Name: Kwantyfikacja zachowań pielęgnacyjnych Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Naucz się kwantyfikacji zachowań pielęgnacyjnych Drosophila przy użyciu barwnika. Ta metoda pozwala badać koordynację ruchów i regulatory molekularne w neurobiologii oraz genetyce behawioralnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Brianowi Shepherdowi, Tat Udomritthiruj, Aaronowi Willeyowi, Ruby Froom, Elise Pitmon i Rose Hedreen za wczesną pracę nad testowaniem i ustanawianiem tej metodologii i projektów komór. Dziękujemy Kelly Tellez i Grahamowi Buchanowi za przeczytanie i zredagowanie rękopisu. Dziękujemy Andrew Seeds i Julie Simpson za ich pionierską pracę oraz rady i wsparcie w sugerowaniu stosowania Brilliant Yellow Dye (Sigma). Praca ta jest częściowo wspierana przez Mary E. Groff Surgical and Medical Research and Education Charitable Trust, Bronfman Science Center oraz Hellman Fellows Program.

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotuj aspirator do przenoszenia żywych Drosophila z fiolki hodowlanej do komory groomerskiej. Aspiratory umożliwiają przeniesienie przytomnych zwierząt do komór behawioralnych, aby zapewnić, że znieczulenie nie wpłynie na późniejszą obserwację behawioralną.
	<ol>
		<li>Za pomocą nożyczek przetnij 1,5 stopy rurki tygon ID 1/8", OD 1/4". Odetnij co najmniej 1 cal od końcówki jednorazowej końcówki do mikropipet o pojemności 1 ml. Przytrzymaj kwadratowy kawałek siatki o długości 1 cm (otwór 0.196 cala) nad wyciętą końcówką. 
		UWAGA: Większość końcówek o pojemności 1 ml ma linię gradacji, w której końcówka znajduje się w opakowaniu, zwykle przyciętą do tej linii.</li>
		<li>Dokładnie umieść świeżą końcówkę mikropipety o pojemności 1 ml na siatkowej/odciętej końcówce. Obserwuj, jak siatka tworzy szczelną barierę między dwiema końcówkami. Wnętrze nowej końcówki tworzy komorę przetrzymującą muchy.</li>
		<li>Odetnij skrajną końcówkę nowej końcówki mikropipety, aby poszerzyć otwór na tyle, aby umożliwić przejście pojedynczej muchy. Otwór będzie mniej więcej pasował do otworu komory groomerskiej (o średnicy około 1,5-2 mm).</li>
		<li>Dokładnie dopasuj zagnieżdżone końcówki do końca rurki tygonowej. Wciśnij końcówki do rurki, aby zapewnić ścisłe dopasowanie i umożliwić podciśnienie.</li>
		<li>Na drugim końcu rurki odetnij końcówkę końcówki mikropipety o pojemności 200 μl i włóż wąsko odciętą końcówkę do rurki. To jest strona "ust" aspiratora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować probówki z podwielokrotnościami pyłu. Odważyć około 5 mg barwnika Brilliant Yellow na wytarowanym papierze wagowym. Wlej pył do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,6 ml i szczelnie zamknij nakrętkę. 
	UWAGA: Zalecamy stosowanie rękawic nitrylowych podczas przygotowywania podwielokrotności, ponieważ niektóre rękawice lateksowe przepuszczają barwnik.</li>
	<li>Powtórzyć krok 1.2 dla wszystkich próbek w doświadczeniu (po jednej dla każdej muchy w każdej komorze).</li>
	<li>Przygotuj probówki z etanolem (EtOH): Odpipetować 1 ml 100% EtOH do 1,5 ml probówek do mikrowirówek. Oznacz probówki dla genotypów lub warunków.</li>
	<li>Powtórzyć krok 1.4 dla wszystkich próbek w doświadczeniu (po jednej dla każdej muchy w każdej komorze). Zakryj i zachowaj probówki EtOH do zakończenia testu pielęgnacji. Należy również dołączyć co najmniej jedną "ślepą" próbkę, która będzie zawierała tylko 1 ml EtOH bez muchy do kontroli ujemnych.</li>
	<li>Zmontuj każdą komorę groomerską, przykręcając przesuwną górną płytę (z mniejszymi otworami), ale pozostawiając dolną płytę (z większymi otworami) zdjętą w celu dodania kurzu.</li>
	<li>Umieść każdą niezbędną komorę groomerską płasko na stole górną stroną do dołu. Strona wejściowa muchy jest zakryta.</li>
	<li>Załaduj 5 mg podwielokrotności barwnika Brilliant Yellow do każdej komory, stukając rurką o powierzchnię komory powyżej żądanej studzienki. Uderz komorą o stół, aby upewnić się, że cały kurz spadnie przez siatkę na górną płytę.</li>
	<li>Przykręć dolną płytę do każdej komory tak, aby szersze końce stożkowych otworów były skierowane na zewnątrz, a otwory nie spoczywały nad studzienkami. Mocno dokręć dolną płytę, aby się nie ślizgała i nie uwalniała barwnika.</li>
	<li>Odwróć komorę i kilkakrotnie uderz nią płasko o stół, tak aby kurz spadł przez siatkę i spoczęł na dolnej płycie.</li>
	<li>Wsuń górną płytę komory do "pozycji otwartej" tak, aby małe otwory zrównały się z piętnastoma studzienkami, umożliwiając wprowadzenie much do poszczególnych studzienek.</li>
</ol>
2. Odkurzanie i pielęgnacja
