Name: Szybkie wytwarzanie delecji u grzybów za pośrednictwem Agrobacterium transformacji konstruktów delecji OSCAR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Poznaj metodę OSCAR do szybkiego tworzenia delecji genów u grzybów za pomocą transformacji Agrobacterium. Ta technika umożliwia precyzyjne badanie funkcji genów w gatunkach grzybów z efektywnym systemem rekombinacji homologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują następującym studentom studiów licencjackich i licealnych za ich pracę nad wygenerowaniem mutantów OSCAR w Fusarium verticillioiodes: Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez, Ashli Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum, Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin, Thi Ngoc Le i Angel Pham.

1. Projekt startera do amplifikacji PCR boków genów
<ol>
	<li>Pobierz do pliku edytora tekstu region genomowy genu będącego przedmiotem zainteresowania (GOI), w tym otwartą ramkę odczytu (ORF) i co najmniej 2 kb flankujące gen z każdej strony, z FungiDB lub innego zasobu danych genomowych.</li>
	<li>Podświetl ORF przeznaczony do usunięcia i oznacz kodony start i stop.</li>
	<li>Zidentyfikuj i podświetl sąsiednie ORF-y w pobranej sekwencji.</li>
	<li>Użyj końca 2 kb 5' ORF GOI i narzędzia do projektowania startera (patrz Lista materiałów), aby zaprojektować parę starterów PCR O1 i O2 w celu wygenerowania iloczynu o minimalnym rozmiarze 1 kb. Uważaj, aby nie wpływać na sąsiednie ORF-y.
	<ol>
		<li>Wklej bok o długości 2 kb 5' w oknie "Wprowadzanie sekwencji". Kliknij pole "Pokaż parametry niestandardowe". Wprowadź następujące niestandardowe parametry projektowe: podkład TM 58 (min), 60 (opcjonalnie) i 62 (maks.); Grunt GC 40 (min), 50 (opcjonalnie) i 60 (maks.); Rozmiar podkładu 22 (min), 24 (opcjonalnie) i 26 (maks.); Rozmiar amplikonu 1250 (min), 1500 (opcjonalnie) i 2000 (maks.).</li>
		<li>Wybierz wynik, który umieszcza odwrócony starter (O2) najbliżej ORF. Uchwyć zrzut ekranu testów, a następnie skopiuj i wklej sekwencje elementarne do dokumentu edytora tekstu.</li>
		<li>Powtórz proces dla flanki 3', aby wygenerować startery O3 i O4, tym razem wybierz wynik, umieszczając przednią spłonkę (O3) najbliżej docelowego ORF.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj odpowiednie miejsca mocowania na końcach 5' podkładów od 1 do 4 (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Należy również zaprojektować i zamówić startery specyficzne dla ORF, które będą używane do potwierdzania usunięcia w sekcji 4 poniżej. Parametry powinny być takie same jak w kroku 1.4.1, z wyjątkiem użycia Amplicon Size 500 (min), 750 (opt) i 1000 (max), dostosowując długość ORF, jeśli to konieczne. Wreszcie, aby potwierdzić homologiczne rekombinanty, wygeneruj startery 5' out i 3' out znajdujące się tuż za bokami chromosomu. Te "wyjściowe" startery będą używane odpowiednio z hygR (210) i hygF (850) (rys. 2).</li>
	<li>Zamów podkłady.</li>
</ol>
2. Produkcja konstrukcji OSCAR
<ol>
	<li>Używając Taq hi-fidelity, przeprowadź dwie reakcje, po jednej dla boków 5' i 3', używając starterów (100 μM) O1 i O2 w jednej reakcji oraz starterów O3 i O4 w drugiej. Mieszanina reakcyjna zawiera: 29,5 μl sterylnej wody destylowanej (SDW), 5 μl 10x LA bufor PCR, 8 μL 2,5 mM mieszaniny dNTP, 5 μL 25 mM MgCl2, 1 μL matrycy (50 ng/μL), 0,5 μL Hi-fidelity Taq, 0,5 μL Primer O1 i 0,5 μL Primer O2 na 5' flank (lub 0,5 μL Primer O3 i 0,5 μL Primer O4 na 3Warunki reakcji należy stosować w następujący sposób: 94 °C przez 1 minutę, następnie 30 cykli po 94 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s, 72 °C przez 2 minuty, następnie końcowe etapy 72 °C przez 5 minut, a następnie utrzymywać w nieskończoność w temperaturze 10 °C.</li>
	<li>Przeprowadzić elektroforezę żelową 0,8% agarozy 1x TAE (40 mM octan Tris pH 8,3, 1 mM EDTA) przez około 125 Vh w standardowym aparacie miniżelowym, aby określić wielkość produktu i względne stężenie. Po zabarwieniu żelu barwnikiem bez etydyny zgodnie z instrukcją producenta. Wizualizacja na oświetlaczu UV.</li>
	<li>Jeśli produkty 5' i 3' flankowe są w mniej więcej równym stężeniu, połącz je i użyj zestawu kolumn powinowactwa (lub PEG wytrącanie 90 μl połączonych produktów PCR, 240 μl buforu TE pH 7,5, 160 μl 30% glikolu polietylenowego PEG8000 30 mM MgCl2) w celu współoczyszczania produktów PCR zgodnie z protokołem producenta. Jeżeli nie mają jednakowego stężenia, należy połączyć cały produkt o niskim stężeniu z oszacowaną równą ilością produktu z reakcji o wyższej wydajności.</li>
	<li>Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć stężenie oczyszczonego DNA.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję BP, mieszając następujące elementy: 1 μl 60 ng/μL pOSCAR, 2 μL 60 ng/μL pA-Hyg-OSCAR, 1 μL 60 ng/μL połączonych boków, 1 μL klonazy. Inkubować przez 16 godzin w temperaturze 25 °C. Zakończyć reakcję przez dodanie 0,5 μl proteinazy K i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Transformacja komórek E. coli o wysokich kompetencjach. Zarówno dostępne na rynku kompetentne ogniwa, jak i kompetentne komórki DH5α CaCl2 domowej produkcji były z powodzeniem stosowane jako biorcy, zgodnie z instrukcjami producenta. Płytka o niskiej zawartości sodu (0,5 g/l NaCl) LB zawierająca 100 μg/ml spektynomycyny (Spec).</li>
	<li>Zidentyfikuj poprawny konstrukt, wykonując minipreps DNA10 kolonii wygenerowanych powyżej. Przeprowadzić podwójne roztwarzanie za pomocą HindIII i KpnI w następujący sposób: odpipetować 5 μl DNA, 2 M każdego enzymu, 2 μL odpowiedni 10x bufor z SDW do całkowitej objętości 20 μL. Powoduje to uwolnienie insertu (ok. 4,5 kb z bokami genu 1,5 kb) z wektora (ok. 7 kb) i nacięcie wszelkich miejsc po bokach, które mogą dać przewidywalne rozmiary pasm.</li>
	<li>Sequence11 wybierz klony wykazujące odpowiedni wzór pasmowania.</li>
</ol>
3. Przemiana za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (ATMT) grzybów
<ol>
	<li>Przekształć szczep Agrobacterium tumefaciens AGL1 za pomocą definicji delecji OSCAR construct12.</li>
	<li>Przekształć grzyba za pomocą AGL1 zawierającego plazmid delecji GOI OSCAR. Aby to zrobić, wykonaj następujące kroki:
	<ol>
		<li>Przygotować zawiesinę zarodników grzybów ze sterylną wodą o stężeniu 2 x 106 zarodników/ml. Określ ilościowo zarodniki na hemocytometrze lub automatycznym liczniku komórek. Umieść 500 μl tego w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Ten zestaw jest przeznaczony dla 4 płyt transformacyjnych.</li>
		<li>Użyj niebieskiej sterylnej jednorazowej pętli, aby dodać łatwo widoczną porcję (powinna pokrywać około 20% średnicy pętli) plazmidu delecyjnego zawierającego AGL1 z 2-3 dniowej pożywki LB-Spec 100 (patrz Lista materiałów dla składu) zawierającej płytki i wymieszać z zawiesiną zarodników. Wirować, aż komórki bakteryjne będą dobrze rozproszone (ok. 5 min średnia prędkość).</li>
