Agregacja magnetycznych komórek macierzystych 3D i dojrzewanie bioreaktora w celu regeneracji chrząstki
27 kwietnia 2017
Chondrogeneza z komórek macierzystych wymaga precyzyjnego dostrojenia warunków hodowli. W tym miejscu przedstawiamy magnetyczne podejście do kondensacji komórek, które jest niezbędnym krokiem do zainicjowania chondrogenezy. Ponadto wykazaliśmy, że dynamiczne dojrzewanie w bioreaktorze stosuje mechaniczną stymulację konstruktów komórkowych i zwiększa produkcję chrzęstnej macierzy zewnątrzkomórkowej.
Ogólnym celem tej metody magnetycznej agregacji komórek i dynamicznego dojrzewania jest poprawa chondrogenezy in vitro mezenchymalnych komórek zrębu lub MSC. Agregacja magnetyczna komórek macierzystych zamiast chondrogenezy jako kondensacji komórek jest wczesnym kluczowym etapem procesu regeneracji chrząstki. Po zamknięciu komórek macierzystych w rusztowaniach, rusztowania mogą być przenoszone do bioreaktora komórkowego w celu oceny dynamicznego dojrzewania komórek.
Ważna metoda dynamiki może być stosowana do innych bioukładów, takich jak naprawa mięśni, serca lub naczyń krwionośnych. Ale jak zobaczysz, bardzo dobrze nadaje się do regeneracji chrząstki. Wizualna demonstracja magnetycznego zasiewu komórek i dynamicznego dojrzewania komórek przy użyciu rzeczywistego bioreaktora ma kluczowe znaczenie, ponieważ te dwie techniki są trudne do nauczenia się tylko na podstawie instrukcji tekstowych.
Aby skonstruować urządzenie z mikromagnesem do formowania agregatów, najpierw włóż końcówkę magnetyczną o średnicy 750 mikrometrów do każdego trzycentymetrowego otworu w aluminiowej płycie o grubości sześciu milimetrów i umieść płytkę na trwałym magnesie neodymowym. Aby skonstruować urządzenie do wysiewu rusztowań, najpierw pokrój twardy polistyren na kwadraty o powierzchni 2,4 centymetra kwadratowego i włóż magnesy o średnicy trzech milimetrów i długości sześciu milimetrów w równej odległości na powierzchni 1,6 centymetra kwadratowego. Następnie umieść urządzenie na stałym magnesie neodymowym.
Aby oznaczyć ludzkie MSC, najpierw posiewa się komórki macierzyste w kompletnej pożywce wzrostowej MSC w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 5% dwutlenku węgla, aż do 90% zlewania się. Odessać, a następnie przepłukać komórki pożywką Serum three RPMI bez glutaminy i dodać 10 mililitrów roztworu nanocząstek tlenku żelaza na kolbę hodowlaną o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych na 30-minutową inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych. Pod koniec inkubacji płucz komórki przez pięć minut pożywką Serum three RPMI bez glutaminy, aby zinternalizować nanocząsteczki nadal przyczepione do błony plazmatycznej.
Następnie zastąp RPMI w każdej kolbie 25 mililitrami kompletnej pożywki wzrostowej MSC i wróć komórki do inkubatora hodowli komórkowych na noc. Następnego ranka odłącz ogniwa magnetyczne z ośmioma mililitrami 05% trypsyny-EDTA na kolbę. I zbierz zdysocjowane komórki przez odwirowanie.
Zawieszamy granulki do liczenia i umieszczamy szklaną płytkę Petriego z 35-milimetrową hodowlą komórkową na wierzchu każdego urządzenia magnetycznego. Aby magnetycznie uformować agregaty, dodaj trzy mililitry pożywki chondrogenicznej do każdej szalki Petriego i delikatnie umieść nie więcej niż osiem mikrolitrów po 2,5 razy 10 do piątej oznakowanej komórki na agregat. Bardzo ważne jest, aby komórki nie były osadzane ani zbyt wolno, ani zbyt szybko.