<ol>
	<li>Załaduj jedną muchę do aspiratora do ust, delikatnie zasysając jeden koniec aspiratora, tak jakby używał słomki. Umieść muchy, lekko i kierując otwór w stronę celu.</li>
	<li>Odessać jedną muchę do każdej studzienki użytej w eksperymencie. Po załadowaniu studni należy przesunąć górną płytę tak, aby mucha została uwięziona w komorze i umieścić taśmę na otworze tej studni podczas ładowania całej komory, aby zapobiec ucieczce muchy podczas ładowania innych studni. Jeśli wiele much zostanie zassanych do jednej studzienki, pozostaw ten otwór otwarty, aż pozostanie tylko jedna mucha.</li>
	<li>Po napełnieniu wszystkich niezbędnych studzienek muchami, odwróć komorę tak, aby dolna płyta była skierowana do góry, tak aby pył mógł pokryć muchy, spadając przez siatkę.</li>
	<li>Mocno dokręć górną i dolną płytę, dokręcając, a następnie obracaj komorę, aby odkurzyć muchy przez 4 sekundy.</li>
	<li>Dwukrotnie uderz komorą (górną płytą zadrukowaną do dołu) o stół, aby barwnik wpadł na drugą stronę. Następnie odwróć komorę (górna płyta skierowana do góry) i dwukrotnie uderz komorę, aby upewnić się, że barwnik osiada na podłodze dolnej komory, z dala od muchy trzymanej w górnej komorze.</li>
	<li>W przypadku much kontrolnych, które nie mogą być pielęgnowane, należy natychmiast przejść do kroku 3 protokołu. W przypadku much, które ukończą test, przejdź do kroku 2.7.</li>
	<li>Oprzyj komorę płasko na stole lub blacie z górną płytą skierowaną do góry przez trzydzieści minut, aby muchy mogły się oczyścić. Umieść komorę w miejscu wolnym od hałasu i wibracji, aby utrzymać stałe środowisko dla wszystkich eksperymentów pielęgnacyjnych (poziom oświetlenia, wilgotność i temperatura). Idealny jest inkubator stołowy o temperaturze pokojowej lub 25 °C z kontrolą wilgotności.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbek i analiza absorbancji
<ol>
	<li>Trzymając komorę poziomo z górną płytą do góry, delikatnie odkręć dolną płytę i wyjmij ją z komory, uważając, aby nie stracić barwnika.</li>
	<li>Umieść komorę na podkładce Fly CO2 o niskim przepływie powietrza, aż muchy zostaną znieczulone.</li>
	<li>Odkręć górną płytę od komory. Ostrożnie użyj kleszczy, aby złapać nogę i przenieść jedną zakurzoną muchę z każdej komory i umieścić ją w 1,5 ml probówce mikrowirówkowej zawierającej EtOH. Czas transferu dla 15 komór z których każda zawiera jedną muchę wynosi około 3-5 minut. Eksperymentatorzy powinni wziąć pod uwagę czas transferu, jeśli/podczas rozłożenia eksperymentów w czasie z wieloma komorami, aby zapewnić efektywne przeprowadzanie eksperymentów.</li>
	<li>Gdy każda probówka do mikrowirówki zawiera 1 muchę, zamknij nakrętkę i odwróć probówkę trzy razy, aby wymieszać i wymieszać roztwór barwnika i etanolu.</li>
	<li>Inkubować probówki zawierające etanol i muchy przez 5 godzin w temperaturze pokojowej, aby zapewnić całkowite usunięcie barwnika z muchy do roztworu. Po upływie 5 godzin krótko zmieszaj każdą rurkę (2 s), aby upewnić się, że barwnik jest usuwany z much.</li>
	<li>Porcję 50 μl eksperymentalnej probówki o pojemności 1,5 ml do studzienki z 96-dołkową płytką, jeśli jest dostępna, zwracając uwagę na położenie każdej próbki na płytce. Dodać 200 μl EtOH w celu rozcieńczenia próbki 5x. Rozcieńczenie pozwala uniknąć efektu sufitu mocno zakurzonych much lub dużych wad pielęgnacyjnych.</li>
	<li>Za pomocą czytnika płytek przeanalizować każdą próbkę przy długości fali 397 nm. Alternatywnie, jeśli czytnik płytek jest niedostępny, należy zmierzyć absorbancję dla pojedynczych próbek i ślepych prób za pomocą standardowego spektrofotometru w widmie widzialnym.</li>
	<li>Odczytaj i zapisz próbkę za pomocą czytnika płytek i zapisz arkusz kalkulacyjny z nagranymi próbkami na płytce.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja wyników
<ol>
	<li>Skompiluj wyniki dla wszystkich próbek i zmierz wariancję dla każdego genotypu lub stanu. 
	UWAGA: Akumulacja barwnika w czasie 0 min i w czasie 30 min jest traktowana jako odrębne warunki przy użyciu analizy statystycznej za pomocą jednoczynnikowej ANOVA i poprawki Bonferroniego lub innych poprawek dla wielu porównań równoległych.</li>
	<li>Obliczyć procentową różnicę w pielęgnacji dla każdego genotypu/stanu, stosując następujące równanie: [(średnia wartość akumulacji barwnika w czasie 0' - średnia wartość akumulacji barwnika w czasie 30') / średnia wartość akumulacji barwnika w czasie 0] x 100.</li>
	<li>Wyraź wartość procentową dla każdego genotypu i warunku na wykresach słupkowych i porównaj różne genotypy i warunki.</li>
</ol>

