Kwantyfikacja zachowań pielęgnacyjnych Drosophila

Ogólnym celem tej metody jest zmierzenie zachowania pielęgnacyjnego Drosophila poprzez ilościowe określenie i porównanie pozostałej części kolorowego jaskrawożółtego barwnika na ciele zwierząt w warunkach pielęgnowanych i niepielęgnowanych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny neurobiologii i genetyki behawioralnej, takie jak koordynacja umiejętności motorycznych oraz związane z nimi regulatory i obwody molekularne. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka, solidna i łatwa do wykonania przez wielu eksperymentatorów i studentów na różnych poziomach umiejętności.

Tę procedurę zademonstruje Frankie Barradale, student z mojego laboratorium. Aby rozpocząć eksperyment, przygotuj aspirator, aby przenieść żywą Drosophilę z fiolki hodowlanej do komory groomerskiej. Za pomocą nożyczek przetnij 1.5 stopy rurki Tygon.

Wytnij co najmniej jeden cal końcówki jednorazowej końcówki do mikropipet o pojemności jednego mililitra i przytrzymaj centymetrowy kwadratowy kawałek siatki nad 196-calowym otworem odciętej końcówki. Dokładnie umieść świeżą, mililitrową końcówkę mikropipety na siatce i odetnij końcówkę, aby stworzyć komorę do trzymania much. Odetnij skrajną końcówkę nowej końcówki mikropipety, aby poszerzyć otwór na tyle, aby umożliwić przejście pojedynczej muchy.

Otwór będzie mniej więcej pasował do otworu komory groomerskiej. Dokładnie dopasuj zagnieżdżone końcówki do końca rurki Tygon. Wciśnij końcówki do rurki, aby zapewnić ścisłe dopasowanie i umożliwić podciśnienie.

Na drugim końcu rurki odetnij końcówkę 200-mililitrowej końcówki mikropipety i dopasuj wąski odcięty koniec do rurki, aby uformować stronę ustną aspiratora. Aby przygotować probówki z podwielokrotnością pyłu, odważ pięć miligramów jaskrawożółtego barwnika na bikucie wagowym. Wlej pył do 8-mililitrowej probówki mikrowirówki i szczelnie zamknij nakrętkę.

Następnie, aby przygotować probówki z etanolem, odpipetuj jeden mililitr 100% etanolu do 15-mililitrowych probówek mikrowirówek. Oznacz probówki, nakrętkę i zachowaj probówki z etanolem do zakończenia testu pielęgnacji. Należy również uwzględnić co najmniej jedną ślepą próbkę zawierającą tylko jeden mililitr etanolu bez muchy do kontroli ujemnych.

Zmontuj każdą komorę groomerską, przykręcając przesuwną górną płytę z mniejszymi otworami, ale pozostawiając dolną płytę z wyjętymi większymi otworami w celu dodania kurzu. Umieść każdą niezbędną komorę groomerską płasko na stole górną stroną do dołu. Załaduj pięć miligramów brylantowej żółtej porcji barwnika do każdej komory, stukając rurką o powierzchnię komory powyżej żądanej studzienki.

Uderz komorą o stół, aby upewnić się, że cały kurz spadnie przez siatkę na górę talerza. Następnie przykręć dolną płytę do każdej komory, tak aby szersze końce stożkowych otworów były skierowane na zewnątrz, a otwory nie spoczywały nad studzienkami. Mocno dokręć dolną płytę, aby nie przesuwała się i nie uwalniała barwnika.

Odwróć komorę i kilkakrotnie uderz nią płasko o stół, tak aby kurz spadł przez siatkę i spocząć na dolnej płycie. Wsuń górną płytę komory w otwarte pozycje, tak aby małe otwory pokrywały się z 15 dołkami, umożliwiając wprowadzenie much do poszczególnych studzienek. Załaduj jedną muchę do aspiratora do ust, delikatnie zasysając jeden koniec aspiratora, tak jakby używał słomki.