		<li>Odpipetować 100 μl zawiesiny conidia-Agro na środek celulozowego filtra membranowego umieszczonego na każdej z czterech 6 cm szalek Petriego zawierających pożywkę do wspólnej uprawy12.</li>
		<li>Rozprowadzić zawiesinę za pomocą sterylnych kulek szklanych (około 4), aby pokryć całą powierzchnię filtra membranowego. Alternatywnie rozprowadzić zawiesinę za pomocą tradycyjnego narzędzia do rozsiewania. Pozostaw filtr membranowy do wyschnięcia w okapie na około 10 minut, owiń folią parafinową. Powtórz kroki 3.2.2 i 3.2.3, aby skonfigurować wiele przekształceń.</li>
		<li>Inkubuj płytkę przez 2 dni w temperaturze pokojowej, odwróconej.</li>
		<li>Przenieść filtr membranowy na 6 cm pożywkę selekcyjną Aspergillus12 płytek zawierających higromycynę B (Hyg) 150 μg/ml, 200 mM cefotaksymu i 100 μg/ml moksaltamu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5-7 dni przed odizolowaniem kolonii odpornych na Hyg.</li>
		<li>Za pomocą sterylnych wykałaczek przenieś przypuszczalne transformanty na 6 cm płytki z agarem ziemniaczano-dekstrozowym (PDA) zawierające 150 μg/ml Hyg, 100 μg/ml kanamycyny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Identyfikacja mutantów usuwanych metodą PCR
<ol>
	<li>Ekstrakcja DNA do PCR z transformantów metodą termolizy13.
	<ol>
		<li>Gdy transformanty utworzą kolonie na PDA z kroku 3.2.7, użyj sterylnej wykałaczki, aby przenieść niewielką ilość (2 mm x 2 mm) grzybni lub komórek drożdży z kolonii do 100 μl roztworu do lizy (50 mM fosforanu sodu, pH 7,4, 1 mM EDTA, 5% glicerolu) w probówce do mikrowirówki.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze 85-90 °C przez 20-30 minut. Przechowywać surowy ekstrakt zawierający genomowe DNA w temperaturze -20 °C do momentu użycia w kroku 4.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić 4 reakcje PCR na transformant, po jednej w każdej w celu wykrycia homologicznej rekombinacji odpowiednio boków 5' i 3', jedną dla wybranego markera (w tym przypadku fosfotransferazy higromycyny) i jedną dla ORF. 
	UWAGA: Zazwyczaj używamy niedrogiego Taq o niskiej wierności do tych reakcji. Warunki reakcji są zgodne z opisem w kroku 2.1 powyżej i zawierają SDW 20 μL, 10x bufor Taq 2,5 μL, dNTPS (10 mM) 0,5 μL, domowej roboty Taq14, 0,5 μL, Primer A (100 μM) 0,5 μL, Primer B (100 μM) 0,5 μL, Template 0,5 μL. Równie dobrze można stosować startery o niższym stężeniu (10 μM).</li>
	<li>Uruchom żel agarozowy (np. 0,8%) produktów PCR. Mutanty delecyjne wytworzą pasmo Hyg, ale nie produkt ORF. Integranty ektopowe pokażą oba pasma. Typ dziki wytworzy tylko pasmo ORF.</li>
	<li>Trwale przechowuj mutanty usuwające (i jeden lub dwa transformatory ektopowe dla kontroli) do wykorzystania w przyszłości. 
	UWAGA: 15% glicerol służy do długoterminowego przechowywania naszych szczepów w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+step+construction+of+Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids+%28OSCAR%29%2C+an+efficient+and+robust+tool+for+ATMT+based+gene+deletion+construction+in+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi.</a> Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Klosterman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+yields+insights+into+niche+adaptation+of+plant+vascular+wilt+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens.</a> PLoS Pathog. 7 (7), (2011).</li>
<li>Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+knockout+in+the+maize+pathogen+Setosphaeria+turcica+using+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation.</a> Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+gene+disruption+methodology+for+the+entomopathogenic+fungus+Metarhizium+robertsii%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii.</a> PloS One. 9 (9), (2014).</li>
<li>Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUBT%2C+a+putative+MFS+transporter%2C+promotes+secretion+of+fusaric+acid+in+the+cotton+pathogen+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+vasinfectum%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum.</a> Microbiology. 161, 875-883 (2015).</li>
<li>Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s13213-015-1055-8">High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora.</a> Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).</li>
<li>Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetic+Screen+for+Pathogenicity+Genes+in+the+Hemibiotrophic+Fungus+Colletotrichum+higginsianum+Identifies+the+Plasma+Membrane+Proton+Pump+Pma2+Required+for+Host+Penetration%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration.</a> PloS One. 10 (5), e0125960(2015).</li>
<li>Chettri, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Regulation+of+dothistromin+toxin+biosyn+by+the+pine+needle+pathogen+Dothistroma+septosporum%3A+a++presented+in+the+partial+fulfilment+of+the+requirements+for+the+degree+of+Doctor+of+Philosophy+%28%29+in+Genetics+at+Massey+University%2C+Manawatu%2C+New+Zealand%22">Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand </a>. , Massey University. Manawatu, New Zealand. (2014).</li>
<li>Chen Zhou,, Yujun Yang,, Jong, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-prep+in+ten+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mini-prep in ten minutes.</a> Biotechniques. 8 (2), 172(1990).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+SciUSA%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhang%2C+CH+%22Agrobacterium+Protocols%22">Agrobacterium Protocols</a>. Wang, K. an 2, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 403-420 (2007).</li>
<li>Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+genomic+DNA+extraction+suitable+for+analysis+of+bulk+fungal+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains.</a> Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).</li>
<li>Pluthero, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+high-activity+Taq+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase.</a> Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).</li>
<li>McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCluskey%2C+K+%22Gene+Expression+Systems+in+Fungi%3A+Advancements+and+Applications%22">Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications</a>. , Springer International Publishing. 361-384 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jednoetapowa konstrukcja plazmidów gotowych do rekombinacji Agrobacterium (OSCAR) została z powodzeniem zastosowana w przypadku stale rosnącej liczby grzybów Ascomycota. Metoda ta powinna być również łatwo stosowana do Basidiomycota i gatunków z innych typów grzybów (z odpowiednimi promotorami napędzającymi selekcjonowane geny markerowe), zakładając, że możliwa jest transformacja za pośrednictwem Agrobacterium i rekombinacja homologiczna. Wygenerowano dodatkowe wektory markerowe, aby zróżnicować wybór z...