I ani za blisko, ani za daleko od magnetyzmu. Po umieszczeniu wszystkich agregatów pozwól sferoidom uformować się przez 20-30 minut bez zakłóceń. Następnie przenieś agregaty do inkubatora do hodowli komórkowych.
Tego samego dnia uformuj agregaty przez odwirowanie 2,5 razy 10 do 5 znakowanych komórek macierzystych w 15-mililitrowych stożkowych probówkach z 1,5 mililitra pożywki chondrogennej. Aby magnetycznie wysadzić rusztowania, umieść jedno wysuszone porowate rusztowanie polisacharydowe pullulan / dekstran na szalce Petriego i rozcieńcz 2 razy 10 do 6 znakowanych komórek w 350 mikrolitrach pożywki chondrogenicznej bez TGFbeta3. Ostrożnie pipetować komórki na rusztowaniach i inkubować struktury w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić pełną penetrację komórek.
Po pięciu minutach delikatnie dodaj trzy mililitry pożywki chondrogenicznej do szalki Petriego i włóż rusztowania z powrotem do inkubatora hodowli komórkowych na cztery dni, aby umożliwić komórkom migrację przez pory rusztowania. Tego samego dnia należy również wysiać kolejny zestaw rusztowań z 2 razy 10 do 6 znakowanych komórek macierzystych, jak pokazano, i inkubować komórki bez magnesu, aby uzyskać jednolicie rozsiane rusztowania jako kontrole pozytywne. W celu chondrogenezy do rusztowań w piątym dniu należy usunąć urządzenie magnetyczne ze wszystkich rusztowań i zwrócić rusztowania statyczne do inkubatora hodowli komórkowej do 25 dnia, zmieniając pożywkę dwa razy w tygodniu.
W celu dynamicznej hodowli komórkowej również w piątym dniu należy przyciąć rurki silikonowe do odpowiedniej długości zgodnie z instrukcjami producenta i nadać tempo rurkom, komorze hodowlanej o pojemności 500 mililitrów, dwukierunkowym rotatorom i klatkom do sterylnej stacji bezpieczeństwa mikrobiologicznego. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, podłącz rurkę do dwukierunkowych rotatorów w komorze hodowlanej. Następnie za pomocą sterylnej szpatułki ostrożnie przenieś dwa rusztowania komórkowe do każdej klatki.
Gdy wszystkie rusztowania zostaną przeniesione, włóż klatki przez igły w pokrywie, aby zapobiec ich przesuwaniu się podczas obracania. I napełnij komorę hodowlaną pożywką chondrogenną. Podczas przygotowywania komór należy stosować sterylną technikę antyseptyczną, aby uniknąć zanieczyszczenia któregokolwiek z narzędzi lub rusztowań.
Następnie włóż klatki do komory, a następnie zamknij komorę i włącz pompę perystaltyczną, aby napełnić rurkę medium chondrogenicznego i wyeliminować pęcherzyki powietrza. Umieść i zabezpiecz napełnioną komorę w silniku bioreaktora i włącz komputer, który steruje obrotami ramienia i komory. Następnie zastosuj prędkość obrotową pięciu obrotów na minutę zarówno do ramienia, jak i komory, i dostosuj pompę perystaltyczną do natężenia przepływu 10 obrotów na minutę w celu ciągłego zasilania rusztowań komórkowych.
Aby wygenerować konstrukt agregatu 3D wolny od rusztowań, w ósmym dniu zainicjuj fuzję, umieszczając dwa agregaty w kontakcie w środowisku chondrogennym dla ośmiu dubletów. Następnie w dniu 11 połącz dwa dublety, aby utworzyć cztery czworaczki i utwórz ostateczną strukturę w dniu 15, łącząc cztery czworaczki. Tkanki powstałe w wyniku fuzji magnetycznej wykazują znaczny wzrost ekspresji kolagenu II w porównaniu z granulkami otrzymanymi przez wirowanie.
