Name: Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębu z ludzkiej pępowiny i łożyska płodu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj izolację mezenchymalnych komórek zrębu z pępowiny i łożyska płodu przy użyciu techniki hodowli eksplantatów. Ta metoda pozwala uzyskać wysokiej jakości komórki MSC do zastosowań w biologii komórek macierzystych i medycynie regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane przez OU-WB ISCRM, Oakland University oraz Michigan Head and Spine Institute. N. Beeravolu i C. McKee otrzymali Provost Graduate Research Award od Oakland University. Dziękujemy S. Bakshi za zrecenzowanie manuskryptu.

Próbki (n = 3) uzyskano od zdrowych, wyrażających zgodę dawców za pośrednictwem Beaumont Hospital BioBank, Royal Oak, MI i Providence Hospital, Southfield, MI zgodnie odpowiednio z HIC- (HIC #2012-101) i IRB- (IRB# 820662-3), zatwierdzonymi protokołami i przetworzonymi zgodnie z zatwierdzonymi przez IBC (#2858) Uniwersytetu Oakland, Rochester, MI.
1. Przetwarzanie ludzkiej pępowiny, połączenia pępowina z łożyskiem oraz łożyska płodu i komórek izolujących
<ol>
	<li>Pobrać w asepcie próbki UC o długości około 10 cm, w tym 5-6 cm podłączone do CPJ i 3-4 cm FP. Natychmiast umieścić każdą próbkę w pojemniku zbiorczym zawierającym pożywkę (DMEM z 4,500 mg/ml glukozy i roztworem antybiotyku (0,1% gentamycyny, 0,2% streptomycyny i 0,12% penicyliny)) i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu transportu do laboratorium, umieszczając ją na lodzie w styropianowym pudełku. Próbkę należy przetworzyć w temperaturze 4 °C w ciągu 2-4 godzin od pobrania.</li>
	<li>Umieścić próbkę na 150-milimetrowej szalce Petriego trzymanej na lodzie w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą igły i strzykawki przepłucz go kilkakrotnie lodowatym PBS, aby usunąć skrzepy krwi. Upewnij się, że próbka jest mokra z PBS podczas przetwarzania i nie pozwól jej wyschnąć. Aby zachować sterylność, z próbką należy obchodzić się w sposób aseptyczny przy użyciu autoklawowanego PBS i narzędzi chirurgicznych podczas przetwarzania próbki.</li>
	<li>Dokładnie zbadaj próbkę, aby zidentyfikować różne obszary anatomiczne: UC, CPJ i FP. Najpierw przeanalizuj UC. Przytrzymaj płodowy koniec UC kleszczami i ostrożnie wykonaj pierwsze cięcie tuż na górze CPJ za pomocą nożyczek. Wykonaj drugie cięcie poniżej CPJ, aby oddzielić CPJ (1,5 - 2,0 cm) od FP. Umieść oddzielone UC, CPJ i FP na oddzielnych szalkach Petriego do dalszej obróbki.</li>
	<li>Przetnij UC wzdłużnie za pomocą nożyczek i kleszczy, całkowicie odsłaniając naczynia krwionośne i otaczające WJ bez naruszania nabłonka.</li>
	<li>Zeskrob WJ z naczyń krwionośnych i wewnętrznego nabłonka podbłonka za pomocą skalpela, a następnie usuń naczynia krwionośne. Pamiętaj, aby zebrać pozostały okołonaczyniowy WJ pod naczyniami krwionośnymi i wokół nich, a następnie umieścić zebrany WJ na osobnej szalce Petriego.</li>
	<li>Zebrać pozostałą tkankę, wyściółkę pępowiny (CL), na oddzielnej szalce Petriego.</li>
	<li>Po oddzieleniu tkanek reprezentujących CL, WJ, CPJ i FP, zastąp PBS 3 - 5 ml komercyjnego roztworu trypsyny i oddzielnie pokrój każdą z tkanek na kawałki o średnicy od 1 do 2 mm za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Inkubować fragmenty tkanek w dostępnym w handlu roztworze trypsyny w temperaturze 37 °C przez 30 minut w inkubatorze z 5% CO2 w celu częściowego roztrawienia próbek. Obserwuj częściowe trawienie, wizualizując uwalnianie komórek za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym.</li>
	<li>Do częściowo strawionych próbek dodać równą objętość pożywki hodowlanej (CM; DMEM z 4,500 mg / ml glukozy i 2 mM L-glutaminy, uzupełniony 10% ludzką surowicą / FBS i roztworem antybiotyku (0,1% gentamycyny, 0,2% streptomycyny i 0,12% penicyliny)) w celu zneutralizowania komercyjnego roztworu trypsyny. Przenieś zawartość do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i pozwól, aby częściowo strawione kawałki tkanki osiadły przez 3 minuty.</li>
	<li>Ostrożnie zassać supernatant, w tym pojedyncze komórki (nie rozszerzają się one wydajnie) i umieścić na płytce 15-20 częściowo strawionych fragmentów tkanek w kolbie do hodowli tkankowych o długości 75cm2 i dodać 9 ml CM. Inkubować w temperaturze 37 °C i nie naruszać kolb hodowlanych przez 2-3 dni, aby umożliwić przyleganie kawałków tkanki. 
	UWAGA: Pozostała część częściowo strawionych próbek tkanek może zostać poddana kriokonserwacji w celu przyszłej izolacji komórek.</li>
	<li>Po 3 dniach inkubacji zmień CM i codziennie szukaj pojawienia się wyrostów komórek z eksplantatu; wzrost komórek powinien być widoczny z przylegających eksplantatów po 3-4 dniach, 7-10 dniach i 11-14 dniach inkubacji odpowiednio dla CPJ, CL/WJ i FP. Od tego momentu zmieniaj CM co 3 dni lub w razie potrzeby. 
	UWAGA: Wzrost komórek osiąga 70% konfluencji 7 - 10 dni po początkowym wyrosciu komórki z eksplantatu. Należy pamiętać, że nieprzylegające kawałki tkanek nie spowodują wzrostu komórek, dopóki nie przylgną do plastiku. Należy zachować ostrożność, aby nie naruszyć kolby w celu uniknięcia oderwania się przylegających kawałków tkanki. Jeśli po pierwszych 3 dniach hodowli pozostaną jakieś pływające kawałki, można je uratować, przenosząc je do nowej kolby w celu zamocowania. 
	UWAGA: Gdy wzrost komórek z eksplantatów tkanek osiągnie 70% konfluencji, należy je hodować. Jak wspomniano powyżej, MSC z CL/WJ, FP, CPJ i osiągną zbieg odpowiednio w ciągu 10 - 14 dni, 14 - 20 dni i 17 - 24 dni.</li>
	<li>Aby wyhodować wyrosłe komórki z eksplantatów, należy rozdzielić komórki za pomocą 1-2 ml komercyjnego roztworu trypsyny/75-cm2 kolby hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Zneutralizować za pomocą 1-2 ml CM i odwirować 1,500 x g przez 3 minuty. Upewnij się, że obracasz kolbę, dodając trypsynę, aby równomiernie rozprowadzić się w całym ciele.</li>
	<li>UWAGA: Granulowane komórki są uważane za pasaż 0 (P0) i zostaną zawieszone w CM, policzone i subhodowane przy gęstości wysiewu 1 x 104 / cm2 w celu amplifikacji, charakterystyki i kriokonserwacji. Nadmiar komórek można poddać krioprezerwacji w temperaturze P0.</li>
</ol>
2. Charakterystyka izolowanych komórek
<ol>
	<li>Test skuteczności tworzenia kolonii (CFE)
	<ol>
		<li>Pokryć 100-milimetrowe szalki Petriego (powierzchnia 60cm2) 0,1% żelatyny przez 30 minut i umieścić w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Chociaż nie jest to konieczne, powłoka żelatynowa poprawia przyleganie komórek.</li>
		<li>Usunąć nadmiar żelatyny i wysiać na pokrytą płytkę komórkami P0 w stężeniu 1,63 komórek/cm2. Dodać 3 ml CM i inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Monitoruj płytki z nasionami pod kątem wzrostu klonów za pomocą mikroskopii świetlnej (LM) i zmieniaj pożywkę co 3 dni.</li>
		<li>Po 10 - 14 dniach wzrostu komórek umyj szalki Petriego dwukrotnie PBS i utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Prosimy o zachowanie ostrożności podczas noszenia rękawiczek i okularów podczas użytkowania.</li>
		<li>Zabarwić utrwalone komórki 0,1% fioletem krystalicznym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i spłukać płytkę wodą z kranu, aż niezwiązana niebieska plama zniknie.</li>
		<li>Policz liczbę kolonii składających się z co najmniej 50 komórek za pomocą LM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspresja markerów powierzchni komórki
	<ol>
		<li>Hoduj izolowane komórki do 70% konfluencji, dysocjuj z dostępnym w handlu roztworem trypsyny, a następnie przemyj i osadzaj przez odwirowanie przy 1,500 x g przez 3 minuty. Zawieś komórki w buforze FACS (1x PBS z 2% FBS i 0,1% azydkiem sodu). 
		UWAGA: Azydek sodu jest toksyczny. Prosimy o zachowanie ostrożności podczas noszenia rękawiczek i okularów podczas użytkowania.</li>
