Kwantyfikacja zachowań pielęgnacyjnych Drosophila

Ogólnym celem tej metody jest pomiar zachowań pielęgnacyjnych u Drosophila poprzez ilościowe określenie i porównanie pozostałości żółtego barwnika Brilliant Yellow na ciele zwierząt w warunkach pielęgnacyjnych i niepielęgnacyjnych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii i genetyki behawioralnej, takie jak koordynacja precyzyjnych umiejętności lokomocyjnych oraz powiązane z nimi regulatory molekularne i obwody neuronalne. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona szybka, odporna na błędy i łatwa do przeprowadzenia przez wielu eksperymentatorów i studentów o różnym stopniu zaawansowania.

Procedurę tę zademonstruje Frankie Barradale, student w moim laboratorium. Aby rozpocząć eksperyment, należy przygotować aspirator do przeniesienia żywych Drosophila z fiolki hodowlanej do komory pielęgnacyjnej. Za pomocą nożyczek odetnij 1,5 stopy rurki Tygon.

Odetnij co najmniej 2,5 cm końcówki jednorazowej mikropipety o pojemności 1 ml i przyłóż kwadratowy kawałek siatki o boku 1 cm do otworu odciętej końcówki. Ściśle nałóż nową końcówkę mikropipety o pojemności 1 ml na siatkę i odciętą końcówkę, aby stworzyć komorę utrzymującą muchy. Odetnij sam czubek nowej końcówki mikropipety, aby poszerzyć otwór na tyle, by umożliwić przejście pojedynczej muchy.

Otwór powinien mniej więcej odpowiadać rozmiarowi otworu komory pielęgnacyjnej. Mocno nasuń zagnieżdżone końcówki na koniec rurki Tygon. Wciśnij końcówki do rurki, aby zapewnić szczelne dopasowanie umożliwiające wytworzenie podciśnienia.

Na drugim końcu rurki odetnij końcówkę tipa do mikro-pipety o pojemności 200 mililitrów i dopasuj wąski, odcięty koniec do rurki, aby utworzyć stronę wlotową aspiratora. W celu przygotowania probówek z alikwotami pyłu, odważ pięć miligramów żółtego barwnika na papierze wagowym. Wsyp pył do probówki do mikro-wirówki o pojemności 8 mililitrów i szczelnie zamknij zakrętkę.

Następnie, aby przygotować probówki z etanolem, należy pipetować 1 ml 100% etanolu do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 15 ml. Probówki należy opisać, zamknąć i zachować do czasu zakończenia testu pielęgnacji. Należy również przygotować co najmniej jedną próbkę kontrolną zawierającą tylko 1 ml etanolu bez muchy w celu uzyskania kontroli negatywnej.

Złóż każdą komorę pielęgnacyjną, przykręcając przesuwną górną płytkę z mniejszymi otworami, pozostawiając jednak zdemontowaną dolną płytkę z większymi otworami w celu dodania pyłu. Połóż każdą niezbędną komorę pielęgnacyjną płasko na stole górną stroną do dołu. Do każdej komory wprowadź pięć miligramów alikwotu jaskrawżółtego barwnika, stukając probówką o powierzchnię komory nad wybranym dołkiem.

Opukaj komorę o stół, aby upewnić się, że cały pył przesypał się przez siatkę na górną część płytki. Następnie przykręć dolną płytkę do każdej komory w taki sposób, aby szersze końce stożkowych otworów były skierowane na zewnątrz, a otwory nie znajdowały się bezpośrednio nad dołkami. Mocno dokręć dolną płytkę, aby nie przesuwała się i nie dopuściła do wycieku barwnika.

Obróć komorę do góry dnem i kilkakrotnie uderz nią płasko o stół, aby kurz przesypał się przez siatkę na płytę dolną. Przesuń górną płytę komory do pozycji otwartej w taki sposób, aby małe otwory znalazły się nad 15 dołkami, umożliwiając wprowadzenie much do poszczególnych dołków. Pobierz jedną muchę do aspiratora, delikatnie wciągając powietrze przez jeden koniec aspiratora, podobnie jak przy użyciu słomki.