Analiza genetyczna to potężna metodologia określania funkcjonalnego znaczenia poszczególnych genów lub kombinacji genów. Standardowym podejściem do zrozumienia roli określonych genów jest produkcja mutantów pojedynczych genów, które nie uległy zmianie w żadnym innym genie. Najpotężniejszym i najmniej potencjalnie mylącym podejściem jest całkowita i precyzyjna delecja otwartej ramy odczytu genu będącego przedmiotem zainteresowania (GOI ORF) bez uszkodzenia jakiejkolwiek innej funkcji genu.
Ponieważ standardowe metody ligacji do generowania plazmidu delecji wymagają wielu etapów, uzasadnieniem dla OSCAR1 było stworzenie szybszego podejścia in vitro. Rysunek 1 przedstawia proces montażu w podejściu OSCAR. Opisana tutaj metoda ma tę zaletę, że łączy szybką budowę pojedynczych wektorów delecji genów w jednej wieloczęściowej reakcji w połączeniu z późniejszą transformacją za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (ATMT). OSCAR jest bardzo szybki i dobrze wypada w porównaniu z innymi strategiami, takimi jak użycie montażu Gibsona w yeast2. Metoda OSCAR jest z powodzeniem stosowana w przypadku kilku gatunków grzybów Ascomycota. Do gatunków tych należą: Fusarium verticillioides (niepublikowany), Verticillium dahliae3, Setosphaeria turcica4, Metarhizium robertsii5, Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum6, Pestalotiopsis microspora7, Colletotrichum higginsianum8 oraz Dothistroma septosporum9 i Sarocladium zeae (niepublikowane).
Ten protokół dostarcza instrukcje krok po kroku dotyczące metody, w tym projektowania startera, amplifikacji PCR z boku, reakcji OSCAR BP, potwierdzenia struktury konstruktu delecyjnego, transformacji Agrobacterium za pomocą konstruktu, a następnie transferu konstruktu delecji opartego na ATMT do komórek grzyba, a na końcu różnicowania mutantów delecji grzybów od tych z ektopowo zintegrowanymi konstrukcjami delecji.