Ze zwiększonym trendem wyrażania agregacji. W przypadku komórkowych rusztowań statycznych i wzrost ekspresji agregantów i kolagenu II obserwuje się, gdy stosuje się wysiew magnetyczny, w porównaniu z rusztowaniem zasianym bez sił magnetycznych. Co ciekawe, ekspresja kolagenu II jest znacznie wyższa, gdy wysiew magnetyczny jest połączony z dynamicznym różnicowaniem.
Analiza histologiczna z użyciem błękitu toluidynowego ujawnia, że sekwencyjna fuzja magnetyczna 16 agregatów wykazuje obfite osadzanie glikanów glukozaminy. Co więcej, w rusztowaniach magnetycznych zawartość glikanów glukozaminy jest wyższa, gdy rusztowania są różnicowane w bioreaktorze, niż gdy są hodowane statycznie. Po opanowaniu agregacji komórek magnetycznych można zakończyć w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ponownym zawieszeniu oznakowanych komórek w jak najmniejszej objętości, aby ułatwić tworzenie się agregatu. Po magnetycznym wysiewie rusztowań można przeprowadzić dynamiczne dojrzewanie przy użyciu rzeczywistego bioreaktora w celu poprawy ekspresji nowo zsyntetyzowanych chondrocytów. Od momentu powstania technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny medycyny regeneracyjnej do badania regeneracji chrząstki stawowej u ludzi.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak konstruować urządzenia magnetyczne, oznaczać komórki macierzyste jako agregaty komórek macierzystych, magnetycznie wysiewać rusztowania i używać prawdziwego bioreaktora. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi komórkami i tkankami może być niezwykle niebezpieczna i że zawsze należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, fartuchów laboratoryjnych i okularów ochronnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia magnetyczną metodę kondensacji mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w celu zwiększenia chondrogenezy. Metoda ta obejmuje dynamiczne dojrzewanie w bioreaktorze z zastosowaniem stymulacji mechanicznej w celu poprawy produkcji macierzy zewnątrzkomórkowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Regeneracja chrząstki
- Inżynieria tkankowa
Wstęp
- Chondrogeneza ma kluczowe znaczenie dla naprawy chrząstki.
- Kondensacja komórek jest niezbędnym wczesnym etapem procesu regeneracji.
- Dynamiczne dojrzewanie może poprawić właściwości konstruktów komórkowych.
- Agregacja magnetyczna oferuje nowatorskie podejście do zasiewu komórek.
Cel badania
- Poprawa chondrogenezy MSCs in vitro.
- Wykazanie skuteczności magnetycznej agregacji komórek.
- Ocena wpływu dynamicznej dojrzewania na regenerację chrząstki.
Zastosowane metody
- Magnetyczna agregacja komórek macierzystych.
- Wykorzystanie rusztowań do ograniczania przestrzeni komórek.
- Dynamiczne dojrzewanie w bioreaktorze.
- Wizualne prezentacje technik.
Główne wyniki
- Agregacja magnetyczna skutecznie kondensuje MSC.
- Dynamiczna maturacja zwiększa produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Metoda ta ma zastosowanie do innych typów tkanek niż chrząstka.
- Pomoce wizualne ułatwiają zrozumienie złożonych technik.
Wnioski
- Metoda magnetyczna jest skuteczna w procesie chondrogenezy.
- Dynamiczne dojrzewanie znacząco usprawnia inżynierię tkanki chrzęstnej.