<ol><li>Szebenyi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003347269800060">Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster.</a> Animal. Behaviour. 17, (1969).</li>
<li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+and+dishabituation+of+a+cleaning+reflex+in+normal+and+mutant+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila.</a> J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).</li>
<li>Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hygienic+grooming+is+induced+by+contact+chemicals+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).</li>
<li>Dawkins, R., Dawkins, M. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=GB19770205092">Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies.</a> Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).</li>
<li>Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951(2014).</li>
<li>King, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromin+Loss+of+Function+Drives+Excessive+Grooming+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22G3-Genes+Genomes+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila.</a> G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).</li>
<li>Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Levels+of+the+Vesicular+Monoamine+Transporter+and+a+Novel+Repetitive+Behavior+in+the+Drosophila+Model+of+Fragile+X+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome.</a> Plos One. 6 (11), e27100(2011).</li>
<li>Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+bisphenol+A+on+Drosophila+melanogaster+behavior--a+new+model+for+the+studies+on+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders.</a> Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).</li>
<li>Chang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+Drosophila+vesicular+monoamine+transporter+increases+motor+activity+and+courtship+but+decreases+the+behavioral+response+to+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine.</a> Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).</li>
<li>Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+sexually+dimorphic+behavioral+responses+to+biogenic+amines+in+decapitated+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).</li>
<li>Feng, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+characterization+of+a+novel+dopamine+receptor+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster.</a> Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).</li>
<li>Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7953290">Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5).</a> Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).</li>
<li>Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAMB%2C+a+novel+dopamine+receptor+expressed+specifically+in+Drosophila+mushroom+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).</li>
<li>Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Primordial+Dopamine+D1-Like+Adenylyl+Cyclase-Linked+Receptor+from+Drosophila-Melanogaster+Displaying+Poor+Affinity+for+Benzazepines%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Letters%22%5BJournal%5D)">A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines.</a> Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).</li>
<li>Pitmon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+D1+family+dopamine+receptor%2C+DopR%2C+potentiates+hind+leg+grooming+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila.</a> Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).</li>
<li>Phillis, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mutations+affecting+neural+circuitry+required+for+grooming+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).</li>
<li>Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+command+circuit+for+grooming+movement+control%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A neural command circuit for grooming movement control.</a> Elife. 4, e08758(2015).</li>
<li>Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+analysis+of+single+neurons+to+correlate+synaptic+connectivity+with+grooming+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior.</a> Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Test pielęgnacji jest stosunkowo prosty, ale ostrzegamy eksperymentatorów, aby zwrócili szczególną uwagę na następujące kwestie. Utrzymanie szczelnego uszczelnienia poprzez dokręcenie na górnej i dolnej płycie po wprowadzeniu muchówek i barwnika ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania powtarzalnych wyników. Barwnik Brilliant Yellow jest bardzo drobny, a luźne spoiny pozwolą na utratę barwnika z krawędzi komory. Nieregularność zawartości barwnika w każdym dołku może łatwo zaburzyć kwantyfikację pielęgnacji, ponieważ nierówn...