<table><tbody><tr><td>Baza danych FungiDB</td><td></td><td></td><td>/ http://fungidb.org/fungidb/</td></tr> <tr><td>IDT PrimerQuest</td><td>IDT</td><td></td><td>Primer projektowanie oprogramowania online/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</td></tr><tr><td>Microsoft Word</td><td></td><td></td><td>Sekwencja manipulacja plikami</td></tr><tr><td>Low Na LB Spec 100 średni</td><td></td><td></td><td>E. coli selekcja transformantów, skład: 1% trypton, 0,05% NaCl, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 1,5% agar dla podłoża stałego</td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td> do kouprawy <td>Indukcja przemiany ATMT (odniesienie 12)</td></tr><tr><td>Minimalna pożywka Aspergillus z higromycyną</td><td></td><td></td><td>Selekcja transformantów grzybów</td></tr><tr><td>Pożywka PDA</td><td>Acumedia</td><td>7149A Rurki</td><td>skośne z pojedynczymi zarodnikami</td></tr><tr><td>PDA-Hyg-Kan pożywka</td><td></td><td></td><td>Izolacja ransformantów grzybów, PDA zawierająca 150 &mu; g/ml higromycyny B i 100 &mu; g / ml Kanamycyna</td></tr><tr><td>Koraliki szklane</td><td>Genlantis</td><td>C400100</td><td>Rozprowadzanie płytek</td></tr><tr><td>Filtry nitrocelulozowe (47 mm)</td><td>Fisher</td><td>09-719-555</td><td>Hodowla dla ATMT</td></tr><tr><td>Różne probówki ceżkowe wielokrotne</td><td></td><td></td><td>przygotowanie</td></tr><tr><td>Płytki Petriego (różne)</td><td></td><td></td><td>Hodowla bakterii i grzybów</td></tr><tr><td>pA-Hyg OSCAR</td><td>Addgene</td><td>29640</td><td>Wektor znacznika</td></tr><tr><td>do wyboru pOSCAR</td><td>Addgene</td><td>29639</td><td>Wektor montażowy</td></tr><tr><td>DH5&#945; One Shot Kompetentne E. coli komórki</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>12297-016</td><td>Transformacja reakcji BP</td></tr><tr><td>ccdB przeżycie komórek E. coli</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A10460</td><td>Konserwacja pOSCAR</td></tr><tr><td>Drewniane patyczki transferowe Smugi</td><td></td><td></td><td>kolonii</td></tr><tr><td>Wykałaczki</td><td></td><td></td><td>Zbieranie kolonii</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td>Granulowanie Bakterie, etc.</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td> preparatywna <td>Zbieranie zarodników grzybów</td></tr><tr>Mikroskop <td></td><td></td><td>preparacyjny</td><td>Pojedynczy izolacja zarodników</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik</td><td></td><td></td> komórek <td>Obliczanie zawiesiny zarodników</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td> złożony <td>Hemocytometr zliczanie komórek</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Oczyszczanie genu PCR z flanki</td></tr><tr><td>TaKaRa LA Taq&nbsp;</td><td>Takara Bio USA</td><td>RR002A</td><td>Hi Fidelity taq polimeraza do generacji flankowej OSCAR</td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg-5</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma</td><td>22189-32-8</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaksym</td><td>TCI America</td><td>C2224</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td></td><td>11815032</td><td></td></tr><tr><td>Moxalactam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43963</td><td></td></tr><tr><td>ŻelCzerwony</td><td>&nbsp; Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>Żele agarozowe po barwieniu</td></tr><tr><td>Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Kat. Nr 28104)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(OneShot_ Mach1TM T1R lub One Shot_ OmniMAX&trade; 2 T1R firmy Invitrogen)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C862003</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Mieszanka enzymów</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11789020</td><td>Służy do składania konstrukcji delecji w pOSAR</td></tr></tbody></table>

