Wykorzystanie modeli wirusa grypy pręgowanej u ludzi do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych i scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza

Ogólnym celem tych procedur jest wykorzystanie rybek zebrafish jako modelu grypy do badania odpowiedzi immunologicznej gospodarza na infekcję wirusową oraz do przesiewu związków przeciwwirusowych. Metody te mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie grypy, takie jak rola fagocytów w odporności i zapaleniu podczas infekcji oraz skuteczność potencjalnych terapii przeciwwirusowych. Model grypy u rybek zebrafish pozwala na rozwiązanie wcześniej niezadanych pytań dzięki przejrzystości optycznej rozwijających się organizmów oraz możliwości przeprowadzania analiz o średniej i wysokiej przepustowości.

Po przygotowaniu odczynników i doprowadzeniu embrionów do pożądanego stadium zgodnie z protokołem tekstowym, w dniu eksperymentu należy użyć pęsety nr 5 do usunięcia błony chorionowej z embrionów. W przypadku użycia wirusów APR-8 lub X31, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy rozcieńczyć wirusy do stężenia 3,3 × 10⁶ ID₅₀ w sterylnym, schłodzonym w lodzie PBS uzupełnionym o 0,25% czerwieni fenolowej. W przypadku użycia szczepu NS1-GFP, wirusa należy rozcieńczyć do stężenia około 1,5 × 10² PFU na nanolitr.

Jednocześnie przygotuj kontrolę zawierającą płyn allantois z niezarażonych jaj kurzych, rozcieńczony w sposób analogiczny do wirusa. Następnie, za pomocą końcówek do mikrodoładowywania, pipetuj roztwór wirusa do igieł do mikroiniekcji i umieść igłę w odpowiednim uchwycie aparatu do iniekcji. Po przycięciu igły zgodnie z protokołem tekstowym, dostosuj ustawienia ciśnienia i czasu w inżektorze ciśnieniowym lub ponownie przytnij końcówkę igły, aż do uzyskania pożądanej objętości iniekcji.

Po znieczuleniu zarodków należy za pomocą plastikowej pipety przenieść od 10 do 20 zarodków na płytkę z dwuprocentową agarozą, a następnie odessać nadmiar cieczy pipetą. Pod stereomikroskopem, używając wypalanej i uszczelnionej kapilary z borokrzemowego szkła, należy delikatnie wyrównać i zorientować zarodki tak, aby przewód Cuviera lub tylna żyła główna znajdowały się w jednej linii z igłą do mikroiniekcji. Aby przeprowadzić mikroiniekcję IAV, należy delikatnie wprowadzić igłę do mikroiniekcji do przewodu Cuviera lub tylnej żyły głównej.

Następnie należy nacisnąć pedał nożny, aby wstrzyknąć pożądaną objętość IAV do układu krążenia zarodka. Aby uzyskać infekcję systemową, kluczowe jest, aby bolus wstrzykniętego materiału został wchłonięty do krwiobiegu i rozprowadzony po całym organizmie. Jeśli bolus gromadzi się w miejscu wstrzyknięcia, należy wycofać zarodek z eksperymentu i go eutanizować.

Pięć dni po zapłodnieniu przygotować igły zgodnie z opisem z wcześniejszej części tego filmu. Ustawić larwy TG MPX mCherry z nadmuchanymi pęcherzami pławnikowymi w sposób zaprezentowany powyżej, z wyjątkiem tego, że larwy należy pozycjonować tak, aby igła mogła przebić pęcherz pławnikowy, a wirus mógł zostać wprowadzony do jego tylnej części. Delikatnie wprowadzić igłę do mikroiniekcji do pęcherza pławnikowego i wstrzyknąć pożądaną objętość w kierunku tylnej części narządu.

Roztwór do wstrzyknięcia powinien gromadzić się w części tylnej, a pęcherzyk powietrza w pęcherzu pławowym powinien zostać przesunięty do przodu. Aby doprowadzić do infekcji pęcherza pławowego, kluczowe jest, aby bolus wstrzykniętego roztworu gromadził się w tylnej części pęcherza pławowego, co spowoduje przesunięcie pęcherzyka powietrza do przodu. Ekspresja GFP powinna stać się widoczna już trzy godziny po wstrzyknięciu.