Pielęgnacja u Drosophila melanogaster (D. melanogaster ) to silne wrodzone zachowanie, które obejmuje koordynację wielu niezależnych programów motorycznych1. Muszki owocowe oczyszczają swoje ciała z kurzu, drobnoustrojów i innych patogenów, które mogą hamować normalne funkcje fizjologiczne, takie jak widzenie i latanie, lub prowadzić do poważnych problemów immunologicznych. Wyczuwając i reagując zarówno na mechaniczny2, jak i immune activation3, muchy powtarzalnie pocierają nogami o siebie lub o wybrany obszar ciała, dopóki nie będzie wystarczająco czysty, a pielęgnacja przejdzie do innej części ciała. Muchy wykonują ruchy pielęgnacyjne w różnych atakach, które w dużej mierze występują w stereotypowych wzorcach1,4. Hierarchia zachowań staje się widoczna, gdy sygnały dotyczące pielęgnacji są traktowane priorytetowo. Obwody i wzorce aktywności zostały zidentyfikowane na poparcie modelu, w którym programy pielęgnacyjne na szczycie hierarchii występują jako pierwsze i tłumią równoległe sygnały z obszarów ciała, które są następnie pielęgnowane5. Najwyższy priorytet ma głowa, następnie brzuch, skrzydła, a na końcu klatka piersiowa5.
Program pielęgnacyjny u D. melanogaster to idealny system do badania obwodów neuronalnych, modulacyjnych sygnałów molekularnych i neuroprzekaźników. Na przykład, upośledzenie funkcji neurofibrominy6, utrata białka upośledzenia umysłowego Drosophila fragile X (dfmr1)7, oraz narażenie na bisfenol A (BPA)8 powodują nadmierną pielęgnację i inne zachowania, które są analogiczne do dyskretnych ludzkich objawów nerwiakowłókniakowatości, zespołu łamliwego chromosomu X oraz aspektów zaburzeń ze spektrum autyzmu i zespołu nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi (ADHD). Zachowania związane z pielęgnacją mogą być również przyzwyczajone w różny sposób u różnych zmutowanych szczepów2, co nadaje ten program motoryczny do badań nad plastycznością behawioralną. Zakres zjawisk neurologicznych, które mogą być modelowane przez Drosophila, wymaga nowatorskiego podejścia porównawczego do pomiaru zdolności much do samodzielnej pielęgnacji.
Wykazano, że połączone działanie pęcherzykowych transporterów monoamin oraz względna obfitość dopaminy i innych amin biogennych w organizmie pośredniczą w zachowaniu pielęgnacyjnym muszek owocowych 9,10. Oktopamina i dopamina stymulują porównywalną aktywność pielęgnacyjną tylnych nóg u zdekapitowanych muszek, podczas gdy tyramina, prekursor oktopaminy, również w mniejszym stopniu wyzwala pielęgnację7. U D. melanogaster11,12,13,14. Korzystając z metody testu pielęgnacyjnego opisanej w tym protokole, określiliśmy rolę DopR receptora dopaminy rodziny typu I (DopR, dDA1, dumb) w zachowaniu pielęgnacji tylnych nóg15.
Pielęgnacja może być pośrednio określona ilościowo, patrząc na stopień czystości, dzięki któremu zwierzę może w pełni oczyścić się po opyleniu całego ciała barwnikiem markerowym lub pyłem fluorescencyjnym5,16. Pozostała część pyłu pozostawiona na ciele może być wykorzystana jako względny marker dla ogólnego zachowania. Zakurzone muchy po zapewnieniu im wystarczającej ilości czasu na pielęgnację mogą przejawiać specyficzny deficyt w zachowaniu pielęgnacyjnym. W miarę jak badania nad uwodzeniem stawały się coraz bardziej rozległe, protokoły obejmowały takie praktyki, jak dekapitacja w celu dodania leczenia farmakologicznego na nerwy łączne szyi10, stymulacja dotykowa szczeciny w celu wywołania reakcji pielęgnacji2 oraz nagrywanie wideo zachowania15. Bezpośrednia obserwacja pielęgnacji może być łatwo badana, korzystając z obserwacji wizualnej i ręcznie rejestrując częstotliwość i czas trwania określonych zdarzeń pielęgnacyjnych4.
Zaprojektowaliśmy piętnastostudniową komorę do pielęgnacji, którą można zbudować za pomocą drukarki 3D lub wycinarki laserowej, a projekty planów są dostępne do reprodukcji15. W konstrukcji zastosowano dwie połączone płyty centralne z otworami dopasowanymi i oddzielonymi siatką oraz dwie dodatkowe przesuwne płyty górne i dolne, z których ładowane są odpowiednio muchy i/lub barwnik. Po pozostawieniu zakurzonym muchom czasu na oczyszczenie, umieszczamy je w etanolu w celu rozpuszczenia barwnika i mierzymy absorbancję tego roztworu na długości fali barwnika. Czytnik płytek może być używany do wielu równoległych próbek lub spektrofotometr z pojedynczym odczytem może być używany do pojedynczych próbek. Metoda ta minimalizuje błędy wywołane obsługą i pozwala na przeprowadzanie testów pielęgnacyjnych na mniejszą, ekonomiczną skalę. Ta metoda wywodzi się i jest modyfikowana z metod zapoczątkowanych przez Julie Simpson i Andrew Seedsa, którzy używają większych komór groomerskich z elementami grzejnymi do manipulacji obwodami wrażliwymi na temperaturę5. Poniższy protokół przedstawia ilościowe określenie pielęgnacji całego ciała, a także pokazuje alternatywne metody ilościowego oznaczania akumulacji barwnika na poszczególnych częściach ciała. Przedstawiamy również przykładowe dane porównawcze mutantów WT i DopR, a także metody obliczania prostego wskaźnika wydajności dla zachowań pielęgnacyjnych.