		<li>Wybarwić komórki (~ 106) przeciwciałami specyficznymi dla MSC znakowanymi FITC lub APC (przeciwciała sprzężone z FITC przeciwko: CD44 i CD90 lub przeciwciała sprzężone APC przeciwko: CD29, CD73 i CD105) w buforze FACS przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
		<li>Odwirować wybarwione komórki przy 670 x g przez 5 minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu FACS.</li>
		<li>Analizuj komórki barwione przeciwciałami za pomocą FACS zgodnie z protokołem producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Potencjał różnicowania
<ol>
	<li>Różnicowanie adipogenne
	<ol>
		<li>Hodować izolowane komórki do 70% konfluencji, dysocjować z komercyjnym roztworem trypsyny, a następnie myć i osadzać przez odwirowanie przy 1,500 x g przez 3 minuty.</li>
		<li>W inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C hodować komórki w stężeniu 100 000 komórek/basenik na 6-dołkowej płytce zawierającej 2 ml CM.</li>
		<li>Po 24 godzinach zastąpić CM pożywką do różnicowania adipogennego (0,5 μM izobutyloksantyny, 1 μM deksametazonu, 10 μM insuliny i 200 μM indometacyny) i inkubować. Zmieniaj podłoże różnicujące co 3 dni lub tak często, jak to konieczne.</li>
		<li>Po 3 tygodniach inkubacji utrwalić komórki 2 ml 4% paraformaldehydu na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej i zabarwić czerwonym olejem O, aby wykryć produkcję kropelek lipidów w celu analizy różnicowania adipogennego. 
		UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Prosimy o zachowanie ostrożności podczas noszenia rękawiczek i okularów podczas użytkowania.</li>
		<li>Traktuj utrwalone komórki 60% izopropanolem (2 ml / dołek płytki 6-dołkowej) przez 5 minut.</li>
		<li>Zastąp izopropanol 2 ml czerwonej plamy olejowej O (przefiltruj 3 części plamy z czerwonego oleju O i 2 części wody destylowanej), inkubuj przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej i przemyj 3-4 razy wodą z kranu, aby usunąć wszelkie niezwiązane plamy.</li>
		<li>Wizualizuj zabarwione na czerwono kropelki lipidów, wskazujące na linię komórek adipogennych, za pomocą LM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie chondrogenne
	<ol>
		<li>Hoduj izolowane komórki do 70% konfluencji, dysocjuj z komercyjnym roztworem trypsyny i przemyj PBS.</li>
		<li>Aby osadzać komórki do indukcji chondrogennej, należy odwirować 250 000 komórek w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml z 2 ml CM przy 11 000 x g przez 8 minut. Inkubować granulki przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Po 24 godzinach delikatnie zastąpić CM chondrogenną pożywką różnicującą (20 ng TGFβ1, 10 ng insuliny, 100 nM deksametazonu i 100 μM kwasu askorbinowego) bez naruszania osadu i kontynuować inkubację. Zmieniaj podłoże różnicujące co 3 dni lub tak często, jak to konieczne.</li>
		<li>Po 3 tygodniach inkubacji utrwalić komórki 2 ml 4% paraformaldehydu na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Kriosekcja i barwienie 1% błękitem toluidynowym w celu zbadania obecności lub produkcji macierzy zewnątrzkomórkowej w celu określenia różnicowania chondrogennego. 
		UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Prosimy o zachowanie ostrożności podczas noszenia rękawiczek i okularów podczas użytkowania.</li>
		<li>Do kriosekcji delikatnie umyj zebrane granulki komórek dwukrotnie PBS i utrwal 1 ml 4% paraformaldehydu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Prosimy o zachowanie ostrożności podczas noszenia rękawiczek i okularów podczas użytkowania.</li>
		<li>Przemyć granulki dwukrotnie PBS w celu usunięcia paraformaldehydu i przenieść do roztworu sacharozy/OCT (1:2, 20% sacharoza:OCT). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, aby roztwór całkowicie wsiąkł w osady komórkowe; Umożliwi to płynne sekcjonowanie.</li>
		<li>Przenieś granulki do foremek OCT. Zamrażać formy w temperaturze -20 °C przez 4 - 6 godzin i kriosekcję około 10 - 12 mikronów odcinków granulek komórek za pomocą kriostatu do barwienia błękitem toluidyny.</li>
		<li>Delikatnie przemyć kriosekcje PBS; dodać kilka kropli 1% niebieskiej plamy toluidynowej, całkowicie pokrywając skrawki osadów na szkiełku; i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj szkiełka kilkakrotnie PBS w celu odbarwienia. Usuń nadmiar plamy, zanurzając szkiełko w roztworze alkoholu na bazie HCl (95% alkoholu + 0,5 ml HCl) kilka razy, aż zniknie niezwiązany niebieski kolor. Zamontuj zabarwione sekcje za pomocą 100 μl roztworu montażowego w celu długotrwałej konserwacji szkiełek. 
		UWAGA: Niebieskie zabarwienie skrawków wskazuje na obecność glikozaminoglikanów i glikoprotein i będzie można je obserwować za pomocą LM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie osteogenne
	<ol>
		<li>Ponownie hoduj izolowane komórki do 70% konfluencji, dysocjuj z komercyjnym roztworem trypsyny, a następnie umyj i osadź przez odwirowanie przy 1,500 x g przez 3 minuty.</li>
		<li>Subhodowla komórek w stężeniu 100 000 komórek/basenik na 6-dołkowych płytkach zawierających 2 ml CM w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Po 24 godzinach zastąpić CM osteogennym podłożem różnicującym (0,1 μM deksametazonu, 10 μM β-glicerofosforanu i 50 μM fosforanu askorbinianu) i kontynuować inkubację. Zmieniaj podłoże różnicujące co 3 dni lub tak często, jak to konieczne.</li>
		<li>Po 3 tygodniach inkubacji utrwalić komórki 2 ml 4% paraformaldehydu na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej i zabarwić czerwienią alizarynową, aby wykryć obecność osadów wapnia w celu określenia różnicowania osteogennego. 
		UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Prosimy o zachowanie ostrożności podczas noszenia rękawiczek i okularów podczas użytkowania.</li>
		<li>Delikatnie umyj utrwalone komórki dwukrotnie wodą destylowaną i potraktuj 2% czerwoną plamą alizaryny (2 ml / studzienkę na 6-dołkowej płytce) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Usuń nadmiar plamy, delikatnie myjąc ją wodą z kranu, aby osady wapnia nie zniknęły.</li>
		<li>Wizualizacja zabarwionych na czerwono osadów wapnia za pomocą LM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ilościowa analiza reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (qRT-PCR)
<ol>
	<li>Hoduj izolowane komórki do 70% konfluencji, dysocjuj z komercyjnym roztworem trypsyny, przemyj i osadzaj przez wirowanie przy 1,500 x g przez 3 minuty, aby wyizolować całkowity komórkowy RNA.</li>
	<li>Umyj komórki PBS, aby usunąć ślady FBS, a następnie przystąp do izolacji RNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania RNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Oczyść wyizolowany całkowity RNA przez traktowanie DNazą w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy użyciu termocyklera. Zsyntetyzuj cDNA za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przygotować trzykrotnie 10 μl reakcji PCR na 96-dołkowej płytce, przy czym każda reakcja zawiera 5 μl supermiksu SYBR-green PCR, 3 μl podwójnie destylowanej wody, 0,5 μl każdego startera, do przodu i do tyłu; oraz 1 μl rozcieńczonego (1:10) cDNA.</li>
	<li>Wykonaj PCR w następujących parametrach: 10 minut w temperaturze 98 °C, a następnie 44 cykle po 30 s każdy w temperaturze 98 °C, 20 s w 60 °C i 30 s w temperaturze 72 °C.</li>
	<li>Normalizować amplifikację genów docelowych do genów referencyjnych, GAPDH i β-ACTIN; sekwencje starterów są wymienione w Tabeli 1.</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Wykonuj wszystkie analizy za pomocą oprogramowania statystycznego. Przedstaw dane jako średnią ± SEM. Wyniki z wartością p (**p ≤ 0,01 i *p ≤ 0,05) uznano za istotne statystycznie.</li>
</ol>