Umieść muchy, lekko i kierując otwór w stronę celu. Po załadowaniu studni przesuń górną płytę tak, aby mucha została uwięziona w komorze i umieść taśmę na otworze studni podczas załadunku komory otworu, aby zapobiec ucieczce muchy podczas ładowania innych studni. Jeśli wiele much zostanie zassanych do jednej studzienki, pozostaw ten otwór otwarty, aż pozostanie tylko jedna mucha.

Po napełnieniu wszystkich niezbędnych studzienek muchami, odwróć komorę tak, aby dolna płyta była skierowana do góry, a pył mógł pokryć muchy, spadając przez siatkę. Mocno zabezpiecz górną i dolną płytę, dokręcając i obracaj komorę, aby odkurzyć muchy przez cztery sekundy. Dwukrotnie uderz komorą, górną płytą zadrukowaną w dół o stół, tak aby barwnik wpadł przez drugą stronę.

Następnie odwróć komorę, górną płytą do góry i dwukrotnie uderz komorę, aby upewnić się, że barwnik osiada na podłodze dolnej komory, z dala od muchy, trzymanej w górnej komorze. W przypadku much kontrolnych, które nie mogą być pielęgnowane, należy natychmiast przystąpić do przygotowania próbki. Oprzyj komorę płasko na stole lub blacie, górną płytą do góry przez 30 minut, aby muchy mogły się oczyścić.

Umieść komorę w przestrzeni wolnej od wibracji, aby utrzymać stałe środowisko dla wszystkich eksperymentów pielęgnacyjnych. Trzymając komorę poziomo z górną płytą do góry, delikatnie odkręć dolną płytę i wyjmij ją z komory, uważając, aby nie stracić barwnika. Umieść komorę na podkładce CO2 o niskim przepływie powietrza, aż muchy zostaną znieczulone.

Odkręć górną płytę od komory, ostrożnie za pomocą kleszczy chwyć nogę i usuń jedną zakurzoną muchę z każdej komory i umieść ją w 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówki zawierającej etanol. Gdy każda probówka do mikrowirówki zawiera jedną muchę, zamknij nakrętkę i odwróć probówki trzy razy, aby wymieszać i wymieszać roztwór barwnika i etanolu. Inkubować probówki zawierające etanol i muchy przez pięć godzin w temperaturze pokojowej, aby zapewnić całkowite usunięcie barwnika z muchy do roztworu.

Po pięciu godzinach krótko wiruj każdą rurkę przez dwie sekundy, aby upewnić się, że barwniki są usuwane z much. Porcję 50 mikrolitrów eksperymentalnej probówki o pojemności 1,5 mililitra do dołka na płytce 96-dołkowej, zwracając uwagę na położenie każdej próbki na płytce. Dodaj 200 mikrolitrów etanolu, aby rozcieńczyć próbkę pięciokrotnie, aby uniknąć efektu uszczelnienia mocno zakurzonych much lub dużych wad pielęgnacyjnych.

Użyj czytnika płytek, aby przeanalizować każdą próbkę w odległości 397 nanometrów. Nagraj próbkę za pomocą czytnika płytek i zapisz arkusz kalkulacyjny z próbkami zapisu na płycie. Użyliśmy tej metody do zbadania DopR, porównując wydajność pielęgnacji silnego hipomorfa i zerowych mutantów DopR ze szczepem typu dzikiego.

Mutanty DopR zachowały znacznie więcej barwnika niż ich dzikie odpowiedniki uratowane, co wskazuje, że mutanty DopR były mniej skuteczne w pielęgnacji. W równoległym eksperymencie na muchach Rutabaga mutanty wykazują wyższy poziom akumulacji barwnika niż mutanty DopR, co sugeruje znaczącą rolę DopR w zachowaniu pielęgnacyjnym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obchodzić się z muchami do testów behawioralnych, a także mierzyć zachowanie związane z uwodzeniem.