<table><tbody><tr><td>Przezroczysta rurka PVC High-Flex Tygon</td><td>McMaster-Carr</td><td>5229K54</td><td>ID 1/8", OD 1/4", używana z końcówkami do mikropipet i siatką do budowy aspiratorów do ust Końcówki</td></tr><tr><td>do mikropipet (1 ml i 200 &#956; L)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>24-165, 24-150R</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh Screen, 2 x 2,6 "</td><td>McMaster-Carr</td><td>9318T44</td><td>Służy do budowy komory groomerskiej i aspiratorów do ust</td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Roboz</td><td>RS-5050</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Yellow Dye</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201375-25G</td><td>Zalecamy używanie rękawic nitrylowych podczas pracy z tym produktem</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td>zestaw do "dotyku"</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>86-1282</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml VWR</td><td>International</td><td>10025-726</td><td></td></tr><tr><td>0,65 ml</td> Probówki <td>VWR International</td><td>20170-293</td><td>mogą być ponownie użyte z kolejnymi testami</td></tr><tr><td>Płytka UV 96-dołkowa</td><td>Corning</td><td></td><td></td>26014017</tr><tr><td>BioTek Synergy HTX Platereader</td><td>BioTek</td><td>musi pobrać katalog, aby uzyskać dostęp do numeru produktu</td><td></td></tr><tr><td>http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview Gen5 Czytnik mikropłytek i oprogramowanie do imagerów</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI.. ql4M2LoZBEhcBljvIA)()</td></tr><tr><td>Drosophila Inkubator</td><td>Tritech</td><td>DT2-CIRC-TK</td><td></td></tr><tr><td>1/4" akryl plastikowy</td><td>McMaster-Carr</td><td>8473K341</td><td></td></tr><tr><td>8 - 32 nakrętki</td><td>McMaster-Carr</td><td>90257A009</td><td></td></tr><tr><td>8 - z sześciokątnym 32 x 1"</td><td>McMaster-Carr</td><td>92185A199</td><td>dolna płyta musi być nagwintowana pod tego rozmiaru</td></tr><tr><td>8 - 32 x z sześciokątnym 1/2"</td><td>McMaster-Carr</td><td>92185A194</td><td>druga płyta od góry musi być gwintowana</td></tr><tr><td>2 - 56 3/8 "maszynowe z płaskim</td><td>McMaster-Carr</td><td>91500A088</td><td>utrzymują dwie środkowe płyty razem</td></tr><tr><td>0,175 "ID, 1/4" OD, 0,34" rura aluminiowa</td><td>McMaster-Carr</td><td>92510A044</td><td>Wyprodukowane we własnym zakresie; Podany produkt ma w przybliżeniu takie same wymiary i powinien działać ze o rozmiarze 8.&nbsp; Działają one jak osłony na 1" i lekko odsuwają nasadkę sześciokątną od powierzchni górnej płyty</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja zachowań pielęgnacyjnych drosophila