<ol><li>Upadhyay, R. K. <a target="_blank" href="http://www.hoajonline.com/jrmte/2050-1218/4/1">Role of regeneration in tissue repairing and therapies.</a> J Regen Med Tissue Eng. 4 (1), 1(2015).</li>
<li>English, K., Mahon, B. P., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3B+role+in+tissue+repair%2C+drug+discovery+and+immune+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells; role in tissue repair, drug discovery and immune modulation.</a> Curr Drug Deliv. 11 (5), 561-571 (2014).</li>
<li>Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+repair+of+damaged+meniscus+with+autologous+adipose+tissue-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Regenerative repair of damaged meniscus with autologous adipose tissue-derived stem cells.</a> Biomed Res Int. 2014, 436029(2014).</li>
<li>Hocking, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stem+Cell+Therapy+for+Cutaneous+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stem Cell Therapy for Cutaneous Wounds.</a> Adv Wound Care. 1 (4), New Rochelle. 166-171 (2012).</li>
<li>Anthony, D. F., Shiels, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+paracrine+mechanisms+of+tissue+regeneration+to+repair+damaged+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Res%22%5BJournal%5D)">Exploiting paracrine mechanisms of tissue regeneration to repair damaged organs.</a> Transplant Res. 2 (1), 10(2013).</li>
<li>Teschendorff, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+variability+in+cells+of+normal+cytology+is+associated+with+the+risk+of+future+morphological+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Epigenetic variability in cells of normal cytology is associated with the risk of future morphological transformation.</a> Genome Med. 4 (3), 24(2012).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+as+determinants+of+muscle+stem+cell+quiescence+and+chronological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications as determinants of muscle stem cell quiescence and chronological aging.</a> Cell Rep. 4 (1), 189-204 (2013).</li>
<li>Bentivegna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Methylation+Changes+during+In+Vitro+Propagation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells%3A+Implications+for+Their+Genomic+Stability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">DNA Methylation Changes during In Vitro Propagation of Human Mesenchymal Stem Cells: Implications for Their Genomic Stability.</a> Stem Cells Int. 2013, 192425(2013).</li>
<li>Bieback, K., Brinkmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+from+human+perinatal+tissues%3A+From+biology+to+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells from human perinatal tissues: From biology to cell therapy.</a> World J Stem Cells. 2 (4), 81-92 (2010).</li>
<li>Tobita, M., Tajima, S., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells+and+platelet-rich+plasma%3A+stem+cell+transplantation+methods+that+enhance+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma: stem cell transplantation methods that enhance stemness.</a> Stem Cell Res Ther. 6, 215(2015).</li>
<li>Kim, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wharton%27s+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells%3A+phenotypic+characterization+and+optimizing+their+therapeutic+potential+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications.</a> Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).</li>
<li>Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+paracrine+actions+and+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell paracrine actions and tissue regeneration.</a> Regen Med. 5 (1), 121-143 (2010).</li>
<li>Díaz-Prado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+membrane+as+an+alternative+source+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Human amniotic membrane as an alternative source of stem cells.</a> Differentiation. 1, 162-171 (2011).</li>
<li>Puissant, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effect+of+human+adipose+tissue-derived+adult+stem+cells%3A+comparison+with+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Br J Haematol. 129 (1), 118-129 (2005).</li>
<li>Christodoulou, I., Kolisis, F. N., Papaevangeliou, D., Zoumpourlis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Evaluation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+of+Fetal+%28Wharton%27s+Jelly%29+and+Adult+%28Adipose+Tissue%29+Origin+during+Prolonged+In+Vitro+Expansion%3A+Considerations+for+Cytotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Comparative Evaluation of Human Mesenchymal Stem Cells of Fetal (Wharton's Jelly) and Adult (Adipose Tissue) Origin during Prolonged In Vitro Expansion: Considerations for Cytotherapy.</a> Stem Cells Int. 2013, 246134(2013).</li>
<li>Dalous, J., Larghero, J., Baud, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+umbilical+cord-derived+mesenchymal+stem+cells+as+a+novel+strategy+to+protect+the+central+nervous+system%3A+technical+aspects%2C+preclinical+studies%2C+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a novel strategy to protect the central nervous system: technical aspects, preclinical studies, and clinical perspectives.</a> Pediatr Res. 71 (4), Pt 2 482-490 (2012).</li>
<li>Escacena, N., Quesada-Hernandez, E., Capilla-Gonzalez, V., Soria, B., Hmadcha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottlenecks+in+the+Efficient+Use+of+Advanced+Therapy+Medicinal+Products+Based+on+Mesenchymal+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Bottlenecks in the Efficient Use of Advanced Therapy Medicinal Products Based on Mesenchymal Stromal Cells.</a> Stem Cells Int. 2015, (2015).</li>
<li>Law, S., Chaudhuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+and+regenerative+medicine%3A+regeneration+versus+immunomodulatory+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell and regenerative medicine: regeneration versus immunomodulatory challenges.</a> Am J Stem Cells. 2 (1), 22-38 (2013).</li>
<li>Brower, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+therapy+and+delivery+systems+in+nonhealing+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Skin+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell therapy and delivery systems in nonhealing wounds.</a> Adv Skin Wound Care. 24 (11), 524-532 (2011).</li>
<li>Angelos, M. G., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell+applications+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell applications for regenerative medicine.</a> Curr Opin Organ Transplant. 20 (6), 663-670 (2015).</li>
<li>Pera, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientific+considerations+relating+to+the+ethics+of+the+use+of+human+embryonic+stem+cells+in+research+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">Scientific considerations relating to the ethics of the use of human embryonic stem cells in research and medicine.</a> Reprod Fertil Dev. 13 (1), 23-29 (2001).</li>
<li>Espinoza, N., Peterson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+depolarise+the+ethical+debate+over+human+embryonic+stem+cell+research+%28and+other+ethical+debates+too%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Ethics%22%5BJournal%5D)">How to depolarise the ethical debate over human embryonic stem cell research (and other ethical debates too).</a> J Med Ethics. 38 (8), 496-500 (2012).</li>
<li>Barrilleaux, B., Knoepfler, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+iPSCs+to+escape+the+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Inducing iPSCs to escape the dish.</a> Cell Stem Cell. 9 (2), 103-111 (2011).</li>
<li>Ding, D. C., Chang, Y. H., Shyu, W. C., Lin, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells%3A+a+new+era+for+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord mesenchymal stem cells: a new era for stem cell therapy.</a> Cell Transplant. 24 (3), 339-347 (2015).</li>
<li>Jeschke, M. G., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Kita, K. <a target="_blank" href="https://benthamopen.com/ABSTRACT/TOTERMJ-4-21">Umbilical Cord Lining Membrane and Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: the Similarities and Differences.</a> J Tissue Eng Regen Med. 4, 21-27 (2011).</li>
<li>Oh, J., Lee, Y. D., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+aging%3A+mechanisms%2C+regulators+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell aging: mechanisms, regulators and therapeutic opportunities.</a> Nat Med. 20 (8), 870-880 (2014).</li>
<li>Burkhalter, M. D., Rudolph, K. L., Sperka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+instability+of+ageing+stem+cells-Induction+and+defence+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Genome instability of ageing stem cells-Induction and defence mechanisms.</a> Ageing Res Rev. 23, Pt A 29-36 (2015).</li>
<li>Adams, P. D., Jasper, H., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging-Induced+Stem+Cell+Mutations+as+Drivers+for+Disease+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging-Induced Stem Cell Mutations as Drivers for Disease and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 16 (6), 601-612 (2015).</li>
<li>Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+isolate+mesenchymal-like+cells+from+Wharton%27s+Jelly+of+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord.</a> Methods Cell Biol. 86, 101-119 (2008).</li>
<li>Trivanovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+isolated+from+peripheral+blood+and+umbilical+cord+Wharton%27s+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22Srp+Arh+Celok+Lek%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells isolated from peripheral blood and umbilical cord Wharton's jelly.</a> Srp Arh Celok Lek. 141 (3-4), 178-186 (2013).</li>
<li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+explant-derived+and+enzymatic+digestion-derived+MSCs+and+the+growth+factors+from+Wharton%27s+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly.</a> Biomed Res Int. 2013, 428726(2013).</li>
<li>Steigman, S. A., Fauza, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mesenchymal+stem+cells+from+amniotic+fluid+and+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mesenchymal stem cells from amniotic fluid and placenta.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Chapter 1 (2007).</li>