szybkie wytwarzanie delecji u grzybów za pośrednictwem agrobacterium transformacji konstruktów delecji oscar

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Precyzyjne usunięcie interesującego genu (genów), przy jednoczesnym pozostawieniu reszty genomu bez zmian, stanowi idealny produkt do określenia funkcji tego konkretnego genu w żywym organizmie. W protokole tym opisano metodę OSCAR polegającą na precyzyjnej i szybkiej budowie plazmidu delecyjnego. OSCAR opiera się na systemie klonowania, w którym przeprowadza się pojedynczą reakcję rekombinazy zawierającą oczyszczone, amplifikowane PCR 5' i 3' boki genu będącego przedmiotem zainteresowania oraz dwa plazmidy, pA-Hyg OSCAR (wektor markerowy) i pOSCAR (wektor złożenia). Potwierdzenie prawidłowo zmontowanego wektora delecji odbywa się poprzez mapowanie trawienia restrykcyjnego, a następnie sekwencjonowanie. Agrobacterium tumefaciens jest następnie używany do pośredniczenia we wprowadzaniu konstruktu delecyjnego do zarodników grzybów (określanych jako ATMT). Na koniec opisano test PCR w celu określenia, czy konstrukt delecji jest zintegrowany przez rekombinację homologiczną czy niehomologiczną, wskazując odpowiednio na delecję genu lub integrację ektopową. Podejście to zostało z powodzeniem zastosowane do delecji wielu genów między innymi u Verticillium dahliae i Fusarium verticillioides.

Metoda OSCAR w ramach jednej reakcji generuje plazmid zawierający flanki genu docelowego, który ma zostać usunięty, otaczające kasetę markera selekcyjnego. Produkcja konstruktów delecyjnych za pomocą OSCAR jest bardzo wydajna. System ten może jednak generować konstrukty częściowe, zawierające niektóre, ale nie wszystkie trzy fragmenty (dwie flanki genu i marker selekcyjny). Zazwyczaj większość transformantów E. coli zawiera prawidłowy konstrukt OSCAR. Na przykład Rysunek ...

Mutanty delecji genów generowane przez rekombinację homologiczną są złotym standardem w badaniach funkcji genów. Opisano metodę OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) służącą do szybkiego generowania konstruktów delecyjnych. Następuje przemiana grzybów za pośrednictwem Agrobacterium. Na koniec przedstawiono metodę potwierdzania delecji genów w transformantach grzybowych opartą na PCR.

Szybkie wytwarzanie delecji u grzybów za pośrednictwem Agrobacterium transformacji konstruktów delecji OSCAR

