasiewanych bez użycia sił magnetycznych. Co ciekawe, ekspresja kolagenu II jest znacznie wyższa, gdy zasiewanie magnetyczne jest połączone z dynamicznym różnicowaniem.Analiza histologiczna z użyciem błękitu toluidyny wykazuje, że sekwencyjna fuzja magnetyczna 16 agregatów charakteryzuje się obfitą depozycją glikanów glukozaminy. Co więcej, w rusztowaniach zasiewanych magnetycznie zawartość glikanów glukozaminy jest wyższa, gdy rusztowania są różnicowane w bioreaktorze, niż w przypadku hodowli statycznej. Po opanowaniu techniki, magnetyczna agregacja komórek może zostać ukończona w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o resuspensji znakowanych komórek w jak najmniejszej objętości, aby ułatwić tworzenie agregatów. Po magnetycznym zasiewaniu rusztowań można przeprowadzić dynamiczne dojrzewanie przy użyciu właściwego bioreaktora w celu poprawy ekspresji nowo zsyntetyzowanych chondrocytów. Od momentu opracowania technika ta utorowała drogą badaczom w dziedzinie medycyny regeneracyjnej do badania regeneracji chrząstki stawowej u ludzi.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak konstruować urządzenia magnetyczne, znakować komórki macierzyste z agregatów komórek macierzystych, magnetycznie zasiewać rusztowania oraz korzystać z rzeczywistego bioreaktora. Prosimy pamiętać, że praca z ludzkimi komórkami i tkankami może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek, fartuchów laboratoryjnych i okularów ochronnych.

3d-magnetic-stem-cell-aggregation-bioreactor-maturation-for-cartilage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zaprojektowaliśmy nowatorski bioreaktor obciążenia mechanicznego, który może zastosować jednoosiowe lub dwuosiowe naprężenie mechaniczne do biokompozytu chrząstki przed przeszczepem do ubytku chrząstki stawowej.

Projekt dwuosiowego bioreaktora obciążenia mechanicznego dla inżynierii tkankowej

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Naprawa chrząstki stanowi niespełnione wyzwanie medyczne, a oparte na komórkach podejścia do inżynierii ludzkiej chrząstki stawowej są obiecującym rozwiązaniem. W tym miejscu opisujemy trójwymiarowe (3D) hydrożele biomimetyczne jako idealne narzędzie do ekspansji i dojrzewania chondrocytów stawowych człowieka.

Rusztowania hydrożelowe 3D do hodowli chondrocytów stawowych i wytwarzania chrząstek

Tutaj proponujemy protokół chondrogenicznego różnicowania od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej.

Tworzenie chondrogennych osadów z pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania systemów hodowli 3D w samoorganizujących się rusztowaniach peptydowych, aby promować różnicowanie odróżnicowanych ludzkich chondrocytów stawowych w tkankę podobną do chrząstki.

Hodowla komórek ssaków w trójwymiarowych rusztowaniach peptydowych

Ten artykuł przedstawia prosty i ekonomiczny protokół prostej izolacji i oczyszczania mezenchymalnych komórek macierzystych z płynu maziowego białego królika z Nowej Zelandii.

Strategie sortowania komórek aktywowanych magnetycznie w celu izolacji i oczyszczenia mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego z modelu królika

Trójwymiarowy jednoosiowy system bioreaktora do stymulacji mechanicznej jest idealnym bioreaktorem do specyficznego dla tenogenicznego różnicowania komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien i tworzenia neościęgien.

Zastosowanie trójwymiarowego, jednoosiowego bioreaktora do stymulacji mechanicznej w celu indukowania różnicowania tenogennego komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien

Terapia kości poprzez kostnienie śródchrzęstne poprzez wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wyprodukowanej z mezenchymalnych komórek macierzystych ma potencjał do obejścia wad konwencjonalnych terapii. Hydrożele kwasu hialuronowego są skuteczne w zwiększaniu skali jednolicie zróżnicowanych przeszczepów chrząstki, a także w tworzeniu zintegrowanej kości z unaczynieniem między zrośniętymi przeszczepami in vivo.

Zintegrowane tworzenie kości poprzez kostnienie endochrzęstne in vivo przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych

To badanie opisuje metodę wytwarzania sferoid chondrocytarnych poprzez agregację komórek w sferoidy w warunkach niskiej adhezji przy użyciu grawitacji, a następnie hodowlę powstałych sferoid w mini-bioreaktorach.

Generowanie sferoid z różnych chondrocytów przy użyciu warunków niskiej przyczepności w warunkach grawitacyjnych i domowych mini-bioreaktorów

Ludzkie okołonaczyniowe komórki macierzyste (PSCs) stanowią nową klasę komórek macierzystych do regeneracji tkanek szkieletowych, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs). PSCs można wyizolować za pomocą FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) z tkanki tłuszczowej pobranej podczas standardowych procedur liposukcji, a następnie połączyć z rusztowaniem osteoindukcyjnym w celu uzyskania formowania kości in vivo.

Zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

Poznaj metodę magnetycznej agregacji komórek macierzystych MSC i dynamicznego dojrzewania w bioreaktorze w celu regeneracji chrząstki. Technika ta wspiera produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej i może być zastosowana w inżynierii tkanek.

Agregacja magnetycznych komórek macierzystych 3D i dojrzewanie bioreaktora w celu regeneracji chrząstki

Przeglądaj więcej filmów