<li>Mennan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterisation+of+mesenchymal+stem+cells+from+different+regions+of+the+human+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord.</a> Biomed Res Int. 2013, (2013).</li>
<li>Conconi, M. T., Di Liddo, R., Tommasini, M., Calore, C., Parnigotto, P. P. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/267768717_Phenotype_and_Differentiation_Potential_of_Stromal_Populations_Obtained_from_Various_Zones_of_Human_Umbilical_Cord_An_Overview">Phenotype and differentiation potential of stem populations obtained from various zones of human umbilical cord-an overview.</a> J Tissue Eng Regen Med. 4, 6-20 (2011).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Weiss, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+matrix+stem+cells%3A+preliminary+characterization+and+effect+of+transplantation+in+a+rodent+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord matrix stem cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson's disease.</a> Stem Cells. 24 (3), 781-792 (2006).</li>
<li>Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+perivascular+%28HUCPV%29+cells%3A+a+source+of+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).</li>
<li>Durnaoglu, S., Genc, S., Genc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+pluripotent+stem+cells+in+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Patient-specific pluripotent stem cells in neurological diseases.</a> Stem Cells Int. 2011, 212487(2011).</li>
<li>Beeravolu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+comparative+analysis+of+potential+stem%2Fprogenitor+cells+from+different+regions+of+human+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and comparative analysis of potential stem/progenitor cells from different regions of human umbilical cord.</a> Stem Cell Res. 16 (3), 696-711 (2016).</li>
<li>Nekanti, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+and+pluripotent+marker+array+analysis+of+Wharton%27s+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 19 (1), 117-130 (2010).</li>
<li>Nagamura-Inoue, T., He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord-derived+mesenchymal+stem+cells%3A+Their+advantages+and+potential+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells: Their advantages and potential clinical utility.</a> World J Stem Cells. 6 (2), 195-202 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niedawne postępy w badaniach nad komórkami macierzystymi nie tylko przyczyniły się do lepszego zrozumienia podstawowych procesów rozwoju, ale także stworzyły obiecujące możliwości wykorzystania komórek macierzystych w zastosowaniach biotechnologicznych, farmaceutycznych, terapii komórkowej, medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej 18,19,20. Podczas gdy pluripotencjalne EKM wyizolowane z wczesnych zarodków są najbardziej obiecujące, stoją one przed wyzwaniami technicznymi i dylematami etycznymi 21,22,23. Alternatywą są indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z dorosłych komórek, ale one również borykają się z podobnymi problemami technicznymi i związanymi z bezpieczeństwem23. Ponadto komórki iPS mogą nie być stabilne genetycznie lub mogły ulec zmianom genetycznym, co ogranicza ich zastosowanie terapeutyczne. Komórki macierzyste zostały również zgłoszone w różnych tkankach i narządach postnatalnych. Najczęstszymi źródłami tych ASC są szpik kostny, tkanka tłuszczowa i mięśniowa. Jednak ASC ze źródeł postnatalnych mają ograniczony potencjał wzrostu i różnicowania24,25. Cierpią również z powodu starzenia się i narażenia na stresy środowiskowe, a zatem nie zawsze są skuteczne w zastosowaniach terapeutycznych 26,27,28. To skłoniło nas i innych do poszukiwania nowych źródeł komórek macierzystych, które są bardziej naiwne niż ASC.
Zbadaliśmy okołoporodowe źródła pierwotnych komórek macierzystych jako alternatywy dla ASC. W tym raporcie przedstawiamy niezawodną, solidną i prostą metodę izolowania ludzkich MSC od próbek pępowiny/łożyska. W porównaniu z innymi źródłami i metodami stosowanymi do izolacji ASC, metoda ta zapewnia skuteczną i nieinwazyjną metodę izolowania dużych ilości wysokiej jakości MSC. To dodatkowo podkreśla wyższy potencjał wzrostu i różnicowania okołoporodowych MSCs w porównaniu z MSCs ze źródeł dorosłych, takich jak BM.
UC łączące płód z łożyskiem jest dużym narządem z odrębnymi obszarami anatomicznymi, w tym dwiema tętnicami, żyłą, CL i WJ (tkanką otaczającą naczynia krwionośne). W kilku badaniach wykazano izolację MSCs z całego pasma rozdzielczego, WJ lub łożyska, o zmiennym potencjale wzrostu i różnicowania25,29. Niemniej jednak do tej pory w żadnym badaniu nie zbadano skutecznie i nie porównano komórek z różnych regionów anatomicznych próbki pępowiny/łożyska. Przedstawiamy tutaj systematyczną i prostą metodę preparacji UC, CPJ i połączonego FP w celu izolacji MSC. Pokazujemy również kompleksowy i prosty protokół charakteryzujący i oceniający jakość izolowanych komórek poprzez określenie ich zdolności do proliferacji, a także ich potencjału samoodnawiania i różnicowania. Ta metoda jest powtarzalna i daje dużą ilość MSCs najwyższej jakości.
Odkryliśmy, że częściowe trawienie fragmentów tkanek o wielkości 1-2 mm przy użyciu komercyjnego roztworu trypsyny w sposób powtarzalny dawało komórki z eksplantatów, podczas gdy całkowite trawienie tkanki na pojedyncze komórki miało słabą wydajność izolowanych komórek. Jednak jedno z badań wykazało, że większe eksplantaty tkankowe UC o wielkości około 10 mm były optymalne do izolacji komórek30. I odwrotnie, inne badanie sugerowało, że metoda eksplantatu tkanek skutkowała dłuższym cyklem hodowli i niższą wydajnością komórek w porównaniu z metodą trawienia enzymatycznego31. W poprzednich doniesieniach leczenie tkanek pępowinowych kolagenazą II i hialuronidazą, oddzielnie lub po trypsyny, przeprowadzono w celu wyizolowania komórek pępowinowych 32,33,34. Nie tylko istnieje duża różnorodność w metodach trawienia tkanki pępowinowej przed hodowlą, ale także izolowane komórki wydają się być niejednorodne. Stosowanie ostrych enzymów przez dłuższy czas może degradować błonę komórkową, wpływając na przyleganie komórek i proliferację. Wyniki tej metody wykazały, że częściowo strawione eksplantaty tkanek okołoporodowych zapewniały wzrost komórek bez powodowania rozległych uszkodzeń komórek, utrzymywały żywotność i dawały większe ilości jednorodnych populacji MSC.
Chociaż protokół sekcji i izolacji komórek z eksplantatów jest prosty, niektóre kroki mogą okazać się trudne. Po pierwsze, należy upewnić się, że eksplantat przylega do podłoża, pozwalając na ich przyczepienie się do powierzchni kolby hodowlanej. Można to ułatwić, stosując niewielką ilość pożywki, przykrywając tylko kawałki tkanek przez pierwsze 2 godziny hodowli, a następnie ostrożnie dodając pozostałą pożywkę. Po drugie, należy ograniczyć liczbę eksplantatów do mniej niż 15 na kolbę T75. Zbyt mała przestrzeń między kawałkami lub zbyt wiele kawałków w kolbie hamuje wzrost komórek. Po trzecie, fragmenty tkanek, które nie przyklejają się do powierzchni kolby hodowlanej po 3 dniach inkubacji, należy przenieść do nowej kolby w celu przylegania i hodowli. Po czwarte, fragmenty tkanek przeznaczone do hodowli powinny być wolne od resztek komórkowych, które hamują przyczepianie. Po piąte, hodowla dużych kawałków wymaga większej ilości pożywki i nie poprawia wydajności wzrostu komórek. Na koniec należy uważnie monitorować kultury eksplantatów, szczególnie po pojawieniu się przerostu komórek, ponieważ komórki mogą szybko zlewać się i różnicować w zależności od źródła tkanki. Kilka ograniczeń tej techniki obejmuje brak wiedzy specjalistycznej w zakresie analizowania próbek w celu oddzielenia CL, WJ, CPJ i FP; mała liczebność próby, co skutkuje niską wydajnością WJ; i opóźnione przetwarzanie - próbki muszą zostać przetworzone w ciągu 2-4 godzin od pobrania, aby uniknąć utraty odzysku komórek.
Złotym standardem w charakterystyce MSCs jest zdolność do przylegania do plastiku, tworzenia fenotypu fibroblastycznego i różnicowania się w wiele linii. Są to również powszechnie stosowane kryteria definiowania MSC zgodnie z opisem ISCT35. W tym badaniu komórki wyizolowane ze wszystkich czterech źródeł przylegały do plastiku i miały dodatnią ekspresję markerów MSC (CD29, CD44, CD73, CD90 i CD105), ale ujemną ekspresję markera hematopoetycznego CD45. Ponadto wykazywały one ekspresję ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) klasy I, ale były ujemne dla HLA klasy II. W porównaniu z BM-MSC, komórki pochodzące z WJ i CPJ były wyższe. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi raportami MSC wywodzącymi się z UC 33,36,37,38. Ponadto nasze wyniki wykazały, że CL-, WJ-, CPJ-, FP-MSCs wyrażają geny pluripotencji, takie jak OCT4, NANOG i SOX2; jednak ich ekspresja była niższa niż w przypadku ESC, jak podano wcześniej39. Wyniki te były również zgodne z poprzednim badaniem, w którym stwierdzono ekspresję markerów pluripotencji w komórkach pochodzących okołoporodowo40. Co ciekawe, zaobserwowano, że ekspresja markera pluripotencjalnego była wyższa w CPJ-MSC niż w komórkach wyizolowanych z innych źródeł. Zauważono również, że UC-MSCs wykazywały większy potencjał samoodnawiania się niż BM-MSCs41. Co ciekawe, pomimo podobieństwa w charakterystyce fenotypowej, komórki wyizolowane z czterech źródeł miały zmienne wartości CFE. Jednak z wyjątkiem FP-MSC, wszystkie miały lepsze wartości CFE niż BMC. CPJ-MSC-MESC miały najwyższą wartość CFE i tempo proliferacji w porównaniu ze wszystkimi innymi MSC. Ponadto WJ- i CPJ-MSC wykazywały wyższy potencjał różnicowania niż BM-MSC. CL-MSC wykazywały najmniejszy potencjał różnicowania we wszystkich trzech liniach (tj. adipogennej, chondrogenicznej i osteogennej), podczas gdy CPJ-MSC miały najwyższy potencjał różnicowania trójliniowego, a FP-MSC wykazywały najmniejszy potencjał różnicowania adipogennego.
Podsumowując, nasze wyniki wykazały, że jakość i ilość wyizolowanych MSCs różniła się między czterema źródłami w próbce pępowiny/łożyska. CPJ-MSC miały większą zdolność do proliferacji i większy potencjał samoodnawiania. Były również silne w różnicowaniu się w trójliniowe typy komórek. Ze względu na krótki czas podwajania, CPJ-MSC mogą być szybko rozbudowywane 1000-krotnie i wykorzystywane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków lub biomateriałów. Komórki te mogą być bardziej obiecującym źródłem zastosowań w terapii komórkowej i medycynie regeneracyjnej.