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Zachowanie pielęgnacyjne Drosophila to złożony, wieloetapowy program lokomotoryczny, który wymaga skoordynowanych ruchów zarówno przednich, jak i tylnych kończyn. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu pielęgnacyjnego i nowatorski projekt komory, który jest opłacalny i skalowalny zarówno dla małych, jak i dużych badań nad pielęgnacją Drosophila. Muchy są spraszane całym ciałem barwnikiem Brilliant Yellow i mają czas na usunięcie barwnika z ich ciał w komorze. Muchy są następnie osadzane w ustalonej objętości etanolu w celu rozpuszczenia barwnika. Mierzy się i rejestruje względną absorbancję spektralną próbek barwnika i etanolu dla zwierząt pielęgnowanych i niepielęgnowanych. Protokół dostarcza danych ilościowych dotyczących akumulacji barwnika dla poszczególnych muszek, które można łatwo uśrednić i porównać między próbkami. Dzięki temu projekty eksperymentalne mogą łatwo ocenić zdolność do pielęgnacji na potrzeby badań na zmutowanych zwierzętach lub manipulacji obwodami. Ta wydajna procedura jest zarówno wszechstronna, jak i skalowalna. Pokazujemy przepływ pracy protokołu i dane porównawcze między zwierzętami WT a zwierzętami zmutowanymi dla receptora dopaminy Drosophila typu I (DopR).