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie precyzyjnych mutantów z delecją genu u grzybów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu genetyki funkcjonalnej grzybów, takie jak rola konkretnego genu w zdolności grzyba do wywoływania choroby. Główną zaletą tej techniki jest możliwość bardzo szybkiego konstruowania plazmidów do generowania precyzyjnych delecji.Metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat każdego grzyba posiadającego skuteczny system rekombinacji homologicznej. Potencjalnie może ona zostać zastosowana również w innych systemach, takich jak komórki protistów lub nicieni. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas opracowywania systemu DelsGate, który jest spokrewniony z systemem Oscar, ale służy do transformacji protoplastów zamiast wykorzystania agrobakterii.Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ zawiera ona szereg zoptymalizowanych lub nieintuicyjnych kroków. Procedurę zaprezentuje Nicole Crenshaw, technik z My Laboratory. Ta strategia projektowania starterów wymaga posiadania w pliku tekstowym regionu genomicznego badanego genu, obejmującego otwartą ramkę odczytu oraz co najmniej dwa kilobazy sekwencji flankującej gen z każdej strony.Zacznij od zaznaczenia otwartej ramki odczytu przeznaczonej do delecji i oznacz kodony start oraz stop. Zidentyfikuj i zaznacz sąsiadujące otwarte ramki odczytu w pobranej sekwencji. Następnie, korzystając z narzędzia do projektowania starterów, zaprojektuj primery PCR dla flanki 5' otwartej ramki odczytu badanego genu.Wykorzystaj fragment o długości dwóch kilobaz powyżej końca 5' ramki odczytu genu docelowego, aby zaprojektować parę starterów PCR O1 i O2 w celu uzyskania produktu o minimalnej wielkości jednej kilobazy. Wybierz wynik, w którym starter odwrotny O2 znajduje się najbliżej ramki odczytu. Upewnij się, że sąsiednia ramka odczytu nie została naruszona.Zrób zrzut ekranu wyników analiz i skopiuj oraz wklej sekwencje starterów do dokumentu tekstowego. Po powtórzeniu tego procesu dla trzech flank obszaru prime w celu wygenerowania starterów O3 i O4, dodaj odpowiednie miejsca przyłączenia do pięciu primandów wszystkich czterech starterów. Na koniec, zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole tekstowym, zaprojektuj startery do potwierdzenia delecji oraz potwierdzenia rekombinacji homologicznej.Rozpocznij tę procedurę od przygotowania dwóch reakcji PCR: jednej dla flanki 5', a drugiej dla flanki 3'. Do obu mieszanin reakcyjnych dodaj: 29,5 µL sterylnej wody destylowanej, 5 µL buforu 10x LA PCR, 8 µL mieszaniny dNTP o stężeniu 2,5 mM, 5 µL chlorku magnezu o stężeniu 25 mM, 1 µL matrycy oraz 0,5 µL polimerazy hi-fidelity Taq. Do reakcji dla flanki 5' dodaj 0,5 µL startera O1 oraz 0,5 µL startera O2. Do reakcji dla flanki 3' dodaj 0,5 µL startera O3 oraz 0,5 µL startera O4. Przeprowadź PCR zgodnie z następującymi warunkami reakcji: 94 °C przez 1 minutę, następnie 30 cykli składających się z 94 °C przez 30 sekund, 60 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 2 minuty, a na koniec 72 °C przez 5 minut przed nieokreślonym przechowywaniem w temperaturze 10 °C.Aby określić wielkość produktu i jego względne stężenie, należy przeprowadzić elektroforezę produktów PCR na żelu 0,8% agar w buforze TLE 1x przez około 125 wolto-godzin w standardowym aparacie do mini-żeli. Żel należy poddać barwieniu potranskrypcyjnemu barwnikiem innym niż bromek etydyny, zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie wizualizować na iluminatorze UV. Jeśli stężenia flanki 5' i 3' są zbliżone, należy je połączyć.Jeśli nie mają one takiego samego stężenia, połącz produkt o niskim stężeniu z szacunkowo taką samą ilością produktu z reakcji o wyższej wydajności. Użyj zestawu do kolumn infinity, aby współoczyszczać produkty PCR zgodnie z protokołem producenta. Następnie przeprowadź reakcję BP clonase, mieszając następujące składniki: 1 µL wektora assemble, 2 µL wektora markerowego, 1 µL połączonych flank oraz 1 µL clonasy.Inkubować w temperaturze 25 °C przez 16 godzin. Reakcję przerwać poprzez dodanie 0,5 µL protonazy K i inkubację w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Po transformacji komórek E.coli produktem reakcji BP i izolacji DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym, zidentyfikować prawidłowy konstrukt, przeprowadzając podwójne trawienie enzymami Hindiii 3 i KPN 1.Po zidentyfikowaniu konstruktu z delecją OSCAR za pomocą sekwencjonowania po podwójnym trawieniu, konstrukt ten zostaje poddany transformacji do szczepu AGL1 agrobacterium tumefaciens. Kolejnym krokiem jest transformacja grzybów szczepem