Komórki macierzyste są obecne w różnych organach i tkankach ciała. Posiadają potencjał regeneracyjny i odgrywają główną rolę w naprawie uszkodzonych tkanek w organizmie przez cały okres życia człowieka1,2. Wzbudziło to duże zainteresowanie dorosłymi komórkami macierzystymi (ASC), zwłaszcza że w przeciwieństwie do embrionalnych komórek macierzystych (ESC) stosowanie ASC nie stwarza dylematów moralnych i etycznych. W kilku badaniach opisano izolację ASC, takich jak mezenchymalne komórki zrębu (MSC); hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC); oraz różnych przodków, w tym różne źródła dla dorosłych, od szpiku kostnego (BM) po tkankę tłuszczową (AT) i miazgę zębową3,4,5. Jednak liczba ASC obecnych w większości dorosłych nisz jest ograniczona, a ich izolacja na ogół wiąże się z inwazyjną i bolesną procedurą, która może powodować zachorowalność w miejscu dawczym. Ponadto wiek dawcy i stres środowiskowy mogą również odgrywać znaczącą rolę w określaniu jakości i aktywności biologicznej izolowanych komórek6,7,8. ASC wykazują również ograniczony potencjał namnażania i różnicowania podczas hodowli in vitro.
Aby przezwyciężyć te wady obecnych ASC, poszukiwano nowych źródeł do izolowania komórek macierzystych. Wysiłki te doprowadziły do wyizolowania komórek macierzystych ze źródeł okołoporodowych, w tym krwi pępowinowej, tkanki pępowinowej, łożyska i płynu owodniowego9. Źródła te zyskały uwagę ze względu na ich łatwą i obfitą dostępność10,11,12,13. Co więcej, tkanki okołoporodowe można pozyskać nieinwazyjnie, a komórki macierzyste z nich pochodzące są bardziej prymitywne niż ASC wyizolowane z dorosłych źródeł14,15. Są one izolowane z tkanek pobranych po urodzeniu i uważa się, że przeszły minimalne zmiany w genomie z powodu starzenia się i stresów środowiskowych16.
Jednak zgłaszane cechy komórek macierzystych ze źródeł okołoporodowych oraz ich potencjał do samoodnawiania się i różnicowania różnią się znacznie11,17. Może to częściowo wynikać z faktu, że ludzka pępowina (UC) jest złożonym narządem. Stawiamy hipotezę, że dyskretne regiony tkanki okołoporodowej tworzą specyficzne nisze odpowiedzialne za zmienność i bardziej prymitywny charakter tych komórek macierzystych w porównaniu z ASC pochodzącymi ze źródeł nieokołoporodowych. W tym badaniu opisano sekcję próbek pępowiny/łożyska na trzy odrębne obszary anatomiczne: UC, połączenie pępowiny-łożysko (CPJ) i łożysko płodu (FP). UC zostało następnie podzielone na dwie strefy: wyściółkę sznurową (CL) i galaretkę Whartona (WJ). Analiza wyizolowanych komórek z CL, WJ, CPJ i FP wykazała, że wszystkie wykazywały morfologię fibroblastoidów i ekspresję markerów MSC, ale różniły się potencjałem samoodnawiania i różnicowania. Komórki pochodzące z CPJ wykazywały wyższy wskaźnik proliferacji i potencjału samoodnawiania w porównaniu z komórkami pochodzącymi z UC i FP, co czyni je bardziej obiecującym źródłem terapii komórkowej, medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej.