Test szczotkowania daje dane ilościowe umożliwiające ocenę wydajności behawioralnej na podstawie ilości pozostałości zgromadzonego barwnika pozostającego na ciałach much po ustalonym czasie pomiaru szczotkowania (30 min). Przykładowe obrazy konstrukcji komory szczotkowania z przesuwanym pokryciem oraz kluczowe etapy testu przedstawiono na ryc. 1. Muchy gromadzą znaczną ilość barwnika bezpośrednio po wysypaniu poprzez wortexowanie w obecności barwnika (ryc. 2d, 2e<...

Ten protokół opisuje skalowalną technikę indywidualnego testowania pielęgnacji u Drosophila, która dostarcza solidnych, ilościowych danych do pomiaru zachowań związanych z uwodzeniem. Metoda opiera się na porównaniu różnicy w akumulacji barwnika na ciałach zwierząt niepielęgnowanych i pielęgnowanych w określonym czasie.

Kwantyfikacja zachowań pielęgnacyjnych Drosophila

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Ogólnym celem tej metody jest pomiar zachowań pielęgnacyjnych u Drosophila poprzez ilościowe określenie i porównanie pozostałości żółtego barwnika Brilliant Yellow na ciele zwierząt w warunkach pielęgnacyjnych i niepielęgnacyjnych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii i genetyki behawioralnej, takie jak koordynacja precyzyjnych umiejętności lokomocyjnych oraz powiązane z nimi regulatory molekularne i obwody neuronalne. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona szybka, odporna na błędy i łatwa do przeprowadzenia przez wielu eksperymentatorów i studentów o różnym stopniu zaawansowania.Procedurę tę zademonstruje Frankie Barradale, student w moim laboratorium. Aby rozpocząć eksperyment, należy przygotować aspirator do przeniesienia żywych Drosophila z fiolki hodowlanej do komory pielęgnacyjnej. Za pomocą nożyczek odetnij 1,5 stopy rurki Tygon.Odetnij co najmniej 2,5 cm końcówki jednorazowej mikropipety o pojemności 1 ml i przyłóż kwadratowy kawałek siatki o boku 1 cm do otworu odciętej końcówki. Ściśle nałóż nową końcówkę mikropipety o pojemności 1 ml na siatkę i odciętą końcówkę, aby stworzyć komorę utrzymującą muchy. Odetnij sam czubek n

quantification-of-drosophila-grooming-behavior

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Drosophila melanogaster to genetycznie i behawioralnie podatny system modelowy, który od ponad wieku jest wykorzystywany do zrozumienia molekularnych i komórkowych podstaw wielu ważnych procesów biologicznych 1. Drosophila została szeroko wykorzystana w celu uzyskania wglądu w genetyczne podstawy zachowania much.

Metody oceny zachowania Drosophila

Ten film opisuje jedną z metod budowy aspiratora much, który może być używany do przenoszenia owadów między pomieszczeniami bez znieczulenia. Aspirator w przykładowym protokole został przygotowany do eksperymentu mającego na celu ilościowe określenie indywidualnych zachowań...

Rurka aspiratora much: proste narzędzie do przenoszenia żywych Drosophila

Automatyczny system śledzenia Flywalk jest używany do wysokorozdzielczego oznaczania ilościowego zachowania kierowanego zapachem u Drosophila melanogaster.