Umieść muchy, lekko dmuchając i kierując otwór w stronę celu. Po załadowaniu dołka przesuń górną płytkę tak, aby mucha została uwięziona w komorze, a następnie zaklej otwór dołka taśmą podczas ładowania komory otworu, aby zapobiec ucieczce muchy podczas ładowania pozostałych dołków. Jeśli do jednego dołka zostanie zassane kilka much, pozostaw ten otwór niezaklejony, dopóki nie zostanie w nim tylko jedna mucha.

Po wypełnieniu wszystkich niezbędnych dołków muchami, odwróć komorę tak, aby dolna płytka znajdowała się u góry, umożliwiając opadanie proszku przez siatkę i pokrycie nim much. Mocno zabezpiecz płytki górną i dolną, dokręcając śruby, a następnie poddaj komorę działaniu wstrząsarki vortex przez cztery sekundy, aby oprószyć muchy. Dwukrotnie uderz komorą o stół, kierując płytką górną w dół, aby barwnik przesypał się na drugą stronę.

Następnie odwrócić komorę tak, aby górna płytka znajdowała się na górze i dwukrotnie stuknąć w komorę, aby upewnić się, że barwnik osiadł na dnie dolnej komory, z dala od muchy znajdującej się w górnej komorze. W przypadku much kontrolnych, którym nie pozwala się na pielęgnację, przejść niezwłocznie do przygotowania próbek. Pozostawić komorę płasko na stole lub blacie, górną płytką do góry, na 30 minut, aby umożliwić muchom pielęgnację.

Umieść komorę w miejscu wolnym od hałasu i wibracji, aby zapewnić stałe warunki środowiskowe dla wszystkich eksperymentów dotyczących pielęgnacji. Trzymając komorę w poziomie z górną płytką skierowaną do góry, ostrożnie odkręć dolną płytkę i wyjmij ją z komory, uważając, aby nie wylać barwnika. Umieść komorę na podkładce z CO2 przy niskim przepływie powietrza, aż muchy zostaną znieczulone.

Odkręć górną płytkę od komory, ostrożnie chwyć nogę pęsetą, wyjmij jedną oprószoną muchę z każdej komory i umieść ją w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej etanol. Gdy każda probówka do mikrowirówki będzie zawierać jedną muchę, zamknij nakrętkę i odwróć probówki trzy razy, aby wymieszać roztwór barwnika i etanolu. Inkubuj probówki zawierające etanol i muchy przez pięć godzin w temperaturze pokojowej, aby zapewnić całkowite usunięcie barwnika z organizmu muchy do roztworu.

Po pięciu godzinach krótko wymieszaj każdą probówkę na wirówce typu vortex przez dwie sekundy, aby upewnić się, że barwniki zostały usunięte z much. Przenieś 50 µL z eksperymentalnej probówki o pojemności 1,5 ml do dołka płytki 96-dołkowej, odnotowując położenie każdej próbki na płytce. Dodaj 200 µL etanolu, aby pięciokrotnie rozcieńczyć próbkę, co pozwoli uniknąć efektów uszczelnienia w przypadku much silnie pokrytych proszkiem lub dużych wad pielęgnacyjnych.

Użyj czytnika płytek do analizy każdej próbki przy 397 nanometrach. Zarejestruj próbki za pomocą czytnika płytek i zapisz arkusz z pomiarami próbek na płytce. Metodę tę zastosowaliśmy do badania DopR, porównując efektywność pielęgnacji silnego hipomorfu oraz mutantów null DopR ze szczepem typu dzikiego.

Mutanty DopR zatrzymały znacznie więcej barwnika niż ich odpowiedniki typu dzikiego lub uratowane, co wskazuje, że mutanty DopR wykazywały niższą efektywność w zachowaniach pielęgnacyjnych. W równoległym eksperymencie na muchach Rutabaga mutanty wykazały wyższe poziomy akumulacji barwnika niż mutanty DopR, co sugeruje istotną rolę DopR w zachowaniu pielęgnacyjnym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak obchodzić się z muchami w testach behawioralnych oraz jak mierzyć zachowania pielęgnacyjne.