<table><tbody><tr><td>DMEM z 4,500 mg / ml glukozy</td><td>Invitrogen</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Aleken Biologicals</td><td>FBSS500</td><td></td></tr><tr><td>Izobutylo-metyloksantyna</td><td>Sigma</td><td>I5879-250mg</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Prospec</td><td>CYT-270</td><td></td></tr><tr><td>Indometacyna</td><td>Sigma</td><td>I7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta; 1</td><td>Prospec</td><td>CYT-716</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A-7631</td><td></td></tr><tr><td>2-fosforan askorbinianu</td><td>Sigma</td><td>A-8960</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosforan</td><td>Sigma</td><td>G-6251</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>50591419</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do oczyszczania RNA</td><td>GeneJET Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>iScript kit</td><td>Biorad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit</td><td>Biorad</td><td>1725274</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH75-125D</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O&nbsp;</td><td>Amerykański MasterTech Scientific</td><td>STORO100</td><td></td></tr><tr><td>Błękit toluidynowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>S71363</td><td></td></tr><tr><td>Kryształowy fiolet</td><td>Sigma</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>Czerwona plama alizaryny</td><td>Thermo Scientific</td><td>S25131</td><td></td></tr><tr><td>APC Mysz anty-ludzka CD29</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>559883</tr><tr><td>Mysz APC anty-ludzka CD34</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>555824</tr><tr><td>Mysz FITC anty-ludzka CD44</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>555478</tr><tr><td>Mysz FITC anty-ludzka CD45</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>555482</tr><tr><td>Mysz APC anty-ludzka CD73</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>560847</tr><tr><td>Mysz FITC anty-ludzka CD90</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>561969</tr><tr><td>Mysz APC anty-ludzka CD105</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>562408</tr><tr><td>Wirówka</td><td>IEC</td><td>93522M-2</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>Hera Cell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny (LM)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td>Hemacytometr <td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>0267151B</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td>, <td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr>, <tr><td>FACS, Canto II i oprogramowanie Diva</td><td>, BD Biosciences&nbsp;</td><td>Pieśń II&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>MJ Research Inc.</td>System PCR w czasie rzeczywistym <td>PTC-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębu z ludzkiej pępowiny i łożyska płodu

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Ludzka pępowina (UC) i łożysko są nieinwazyjnymi, prymitywnymi i obfitymi źródłami mezenchymalnych komórek zrębu (MSC), które coraz częściej zyskują na znaczeniu, ponieważ nie stanowią żadnego etycznego czy moralnego problemu. Obecne metody izolacji MSC z UC dają niewielką ilość komórek o zmiennym potencjale proliferacji. Ponieważ UC jest anatomicznie złożonym narządem, różnice we właściwościach MSC mogą wynikać z różnic w anatomicznych regionach ich izolacji. W tym badaniu najpierw przeprowadziliśmy sekcję próbek pępowiny/łożyska na trzy odrębne obszary anatomiczne: UC, połączenie pępowiny-łożysko (CPJ) i łożysko płodu (FP). Po drugie, oddzielono dwie odrębne strefy, wyściółkę sznura (CL) i galaretkę Whartona (WJ). Następnie zastosowano technikę hodowli eksplantatów w celu wyizolowania komórek z czterech źródeł. Czas potrzebny na pierwotną hodowlę komórek z eksplantatów różnił się w zależności od źródła tkanki. Wzrost komórek nastąpił w ciągu 3 - 4 dni od eksplantatów CPJ, podczas gdy wzrost obserwowano po 7 - 10 dniach i 11 - 14 dniach odpowiednio od eksplantatów CL / WJ i FP. Wyizolowane komórki przylegały do tworzywa sztucznego i wykazywały morfologię fibroblastoidów oraz markery powierzchniowe, takie jak CD29, CD44, CD73, CD90 i CD105, podobnie jak MSC pochodzące ze szpiku kostnego (BM). Jednak wydajność tworzenia kolonii komórek była zróżnicowana, przy czym CPJ-MSC i WJ-MSC wykazywały wyższą wydajność niż BM-MSC. MSCs ze wszystkich czterech źródeł różnicowały się w linie adipogenne, chondrogeniczne i osteogenne, co wskazuje, że były multipotencjalne. CPJ-MSC różniły się bardziej efektywnie w porównaniu z innymi źródłami MSC. Wyniki te sugerują, że CPJ jest najsilniejszym regionem anatomicznym i daje większą liczbę komórek, z większą zdolnością do proliferacji i samoodnawiania się in vitro. Podsumowując, analiza porównawcza MSCs z czterech źródeł wykazała, że CPJ jest bardziej obiecującym źródłem MSCs w terapii komórkowej, medycynie regeneracyjnej i inżynierii tkankowej.