- Metody te mogą zostać zaadaptowane do innych zastosowań regeneracyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Magnetyczna agregacja komórek macierzystych rozwiązuje kluczowy problem w regeneracji chrząstki, umożliwiając kontrolowaną kondensację komórek, która jest warunkiem wstępnym chondrogenezy. W połączeniu z dojrzewaniem w dynamicznym bioreaktorze podejście to zwiększa odkładanie macierzy zewnątrzkomórkowej, co podnosi wartość prognostyczną modeli in vitro w zakresie ograniczania ryzyka strategii naprawy chrząstki. Metoda ta wspiera walidację celów oraz rozwój testów, zapewniając odtwarzalny i skalowalny system oceny potencjału chondrogennego w warunkach fizjologicznie istotnych bodźców mechanicznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez chondrogennych poprzez magnetycznie indukowaną kondensację komórek macierzystych, co pozwala na wyjaśnienie wczesnych celów funkcjonalnych w procesie tworzenia chrząstki.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowaną metodę indukcji zagęszczania komórek, co redukuje zmienność w testach wczesnych etapów chondrogenezy.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie wolnych od rusztowania agregatów 3D oraz rusztowań zasianych magnetycznie z podwyższoną ekspresją kolagenu II i agrekanu, co umożliwia ilościową analizę różnicowania chondrogennego.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację testów poprzez spójne tworzenie agregatów i dojrzewanie wspomagane bioreaktorem, co poprawia powtarzalność w ramach kampanii przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje ciągłość od odkrycia do walidacji przedklinicznej, pokazując zwiększoną produkcję macierzy w warunkach dynamicznej hodowli, co odzwierciedla biomechanikę rodzimej chrząstki.
- Wartość operacyjna: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka poprzez korelację zasiewu magnetycznego i dojrzewania w bioreaktorze z poprawionym odkładaniem macierzy zewnątrzkomórkowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesów odkrywania – od kondensacji komórek macierzystych, poprzez tworzenie trójwymiarowej tkanki, aż po dynamiczne dojrzewanie – wspierając identyfikację związków wiodących oraz ocenę przedkliniczną kandydatów do regeneracji chrząstki.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnalizacyjnych poprzez umożliwienie precyzyjnej kontroli agregacji komórek macierzystych, co stanowi krytyczny wczesny etap chondrogenezy.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy systemów biologicznych o ustandaryzowanym rozmiarze i zwiększonej ekspresji markerów macierzy, co umożliwia wiarygodną ocenę związków lub warunków.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary zmiennych zależnych, takich jak poziomy ekspresji kolagenu II i agrekanu, co pozwala zespołom na porównywanie wyników chondrogennych w różnych grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkryć z walidacją przedkliniczną, wykazując, że dojrzewanie w bioreaktorze poprawia właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej zarówno w systemach bezrusztowianowych, jak i opartych na rusztowaniach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do generowania modeli chrząstki, którą można dostosować do różnych źródeł MSC i typów rusztowań w celu iteracyjnej walidacji celów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną różnicowania chondrogennego poprzez nasilenie ekspresji kolagenu II i agrekanu dzięki agregacji magnetycznej i dynamicznemu dojrzewaniu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność trójwymiarowych modeli chrząstki poprzez powtarzalne wysiewanie magnetyczne i dojrzewanie w bioreaktorze.
- Wartość strategiczna: Wspiera lepsze podejmowanie decyzji go/no-go poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w wczesnych podejściach do regeneracji chrząstki.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie poprawionego odkładania macierzy zewnątrzkomórkowej w warunkach fizjologicznie istotnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek macierzystych, znakowaniu nanocząsteczkami magnetycznymi oraz obsłudze bioreaktorów.
- Zależne od dostępu do mikrofabrykowanych urządzeń magnetycznych, pożywek chondrogennych i systemów bioreaktorów rotacyjnych.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja czasu formowania agregatów, gęstości komórek i czasu dojrzewania w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wymaga rozważenia adaptacji przy przenoszeniu metody na inne źródła MSC lub materiały rusztowań.
- Ograniczone przez konieczność precyzyjnej kontroli pola magnetycznego i objętości zawiesiny komórkowej w celu zapewnienia spójnego formowania agregatów.