AGL1 zawierającym konstrukt z delecją OSCAR. Należy rozpocząć od przygotowania zawiesiny zarodników grzyba w sterylnej wodzie o stężeniu 2 × 10⁶ zarodników na mililitr.Po rozcieńczeniu zarodników, przenieś 500 µL zawiesiny zarodników grzyba do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Za pomocą niebieskiej, sterylnej jednorazowej pętli dodaj do zawiesiny zarodników wyraźnie widoczną ilość plazmidu delecyjnego zawierającego AGL1. Wymieszaj na wortexie, aż komórki bakteryjne zostaną dobrze rozproszone.Umieść filtr z błony celulozowej na każdym z czterech sześciocentymetrowych szalek Petri zawierających pożywkę do współhodowli, a następnie dodaj około czterech sterylnych szklanych kulek do każdej szalki. Pipetą nanieś 100 µL zawiesiny konidiów agra na środek każdego filtra membranowego i rozprowadź zawiesinę za pomocą kulek, aby pokryły całą powierzchnię filtra. Po usunięciu kulek pozostaw filtry do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez około dziesięć minut, a następnie owiń szalki Petri folią parafinową.Odwróć płytki i inkubuj przez dwa dni w temperaturze pokojowej. Po dwóch dniach przenieś każdy filtr membranowy na sześciocentymetrową płytkę z selektywną pożywką agarową zawierającą Hygromycin B oraz kanamycynę. Inkubuj w temperaturze pokojowej od pięciu do ośmiu dni.Aby wyizolować kolonie oporne na hygromycynę, należy użyć sterylnych wykałaczek do przeniesienia domniemanych transformantów na sześciocentymetrowe płytki z agarem ziemniaczanym (PD), zawierające hygromycynę i kanamycynę. Płytki należy inkubować w temperaturze pokojowej. Po uformowaniu się kolonii transformantów na płytkach, należy za pomocą sterylnej wykałaczki przenieść niewielką ilość grzybni lub komórek drożdżowych z kolonii do 100 µL roztworu lizującego w probówce do mikrocentryfugi.Inkubować mieszaninę w temperaturze od 85 do 90 °C przez 20 do 30 minut. Przechowywać surowy ekstrakt zawierający DNA genomowe w temperaturze -20 °C do momentu przeprowadzenia PCR. Aby zidentyfikować mutanty z delecją, najpierw przeprowadzić PCR w celu wykrycia otwartej ramki odczytu interesującego genu oraz markera selekcyjnego dla każdego transformanta.Zastosuj te same warunki reakcji do produkcji konstruktów OSCAR. Po izolacji pojedynczych zarodników i lizie termicznej powtórz PCR dla otwartej ramki odczytu i Hygromycyny, a także PCR w celu wykrycia rekombinacji homologicznej flank 5' i 3'. Następnie przeprowadź elektroforezę produktów PCR w żelu agarozowym.Metoda OSCAR generuje plazmid zawierający gen markera selekcyjnego, otoczony flankami genu docelowego do usunięcia, którym w tym przykładzie jest gen verticillium dahliae. Po trawieniu podwójnym uwolnienie wkładki o długości 4 247 par zasad w tym przypadku potwierdza poprawną strukturę plazmidu we wszystkich ścieżkach, z wyjątkiem ścieżek piątej i 11. Do potwierdzenia delecji zastosowano metodę PCR.Ten przykład przedstawia analizę pięciu transformantów Fusarium verticillioides. Na górnym żelu ścieżki od drugiej do szóstej to amplifikacje flanki 5', a ścieżki od siódmej do jedenastej to amplifikacje otwartych ramek odczytu. Na dolnym żelu ścieżki od drugiej do szóstej to amplifikacje genu markera selekcyjnego, a ścieżki od siódmej do jedenastej to amplifikacje flanki 3'.Obecność prążków w amplifikacjach flanki 5', flanki 3' oraz genu markera selekcyjnego, przy jednoczesnym braku prążków w amplifikacji otwartej ramki odczytu, potwierdza, że szczepy 1131, 1132 i 1133 są transformantami z delecją. Obecność prążków w amplifikacjach otwartej ramki odczytu i genów markerów selekcyjnych oraz brak prążków w amplifikacjach flanki 5' i flanki 3' wskazuje, że szczepy 1134 i 1135 są transformantami atypowymi. Delekcje genowe można również potwierdzić za pomocą analizy Southern blot.Po opanowaniu ta technika pozwala na wygenerowanie plazmidów do delecji Oscar gotowych do transformacji grzybów w ciągu dwóch dni, nie licząc czasu potrzebnego na sekwencjonowanie. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest pamiętanie o zastosowaniu wysokowiernej polimerazy Taq w etapach wstępnych oraz upewnienie się, że sąsiednie geny nie zostaną naruszone. Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody testowania fenotypów mutantów w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy dany gen jest istotny w konkretnych procesach, na przykład w wrażliwości lub oporności na leki.Należy pamiętać, że praca z organizmami żywymi, takimi jak agrobakterie i grzyby, może być niebezpieczna, zwłaszcza w przypadku osób z obniżoną odpornością. Podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak mycie rąk po zakończeniu pracy.