Disekcja i izolacja komórek z ludzkiej pępowiny, miejsca połączenia pępowiny z łożyskiem oraz z łożyska płodowego
Tkanka okołoporodowa składa się z trzech odrębnych obszarów anatomicznych. Pierwszym jest UC, zawierająca dwie tętnice i jedną żyłę, a także dwie wyraźne strefy: CL (zewnętrzna warstwa pępowiny) oraz WJ (galaretowata substancja otaczająca naczynia krwionośne wewnątrz pępowiny). Drugim obszarem jest CPJ (połączenie pępowiny z łożyskiem), a trzecim FP, który znajduje się bezpośrednio za CPJ (pępowina wczepia się w łożysko, które jest przytwierdzone do ściany macicy matki). Schemat protokołu izolacji komórek z tkanki okołoporodowej przedstawiono na Ryc. 1. Cztery źródła – CL, WJ, CPJ i FP – są wyraźnie identyfikowalne i zostały rozdzielone w celu izolacji komórek z eksplantatów, jak pokazano na Ryc. 2. Pojawienie się przerostu komórek z kultur eksplantatów było rutynowo monitorowane i rejestrowane za pomocą LM. Adherentne komórki fibroblastoidalne zaobserwowano po 3-4 dniach hodowli eksplantatów CPJ. Komórki o podobnej morfologii pojawiły się odpowiednio 7-8, 9-10 i 11-14 dni po hodowli eksplantatów WJ, CL i FP. Przerost komórek z eksplantatów reprezentujących różne źródła (CL, WJ, CPJ i FP) przedstawiono na Ryc. 3A. Komórki te uznano za P0. Po pasażowaniu komórek P0 wydawały się one rosnąć klonalnie, wykazując morfologię fibroblastoidalną podobną do BM-MSCs. Wykazywały one jednak różnice w czasie podwojenia populacji, który wynosił od 32 h do 94 h dla komórek z CPJ i FP, jak pokazano na Ryc. 3B i C. Komórki z WJ i CL miały podobne czasy podwojenia, będące wartościami średnimi w stosunku do CPJ i FP. Dalsza analiza komórek P0 wykazała, że różniły się one również pod względem CFE, w zakresie od 16 do 92 kolonii. Komórki z CPJ miały najwyższy (92), natomiast komórki FP najniższy (16) wskaźnik CFE. Komórki z CL i WJ miały wartości CFE wynoszące odpowiednio 59 i 80 kolonii (Ryc. 4A-C). Komórki z CL miały wartości CFE podobne do BM-MSCs. Wyniki te sugerują, że komórki pochodzące z CPJ posiadają wyższe zdolności proliferacyjne i zdolność do samoodnowy.
Immunoprofil wyizolowanych komórek
Komórki wyizolowane z CL, WJ, CPJ oraz FP poddano badaniu pod kątem ekspresji markerów specyficznych dla danej komórki. Komórki P3-5 wykazywały pozytywną ekspresję markerów MSC, takich jak CD29, CD44, CD73, CD90 oraz CD105 (Rysunek 5A i B). Znane jest również, że komórki te wykazują ekspresję markera głównego układu zgodności tkankowej klasy I, HLA-ABC, i nie wykazują ekspresji markera klasy II, HLA-DR3. Odsetki komórek pozytywnych dla tych wybranych markerów we wszystkich czterech źródłach były zbliżone do odsetka ekspresji w standardowych BM-MSCs. Jednakże stosunki MFI wskazują, że komórki pochodzące z WJ i CPJ są niemal identyczne, a ich wartości są nawet wyższe niż w przypadku komórek pochodzących z CL i FP (Rysunek 5C). Co ciekawe, pomimo zróżnicowanych wartości CFE, wszystkie komórki z różnych źródeł wykazywały podobne poziomy markerów MSC. Na podstawie wyników analizy markerów powierzchniowych, komórki wyizolowane ze wszystkich czterech źródeł uznano za MSCs. Dalsza analiza tych komórek wykazała, że wykazują one również ekspresję genów pluripotencji: OCT4, NANOG, KLF4 oraz SOX2, co przedstawiono na Rysunku 5D. Najwyższą ekspresję markerów pluripotencji wykazały CPJ-MSCs, a następnie WJ-, CL- i FP-MSCs.
Potencjał różnicowania wyizolowanych MSC
Złotym standardem charakteryzacji MSC jest ich zdolność do różnicowania się w wiele linii komórkowych. Nasze wyniki wykazały, że izolowane MSC ze wszystkich źródeł okołoporodowych łatwo różnicowały się w typy komórek adypogennych, chondrogennych i osteogennych. Pochodne adypogenne wytworzyły krople lipidów, które były dodatnio barwione Oil Red O, co przedstawiono na Ryc. 6A. Barwienie błękitem toluidynowym pochodnej chondrogennej MSC wykazało obecność proteoglikanów i glikoprotein, które wspomagały produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej (Ryc. 6B). Pochodne osteogenne MSC wykazujące dodatnie barwienie alizaryną czerwoną wskazują na obecność złogów wapnia uczestniczących w mineralizacji kości, jak pokazano na Ryc. 6C.
Zgodnie z oczekiwaniami, analiza transkrypcyjna izolowanych MSC z wszystkich źródeł wykazała różnicowanie tryliniowe (Rycyna 6D-F). Potencjał różnicowania różnił się jednak w zależności od źródła MSC. Pochodne adipogenne WJ-MSCs wykazywały 2-krotnie wyższe poziomy ekspresji wybranych genów adipogennych (CEBPβ, FABP4 oraz PPARγ) w porównaniu do CPJ-MSCs. CL- oraz FP-MSCs wykazywały najniższą ekspresję tych genów. W przypadku różnicowania chondrogennego pochodne CPJ-MSCs wykazywały 50-krotnie wyższą ekspresję wybranych genów chondrogennych (SOX9 i COL2) niż pochodne WJ- oraz FP-MSCs. Podobnie jak w przypadku słabego różnicowania adipogennego CL-MSCs, wykazywały one niższy potencjał chondrogenny, co potwierdzała najniższa ekspresja genów chondrogennych. CPJ-MSCs wykazywały również najwyższy potencjał różnicowania osteogennego, o czym świadczyły 2-krotnie wyższe poziomy transkrypcji wybranych genów osteogennych (COL1, OPN i OCN). Jednak ekspresja markera progenitorowego RUNX2 była najwyższa w pochodnych osteogennych WJ-MSCs, co wskazuje, że komórki te wolniej reagowały na warunki różnicowania. Ponownie CL-MSCs wykazały słabe różnicowanie w kierunku linii osteogennej. Wyniki te sugerują, że CPJ-MSCs i WJ-MSCs wykazują większy potencjał różnicowania niż CL- oraz FP-MSCs. CL-MSCs miały najniższy potencjał do różnicowania w pochodne tryliniowe.
<img alt="Schemat przetwarzania ludzkiej pępowiny; kroki przedstawiają sekcję, trawienie, hodowlę i charakterystykę." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat izolacji komórek z ludzkiej pępowiny, miejsca połączenia pępowiny z łożyskiem oraz płodowego łożyska. Obejrzyj pobraną próbkę i przystąp do sekcji. Krok 1. Ręcznie przeprowadź sekcję i podziel próbkę pępowiny/łożyska na trzy oddzielne obszary: pępowinę (UC), miejsce połączenia pępowiny z łożyskiem (CPJ) oraz płodowe łożysko (FP). Wyodrębnij dwie różne strefy UC na wyściółkę pępowiny (CL) i galaretkę Whartona (WJ) za pomocą nożyczek i pęsety. Krok 2. Pokrój każdą z wyseczonych tkanek oddzielnie na kawałki o wielkości 1-2 mm za pomocą nożyczek i poddaj kawałki częściowemu trawieniu. Krok 3. Hoduj fragmenty tkanek. Krok 4. Izoluj komórki z eksplantów poprzez traktowanie trypsyną. Przeprowadź pasaż i charakterystykę izolowanych komórek. Krok 5. Izolowane i scharakteryzowane komórki mogą być namnażane i wykorzystywane w różnych zastosowaniach. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat tkanki pępowiny z próbkami do hodowli; opisane żyła i tętnice; układ badania biologicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Disekcja i hodowla eksplantów z ludzkiej pępowiny, połączenia pępowina-łożysko oraz łożyska płodowego. Przedstawiono trzy różne regiony anatomiczne próbki pępowiny/łożyska: UC (podzielone na CL i WJ), CPJ oraz FP, a także powiązane z nimi tętnice i żyły. CL, WJ, CPJ oraz FP zostały oddzielone poprzez manualną disekcję w celu wyizolowania komórek z eksplantów. Każdy z wypreparowanych regionów został oddzielnie pocięty na małe fragmenty i poddany hodowli w płytkach 75-cm2 z użyciem 9 mL CM. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie wzrostu komórek, obrazy mikroskopowe (A, B) i wykres słupkowy (C) analizy czasu podwojenia populacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Morfologia komórek wyizolowanych z ludzkiej pępowiny, połączenia pępowina-łożysko oraz łożyska płodowego. (A) Wzrost komórek z eksplantatów CL, WJ, CPJ i FP, obrazowany za pomocą LM. (B) Subkultura wyizolowanych komórek z eksplantatów CL, WJ, CPJ i FP wykazała morfologię fibroblastopodobną. Pasek skali odpowiada 100 µm (powiększenie: 4X). (C) Czas podwojenia populacji komórek wyizolowanych z CL, WJ, CPJ i FP. Jako standard zastosowano BM-MSCs. Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy średniej z pomiarów wykonanych w trzech powtórzeniach (**p ≤ 0.01 i *p ≤ 0.05). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza hodowli komórkowych: wyniki mikroskopii i testu tworzenia kolonii z porównaniem na wykresie słupkowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wydajność tworzenia kolonii przez komórki z ludzkiej pępowiny, złączenia pępowina-łożysko oraz łożyska płodowego. (A) Wzrost komórek (P0) wyizolowanych z CL, WJ, CPJ i FP, wysianych z gęstością klonalną 1,63 cells/cm2, zwizualizowany za pomocą LM. (B) Fotomikrografie komórek barwionych fioletem krystalicznym wykazujące zdolność do tworzenia kolonii. (C) Pojedyncza kolonia komórek barwionych fioletem krystalicznym. Paski skali reprezentują 100 µm (powiększenie: 4X). (D) Graficzna reprezentacja liczby kolonii powstałych z komórek pochodzących z CL, WJ, CPJ i FP. Jako standard wykorzystano BM-MSCs. Słupki błędów reprezentują standardowy błąd średniej z pomiarów wykonanych w trzech powtórzeniach (**p ≤ 0,01 oraz *p ≤ 0,05). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza cytometryczna markerów powierzchniowych MSC i ekspresji genów pluripotencji w różnych tkankach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Analiza markerów MSC ekspresywnych w komórkach wyizolowanych z ludzkiej pępowiny, złączenia pępowina-łożysko oraz łożyska płodowego. (A) Ekspresja mezenchymalnych markerów powierzchniowych (CD29, CD44, CD73, CD90 i CD105) w komórkach z CL, WJ, CPJ i FP, określona metodą cytometrii przepływowej. (B i C) Graficzna prezentacja procentów komórek pozytywnych oraz stosunków mediany intensywności fluorescencji (MFI) dla wybranych mezenchymalnych markerów powierzchniowych. Stosunki MFI obliczono poprzez podzielenie wartości MFI markera (wygenerowanej przez oprogramowanie na podstawie intensywności fluorescencji bramkowanych populacji komórek) przez wartość MFI izotypu. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej z pomiarów wykonanych w trzech powtórzeniach. (D) Ekspresja genów pluripotencji (OCT4, NANOG, KLF4 i SOX2) w komórkach z CL, WJ, CPJ i FP, określona metodą qRT-PCR. (**p ≤ 0.01 i *p ≤ 0.05). Ekspresja genów została znormalizowana względem GAPDH i β-ACTIN, a słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej z pomiarów wykonanych w trzech powtórzeniach. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Różnicowanie komórek macierzystych; barwienie Oil Red O, błękitem toluidynowym, alizaryną czerwoną; wykresy ekspresji genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Wieloliniowe różnicowanie MSC wyizolowanych z ludzkiej pępowiny, złączenia pępowina-łożysko oraz łożyska płodowego. (A) Komórki inkubowano w medium do różnicowania adipogennego przez 3 tygodnie i barwiono Oil Red O, co wskazuje na obecność kropli lipidowych. (B) Pellety komórkowe inkubowano w medium do różnicowania chondrogennego przez 3 tygodnie. Przekroje mrożone kultur pelletów barwiono błękitem toluidynowym, co wykazało obecność glikozaminoglikanów. (C) Komórki inkubowano w medium do różnicowania osteogennego przez 3 tygodnie i barwiono alizaryną czerwoną, co wykazało wytwarzanie złogów wapnia sugerujących mineralizację kości. Wszystkie obrazy uzyskano za pomocą LM. Pasek skali reprezentuje 100 µm (powiększenie: 4X). Jako standard wykorzystano BM-MSCs. (D-F) Ekspresja wybranych genów (CEBPβ, FABP4 i PPARγ; SOX9, ACAN i COL2; oraz COL1, RUNX2, OPN i OCN reprezentujących różnicowanie MSC odpowiednio w linie adipogenne, chondrogenne i osteogenne), określona za pomocą analizy qRT-PCR (**p ≤ 0.01 i *p ≤ 0.05). Ekspresję genów znormalizowano względem GAPDH i β-ACTIN, a słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej z pomiarów w trzech powtórzeniach. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gen</td>
			<td>Sekwencje starterów</td>
			<td>Długość produktu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4</td>
			<td>Forward-CCCCTGGTGCCGTGAA</td>
			<td>97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Odwrócony-GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG</td>
			<td>Forward- AAAGAATCTTCACCTATGCC</td>
			<td>110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Odwrócona sekwencja- GAAGGAAGAGGAGAGACAGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4</td>
			<td>Forward- CGAACCCACACAGGTGAGAA</td>
			<td>94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Odwrotna- TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Forward- TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA</td>
			<td>75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Odwrócona- CTGGGGCTCAAACTTCTCTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9</td>
			<td>Forward- AGCGAACGCACATCAAGAC</td>
			<td>85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Odwrócona sekwencja: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COL2</td>
			<td>Forward- CTCGTGGCAGAGATGGAGAA</td>
			<td>252</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Odwrócona- CACCAGGTTCACCAGGATTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACAN</td>
			<td>Forward- AGCCTGCGCTCCAATGACT </td>
			<td>103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Odwrotna- GGAACACGATGCCTTTCACC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COL1</td>
			<td>Forward- AAGGTCATGCTGGTCTTGCT</td>
			<td>114</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Odwrotna- GACCCTGTTCACCTTTTCCA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RUNX2</td>
			<td>Forward- TGCTTCATTCGCCTCACAAA</td>
			<td>111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Odwrotna- AGTGACCTGCGGAGATTAAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPN</td>
			<td>Forward- CATACAAGGCCATCCCCGTT</td>
			<td>112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Odwrotna- TGGGTTTCAGCACTCTGGTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCN</td>
			<td>Forward- TAAACAGTGCTGGAGGCTGG </td>
			<td>191</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Odwrotna- CTTGGACACAAAGGCTGCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEBPβ</td>
			<td>Forward- TATAGGCTGGGCTTCCCCTT</td>
			<td>94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Odwrócona- AGCTTTCTGGTGTGACTCGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FABP4</td>
			<td>Forward- TTAGATGGGGGTGTCCTGGT</td>
			<td>158</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Odwrotna- GGTCAACGTCCCTTGGCTTA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPARγ</td>
			<td>Forward- GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC </td>
			<td>74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Odwrócona- ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>Forward- ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG</td>
			<td>101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Odwrotna: GCCATCACGCCACAGTTTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTYNA</td>
			<td>Forward- AATCTGGCACCACACCTTCTAC</td>
			<td>170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Odwrotna- ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC  </td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista sekwencji starterów ludzkich użytych w niniejszym badaniu.