Po zakończeniu iniekcji, w tym z użyciem roztworów kontrolnych, przenieś larwy do naczyń Petri zawierających sterylną wodę do jaj i inkubuj ryby w temperaturze 33 °C. Aby przeprowadzić leczenie lekami przeciwwirusowymi, w trzeciej godzinie po infekcji wymień wodę do jaj u ryb zainfekowanych NS1-GFP oraz ryb kontrolnych na sterylną wodę zawierającą 0, 16,7 lub 33,3 ng/mL Zanamiviru. Od 24 do 48 godzin po iniekcji zacznij zapisywać obserwacje dotyczące dynamiki infekcji w odniesieniu do patologii choroby, w tym objawów letargu i oznak obrzęków, różnic w pigmentacji, deformacji oczu i czaszki oraz lordozy.

Przez pięć dni po zakażeniu, co 24 godziny, należy odnotować liczbę martwych, chorych oraz zdrowych larw. Dane należy przedstawić na wykresie słupkowym skumulowanym, gdzie na osi Y naniesie się procenty ryb zdrowych, chorych lub martwych, a na osi X grupy traktowane. W celu zamocowania danio pręgowanego do obrazowania, pojedynczą transgeniczną larwę MPX mCherry zakażoną NS1-GFP należy przenieść do studzienki szklanej płytki 24-dołkowej i dodać małą kroplę wody z jaj.

Powtórz procedurę z pozostałymi rybami z grup kontrolnej oraz zakażonej IAV. Do każdej studni powoli dodaj jeden procentowe podłoże do montowania zarodków z agarozy, uważając, aby nie wprowadzić dużych pęcherzyków powietrza. Delikatnie skoryguj położenie larwy tak, aby każda z nich była zamontowana na boku.

Po stężeniu agarozy, należy delikatnie wypełnić poszczególne dołki wodą z jajami zawierającą 200 µg/L tricainy. Za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 20x skupionym na pęcherzu pławnym, należy zarejestrować serię obrazów z-stack w jasnym polu i fluorescencji. Następnie należy określić i porównać liczbę neutrofili pozytywnych pod kątem MPX mCherry obecnych w pęcherzach pławnych danego gatunku zebrafish zainfekowanych IAV oraz w grupie kontrolnej po wstrzyknięciu.

Przedstawione tutaj dane obrazują, w jaki sposób systemowa infekcja IAV u danio pręgowanego może być wykorzystana do testowania skuteczności leków. Zarodki w 48 HPF zostały poddane iniekcji APR8, X31 lub NS1-GFP przez przewód Cuviera w celu zainicjowania infekcji wirusowej. Zarodki służące jako kontrole infekcji wirusowej zostały poddane iniekcji w 48 HPF.

W 48. godzinie po zakażeniu u rybek danio-ostrobramnych wstrzykniętych z IAV pojawiły się objawy obrzęku osierdziowego oraz zatrzymania krążenia, z obecnością erytrocytów w całym osierdziu. U zainfekowanych ryb niepoddanych działaniu zanamiwiru w systemowej ekspresji GFP zaobserwowano cechy obrzęku. Zmniejszone zmiany patologiczne w fluorescencji GFP odnotowano u larw zainfekowanych NS1-GFP poddanych działaniu zanamiwiru.

W tym eksperymencie z wykorzystaniem modelu miejscowej infekcji pęcherza pławnego danio-ostrosejnika, wirus NS1-GFP został wstrzyknięty do pęcherzy pławnych transgenicznych larw MPX mCherry w piątym dniu po zapłodnieniu, a następnie monitorowano rekrutację neutrofilów oznakowanych białkiem mCherry do pęcherza pławnego. W 20. godzinie po infekcji zaobserwowano znaczną migrację neutrofilów do pęcherzy pławnych ryb zainfekowanych IAV w porównaniu z grupą kontrolną wstrzykiwaną PBS, co wskazuje, że IAV potrafi rekrutować neutrofile do pęcherza pławnego, podobnie jak rekrutuje je do ludzkich płuc. Znaczenie tych technik rozciąga się na terapie przeciwwirusowe, ponieważ mają one potencjał do ujawnienia kluczowych informacji na temat interakcji gospodarza z wirusem grypy A lub IAV, co w ostateczności może znaleźć zastosowanie w klinice.

Należy pamiętać, że praca z wirusem grypy może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, w tym szczepień oraz stosowania odpowiednich środków ochrony indywidualnej (PPE).