rapid-deletion-production-fungi-via-agrobacterium-mediated

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

Metoda Green Monster umożliwia szybkie tworzenie wielokrotnych delecji oznakowanych genem reporterowym kodującym zielone białko fluorescencyjne. Metoda ta opiera się na przeprowadzaniu szczepów drożdży przez powtarzalne cykle seksualnego sortowania delecji oraz wzbogacania komórek posiadających więcej delekcji na podstawie fluorescencji.

Proces Green Monster w celu generowania szczepów drożdży z wielokrotnymi delecjami genów

Opracowano wydajną metodę wprowadzania pojedynczych mutacji genowych w całym genomie, wykorzystując Streptococcus sanguinis jako organizm modelowy. Metoda ta została osiągnięta dzięki zastosowaniu wysokoprzepustowych reakcji PCR rekombinacyjnego oraz transformacji.

Delecje genów w całym genomie Streptococcus sanguinis za pomocą wysokoprzepustowej PCR

Transformacja biolistyczna to metoda używana do generowania stabilnej integracji DNA z genomem oportunistycznego patogenu Cryptococcus neoformans poprzez rekombinację homologiczną. Zademonstrujemy biolistyczną transformację konstruktu, który ma gen kodujący kinazę octanową połączony ze znacznikiem fluorescencyjnym mCherry w C. neoformans.

Biolistyczna transformacja genu znakowanego fluorescencyjnie w oportunistyczny patogen grzybowy Cryptococcus neoformans

Niniejszym opisujemy metody molekularnej manipulacji genetycznej szczepu Yarrowia lipolytica Po1g w celu poprawy efektywności delecji genów. Powstałe w ten sposób zmodyfikowane szczepy Y. lipolytica mają potencjalne zastosowania w produkcji biopaliw i biochemii.

Inżynieria genetyczna niekonwencjonalnych drożdży do produkcji biopaliw odnawialnych i biochemicznych

Opisujemy solidną strategię wymiany genów w celu genetycznego manipulowania grzybem Ustilago maydis. Ten protokół wyjaśnia, jak generować mutanty delecji w celu zbadania fenotypów infekcji. Można go rozszerzyć o modyfikację genów w dowolny sposób, np. poprzez dodanie sekwencji kodującej znacznik białka fluorescencyjnego.

Manipulacja genetyczna patogenu roślinnego Ustilago maydis w celu zbadania biologii grzybów i interakcji mikroorganizmów roślinnych

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię losowej mutagenezy docelowego genu u drożdży rozszczepieniowych. Jako przykład celujemy w rpt4 +, który koduje podjednostkę proteasomu 19S i badamy pod kątem mutacji, które destabilizują heterochromatynę.

Mutageneza losowa ukierunkowana na geny w celu wyselekcjonowania mutantów proteasomów destabilizujących heterochromatynę w drożdżach rozszczepieniowych

Tutaj prezentujemy protokół użycia istniejących wcześniej konstruktów delecji kasety oporności na antybiotyki jako podstawy do tworzenia mutantów delecyjnych w innych szczepach E. coli. Takie mutacje delecji mogą być mobilizowane i wprowadzane do odpowiedniego locus szczepu biorcy za pomocą transdukcji bakteriofaga P1.

Wytwarzanie delecji genów w Escherichia coli przez transdukcję P1 z kasetami oporności na antybiotyki podlegającymi akcyzie

Opisana tutaj jest metoda celowanej, bezznacznikowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasecie floksowanej, FLAEM.

Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis

Przedstawiono protokół iniekcji (agroiniekcji) oparty na Agrobacterium do inokulacji wirusa mozaiki czyńca i klonów wirusa mozaiki trzciny cukrowej do siewek kukurydzy. Inokulacja w ten sposób prowadzi do infekcji wirusowej, wywołanego przez wirusa wyciszenia genów markerowych i nadekspresji wirusa GFP.

Bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy przez wstrzyknięcie rekombinowanym wirusem mozaiki wyczyńca i zakaźnymi klonami wirusa mozaiki wyczyńca cukrowego

Ta praca opisuje protokół dla wielokopijnego badania genetycznego supresorowego u Schizosaccharomyces pombe. To badanie przesiewowe wykorzystuje bibliotekę plazmidów obejmującą cały genom do identyfikacji klonów supresorowych fenotypu utraty funkcji związanego ze zmutowanym szczepem zapytania. Za pomocą tego badania przesiewowego zidentyfikowano nowe supresory genetyczne mutanta zerowego ell1.

Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe

Poznaj metodę OSCAR do szybkiego tworzenia delecji genów u grzybów za pomocą transformacji Agrobacterium. Ta technika umożliwia precyzyjne badanie funkcji genów w gatunkach grzybów z efektywnym systemem rekombinacji homologicznej.

Szybkie wytwarzanie delecji u grzybów za pośrednictwem Agrobacterium transformacji konstruktów delecji OSCAR

Przeglądaj więcej filmów