Tutaj prezentujemy protokół do sekcji próbki ludzkiej pępowiny (UC) i łożyska płodu na błonę śluzową pępowiny (CL), galaretkę Whartona (WJ), połączenie pępowina-łożysko (CPJ) i łożysko płodu (FP) w celu izolacji i charakterystyki mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) przy użyciu techniki hodowli eksplantatów.

Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębu z ludzkiej pępowiny i łożyska płodu

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z czterech odrębnych okołoporodowych źródeł tkanek: wyściółki pępowiny, galaretki Whartona, złączenia pępowina-łożysko oraz łożyska płodowej. Metoda ta może przyczynić się do rozwoju biologii komórek macierzystych i medycyny alternatywnej poprzez nieinwazyjne pozyskanie wysokiej jakości mezenchymalnych komórek macierzystych. Główną zaletą tej techniki jest wydajne uzyskiwanie dużych ilości wysokiej jakości homogenicznych populacji komórek z różnych okołoporodowych źródeł tkanek.Wielopotencjalne mezenchymalne komórki macierzyste pępowiny uzyskane za pomocą tej techniki mogą być stosowane w leczeniu różnych chorób i zaburzeń, ponieważ są one bardziej prymitywne niż mezenchymalne komórki macierzyste izolowane z tkanek dorosłych. Metoda ta pozwala na poznanie charakterystyki mezenchymalnych komórek macierzystych z różnych odcinków i specyficznych nisz pępowiny oraz łożyska. Procedurę należy rozpocząć od umieszczenia próbki w 150 mm czarce Petriego na lodzie w komorze bezpieczeństwa biologicznego, a następnie użyć igły i strzykawki, aby kilkukrotnie wypłukać tkankę lodowatym PBS.Po usunięciu wszystkich skrzepów krwi należy dokładnie zbadać próbkę, aby zidentyfikować poszczególne obszary anatomiczne. Następnie za pomocą pęsety należy chwycić koniec pępowiny od strony płodu i za pomocą nożyczek ostrożnie wykonać nacięcie w górnej części miejsca połączenia pępowiny z łożyskiem. Wykonać drugie nacięcie poniżej tego połączenia, aby oddzielić miejsce połączenia pępowiny z łożyskiem od łożyska.Następnie podzielone tkanki należy rozdzielić do oddzielnych szalek Petriego. Dalej, przetnij pępowinę wzdłużnie, aby całkowicie odsłonić naczynia krwionośne oraz otaczającą je galaretkę Whartona, nie naruszając nabłonka. Użyj skalpela, aby zeskrobać galaretkę Whartona z naczyń krwionośnych i między nabłonkiem pod Amnionu.Następnie usunąć naczynia krwionośne, przenosząc pozostałą galaretkę okołynaczyniową znajdującą się pod i wokół naczyń do naczynia z galaretką Whartona, a pozostałą tkankę wyściółki pępowiny umieścić w osobnym naczyniu. Po wypreparowaniu wszystkich tkanek zastąpić PBS w każdym naczyniu od trzech do pięciu mililitrów trypsyny i za pomocą nożyczek pociąć każdą próbkę tkanki na kawałki o wielkości od jednego do dwóch milimetrów w celu inkubacji przez 30 minut w temperaturze 37 °C i pięciu procentach dwutlenku węgla. Użyć mikroskopu kontrastowego, aby obserwować częściowe trawienie, wizualizując uwalnianie komórek z tkanki.Po zakończeniu okresu częściowego trawienia zneutralizować trypsynę równą objętością pożywki hodowlanej i przenieść próbki do oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów. Pozostawić fragmenty tkanki do osadzenia się na trzy minuty. Następnie ostrożnie odessać nadsącz i przenieść od 15 do 20 częściowo strawionych fragmentów tkanki z każdej próbki do oddzielnych 75 cm² kolb do hodowli tkankowej.Następnie dodaj dziewięć mililitrów pożywki hodowlanej i inkubuj przez dwa do trzech dni w temperaturze 37 °C. Po trzech dniach wymień pożywkę i sprawdź eksplanty pod mikroskopem fazokontrastowym pod kątem wyprowadzenia komórek. Gdy komórki osiągną 70% konfluencji, zdysocjuj je, dodając od jednego do dwóch mililitrów roztworu trypsyny na kolbę; obracaj kolbę, aby równomiernie pokryć powierzchnię roztworem enzymu, a następnie inkubuj hodowle przez trzy minuty w temperaturze 37 °C.Następnie zneutralizuj reakcję, dodając od jednego do dwóch mililitrów pożywki hodowlanej. Zbierz komórki poprzez wirowanie, resuspendując osad w pożywce do dalszej subkultury przy gęstości zasiewu wynoszącej 1×10⁴ komórek na cm². Komórki z kultur wyścielki pępowiny oraz galaretki Whartona wykazują odpowiednio wartości wydajności tworzenia kolonii na poziomie 59 i 80 kolonii.Wartość wydajności tworzenia kolonii przez komórki z miejsca połączenia pępowiny z łożyskiem jest jednak zbliżona do tej obserwowanej dla mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego, co sugeruje, że komórki pochodzące z połączenia pępowina-łożysko wykazują wyższe zdolności do proliferacji i samoodnowy. Analiza cytometryczna zawiesin pojedynczych komórek wyizolowanych z tych tkanek okołoporodowych wskazuje, że odsetki komórek pozytywnych pod kątem specyficznych markerów mezenchymalnych komórek macierzystych ze wszystkich czterech źródeł tkanek są zbliżone do tych ekspresjonowanych przez standardowe mezenchymalne komórki pochodzące z szpiku kostnego. Stosunki mediany intensywności fluorescencji wskazują jednak, że komórki pochodzące z galaretki Whartona oraz z połączenia pępowina-łożysko wykazują poziom bardzo podobny lub wyższy niż komórki wyściółki pępowiny w łożysku płodowym.Co ciekawe, pomimo zróżnicowanych wartości efektywności tworzenia kolonii, wszystkie komórki pochodzące z różnych źródeł okołoporodowych wykazują podobne poziomy markerów pluripotencji w analizie ilościowej RTPCR, z wyjątkiem mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z miejsca przyczepu pępowiny do łożyska, które wykazały najwyższe poziomy ekspresji dla wszystkich badanych markerów pluripotencji. Ponadto, mezenchymalne komórki macierzyste izolowane ze wszystkich źródeł okołoporodowych łatwo różnicują się w typy komórek adypogennych, chondrogennych i osteogennych, wykazując tym samym różnicowanie trójliniowe. Potencjał różnicowania różni się jednak w zależności od źródła pochodzenia mezenchymalnych komórek macierzystych.Po opanowaniu, technika ta może zostać przeprowadzona w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostanie wykonana sprawnie. Podczas realizacji tej procedury ważne jest stosowanie techniki lateralnej i unikanie kontaminacji krzyżowej między źródłami tkanek. Technika ta utorowała drogę badaczom do zgłębiania natury nisz komórek macierzystych w tkankach okołoporodowych.

isolation-characterization-mesenchymal-stromal-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje izolację i następującą ekspansję mezenchymalnych komórek macierzystych oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie bez użycia surowicy zwierzęcej, w celu wygenerowania autologicznych par do celów eksperymentalnej transplantacji.

Izolacja i ekspansja w warunkach wolnych od surowicy zwierzęcej mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) oraz endotelialnych komórek progenitorowych tworzących kolonie (ECFC) pochodzących z ludzkiej pępowiny

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają potencjał różnicowania w kierunku linii osteoblastycznej, gdy są stymulowane przez rozpuszczalne czynniki lub określone biomateriały. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską opcję dostarczania MSCs z ludzkiej błony owodniowej (AM-hMSC), która wykorzystuje macierz kostną bydła Nukbone (NKB) jako rusztowanie.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ich hodowla na porowatej macierzy kostnej

Tutaj opisujemy metody preparowania tkanek płodowych i matczynych z ludzkiego łożyska, a następnie izolacji i ekspansji mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) z tych tkanek.

Izolacja i ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych pochodzących z ludzkiej tkanki łożyska

Ludzka pępowina (UC) może być uzyskana w okresie okołoporodowym w wyniku porodu przedwczesnego, terminowego i poterminowego. W tym protokole opisujemy izolację i charakterystykę mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z WZJG (UC-MSC) od płodów/niemowląt w 19-40 tygodniu ciąży.

Izolacja i charakterystyka ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z pępowiny od wcześniaków i niemowląt urodzonych w terminie

Opisujemy protokół izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej i ich różnicowania w linię mięśni szkieletowych.

Wytwarzanie mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej i ich różnicowanie w linię mięśni szkieletowych

To badanie przedstawia unikalną procedurę sekcji w celu zachowania integralności galarety Whartona (WJ), co skutkuje mniej uszkodzonym WJ oraz większą ilością i żywotnością pobranych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). Metoda ta wykazuje lepszą wydajność i zdolność proliferacyjną w porównaniu z konwencjonalnymi metodami ostrej sekcji.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z pępowiny o wysokiej wydajności i niskich uszkodzeniach

Izolacja MSC o wysokimMFGE8 BAMBI, jednej z trzech głównych podgrup tworzących heterogeniczne ludzkie UC-MSC, jest pomocna dla pełnego zrozumienia cech i funkcji tego podtypu dla jego przyszłego zastosowania w celu poprawy skuteczności klinicznej w określonych chorobach. W tym miejscu przedstawiamy metodę sortowania BAMBIhighMFGE8high UC-MSC.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z pępowiny owysokim poziomieMFGE8

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Niejednorodność transkrypcyjna w ludzkich komórkach zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej może być zdefiniowana na poziomie pojedynczej komórki za pomocą markerów powierzchni komórki i genów osteogennych.  Opisujemy protokół wykorzystujący cytometrię przepływową do izolacji subpopulacji komórek o zwiększonym potencjale osteogennym, który może być wykorzystany do poprawy rekonstrukcji szkieletu twarzoczaszki.

Izolacja i wzbogacenie ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zwiększenia osteogenezy

Ten protokół opisuje izolację komórek satelitarnych z mięśni głowy skrzelowych 9-tygodniowego szczura. Mięśnie wywodzą się z różnych łuków skrzelowych. Następnie komórki satelitarne są hodowane na punktowej powłoce o rozmiarach milimetra w celu zbadania ich różnicowania. Takie podejście pozwala uniknąć rozszerzania się i przechodzenia komórek satelitarnych.

Izolacja i charakterystyka komórek satelitarnych z mięśni skrzelowych głowy szczura

Poznaj izolację mezenchymalnych komórek zrębu z pępowiny i łożyska płodu przy użyciu techniki hodowli eksplantatów. Ta metoda pozwala uzyskać wysokiej jakości komórki MSC do zastosowań w biologii komórek macierzystych i medycynie regeneracyjnej.

Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębu z ludzkiej pępowiny i łożyska płodu

Przeglądaj więcej filmów