Kwantyfikacja zachowania kierowanego zapachem w wysokiej rozdzielczości u Drosophila melanogaster przy użyciu paradygmatu Flywalk

Aby zidentyfikować nowe mutacje wpływające na mechanosensację, zaprojektowaliśmy test, który mierzy reakcję behawioralną na stymulację dotykową szczeciny muchy u zmutowanych klonów generowanych metodą MARCM. Połączenie technik pozwala na identyfikację mutacji mechanowrażliwych, które w przeciwnym razie byłyby śmiertelne.

Test behawioralny do mechanosensacji klonów opartych na MARCM u Drosophila melanogaster

Ten artykuł opisuje test behawioralny, który wykorzystuje popęd godowy samców u Drosophila melanogaster do badania motywacji. Korzystając z tej metody, naukowcy mogą wykorzystać zaawansowane techniki neurogenetyczne much, aby odkryć mechanizmy genetyczne, molekularne i komórkowe, które leżą u podstaw tej motywacji.

Pomiar i zmiana popędu godowego u samca Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje test uczenia się i zapamiętywania u Drosophila zwany warunkowaniem zalotów. Ten klasyczny test opiera się na zmniejszeniu zachowań związanych z zalotami samców po odrzuceniu seksualnym przez niepodatną samicę z premfetem. Ta naturalna forma plastyczności behawioralnej może być wykorzystana do testowania uczenia się, pamięci krótkotrwałej i pamięci długotrwałej.

Drosophila Warunkowanie zalotów jako miara uczenia się i pamięci

Ta praca opisuje prosty paradygmat behawioralny, który pozwala na analizę awersyjnego uczenia się asocjacyjnego u dorosłych muszek owocowych. Metoda opiera się na tłumieniu wrodzonego negatywnego zachowania geotaksji ze względu na związek powstały między określonym kontekstem środowiskowym a porażeniem prądem.

Drosophila Pasywne zachowanie unikające jako nowy paradygmat badania awersyjnego uczenia się awersyjnego

Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) wiąże się z zaburzeniami zachowań społecznych i komunikacyjnych oraz pojawieniem się powtarzających się zachowań. W celu zbadania wzajemnych relacji między genami ASD a deficytami behawioralnymi w modelu Drosophila, w tym artykule opisano pięć paradygmatów behawioralnych do oceny odstępów społecznych, agresji, zalotów, pielęgnacji i zachowań habituacyjnych.

Paradygmaty oceny behawioralnej w modelu zaburzenia ze spektrum autyzmu Drosophila

Modele gryzoni są cennymi narzędziami do badania podstawowych zachowań związanych z zaburzeniami ze spektrum autyzmu (ASD). W tym artykule wyjaśniamy dwa testy behawioralne do modelowania podstawowych cech ASD u myszy: samopielęgnację, który ocenia powtarzające się zachowanie, oraz trzykomorowy test interakcji społecznych, który dokumentuje upośledzenia społeczne.

Strategie oceny zachowań podobnych do autystycznych u myszy

Metoda przedstawiona tutaj polega na ręcznym dodawaniu adnotacji do materiału filmowego pozyskanego z Drosophila melanogaster pod kątem określonych zachowań pielęgnacyjnych. Pozwala to na ilościowe określenie zarówno liczby napadów pielęgnacji, jak i całkowitego czasu spędzonego na pielęgnacji w celu oceny nietypowych fenotypów samodzielnej pielęgnacji.

Kwantyfikacja zachowań pielęgnacyjnych Drosophila melanogaster w celu oceny nadmiernych fenotypów pielęgnacyjnych

Naucz się kwantyfikacji zachowań pielęgnacyjnych Drosophila przy użyciu barwnika. Ta metoda pozwala badać koordynację ruchów i regulatory molekularne w neurobiologii oraz genetyce behawioralnej.

Kwantyfikacja zachowań pielęgnacyjnych Drosophila

Przeglądaj więcej filmów